CHƯƠNG III. CÔNG NGHỆ PHÔI VÔ TÍNH – HẠT NHÂN TẠO pps

Công nghệ sinh học thực vật Chương 3. Công nghệ phôi vô tính – Hạt nhân tạo


22 
CHƯƠNG III. CƠNG NGHỆ PHƠI VƠ TÍNH – HẠT NHÂN TẠO

Một vấn đề trong việc sử dụng phương pháp ni cấy mơ để tạo nên cây
con mới nhằm thay thế phương pháp nhân giống bằng hạt là phải tính đến việc
giảm nhân cơng lao động để từ đó giảm giá thành cây ni cấy mơ. Một trong
những giai đoạn tốn nhiều sức lao động nhất là giai đoạn chuyển cây ni cấy mơ
sang điều kiện ex vitro. Phơi vơ tính có một ưu thế rất đặc biệt so với các thể nhân
giống in vitro khác là nó sở hữu một hệ thống vận chuyển tương tự như hạt ngồi
tự nhiên. Nhờ đó mà phơi vơ tính được nghiên cứu rất nhiều và được sử dụng để
làm vật liệu để sản xuất hạt nhân tạo, đây là một phương pháp thu được nhiều lợi
nhuận dựa trên khả năng nhân giống cây trồng thơng qua sự phát triển phơi sinh
dưỡng.
1. Phơi vơ tính
Hạt là cơ quan bảo quản chất mầm và nhân giống ở tất cả thực vật có hoa.
Hạt có chứa phơi phát triển từ hợp tử sau khi sự thụ tinh giữa một tế bào trứng với
một giao tử đực diễn ra. Sự tái tổ hợp gene trong suốt q trình hình thành cũng
như sự kết hợp giữa hai giao tử đóng vai trò quan trọng trong sự tiến hố của thực
vật hạt kín. Trong suốt q trình tiến hóa, nhiều lồi thực vật đã phát triển nên
những cách nhân giống mới để vượt qua các trở ngại gây ra bởi yếu tố mơi trường,
gene, yếu tố vật lý làm ngăn cản q trình ra hoa, tạo hạt. Các cách nhân giống
mới này bao gồm sự tạo thành những cấu trúc như thân củ, thân rễ, củ, thân bò,
Một hình thức tiến bộ khác xuất hiện ở những lồi có khả năng sinh sản vơ tính đó
là tạo phơi từ giao tử khơng được thụ tinh hoặc từ các tế bào sinh dưỡng. Cũng
giống như phơi hợp tử, các phơi vơ tính này phát triển trong hạt, được bảo vệ và
phân tán đi như các hạt tự nhiên. Sinh sản vơ tính được coi như là khơng chịu
kiểm sốt bởi gene, nhưng các điều kiện mơi trường về nhiệt độ, quang kỳ cũng
thúc đẩy sự phát triển từ hữu tính sang vơ tính.

Sự tạo phơi vơ tính bất định xuất hiện ở một số lồi thực vật hạt kín trong
tự nhiên hay trong các thí nghiệm được tiến hành bằng phương pháp ni cấy mơ
và tế bào thực vật in vitro. Q trình hình thành phơi vơ tính này được mơ tả bằng
thuật ngữ “somatic embryogenesis”. Những mơ tả đầu tiên về sự hình thành phơi
vơ tính trong ni cấy tế bào được đưa ra khi ni cấy tế bào cà rốt. Kể từ đó thì
hiện tượng này được nghiên cứu thành cơng trên nhiều đối tượng một lá mầm
thuộc các họ: Alliaceae, Araceae, Asparagaceae, Dioscoreaceae, Gramineae,
Henerocallidaeae, Iridaceae, Liliaceae, Musaceae, Orchidaeae, Zingiberaceae.
Công nghệ sinh học thực vật Chương 3. Công nghệ phôi vô tính – Hạt nhân tạo


23 
1.1. Khái niệm về phơi vơ tính
Phơi vơ tính, phơi soma, phơi sinh dưỡng hay phơi thể hệ đều là khái niệm
để mơ tả một cấu trúc lưỡng cực bất định bao gồm cực chồi và cực rễ, mà dưới
những điều kiện thích hợp thì có thể phát triển thành một cơ thể có chức năng
hồn chỉnh. Sự hình thành phơi vơ tính được xem như là một con đường phát triển
riêng biệt, khác hẳn với con đường phát sinh cơ quan chồi và rễ. Trong đó, một tế
bào sẽ phát triển thành một cấu trúc có mơ phân sinh chồi và rễ đầy đủ và khơng
có kết nối với hệ thống mao mạch của mơ mẹ ban đầu. Sự tạo phơi vơ tính là một
q trình ngun vẹn và vì vậy sự phát sinh chồi chỉ là một biến đổi của q trình
cảm ứng và phát triển của phơi. Với quan niệm như trên thì sự tạo phơi có thể
được coi như là kết quả của một chuỗi các sự kiện phát sinh cơ quan cạnh tranh
nhau.
Khơng như những cơ thể sinh vật khác, ở thực vật, tính tồn thế của tế bào
khơng chỉ có ở các tế bào của phơi hợp tử mà các tế bào sinh dưỡng cũng có mang
tính tồn thế. Sự linh hoạt của chương trình biệt hóa giúp cho các tế bào đã biệt
hóa hồn tồn vẫn có thể trở về giai đoạn sinh phơi dưới những điều kiện nhất
định. Sự lặp lại tồn bộ chương trình phát sinh cơ thể thơng qua việc khởi đầu sự
tạo phơi đòi hỏi sự tái thiết lập biểu hiện của những gene cần thiết. Sau khi đã

