ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR BÁN ĐỊNH LƯỢNG VÀ ĐỊNH LƯỢNG XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ SAO CHÉP CỦA HEPARANSULPHAT INTERACTING PROTEIN Ở MÔ UNG THƯ ppt

ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR BÁN ĐỊNH LƯỢNG
VÀ ĐỊNH LƯỢNG XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ SAO CHÉP
CỦA HEPARANSULPHAT INTERACTING PROTEIN Ở MÔ
UNG THƯ

Phương pháp PCR bán định lượng và định lượng là những phương
pháp đơn giản, chính xác và cho độ tin cậy tương đối cao được sử dụng rất
rộng rãi để xác định mức độ biểu hiện của mỗi gen được khuyếch đại sau
mỗi phản ứng PCR.
Mục tiêu: Sử dụng phương pháp PCR bán định lượng và định lượng
để đánh giá mức độ sao chép của Heparansulphat Interacting Protein (HIP) ở
mô ung thư so với mô lành tính; so sánh kết quả của 2 phương pháp trên.
Phương pháp: Tách triết mRNA tổng số từ mô ung thư và lành tính;
tổng hợp cDNA; xác định mức độ sao chép của HIP sử dụng phương pháp
PCR bán định lượng và định lượng.
Kết quả: Cả phương pháp này đều cho kết quả tương tự như nhau;
HIP được tăng cường sao chép rất rõ ở những mô ung thư trong khi đó phát
hiện được rất thấp trên mẫu lành tính.
Kết luận: Mức độ biểu hiện của HIP ở mô ung thư và mô lành tính
khác biệt nhau một cách rõ rệt. Chúng ta có thể dùng một trong hai phương
pháp PCR bán định lượng và định lượng trên để đánh giá mức độ sao chép
của HIP trong chẩn đoán bệnh ung thư.

ABSTRACT
Semiquantitative PCR and quantitative PCR are accurate and simple
methods. They are commonly used to determine amplified gene levels in
PCR reaction.
Objective: Using semiquantitative PCR and quantitative PCR
methods to determine HIP transcript levels in cancer and normal tissue; to
evaluate sensibility of tow methods.
Methods: mRNA was extracted from cancer and normal tissues,

cDNA synthesis by reverse transcript-polymerase chain reaction (RT-PCR);
HIP transcript determination using semiquantitative PCR and quantitative
PCR methods.
Results: Both methods showed the same results: HIP transcript was
up regulated in cancer tissues.
Conclusion: Levels of HIP transcript was different between cancer
tissue and the normal control. Semiquantitative PCR and quantitative PCR
are useful methods to determine HIP transcript for cancer diagnosis.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Heparin và heparansulfate (HP/HS) là đại phân tử mang điện âm với
độ sulphate hóa rất cao, chính vì vậy chúng có khả năng tương tác với nhiều
loại protein trong các quá trình sinh học khác nhau và đóng vai trò rất quan
trọng trong việc hình thành và duy trì cấu trúc chức năng của tế bào
(6)
.
Daniel D. Carson và cộng sự đã phát hiện ra một protein bề mặt tế bào biểu
mô thận người và một số dòng tế bào khác, protein này được đặt tên là
Heparansulphat Interacting Protein (HIP)
(2)
. Đây là một protein có chiều dài
155 aa với trọng lượng phân tử khoảng 18 kDa
(3)
. Khi nghiên cứu sâu hơn về
chức năng sinh học của HIP các tác giả đã phát hiện ra rằng HIP cũng có
chức năng tương tự như những protein gắn ái lực với HP/HS và chúng được
tổng hợp nhiều ở các dòng tế bào nội mạc và tế bào biểu mô trưởng thành.
Một số nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng HIP được tăng cường tổng
hợp ở các dòng tế bào và mô ung thư ở cả mức độ RNA thông tin và protein
như: ung thư tuyến giáp trạng và ung thư vú, ung thư đại tràng Đặc biệt
mức độ biểu hiện của HIP liên quan chặt chẽ với quá trình phát triển và xâm

lấn của ung thư và phụ thuộc vào mức độ ác tính của các dòng ung thư
(1,7)
.
Việc nghiên cứu tìm hiểu cơ chế ung thư ở mức độ phân tử, từ đó tìm ra
phương pháp chẩn đoán hữu hiệu và điều trị sớm là một lĩnh vực đang được
rất nhiều nhà khoa học quan tâm. Trong một vài nghiên cứu gần đây, bằng
phương pháp RT-PCR chúng tôi đã phát hiện thấy mRNA của HIP được sao
chép với một lượng đáng kể trong mô ung thư vú và ung thư tuyến tiền liệt
trong khi đó không phát hiện được hoặc phát hiện rất thấp ở mô u xơ
(4,5)
.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng phương pháp RT-PCR bán định
lượng và định lượng để xác định mức độ sao chép của HIP ở mô ung thư, từ
đó so sánh kết quả, đánh giá độ tin cậy của 2 phương pháp trên để ứng dụng
chúng xác định mức độ sao chép của HIP và các gen khác trong chẩn đoán
bệnh ung thư.
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng
30 bệnh nhân ung thư được chẩn đoán xác định dựa trên lâm sàng, cận
lâm sàng (siêu âm, hoá sinh, mô bệnh học) tại Bệnh viện K Hà nội. Chúng
tôi sử dụng 15 mẫu mô lành tính để làm đối chứng.
Phương pháp nghiên cứu
Tách chiết mRNA và tổng hợp cDNA
RNA tổng số được tách chiết từ mô ung thư theo quy trình chuẩn đã
được mô tả trước đây
(5)
. 5µg RNA tổng số được sử dụng để tổng hợp chuỗi
cDNA bổ xung bằng phản ứng reverse transcript-polymerase chain reaction
RT- PCR.
Phương pháp PCR bán định lượng

