Nuôi cấy và dung hợp tế bào trần pptx

Công nghệ tế bào thực vật
Nuôi cấy và dung hợp tế bào trần

HÀ NỘI 03/2011
1
TRƯỜNG ĐẠI HỌC THÀNH TÂY
Khoa công nghệ nông – thực phẩm
Thảo luận
Nuôi cấy và dung hợp tế bào trần
Gv hướng dẫn : ths. BÙI VĂN THẮNG
Nhóm sinh viên thực hiện :
1. DƯƠNG TUẤN BẢO
2. NGUYỄN VĂN SINH
3. NGUYỄN ĐÌNH CÔNG
4. HÀ HUY HUÂN
5. QUẢN TRỌNG LÂN
6. LÊ VĂN LÂM
7. PHẠM CÔNG HÀ
8.PHẠM THẾ TÙNG
9.VŨ MẠNH TUẤN
10.TRẦN NGỌC THỊNH
2
Nội Dung
1. Phương pháp tách protoplast
2. Nuôi cấy protoplast
3. Phương pháp Dung hợp protoplast
4.Ứng dụng và các tồn tại của kỹ thuật protoplast
3
1.Phương pháp tách tế bào trần
1.1 nguyên tắc


Sử dụng hỗn hợp enzym:
xenlulolaza, emixelulolaza,
pectinlaza để phân giải
thành tế bào giải phóng các
tế bào trần

Tạo môi trường có áp suất
thẩm thấu thích hợp tránh
nước vào làm vỡ tế bào.
4
1. Phương pháp tách tế bào trần
1.2 các bước tiến hành

Chọn nguyên liệu

Xử lý gây co nguyên sinh
chất

Xử lý hỗn hợp enzym

Tách và làm sạch
protoplas

Kiểm tra khả năng sống
và tạo mật dọ thích hợp
5
6
2. Nuôi cấy protoplast
2.1 phát sinh hình thái
•

Có 2 con đường :

phát sinh cơ quan
(organogenesis)

Phát sinh phôi soma
(somatic embryogenesis)
7
2. Nuôi cấy protoplast
2.2 Môi trường nuôi cấy
•
Ammonium nitrate
•
Calcium
•
Chất hữu cơ
•
Các acid hưu cơ và
vitamin
•
Chất điều tiết sinh trưởng
•
Đường
8
2. Nuôi cấy protoplast
2.3 Điều kiện nuôi cấy
•
Cường độ ánh sáng
•
Chất lượng ánh sáng

•
Nhiệt độ
9
3.Phương pháp dung hợp protoplast
3.1 Dùng hóa chất
•
Xử lý bằng NaNO3
•
Xỷ lý bằng PEG
10
3.Phương pháp Dung hợp protoplast
3.1.1 xử lý bằng NaNO3
•
Power và cs đã dùng
NaNO3 (0,25 M) kích
thích dung hợp hai
protoplast.
•
phương pháp này cho
hiệu suất thấp vì NaNO
3

không thích hợp với tế
bào bị không bào hóa
mạnh như protoplast từ
nhu mô lá.
•
Tác nhân PEG
(polyethylen glycol)
•

PEG có 2 tác dụng:

Hoạc cung cấp một cầu
nối Ca
2+
có thể liên kết
các bề mặt màng với
nhau

Hoạc dẫn đến sự rối loạn
tích diện bề mặt
3.1.2 xử lý bằng PEG
11
3.Phương pháp Dung hợp protoplast
12
3.Phương pháp Dung hợp protoplast
3.2 Dùng xung điện
•
Nguyên tắc : các
protoplast tích điện nên
dịch chuyển trong điện
trường tạo chuỗi giữa hai
thanh điện cực, xung điện
làm thủng màng khiến
protoplast hòa trộn vào
nhau
13
3.Phương pháp Dung hợp protoplast
14
15

3.Phương pháp Dung hợp protoplast
3.3 các khả năng xảy ra khi dung hợp
16
4.Ứng dụng và các tồn tại của kỹ thuật
protoplast
4.1 ứng dụng :

Dung hợp protoplast (lai soma)

Chọn dòng tế bào

Biến nạp, di truyền : chuyển cơ quan tử , AND ngoại lai
vào protoplast
17
4.Ứng dụng và các tồn tại của kỹ
thuật protoplast
4.1.1 nuôi cấy tế bào protoplast thuốc lá

Chuẩn bị môi trường :
+ Onozuka cellulase R10 0,5 %
+ Onozuka macerozyme R10 0,1 %
+ Mannitol 13,0 %
+ pHmôi trường ~ 5,8
Dung dịch này được khử trùng bằng màng lọc Millipore
loại có đường kính lỗ lọc 0,2-0,25 µm.
18
4.Ứng dụng và các tồn tại của kỹ
thuật protoplast
19
4.Ứng dụng và các tồn tại của kỹ

thuật protoplast
•
Tiến hành:

Ngày thứ 1: ngâm lá
trong dung dịch enzym
tách protoplast.

Ngày thứ 2: lọc, tách tế
bào protoplast, nuôi cấy
qua đêm ở 28
o
C

Ngày thứ 3 : chuyển sang
nuôi cấy ở ánh sáng yếu
(10-20 µmol.sec/m2)

Ngày tứ 5 : chuyển sang
nuôi cấy ở ánh sáng có
cường độ cao hơn (50-75
µmol/sec/m2)

Ngày thứ 7: kiểm tra số
lượng tế bào phân chia,
kiểm tra xem có dấu hiệu
của sự nhiễm bẩn không.
20
4.1.1 nuôi cấy tế bào protoplast thuốc lá
4.Ứng dụng và các tồn tại của kỹ thuật

protoplast
Cây cà chua lai khoai tây
(pomato)
21
4.Ứng dụng và các tồn tại của kỹ thuật
protoplast
4.2 các tồn tại của kỹ thuật protoplast

Các quy trình nuôi cấy tế bào phức tạp, yêu cầu các
thiết bị cao.

Nhiều cây trồng khác việc tái sinh protoplast là khó khăn
thậm trí không thể xảy ra.

Tỷ lệ cây tái sinh bất thụ từ các tế bào lai soma nhiều
trường hợp còn cao.

Khả năng ứng dụng của lai soma vào lai xa còn han chế
do có thất thoát NST của thể tái sinh.
22
1
23