hồn tồn thốt khỏi chức năng trước đó của các tế bào đã biệt hóa, các tế bào sinh
dưỡng mang tính tồn thế dưới tác động cảm ứng phân chia của tế bào sẽ có trạng
thái biến dưỡng tương tự như phơi hợp tử.
Phơi vơ tính có thể được hình thành từ một tế bào đơn hay từ cả một cụm tế
bào. Thơng qua một q trình phân chia có thứ tự, ở phơi sẽ diễn ra sự biệt hố,
trưởng thành và phát triển thành cây con. Cây có thể phát triển từ một hay từ một
cụm tế bào phơi.
Sự sinh phơi từ một tế bào sinh dưỡng được định nghĩa là một q trình mà
trong đó một hay vài tế bào sinh dưỡng, trong các điều kiện thực nghiệm (bao gồm
việc sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật), có thể tham gia vào một q
trình phân chia theo một trật tự nhất định để tạo thành một phơi, theo kiểu giống
hay gần giống như kiểu sinh phơi từ hợp tử.
Giống như các tế bào của mơ phân sinh, các tế bào có khả năng sinh phơi
có các đặc tính cơ bản như sau: tế bào có kích thước nhỏ, đẳng kính, có hoạt động
biến dưỡng rất mạnh mẽ, cường độ tổng hợp acid ribonucleic cao, thể tích khơng
bào giảm, tăng thể tích tế bào chất, nhân và hạch nhân rất to và đậm màu, đặc biệt
là các tế bào này có một số lượng lớn các ribosome, ty thể, hạt tinh bột và có mạng
Công nghệ sinh học thực vật Chương 3. Công nghệ phôi vô tính – Hạt nhân tạo


24 
lưới nội chất nhỏ. Các tế bào có khả năng sinh phơi được phân biệt rõ ràng với các
tế bào khơng có khả năng sinh phơi dựa trên những đặc tính trên.
Phơi vơ tính được hình thành sau khi được cảm ứng sẽ trải qua những giai
đoạn phát triển tương tự như phơi hợp tử. Đối với phơi của thực vật hai lá mầm thì
sau giai đoạn tiền phơi sẽ là giai đoạn phơi hình cầu, hình tim, hình thủy lơi và giai
đoạn 2 lá mầm tương tự như ở phơi hữu tính (Hình 3.1). Phơi của thực vật một lá
mầm sẽ trải qua giai đoạn hình cầu (hình trứng hay hình chùy), bao lá mầm và lá
mầm (một lá mầm hay thuẫn). Q trình hình thành cơ quan tính từ khi phơi hình
cầu phát triển sang giai đoạn lá mầm được gọi là sự biệt hóa mơ. Sự tạo cơ quan

phơi một lá mầm về căn bản giống ở cây hai lá mầm trừ vài khác biệt về số tử diệp
hay tính đối xứng của phơi.



Hình 3.1. Các biến đổi hình thái hợp tử cây Capsella bursa-pasturis

Phơi vơ tính rất giống phơi hữu tính ở hình thái và sinh lý nhưng khơng có
q trình tái tổ hợp di truyền do phơi vơ tính khơng phải là sản phẩm của sự thụ
tinh giữa giao tử đực và giao tử cái. Về ngun tắc, tất cả những cây con được tái
sinh bằng con đường này đều có vật chất di truyền giống hệt các tế bào sinh dưỡng
cha mẹ, nếu tế bào này được chuyển gene thì các cây tái sinh là cây chuyển gene.
Nhân giống vơ tính thực vật qua con đường phát sinh phơi vơ tính cho hệ số nhân
rất cao. Tuy nhiên, sự phát triển bình thường của tất cả các phơi này là cả một vấn
đề. Các cơng ty hạt giống đang nghiên cứu q trình này để sản xuất hạt nhân tạo.
Công nghệ sinh học thực vật Chương 3. Công nghệ phôi vô tính – Hạt nhân tạo


25 
1.2. Một số khía cạnh giả định trong sự hình thành phơi vơ tính
Tất cả các tế bào sinh dưỡng của thực vật đều có chứa tồn bộ thơng tin di
truyền cần thiết cho việc hình thành nên một cơ thể thực vật hồn thiện với đầy đủ
các chức năng cần thiết. Trong suốt q trình phát triển, sự biểu hiện gene ở thực
vật được kiểm sốt chặt chẽ theo khơng gian và thời gian để cho phép sự biệt hóa
của rất nhiều cơ quan trong cơ thể. Sự cảm ứng hình thành phơi vơ tính phải làm
kết thúc sự biểu hiện của một gene trong mơ thực vật tại thời điểm đó, và thay thế
nó bằng chương trình biểu hiện của gene sinh phơi. Thuật ngữ IEDC (induced
embryogenic determined cell) nhằm mơ tả những tế bào có khả năng sinh phơi xuất
phát ban đầu là những tế bào khơng sinh phơi. Những tế bào của phơi hợp tử đã có
sẵn chương trình biểu hiện của các gene sinh phơi thì được gọi bằng thuật ngữ