Cặp mồi đặc hiệu với HIP có trình tự như sau: HIP-F: 5’-GCT TAT
GGT GCA GAC ATG G -3’; HIP-R: 5’-CAG AGA TAT CTA CTC TGA
AGC-3’. PCR được tiến hành với tổng thể tích 20µl gồm: 4 µl cDNA, 2 µl
10x Ex Taq Buffer, 2 µl 2.5mM dNTPs, 10 pmol mồi xuôi và ngược, 1 unit
Ex Taq Polymerase (Takara Bio Inc.Kyoto, Japan). Chu trình nhiệt của phản
ứng PCR như sau: Biến tính 94
0
C - 5 phút, 35 chu kỳ 94
0
C - 50 giây, 58
0
C
- 50 giây, 72
0
C - 50 giây, 72
0
C - 5 phút. Sử dụng gen nội chuẩn GAPDH
để đánh giá chất lượng RNA và so sánh lượng mẫu sử dụng trong phản ứng
RT-PCR. Đậm độ mỗi vạch HIP và GAPDH được xác định nhờ phần mềm
chuyên dụng. Mức độ sao chép của HIP được tính bằng tỉ lệ HIP/GAPDH rồi vẽ
đồ thị.
Phương pháp PCR định lượng
(Agilent 2100 Bioanalyzer with DNA 1000 Lab Chips; Agilent
Technologies, Palo Alto, CA): Phương pháp PCR định lượng được ứng dụng
để đánh giá độ tin cậy của phương pháp trên. Quy trình PCR được tiến hành
tương tự như phương pháp PCR bán định lượng. Vì phương pháp này rất
nhạy và có thể đánh giá được mức độ sao chép của HIP cho dù ở mức độ rất
thấp nên chu kỳ của phản ứng được giảm từ 35 xuống 24 chu kỳ. Sản phẩm
PCR sau đó được điện di trên hệ thống capillary (Capillary electrophoresis)
và mức độ sao chép của HIP được xác định thông qua hệ thống máy tính.

Kết quả PCR định lượng được biểu thị trên đồ thị tương ứng với các đỉnh.
GAPDH cũng được sử dụng để so sánh lượng mẫu sử dụng trong mỗi phản
ứng.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Để xác định mức độ sao chép của HIP, sử dụng cặp mồi đặc hiệu với
HIP chúng tôi tiến hành phản ứng RT-PCR bán định lượng trên những mẫu
RNA tổng số tách từ mẫu ung thư và mẫu lành tính. Sau khi được điện di
trên agarose 2%, sản phẩm PCR nhận được có kích thước phân tử 444 bp
(hình 1a). Quan sát chúng ta thấy đậm độ vạch PCR ở những mẫu ung thư rõ
hơn so với những mẫu lành tính, kết quả gợi ý rằng HIP tăng cường sao chép
ở những mô ung thư trong khi đó sao chép rất thấp ở những mô lành tính.

a.
1 2 3 4 5 6
7

HIP




GAPDH


1 2 3 4 5
6 7

b.

Hình 1: Kết quả của phản ứng RT-PCR của HIP và GAPDH ở mô
ung thư và mô lành tính (a). Sản phẩm được khuyếch đại từ cDNA của mô
ung thư (1-5) và mô lành tính (6-7). Kết quả định lượng của HIP/GAPDH
tương ứng với hình a đã được tính và vẽ đồ thị (b).

Nhận xét: Sản phẩm PCR đặc hiệu của gen GAPDH trên những mẫu
ung thư và những mẫu lành tính tương ứng có kích thước 350 bp (hình 1a).
GAPDH là một gen thể hiện trên mọi tế bào, không phụ thuộc vào thể loại,
trạng thái hoạt động hay nguồn gốc nên được dùng như một gen nội chuẩn.
Kết quả của phản ứng khuếch đại GAPDH chỉ ra rằng cả 7 bệnh nhân nghiên
cứu đều có chất lượng mRNA tốt đảm bảo tiêu chuẩn cho phản ứng, đồng
thời không có sự khác biệt về lượng mẫu đã sử dụng trong mỗi phản ứng PCR.
Kết quả vẽ đồ thị của tỉ lệ HIP/GAPDH ở hình 1b cho thấy HIP được tăng
cường sao chép rất rõ ở những mô ung thư trong khi đó phát hiện được rất thấp
trên những mẫu lành tính. Điều này khẳng định rõ sự khác biệt về mức độ biểu
hiện của HIP ở mô ung thư so với mô lành tính.
GAPDH
M
M

