PHÁT HIỆN MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY Ô NHIỄM THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR pps

PHÁT HIỆN MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY Ô NHIỄM THỰC
PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR

TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Ứng dụng kỹ thuật PCR để phân tích vi sinh vật thực
phẩm hiện nay chưa được áp dụng nhiều trong các labo vi sinh.
Mục tiêu: so sánh phương pháp PCR và nuôi cấy trong kiểm nghiệm
vi sinh vật thực phẩm.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 270 loại mẫu thực phẩm thuộc
các nhóm thịt, thủy hải sản, sữa, và các loại bánh đã được thu thập và phân
tích so sánh bằng phương pháp nuôi cấy và phương pháp PCR với các bộ kit
do Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐH Quốc gia TP. HCM cung cấp.
Kết quả: 100 mẫu thực phẩm kiểm tra chỉ tiêu vi sinh vật theo phương
pháp nuôi cấy và PCR cho thấy tỷ lệ mẫu dương tính đối với Salmonella là
8% và 20%; đối với E. coli là 44 và 88%; đối với S. aureus là 32 và 46%;
đối với Listeria monocytogenes là 8 và 13%. 70 mẫu thủy hải sản kiểm tra
V. parahaemolyticus cho kết quả nuôi cấy là 11,4% và PCR 17,1%. So sánh
về độ nhạy cho thấy phương pháp PCR cho kết quả tốt hơn (100%).
Kết luận: Sử dụng PCR giám sát mẫu thực phẩm nhằm phát hiện và
chọn nhanh các mẫu đạt yêu cầu (cho kết quả âm tính) khi kiểm tra chất
lượng vệ sinh thực phẩm sẽ tiết kiệm được thời gian trả lời kết quả so vớI
phương pháp nuôi cấy.
SUMMARY
Background: Nowadays, Applying PCR method to analyse bacterial
contamination in food is not popular in Viet Nam.
Objectives: Comparing of PCR method and traditional culture-based
method for control of food microbiology.
Method: 270 food samples including meats, sea products, milks, and
cakes were collected and comparatively analyzed by traditional culture-
based technique and PCR technique with kits supplied by the University of
Natural Sciences in HCMC.

Results: The survey results showed that: 100 samples were analyzed
by traditional culture-based technique and PCR technique for Salmonella is
8% and 20%; for E. coli is 44 and 88%; for S. aureus is 32 and 46%; for
Listeria monocytogenes is 8 and 13%, respectively. 70 samples were
analyzed by traditional culture-based technique and PCR technique for
Vibrio parahaemolyticus is 11.4% and 17.1%, respectively. A comparation
the sensity of two methods between PCR and culture method showed that:
PCR have the sensity higher (100%).

Conclusion: PCR method can use in monitoring food hygiene-safety
to detect and eliminate rapidly the foods of bacterial contamination and
time-saving.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay trong công tác kiểm tra chất lượng vệ sinh thực phẩm về mặt
vi sinh vật tại các phòng thí nghiệm trong cả nước chủ yếu vẫn sử dụng
phương pháp nuôi cấy truyền thống(5,7,8,9). Để đáp ứng cho nhu cầu giám
sát mẫu thực phẩm với số lượng nhiều cùng một lúc thì công tác nuôi cấy sẽ
tốn nhiều thời gian, môi trường nuôi cấy, hơn nữa để góp phần trong chẩn
đoán nhanh các vụ ngộ độc thực phẩm xảy ra với quy mô ngày càng lớn,
trong đó, phần lớn có nguyên nhân là do vi sinh vật thì kỹ thuật PCR sẽ đáp
ứng kịp thời cho những nhu cầu đó. Các tác nhân vi khuẩn thường gây ngộ
độc thực phẩm là Salmonella spp., Escherichia coli, Staphylococcus aureus,
Vibrio parahaemolyticus và Listeria monocytogenes(2,3,5,7,9). Để đánh giá
khả năng ứng dụng của bộ kit PCR do trường Đại học Khoa học Tự nhiên
TP. Hồ Chí Minh sản xuất chúng tôi đã tiến hành phân tích mức độ ô nhiễm
vi sinh vật một số nhóm mẫu thực phẩm như thịt, thủy hải sản, sữa và các
loại bánh được bày bán tại các chợ và các hàng quán trên địa bàn thành phố
bằng kỹ thuật PCR và so sánh độ nhạy phát hiện của hai phương pháp. Từ
những kết quả nghiên cứu, chúng tôi đưa ra một số khuyến cáo khi sử dụng
bộ kit PCR chẩn đoán nhanh các vi sinh vật gây ô nhiễm thực phẩm.

VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu
- 270 mẫu thực phẩm: thịt, thủy hải sản, sữa và các loại bánh được thu
thập từ các chợ và các hàng quán trên đường phố tại TP. Hồ Chí Minh.
- Hóa chất và môi trường để phát hiện các vi sinh vật bằng phương
pháp nuôi cấy.
- Hóa chất dùng để phát hiện vi sinh vật bằng kỹ thuật PCR: hóa chất
tách chiết DNA, điện di và các bộ kit PCR để phát hiện cho các chỉ tiêu:
Salmonella spp., Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Vibrio
parahaemolyticus và Listeria monocytogenes được cung cấp bởi Phòng thí
nghiệm Công nghệ Sinh học phân tử Trường ĐH Khoa học Tự nhiên (thuộc
ĐH Quốc gia TP. HCM).
Phương pháp
- Mẫu thực phẩm được phân tích các chỉ tiêu vi sinh dựa trên qui định
của Bộ Y tế (QĐ 867/1998)(9) bằng cả hai phương pháp PCR và nuôi cấy.
- Phân tích mẫu bằng phương pháp nuôi cấy được thực hiện theo các
tiêu chuẩn như sau: Salmonella (TCVN 4829:2001), E. coli (TCVN
5155:90), S. aureus (TCVN 5156:1990), V. parahaemolyticus (QĐ
3349/QĐ-BYT) và Listeria monocytogenes (AOAC 2000 - 993.12)
- Phân tích mẫu bằng kỹ thuật PCR(7,8):
+ Xử lý mẫu: đồng nhất 25g mẫu trong 225ml môi trường tăng sinh
thích hợp, ủ từ 16 - 22h. Hút 1ml mẫu sau khi tăng sinh, xử lý .
+ Thu nhận DNA bản mẫu từ 1ml dịch sau tăng sinh, ly tâm
800vòng/phút, loại bỏ mảnh vụn thực phẩm, thu dịch nổi. Ly tâm
5000vòng/5phút, lấy cặn. Rửa cặn 2 lần bằng nước cất vô trùng. Ly tâm và
huyền phù cặn trong 200ml TE, đun ở 100oC/10phút. Ly tâm 12.000 vòng/5
phút. Hút 3ml dịch nổi là DNA khuôn cho vào tube chứa 21,5ml PCR mix
và 0,5ml Taq DNA polymerase (tổng thể tích là 25ml).
+ Thực hiện phản ứng PCR trên máy luân nhiệt (thermal cycler) của
hãng Bio-Rad theo chương trình đã cài đặt, gồm các bước sau:

Chu kỳ 1: (x1) Bước 1: 940C x 5 phút
Chu kỳ 2: (x35) Bước 1: 940C x 30 giây
Bước 2: 550C x 40 giây
Bước 3: 720C x 45 giây
Chu kỳ 1: (x1) Bước 1: 940C x 5 phút
+ Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 2% nhuộm ethidium
bromide và chụp hình ảnh điện di bằng máy Gel.doc với kích thước vạch:
Salmonella: 520 bp, E. coli: 299bp, S. aureus: 276bp, V. parahaemolyticus:
450bp, Listeria monocytogenes: 220bp.
- Phương pháp PCR-ELISA theo bộ kit của hãng Bio-Rad: để phát
hiện Salmonella.
- Thống kê, đối chiếu kết quả ghi nhận bằng phương pháp PCR và
nuôi cấy dựa trên độ nhạy của hai phương pháp theo tiêu chuẩn của HC
(Health Canada) and CFIA (the Canadian Food Inspection Agency).
KẾT QUẢ
Kết quả nuôi cấy và PCR phát hiện Salmonella
Bảng 1: Kết quả nuôi cấy, PCR-ELISA và PCR phát hiện Salmonella
(n=100)
Mẫu thực phẩm