PEDC (pre-embryogenic determined cell). Cả IEDC và PEDC đều có chức năng
tương tự nhau là nhằm mục đích tái sinh, và cả hai có thể được gọi chung bằng thuật
ngữ EDC – embryogenic determined cell, hay gọi đơn giản là EC – embryogenic
cell. Thuật ngữ EC được sử dụng nhiều hơn bởi vì sự hình thành phơi vơ tính khơng
phải là một hiện tượng chắc chắn sẽ xảy ra của các EC, do đó thuật ngữ EC cho thấy
là các tế bào sinh phơi này có tính mềm dẻo trong một số trường hợp.
Các thí nghiệm nhằm hình thành phơi vơ tính đều phụ thuộc vào việc mơ
cấy chứa các PEDC hoặc là EC. Nếu mơ cấy có các PEDC thì chỉ cần một sự kích
thích phân chia tế bào là đủ để hình thành phơi, và q trình này được gọi là sự
hình thành phơi vơ tính trực tiếp bởi vì phơi xuất hiện trực tiếp từ mơ cấy. Ngược
lại, nếu các mơ cấy là những tế bào đã phân hóa khơng còn khả năng sinh phơi thì
chúng cần phải trải qua nhiều lần phân chia tế bào liên tiếp dưới sự cảm ứng của
auxin trong suốt q trình để được tái lập trình đi vào con đường sinh phơi. Các tế
bào được sinh ra do nhiều lần phân chia ngun nhiễm được gọi là mơ sẹo, và q
trình này được gọi là sự hình thành phơi vơ tính gián tiếp vì phải thơng qua giai
đoạn tạo mơ sẹo. Sự chuyển vị từ các tế bào mơ sẹo sang trạng thái sinh phơi đi
kèm với những thay đổi trong sự sắp xếp của các vi ống từ định hướng ngẫu nhiên
để sắp xếp thành những hàng thẳng song song với nhau.
Trong thực tế, một mơ cấy có thể rơi vào nhiều trạng thái giữa trạng thái có
đặc tính sinh phơi và khơng sinh phơi, tùy thuộc vào độ tuổi sinh lý của mơ cấy
đó. Điều này có thể ảnh hưởng đến việc cảm ứng tạo phơi vơ tính. Từ đó có thể
giải thích được tại sao có sự khác biệt về khả năng tạo phơi của các loại mơ cấy
khác nhau. Ví dụ, mơ cấy cây đậu nành, cà chua, cây lanh chứa các tế bào già thì
tạo những phơi bất bình thường hơn những tế bào còn non. Khi các phơi hợp tử
Công nghệ sinh học thực vật Chương 3. Công nghệ phôi vô tính – Hạt nhân tạo


26 
đậu nành đạt đến giai đoạn khi mà mọi sự phân chia tế bào đều kết thúc thì khơng
thể nào cảm ứng sự hình thành phơi vơ tính nữa.

Hình 3.2. Vai trò tuổi sinh lý của mẫu cấy trong việc khởi phát
sự sinh phơi vơ tính
Mẫu cấy bao gồm các tế bào có thể rơi vào các trạng thái giữa trạng thái có
khả năng sinh phơi (PEDC) và khơng có khả năng sinh phơi (non-EC). (A) Phơi
hợp tử còn non có nhiều khả năng sinh phơi nhất và sẽ đáp ứng các xử lý cytokinin
để hình thành phơi vơ tính. (B) Phơi hợp tử trưởng thành hơn sẽ khơng còn khả
năng đáp ứng cytokinin riêng lẽ nữa mà đòi hỏi một nhân tố auxin để tạo phơi vơ
tính. (C) Ở những lồi thực vật và mơ cấy mà có thể đảo ngược từ trạng thái khơng
sinh phơi sang có khả năng sinh phơi sẽ hình thành phơi vơ tính thơng qua giai
đoạn mơ sẹo khi được xử lý kết hợp auxin và cytokinin. Những mơ cấy này bao
gồm các tế bào cần được cảm ứng để có khả năng sinh phơi (IEDC).
1.3. Nguồn gốc của phơi vơ tính
Một chủ đề có liên quan khác đó là phơi vơ tính có nguồn gốc từ một tế bào
hay nhiều tế bào. Một giả thuyết cho rằng mơ PEDC thì sẽ tạo thành phơi có
nguồn gốc từ nhiều tế bào, trong khi phơi vơ tính thứ cấp (phơi vơ tính có nguồn
gốc từ phơi vơ tính khác) có khuynh hướng là từ tế bào đơn.
Công nghệ sinh học thực vật Chương 3. Công nghệ phôi vô tính – Hạt nhân tạo