G
M
M

G
M
M

G
M

M

G
M
M

G
M
M

G
M
M

G
1
2
3
4
5
6
7
HIP
M
M

H
M
M
H

M
i
3**
***
***
***
***
***
***
***
***
***
***
***
***


Hình 2: Hình ảnh của phản ứng RT-PCR định lượng. Kết quả PCR
định lượng của HIP tương ứng với đỉnh H ở mô ung thư và mô lành tính
(bên trái). Kết quả PCR của gen GAPDH tương ứng với đỉnh G (bên phải).
Đỉnh M tương ứng với marker 15 và 1500 bp. Sản phẩm được khuyếch đại
từ cDNA của mô ung thư (1-5) và mô lành tính (6-7)
Nhận xét: Kết quả PCR định lượng đánh giá mức độ sao chép của
HIP sử dụng hệ thống điện di cappilary (hình 2) chỉ rõ: đỉnh H (bên trái)
tương ứng với mức độ mức độ biểu hiện của HIP ở những mẫu ung thư (1-5)
cao hơn rõ ràng so với những mẫu lành tính (6-7) trong khi đó đỉnh G (bên
phải) tương ứng với mức độ biểu hiện của gen GAPDH không thấy có sự
khác biệt, điều này chứng tỏ không có sự khác biệt về lượng mẫu sử dụng
trong mỗi phản ứng. Kết quả này một lần nữa khẳng định HIP được tăng
cường sao chép rất rõ ở những mô ung thư.

BÀN LUẬN
Việc nghiên cứu tìm hiểu những gen tăng cường tổng hợp ở mô ung
thư sẽ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế phân tử của bệnh, từ đó cho phép chúng ta
tìm ra những marker có giá trị để chẩn đoán xác định và mức độ tiến triển
của mô ung thư. HIP là một protein bề mặt tế bào được phát hiện lần đầu
tiên ở dòng tế bào biểu mô thận người và được tổng hợp rất nhiều ở các
dòng tế bào nội mạc và tế bào biểu mô trưởng thành. HIP gắn trực tiếp vào
Heparin, một loại protein có khả năng tương tác với nhiều loại protein khác
nhau vì vậy HIP tham gia vào quá trình liên kết tế bào – tế bào, tế bào –
khoảng gian bào. Rohde và cộng sự đã chứng minh rằng HIP giúp cho
những tế bào trophoblast gắn vào biểu mô thận và tăng cường quá trình xâm
lấn tế bào. Một vài nghiên cứu trong và ngoài nước gần đây đã chứng minh
rằng HIP được tăng cường tổng hợp ở các dòng tế bào và mô ung thư ở cả
mức độ RNA thông tin và protein
(1,4,5,7)
. Sự tăng cường tổng hợp của HIP ở
những mô ung thư sẽ thúc đẩy sự tương tác tế bào-tế bào, tế bào-ngoại bào
đồng thời nó có thể đóng vai trò quan trọng cho sự phát triển, khư trú và
xâm lấn của khối u.
Trong nghiên cứu này chúng tôi đã dùng phương pháp RT-PCR bán
định lượng và định lượng để xác định mức độ biểu hiện của gen HIP ở mô
ung thư so sánh với mô lành tính. Đây là những kỹ thuật đơn giản, chính xác
và cho độ tin cậy tương đối cao. Cả 2 phương pháp này đều cho kết quả
tương tự như nhau: HIP được tăng cường tổng hợp rất rõ ở những mô ung
thư trong khi đó phát hiện được rất thấp ở mô lành tính. Điều này giúp cho
chúng tôi có những định hướng tiếp theo và có thể ứng dụng những phương
pháp này như một công cụ hữu ích không chỉ trong việc đánh giá mức độ
biểu hiện của HIP ở những mô ung thư mà trong cả việc nghiên cứu tìm hiểu
đánh giá mức độ biểu hiên của những marker khác trong chẩn đoán bệnh
ung thư.

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với các nghiên cứu của các
tác giả nước ngoài cho thấy mức độ sao chép mRNA của HIP được tăng
cường ở dòng tế bào và mô ung thư trong khi đó không biểu hiện hoặc biểu
hiện rất thấp ở mô lành tính. Sự tăng cường tổng hợp của HIP ở những mô
ung thư cho phép chúng ta kết luận rằng, HIP có mối liên hệ chặt chẽ với sự
phát triển mô ung thư và có thể dùng HIP như một marker có giá trị góp
phần chẩn đoán bệnh ung thư.
KẾT LUẬN
Từ những kết quả nghiên cứu trên cho phép chúng tôi rút ra một số
kết luận sau:
- Mức độ biểu hiện của HIP giữa mô ung thư và mô lành tính khác
biệt nhau một cách rõ rệt.
- Cả 2 phương pháp PCR bán định lượng và định lượng đều cho kết
quả tương tự nhau với độ tin cậy cao. Chúng ta có thể dùng một trong hai
phương pháp này để đánh giá mức độ sao chép của HIP và một số marker
khác trong chẩn đoán xác định bệnh ung thư.