Nuôi cấy

PCR - ELISA

PCR
+

-

+

-

+

-
Tần suất

8

92

19

81

20

80
Tỉ lệ %

8,00

92,00

19,00

81,00

20,00

80,00

Hình 1: Hình ảnh PCR phát hiện Salmonella
Kết quả nuôi cấy và PCR phát hiện E. coli
Bảng 2: Kết quả nuôi cấy và PCR phát hiện E. coli (n=100)
Mẫu thực phẩm

Nuôi cấy

PCR
+

-

+

-
Tần suất

44

56

88

12
Tỉ lệ %

44,00

56,00

88,00

12,00
Hình 2: Hình ảnh PCR phát hiện vi khuẩn E. coli
Ghi chú: Các mẫu từ D1 đến D14 (14 mẫu) E. coli đều dương tính,
vạch 299bp.
Kết quả nuôi cấy và PCR phát hiện S. aureus
Bảng 3: Kết quả nuôi cấy và PCR phát hiện S. aureus (n=100)
Mẫu thực phẩm

Nuôi cấy

PCR
+

-

+

-
Tần suất

32

68

46

54
Tỉ lệ %

32,00

68,00

46,00

54,00

D1 D2 D3 D4

Hình 3: Hình ảnh PCR phát hiện vi khuẩn S. aureus
Ghi chú: các mẫu từ D1 đến D4 (4 mẫu) S. aureus đều dương tính,
vạch 276 bp.
Kết quả nuôi cấy và PCR phát hiện Listeria monocytogenes (hình 4)
Bảng 4: Kết quả nuôi cấy và PCR Listeria monocytogenes (n=100)
Mẫu thực phẩm

Nuôi cấy

PCR
+

-

+

-
Tần suất

8

92

13

87
Tỉ lệ %

8,00

92,00

13,00

87,00

Kết quả nuôi cấy và PCR phát hiện V. parahaemolyticus (hình 5)
Bảng 5: Kết quả nuôi cấy và PCR V. parahaemolyticus (n=70)
Mẫu thực phẩm

Nuôi cấy

PCR
+

-

+

-
Tần suất

8

62

12

58
Tỉ lệ %

11,4

88,6

17,1

82,9

Hình 4: Hình ảnh PCR phát hiện vi khuẩn Listeria monocytogenes
Ghi chú: các mẫu từ E1 đến E6 (14 mẫu) Listeria monocytogenes đều
dương tính, vạch 220bp.
Hình 5: Hình ảnh PCR phát hiện vi khuẩn V. parahaemolyticus
Ghi chú: - H1, G4, G5 và G7: (+) - H2, H3, H4, H5, G1,
G2, G3, G6 và F1: (-)
BÀN LUẬN

Bảng 1 cho thấy kết quả kiểm tra định tính Salmonella trong thực
phẩm bằng 3 phương pháp: nuôi cấy, PCR-ELISA và PCR như sau: nuôi cấy
cho kết quả dương tính là 8 mẫu (8%), PCR-ELISA (bộ kit của hãng Bio-
Rad) cho số mẫu dương tính là 19 (19%) và PCR (bộ kit của trường Ðại học
KHTN) cho số mẫu dương tính là 20 (20%).
Như vậy, hai phương pháp PCR-ELISA và PCR cho kết quả tương
đương (19% và 20%) khi phát hiện Salmonella, nhưng cho tỉ lệ phát hiện
cao hơn hẳn phương pháp nuôi cấy (8%), sự khác bệt có ý nghĩa thống kê
(p<0,05). Điều này có thể lý giải như sau: trong các thực phẩm qua chế biến
có Salmonella bị chết, không thể phát hiện bằng phương pháp nuôi cấy
nhưng vẫn phát hiện được bằng phương pháp PCR, nguồn thực phẩm ban
đầu đưa vào chế biến chưa đảm bảo vệ sinh vì theo chỉ tiêu đã qui định:
Salmonella không được hiện diện trong nguyên liệu chưa chế biến. ngoài ra,
phương pháp PCR có độ nhạy cao hơn phương pháp nuôi cấy nên cho kết
quả phát hiện cao hơn.
Bảng 2 thể hiện kết quả kiểm tra vi khuẩn E. coli trong thực phẩm
bằng 2 phương pháp nuôi cấy và PCR: nuôi cấy cho số mẫu dương tính là 44
(44%), PCR (bộ kit của trường Ðại học KHTN) cho 88 mẫu dương tính
(88%). Như vậy, phương pháp PCR có độ nhạy cao hơn hẳn phương pháp
nuôi cấy (88% so với 44%), sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Để
ứng dụng bộ kit này trong công tác giám sát vệ sinh thực phẩm, cần thực
hiện kỹ thuật bán định lượng cho qui trình PCR, nghĩa là đối với từng chủng
loại thực phẩm cho phép sự có mặt của E. coli bao nhiêu thì chúng ta sẽ pha
loãng mẫu đến đậm độ cho phép rồi sau đó mới tăng sinh và kiểm nghiệm
bằng PCR, nếu mẫu điện di dương tính có nghĩa mẫu là vượt quá giới hạn
cho phép.
Bảng 3 cho thấy kết quả kiểm tra S. aureus trong thực phẩm bằng 2
phương pháp nuôi cấy và PCR: nuôi cấy cho 32 mẫu dương tính (32%),
PCR (bộ kít của trường Ðại học KHTN) cho 46 mẫu dương tính (46%).
Phương pháp PCR cho kết quả dương tính cao hơn phương pháp nuôi cấy