27 
Quan điểm khác thì cho rằng các hệ thống tạo phơi vơ tính khơng thơng qua
giai đoạn mơ sẹo thì phơi vơ tính sinh ra có nguồn gốc từ một tế bào. Những hệ
thống khác, đặc biệt là hệ thống đòi hỏi phải thơng qua giai đoạn tạo mơ sẹo trong
ni cấy lỏng, huyền phù tế bào thì nguồn gốc một tế bào của phơi vơ tính khơng
chắc chắn lắm và vẫn còn gây nhiều tranh cãi. Tuy nhiên, khơng thể biết chính xác
rằng các tế bào nằm trong khối sinh phơi này là những tế bào đã được quyết định
sinh phơi hay khơng. Hơn nữa, trong hệ thống ni cấy lỏng, chính điều kiện vật lý
đã làm thay đổi hình dạng của các phơi vơ tính, ngăn chặn sự hình thành một khối
tiền phơi có thể nhìn thấy được từ một tế bào đơn.

Một tế bào đã cơ lập thì gần giống với phơi hợp tử, có nghĩa là nó được giải
phóng khỏi tế bào bên cạnh cũng như các chất tiết của tế bào bên cạnh và do vậy
phát triển thành phơi giống như một hợp tử. Giả thuyết này nghe có vẻ hợp lý và
thuyết phục nhưng vẫn chưa được ủng hộ bởi những nghiên cứu mà trong đó phơi
vơ tính xuất hiện trên bề mặt hoặc sâu bên trong các mơ ni cấy và mơ sẹo có tổ
chức bằng sự biến đổi của các tế bào có liên kết hữu cơ với những tế bào trung
gian bên cạnh.
Khi một tế bào đã được quyết định để trở nên sinh phơi thì khơng phải tất cả
các tế bào có khả năng sinh phơi đó đều phát triển thành phơi vơ tính. Trong hệ
thống biểu mơ của cây lúa, bằng cách xem xét những tương đồng trong cấu trúc của
các tế bào người ta thấy rằng nhiều tế bào có khả năng tạo phơi. Tuy nhiên, chỉ một
vài phơi vơ tính xuất hiện. Tương tự như vậy, ở cà rốt chỉ có một hoặc vài phơi vơ
tính được tạo thành từ một khối tiền phơi. Người ta cho rằng có một sự cạnh tranh
giữa các tế bào này vì vậy chỉ có những tế bào nào chiếm ưu thế hơn thì mới tạo nên
phơi vơ tính. Ở các hệ thống ni cấy khác nhau thì một tế bào tạo nên một phơi vơ
tính có thể bằng cách trực tiếp hoặc gián tiếp thơng qua vài chu kỳ phân chia, tuy
nhiên điều kiện ni cấy, sự tương tác với các tế bào bên cạnh có thể làm ảnh hưởng
đến sự phát triển của chúng sau này.
1.4. Đặc điểm của thực vật tái sinh từ con đường hình thành phơi vơ tính
Mặc dù rõ ràng là hệ thống tạo phơi có khả năng sản xuất ra một số lượng
đáng kể các thể nhân giống ở vài lồi thực vật có giá trị thương mại quan trọng,
nhưng cơng việc kiểm tra sự biểu hiện của cây từ phơi vơ tính ex vitro vẫn còn cần
được tìm hiểu kỹ. Về ngun tắc thì phơi vơ tính khơng giống như phơi hữu tính là
nó khơng trải qua q trình trao đổi chéo và tái tổ hợp của DNA, do đó phơi vơ
tính tiêu biểu cho một hệ thống nhân giống vơ tính mà trong đó cây con được tạo
thành vẫn duy trì các đặc tính của cây mẹ. Nếu có sinh ra đột biến thì đó là đột
Công nghệ sinh học thực vật Chương 3. Công nghệ phôi vô tính – Hạt nhân tạo


