Kỹ thuật tách nuôi cấy và dung hợp tế bào trần protoplast

Kỹ thuật tách nuôi cấy và dung hợp tế bào trần protoplast
---------- o 0 ----------
a. Khái niệm tế bào trần
Tế bào trần (protoplast) là tế bào thực vật bị tách bỏ thành tế bào chỉ còn phần
nguyên sinh chất, nhân, các cơ quan tử khác và màng sinh chất là ranh giới phân
biệt bên trong và bên ngoài tế bào trần.
b. Phương pháp tách tế bào trần
* Nguyên tắc:
- Sử dụng hỗn hợp enzym cellulolaza và hemicellulolaza, pectinaza để phân giải
thành tế bào và giải phóng các tế bào trần.
- Một nguyên tắc cơ bản là sau khi thành tế bào được tách ra, tế bào trần phải
được phóng thích vào môi trường có áp suất thẩm thấu cao để tránh nước xâm nhập
vào không bào, gây vỡ tế bào chất bằng việc bổ sung các chất gây áp suất thẩm
thấu như saccarose, manitol, sorbitol, Ca
2+
…
- Nồng độ chất áp suất thẩm thấu và thời gian lưu giữ tối đa thay đổi cho phù hợp
với từng loại cây trồng.
Đây là phương pháp dùng phổ biến và có hiệu quả cao: Có thể thu được từ 1g lá
tươi có thể thu được 6÷12 triệu tế bào trần.
* Các bước tiến hành
- Chọn nguyên liệu: ex ivtro: mô lá non (cần phải khử trùng), in vitro: lá, mô sẹo,
tế bào huyền phù.
- Xử lý gây co nguyên sinh chất (CaCl
2
, đường monitol …0,5÷0,7M)
- Xử lý hỗn hợp enzym cellulolaza và hemicellulolaza, pectinaza
- Tách và làm sạch protoplast: lọc, ly tâm.
- Kiểm tra khả năng sống (fluorescein diacetate) và tạo huyền phù protoplast có
mật độ phù hợp (10
4

÷10
7
/ml)
Ví dụ về kỹ thuật tách tế bào trần
+ Ở cây thuốc lá
Nguyên liệu thực vật: lá thứ 3 từ trên xuống.
Hỗn hợp enzym: cellulolaza 1%
macerozyme 0,02%
driselaza0,05%
Thời gian ủ: 16h (ngâm qua đêm)
+ Ở cây ngô
Nguyên liệu thực vật: tế bào hạt phấn.
Hỗn hợp enzym: cellulolaza 2%
macerozyme 0,1%
pectolyaza 0,05%
Thời gian ủ: 4÷12h (ngâm qua đêm)
Các tế bào trần sau khi tách thành tế bào được lọc qua rây có kích thước
50÷80μm, rồi rửa bằng dung dịchkhông có enzym bằng ly tâm.
c. Quá trình tái sinh của tế bào trần và các yếu tố ảnh hưởng
* Quá trình tái sinh:
- Nuôi cấy protoplast: thường chia 2 giai đoạn
+ Giai đoạn 1: Nuôi cấy để protoplast tái sinh thành (vỏ) tế bào và phân chia
tạo thành cụm nhỏ tế bào (4÷10 tế bào): nuôi cấy trong tối hay trong điều kiện ánh
sáng yếu, trong môi trường lỏng có lắc hoặc bán lỏng. Môi trương cần giàu dinh
dưỡng và áp suất thẩm thấu phù hợp. Nhiều trường hợp cần dùng lớp nuôi trợ
dưỡng.
+ Giai đoạn 2: Nuôi cấy tạo mô sạo ổn định và tái sinh cây hoàn chỉnh: nuôi
cấy trong điều kiện chiếu sáng tốt với quang chu kỳ phù hợp, trên môi trường đặc.
Cần chú ý tới tỷ lệ và hàm lượng Auxin và xytokinin để tái được cây từ callus.
- Có hai con đường phát sinh hình thái trong quá trình hình thành cây hoàn chỉnh

đối với các tế bào có nguồn gốc protoplast:
+ Thông qua quá trình phát sinh cơ quan (organogenesis), ví dụ tế bào
protoplast có nguồn gốc từ mô thịt lá của cây thuốc lá.
+ Thông qua con đường phát sinh phôi soma (somatic embryogenesis), ví dụ
các tế bào protoplast có nguồn gốc từ các tế bào phôi được nuôi cấy dạng huyền
phù một số loài cây thuộc họ hoà thảo.
Nếu đảm bảo được môi trường nuôi cấy phù hợp, thì phôi và các mô phân sinh sẽ
hình thành sau khoảng 3÷5 tuần. Nhưng nếu điều kiện nuôi cấy không tối ưu, các
biến đổi di truyền có thể xảy ra. Ví dụ, trong một số nghiên cứu nuôi cấy protoplast
từ cây khoai tây, tần số cây 2n được tái sinh chỉ khoảng 10%, con lai là cây 4n.
Protoplast
TÕ bµo
M« / khèi m«
Ph¸t sinh chåi / rÔH×nh thµnh cÊu tróc ph«i
C©y hoµn chØnh
Organogenesis
Embryogenesis
Protoplast tái sinh vỏ tế bào và phân chia tạo microcallus
Callus phát triển từ microcallus
Callus trên môi trường tái sinh