(46% so vớI 32%, p<0,05). Có thể lý giải này như sau: một số vi khuẩn S.
aureus bị chết trong quá trình chế biến nên không phát hiện được qua nuôi
cấy và độ nhạy của phương pháp PCR cao hơn phương pháp nuôi cấy.
Bảng 4 thể hiện kết quả kiểm tra Listeria monocytogenes trong thực
phẩm phương pháp nuôi cấy và PCR: nuôi cấy cho 8 mẫu dương tính (8%),
PCR (bộ kit của trường Ðại học KHTN) cho số mẫu dương tính là 13 (13%).
Như vậy, phương pháp PCR có độ nhạy cao hơn phương pháp nuôi
cấy (p<0,05). Ngoài ta, có thể do mẫu ban đầu nhiễm, qua xử lý vi khuẩn bị
chết và không thể phát hiện được bằng phương pháp nuôi cấy nhưng vẫn
phát hiện được bằng PCR. Khi kết quả PCR dương tính chúng ta chỉ xác
định được chắc chắn các mẫu thực phẩm không bị nhiễm trước khi chế biến
(các mẫu PCR âm tính). Để xác định chắc chắn các mẫu thực phẩm có bị
nhiễm trước khi sử dụng hay không, phải phương pháp nuôi cấy lại mới kết
luận được chính xác.
Bảng 5 cho thấy có 70 mẫu hải sản được kiểm tra bằng nuôi cấy và
PCR để phát hiện Vibrio parahaemolyticus: nuôi cấy phát hiện được 8 mẫu
dương tính (11,4%) trong khi PCR cho số mẫu dương tính là 12 (17,1%).
Cách lý giảI cũng tương tự như ở phần trên.
KẾT LUẬN
1. Quy trình và bộ kít PCR phát hiện Salmonella spp., Escherichia
coli, Staphylococcus aureus, Vibrio parahaemolyticus và Listeria
monocytogenes gây ô nhiễm thực phẩm do Trường ĐH Khoa học Tự nhiên,
ĐH Quốc gia - TP. HCM xây dựng có thể được ứng dụng để phát hiện
nhanh các loài vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm nhằm giảm thiểu thời
gian trả lời kết quả so với phương pháp nuôi cấy (tốn 3 - 6 ngày).
2. Các qui trình và bộ kit PCR này dễ dùng, dễ thao tác và có độ nhạy
cao (100%). Với ưu điểm như trên, phương pháp PCR rất thích hợp cho
công tác kiểm tra và giám sát cùng lúc một số lượng lớn các mẫu thực phẩm
hoặc chẩn đoán nhanh các vụ ngộ độc có liên quan đến ô nhiễm vi sinh vật
với nhiều chỉ tiêu mà không tốn nhiều công sức và thời gian theo dõi kết quả

như phương pháp nuôi cấy.
3. Tuy nhiên, phương pháp PCR phát hiện cả những mầm bệnh đã
chết (vẫn cho kết quả PCR dương). Do đó, phương pháp PCR phát hiện vi
khuẩn gây ô nhiễm thực phẩm có giá trị thực tiễn nhất trong việc chọn được
nhanh các mẫu cho kết quả âm tính – các mẫu thực phẩm đạt chất lượng tốt
qua giám sát.