28 

biến sinh ra trong q trình ni cấy in vitro. Tuy nhiên, tần số đột biến ở sự tạo
phơi vơ tính thấp hơn là từ hệ thống tái sinh cây từ mơ sẹo, vì phơi vơ tính phát
triển nhanh để tạo thành cá thể hồn chỉnh nên đặc tính chống chịu với đột biến và
những biến đổi cá thể thấp hơn ở sự ni cấy cơ quan. Điều này rất quan trọng
trong nhân giống cây trồng vì phải duy trì tính đồng nhất của các cây nhân giống.
Trong phân tích các cây con tái sinh từ phơi vơ tính người ta nhận thấy các
cây này có sức sống cao, dễ sống khi chuyển ra mơi trường đất và sinh trưởng,
phát triển tốt nhờ nó có các trục rễ và chồi mạnh. Có lẽ một trong những đặc điểm
quan trọng của cây từ phơi là nó khơng xuất hiện những bất thường về hình thái
trong tự nhiên và khơng có những thay đổi nào về di truyền và tế bào. Điều này có
thể là do nguồn gốc một tế bào của phơi và do sự chọn lọc tế bào nghiêm ngặt trong
suốt q trình phát triển thành phơi.
1.5. Ứng dụng của q trình tạo phơi vơ tính
Q trình hình thành phơi vơ tính đã mang lại nhiều ứng dụng thực tiễn và
có tính thương mại to lớn, đặc biệt trong vi nhân giống in vitro. Trên lý thuyết, từ
một mẫu mơ được ni cấy có thể sản xuất ra vơ số tế bào phơi. Tốc độ nhân
giống từ phơi cao hơn nhiều so với việc nhân giống từ mơ phân sinh. Đây chính là
một ưu thế của nhân giống từ phơi so với các phương pháp nhân giống in vitro
khác. Ngồi ra, số lượng lớn của phơi chính là một nguồn ngun liệu đáng kể
phục vụ cho những ứng dụng thực tiễn quan trọng khác như sản xuất hạt nhân tạo,
cải thiện chất lượng cây trồng (là ngun liệu cho chọn lọc tế bào, biến nạp gene,
lai soma, tạo những cây đa bội), bảo quản chất mầm, loại trừ virus, sản xuất các
chất biến dưỡng in vitro và sự thành lập khuẩn căn in vitro.
1.5.1. Sự chọn lọc tế bào
Sự chọn lọc tế bào là việc tái sinh thực vật từ các quần thể tế bào kết hợp
với việc chọn lọc những đặc tính mong muốn của gene. Việc cần thiết nhất là phải
sử dụng những hệ thống tái sinh thực vật có khả năng tái tạo nên một cây mới từ tế
bào đơn nhằm tránh sự xuất hiện các biến dị trên gene. Q trình hình thành phơi
vơ tính cho phép tái tạo nên những cây hồn chỉnh từ các tế bào đơn, từ đó ứng
dụng trong các chương trình chọn lọc tế bào.

Các quần thể tế bào dùng trong chọn lọc tế bào có thể được gây đột biến
một cách nhân tạo, tuy nhiên khơng cần phải tốn thời gian và tiền bạc để gây đột
biến các tế bào trong ni cấy in vitro bởi vì bản thân chúng trong q trình ni
cấy cũng đã xuất hiện những biến đổi phân dòng soma. Thực vật có nguồn gốc từ
Công nghệ sinh học thực vật Chương 3. Công nghệ phôi vô tính – Hạt nhân tạo


29 
ni cấy in vitro có thể mang những biến đổi về kiểu hình và thường là di truyền
được. Những biến đổi này gọi là biến dị soma và các cây có nguồn gốc từ phơi vơ
tính cũng xuất hiện những biến dị trên.
Biến đổi soma là một vấn đề nghiêm trọng trong nhân giống vơ tính, tuy
nhiên nó lại có giá trị trong các chương trình chọn lọc tế bào. Các biến đổi soma
có thể tạo ra những đặc tính quan trọng trong nơng nghiệp chẳng hạn như làm tăng
khả năng chịu mặn, hay trở nên kháng được thuốc diệt cỏ, kháng bệnh, chịu phèn
hay chịu hạn, hoặc có thể xuất hiện những đột biến sinh hóa thú vị khác. Ví dụ như
sự chọn lọc tế bào và tái sinh cây thơng qua phơi vơ tính đã được ứng dụng để tăng
tính chịu mặn và kháng bệnh ở cây Citrus, kháng virus ở cây mía, kháng phytotoxin
ở cây cà phê.
5.1.2. Sự tái sinh các thực vật chuyển gene
Có nhiều cách để tái sinh cây sau khi đã được chuyển gene bằng con đường
phơi vơ tính:
 Biến nạp vào mẫu cấy và sau đó cho tái sinh thơng qua tạo phơi vơ tính trực
tiếp.
 Biến nạp vào mẫu cấy và sau đó cho tái sinh thơng qua tạo phơi vơ tính gián tiếp.
 Biến nạp vào tế bào có khả năng sinh phơi và sau đó tái sinh bằng con
đường sinh phơi gián tiếp.
 Biến nạp vào phơi vơ tính và tái sinh thơng qua con đường sinh phơi thứ
cấp hoặc sinh phơi gián tiếp.
 Biến nạp vào trong phơi vơ tính, tăng sinh thơng qua con đường hình thành

phơi thứ cấp và sau đó tái sinh thơng qua con đường hình thành cơ quan.
5.1.3. Sự tạo các dòng đồng hợp tử và đa bội
Q trình hình thành phơi vơ tính cũng có thể làm xuất hiện những cây tái
sinh đa bội. Xử lý colchicine hoặc amiprophos-methyl làm ngăn chặn sự hình
thành vi ống trong mơi trường ni cấy phơi vơ tính sẽ thúc đẩy sự hình thành các
phơi đa bội. Những thực vật tam bội cũng có thể được tái sinh nếu phơi vơ tính
được hình thành có nguồn gốc từ nội nhũ.
Hoặc cũng có thể tạo được những cây đơn bội khi ni cấy các mẫu cấy
đơn bội như hạt phấn, bào tử thơng qua con đường hình thành phơi vơ tính. Sự kết
hợp của sự tạo cây đơn bội và các kỹ thuật nhân đơi bộ nhiễm sắc thể cũng giúp
tạo nên các cây đồng hợp tử ở thế hệ đầu tiên.

Công nghệ sinh học thực vật Chương 3. Công nghệ phôi vô tính – Hạt nhân tạo


30 
1.5.4. Sự loại trừ virus
Phơi vơ tính có một hệ mao mạch rất phát triển, tuy nhiên hệ thống này
khơng nối liền với hệ mạch dẫn của mơ cấy. Điều này có nghĩa là việc tạo phơi vơ
tính cũng có thể giúp để tạo được các dòng cây sạch bệnh virus, có thể kết hợp với
biện pháp sốc nhiệt để đạt được kết quả tốt hơn.
Các loại virus GFLV (Grapevine Fan Leaf Virus) và A-2 và 3-GLR
(Grapevine Leafroll associated virus) đã được loại trừ bằng cách sử dụng phương
pháp tạo phơi vơ tính kết hợp với các liệu pháp nhiệt. Mơ sẹo hình thành từ bao
phấn và bầu nỗn của những cây bị nhiễm GFLV và các loại virus GLR khác. Các
mơ sẹo này được sốc nhiệt (35
o
C) và phơi vơ tính được tạo ra sau đó đã nảy mầm
và phát triển thành cây. Các cây tái sinh này được kiểm tra bằng phương pháp
miễn dịch học và các kiểm nghiệm huyết thanh học. Kết quả sau đó cho thấy sự

hình thành phơi vơ tính kết hợp với sốc nhiệt là một q trình hiệu quả nhằm loại
trừ các bệnh virus.
Phương pháp này cũng được áp dụng thành cơng ở cây Citrus. Vòi nhụy
của cây chanh thuộc các giống khác nhau đã bị nhiễm các bệnh virus có khả năng
sinh phơi vơ tính. Cây tái sinh từ phơi vơ tính này cho kết quả âm tính khi thử
nghiệm sự hiện diện của virus và viroid.
1.5.5. Sự thành lập khuẩn căn
Việc kết hợp giữa sự hình thành phơi vơ tính và sự hình thành khuẩn căn in
vitro được đưa ra đầu tiên do Redenbaugh và cộng sự vào năm 1987. Các ứng
dụng của nó rất hấp dẫn nhưng đến nay vẫn có rất ít các cơng trình nghiên cứu về
điều này. Các nghiên cứu cho thấy việc ủ các nấm khuẩn căn ngồi vào mơi
trường đã thúc đẩy sự phát triển của cây con có nguồn gốc từ phơi vơ tính.
2. Cơng nghệ hạt nhân tạo
Giống như phơi từ hạt, phơi vơ tính có mang sẵn các mơ rễ và chồi, nghĩa là
đã được thiết lập sẵn một chương trình để phát triển thành cây hồn thiện. Bên
cạnh đó, phơi vơ tính khơng như chồi bất định là vì nó khơng có hệ thống mao
mạch nối liền với nguồn mơ ban đầu. Vì tất cả lý do trên mà phơi vơ tính khơng
như bất kỳ thể nhân giống thực vật nào khác là nó khơng cần giai đoạn kéo giãn
chồi, cắt chồi và giai đoạn ra rễ trước khi chuyển sang mơi trường đất trồng tự
nhiên. Tuy vậy, phơi vơ tính cũng có những khác biệt so với phơi hữu tính: (1)
khơng được phát triển bên trong một vỏ bọc hạt, (2) khơng phải trải qua q trình
làm khơ nhờ nguồn mơ mẫu ban đầu, và (3) khơng được trang bị một hệ thống
Công nghệ sinh học thực vật Chương 3. Công nghệ phôi vô tính – Hạt nhân tạo


31 
chất dự trữ, nghĩa là khơng được cung cấp năng lượng cần thiết và các nhân tố cần
thiết khác cho đến khi nó có thể bắt đầu thực hiện quang hợp. Do vậy, các nghiên
cứu về vấn đề tạo hạt nhân tạo nhờ phơi vơ tính đã tập trung chủ yếu vào việc thiết
kế ra các phương pháp tạo vỏ bao, thực hiện các xử lý làm khơ và cải thiện chất

lượng phơi.
Mặc dù quan niệm về việc tạo các hạt tổng hợp bằng cách bao bọc phơi vơ
tính được Murashige giới thiệu đầu tiên vào năm 1977, nhưng mãi cho đến vài
năm sau đó mới có thí nghiệm đầu tiên được thực hiện, và cho đến năm 1986 thì
Redenbaugh và cộng sự mới tóm lại về tất cả các nhân tố cần thiết để tạo nên một
vỏ bọc hiệu quả nhất. Ngun liệu để tạo vỏ bao cần phải có độ bền đủ cao để vừa
bảo vệ phơi trong suốt q trình vận chuyển và gieo vào đất và vừa cho phép phơi
nảy mầm tốt được. Ngồi ra, khả năng tái sinh một số lồi thực vật từ phơi vơ tính
và sự thích hợp khí hậu sau đó của cây là một trong những yếu tố khó khăn nhất
nhằm đạt đến thành cơng trong việc tạo hạt này.
2.1. Khái niệm về hạt nhân tạo
Hạt tổng hợp hay hạt nhân tạo là một thuật ngữ được dùng để chỉ phơi vơ
tính hay những thể nhân giống khác được bọc bởi một lớp gel, giúp cho việc bảo
quản trong thời gian dài và vận chuyển trở nên dễ dàng hơn. Cơng nghệ hạt nhân
tạo sử dụng phơi vơ tính cho thấy có tầm quan trọng đối với những thực vật: 1)
khơng tạo được hạt, 2) hạt được tạo thành với một số lượng thấp, 3) khả năng hạt
sống sót rất thấp, 4) việc nhân giống thực vật khó khăn, và chất mầm khơng thể
bảo quản được.
Tuy nhiên, để có thể thương mại hóa hạt nhân tạo thì trước tiên đòi hỏi q
trình tạo phơi vơ tính trên các đối tượng thực vật đó phải cho ra những phơi phát
triển bình thường, có kiểu hình đồng nhất.
2.2. Các nhân tố cần thiết trong tổng hợp hạt nhân tạo
2.2.1. Các nguồn mẫu sử dụng làm hạt nhân tạo
Phơi vơ tính:
Q trình tổng hợp hạt nhân tạo từ phơi vơ tính là một cơng việc được thực
hiện qua nhiều bước. Để việc tổng hợp hạt thành cơng thì đòi hỏi một u cầu cơ
bản đó là phải có một số lượng lớn các phơi vơ tính có chất lượng cao, có sức sống
tốt, và các phơi này phải phát triển đồng bộ. u cầu về một chất lượng tốt tồn
diện của các phơi vơ tính là yếu tố quan trọng hơn cả để đạt được tần suất biến đổi
từ phơi đến cây con cao. Sử dụng phơi vơ tính ở giai đoạn hình tim muộn và hình

Công nghệ sinh học thực vật Chương 3. Công nghệ phôi vô tính – Hạt nhân tạo


32 
thủy lơi làm hạt nhân tạo cho tỷ lệ nảy mầm cao đến 100%. Một số hạn chế đáng
kể khi sử dụng phơi vơ tính làm vật liệu để tạo hạt nhân tạo là:
 Sự phát sinh phơi trong ni cấy tế bào có tính lặp lại cao và phơi vơ tính
có thể tạo ra những phơi phụ nhỏ hơn nằm dọc theo trục phơi. Những phơi phụ này
thỉnh thoảng mới có vị trí xác định, ví dụ như tại chỗ nối giữa rễ và trụ dưới lá
mầm hay tại phần gốc của rễ. Trong những trường hợp khác, các phơi phụ và phơi
thứ cấp có thể xuất hiện trên suốt trục phơi. Đây là một trong những ngun nhân
chính dẫn đến sự thiếu tính đồng bộ trong quần thể phơi vơ tính.
 Bên cạnh những đơn phơi thì các dạng song phơi, tam phơi hay các cụm đa
phơi cũng được tìm thấy. Các cụm phơi này sản sinh ra nhiều chồi khi cây con
hình thành.
 Sự phát triển của lá mầm có thể bị ảnh hưởng cả về số lượng lẫn hình thái.
Có thể có một, hai, ba hoặc nhiều lá mầm trên một trục đơn. Chúng có thể phát
triển rất kém hoặc có thể bị dính lại với nhau từng phần hay tồn bộ.
 Các chồi ngọn có thể bị ảnh hưởng. Mặc dù phơi có thể có hình thái bên
ngồi bình thường nhưng nó lại khơng sản xuất được chồi có đủ lá và than giống
như các chồi được tạo ra từ phơi hữu tính khi hạt nảy mầm.
 Khi phơi vơ tính trưởng thành, nó có thể biến đổi trực tiếp thành cây con
mà vẫn khơng ngừng tăng trưởng và cũng khơng cần sự trưởng thành của hạt.
Trong nhiều trường hợp, điều này xảy ra rất sớm (được gọi là sự nảy mầm sớm)
với các kết quả tương tự được tìm thấy khi các phơi hợp tử còn non được sử dụng
để ni cấy, và kết quả thường là tạo ra các cây dị dạng hay khơng phát triển.
Protocorm-like body:
Protocorm là một cơ quan dự trữ nhỏ được hình thành từ phơi đang nảy mầm.
Hạt chứa phơi rất nhỏ bao gồm một số tế bào tương đối ít và phơi này thường mang
một chồi tận cùng, một vòng bao ngồi có dạng củ rễ. Sau đó phơi sẽ phát triển thành

protocorm.
Protocorm-like body (PLB) là một cấu trúc đặc biệt tương ứng với giai đoạn
chuyển tiếp và sự phát triển mạnh mẽ của phơi thành cây con. Nói cách khác, PLB là
thuật ngữ để chỉ những cấu trúc giống với protocorm và có nguồn gốc từ ni cấy in
vitro. Thuật ngữ này được đặt đầu tiên bởi Morel trong một bài báo tiếng Anh của
ơng về ni cấy chồi đỉnh.
Điểm sinh trưởng của PLB có cấu trúc chưa đầy đủ và dường như thiếu các
phần khởi đầu của lá trong một thời gian. Các tế bào bề mặt của PLB duy trì tiềm
Công nghệ sinh học thực vật Chương 3. Công nghệ phôi vô tính – Hạt nhân tạo


33 
năng của các tế bào phơi, từ đây chúng dễ dàng phát khởi tạo nhiều điểm sinh trưởng
bất định.
Như vậy, PLB là một cấu trúc sinh cơ quan. Trong một vài trường hợp, người
ta cũng có thể thu phơi từ PLB. Tuy nhiên, việc phát sinh phơi từ PLB là ngẫu nhiên.
2.2.2. Vật liệu làm vỏ bọc
Có rất nhiều tác nhân tạo gel được sử dụng làm vỏ bọc cho phơi. Đó có thể
là agar, alginate, polyco2133, carboxyl methyl cellulose, carrageenan, gelrite,
guargum, sodium pectate, tragacanth gum, dextran, xanthan gum,… Phương pháp
được sử dụng rộng rãi nhất để tạo vỏ bọc cho phơi đó là sử dụng chất nền sodium
alginate. Hợp chất này sẽ đơng lại thành gel khi được cho vào mơi trường có muối
kim loại hóa trị hai hay ba như đồng sulphate (CuSO
4
) hay calcium chloride
(CaCl
2
) nhờ vào những liên kết ion.
Alginate được sử dụng nhiều hơn cả do nó có những đặc tính rất thuận lợi
như tính dính vừa phải, khơng gây độc cho phơi vơ tính, có các đặc tính tương hợp

sinh học, khả năng tạo thành gel nhanh, rẻ tiền, để lâu được, độ cứng của gel vừa
phải để có thể vừa tạo thuận lợi cho sự hơ hấp của phơi và vừa bảo vệ được phơi
khỏi những tổn thương bên ngồi.
2.3. Ngun tắc và điều kiện khi tạo vỏ bọc bằng chất nền sodium alginate
Alginate, chất hữu cơ mạch thẳng, kỵ nước, muối của acid alginic, là một
polyuronic bao gồm -D-mannuronate (M) và mảnh bên C5 -L-guluronate (G).








Hình 3.3. Cơng thức cấu tạo của alginate
Ngun tắc chính trong q trình tạo vỏ bọc alginate đó là sodium alginate
chứa phơi sẽ tạo thành từng hạt nhỏ, tròn và cứng khi được nhỏ vào trong dung dịch
CaCl
2
nhờ vào sự trao đổi ion giữa ion Na
+
có trong hỗn hợp sodium alginate với
Ca
2+
có trong dung dịch CaCl
2
. Vỏ bọc cứng nhiều hay ít là phụ thuộc vào số lượng
ion Na
+
trao đổi với ion Ca

2+
. Do đó, nồng độ của hai tác nhân tạo gel là sodium
Công nghệ sinh học thực vật Chương 3. Công nghệ phôi vô tính – Hạt nhân tạo


34 
alginate và CaCl
2
cũng như thời gian cho việc tạo liên kết ion phải thật tối ưu để có
thể tạo thành vỏ bọc có một độ cứng thích hợp nhất.
Khơng như phơi hợp tử, phơi vơ tính thiếu lớp nội nhũ chứa chất dinh
dưỡng bên ngồi ni phơi, do đó bằng việc thêm những chất dinh dưỡng, chất
điều hòa sinh trưởng, carbohydrate vào chất nền gel sẽ tạo một nội nhũ nhân tạo
thích hợp tối đa cho tăng trưởng và sống sót của phơi. Ngồi ra nhằm tránh cho
phơi bị mất nước, hay các tổn thương cơ học, tăng sức đề kháng cho phơi người ta
có thể thêm chất kháng sinh, thuốc trừ nấm, trừ sâu, vi sinh vật (chẳng hạn như
rhizobia) vào chất nền gel.
Mặc dù việc tạo hạt nhân tạo từ cách bọc phơi vơ tính bằng sodium alginate
cho thấy có một số thành cơng nhất định trong việc tái sinh cây con nhưng vẫn còn
nhiều vấn đề khó khăn khi sử dụng vỏ bao alginate này chẳng hạn như chất dinh
dưỡng có thể bị mất đi khỏi vỏ bao, sự trao đổi khí kém. Đã có một số đề nghị cho
rằng việc thêm vào than hoạt tính sẽ giúp nâng cao khả năng sống sót và phát triển
của phơi vơ tính. Ngun nhân là do than hoạt tính tăng cường khả năng hơ hấp
của phơi, và nó giữ lại những chất dinh dưỡng trong vỏ bọc nhiều hơn, giải phóng
dinh dưỡng rất chậm để cung cấp dần cho q trình phát triển của phơi.