Đề tài nấm Beauveria bassiana

1
Phần I. MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Cuộc cách mạng khoa học kỹ thuật trong nông nghiệp đã mang lại nhiều thành
tựu to lớn trong đó quan trọng nhất là giảm tỷ lệ đói nghèo trên thế giới nhờ nâng cao
năng suất cây trồng. Mặc dù thuốc bảo vệ thực vật giúp giảm tổn thất do sâu hại (ước
tính mức độ tổn thất do sâu hại nếu không sử dụng thuốc trừ sâu là 83 % ở lúa gạo và
84 % ở bông vải (Viện lúa đồng bằng sông Cửu Long, 2004)) song thuốc trừ sâu cũng
mang lại những bất lợi khó giải quyết như: ô nhiễm môi trường, độc hại cho sức khỏe
con người, mất cân bằng sinh thái và gây tính kháng của côn trùng. Trong những năm
gần đây, với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, các nhà khoa học tập
trung nghiên cứu tạo ra các cây trồng chuyển gen mang tính kháng, xem các giống
kháng là thành phần chủ yếu trong hệ thống phòng trừ tổng hợp. Tuy nhiên, những gen
dùng trong công nghệ chuyển gen còn ít, chuyển gen tỷ lệ thành công thấp và vẫn còn
tồn tại những tranh cãi về tính an toàn của cây chuyển gen nên thuốc trừ sâu vi sinh
được coi là giải pháp khả thi, có thể đáp ứng nhanh yêu cầu của con người về một giải
pháp phòng trừ sâu hại an toàn môi sinh và hiệu quả, giúp hạn chế sử dụng thuốc trừ
sâu hóa học. Thuốc trừ sâu vi sinh gồm các sản phẩm từ các loài thiên địch của sâu
như: các loài ăn mồi, ký sinh, nguồn bệnh, trong đó các chế phẩm tạo nên trên cơ sở
các loài nấm chiếm vị trí quan trọng, đặc biệt chế phẩm nấm diệt sâu từ nấm
Beauveria bassiana đã có hiệu lực cao tiêu diệt nhiều loài côn trùng gây hại. Để nâng
cao hiệu quả ứng dụng của nấm này, cần đẩy mạnh các nghiên cứu về sinh học, sinh
lý, sinh thái và mối quan hệ giữa nấm Beauveria bassiana với côn trùng vật chủ.
Trong đó, nhiệm vụ trung tâm của công nghệ sinh học hiện nay khi nghiên cứu các đối
tượng là đọc được chuỗi mã DNA để phân tích bộ genome nhằm tìm hiểu quan hệ di
truyền của các đối tượng nghiên cứu và mối liên hệ giữa genome với tính độc của nấm
nhằm tạo ra các chế phẩm vi nấm có hiệu quả diệt côn trùng cao. Trong phạm vi
nghiên cứu của đề tài, chúng tôi chỉ đọc trình tự vùng ITS1 - 5,8 S - ITS2 của rDNA
để so sánh sự biến đổi trong trình tự giữa các chủng nấm Beauveria bassiana.

2
1.2. Mục tiêu đề tài
Khuếch đại vùng gen ITS1 - 5,8 S - ITS2 các nguồn nấm Beauveria basiana có
tính độc cao và đọc trình tự sản phẩm PCR của nấm làm cơ sở xác định mối liên hệ
giữa tính độc của nấm với những biến đổi trong trình tự vùng ITS - rDNA

1.3. Yêu cầu
Nắm vững nguyên tắc nuôi cấy và nhân sinh khối nấm.
Nắm vững kỹ thuật PCR
Nắm vững nguyên tắc đọc trình tự.

1.4. Nội dung thực hiện
Phân lập thêm một số dòng nấm Beauveria bassiana ký sinh trên côn trùng.
Khuếch đại vùng gen ITS1 - 5,8 S - ITS2 của các dòng nấm có tính độc cao.
Đọc trình tự vùng gen ITS1 - 5,8 S - ITS2 trực tiếp từ sản phẩm PCR và tiến
hành so sánh với cơ sở dữ liệu của NCBI.

3
Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Giới thiệu về nấm Beauveria bassiana
2.1.1. Vị trí phân loại
Lớp: Deuteromycetes.
Bộ: Moniliales.
Họ: Moniliaceae.
Giống: Beauveria.
Giống Beauveria thường được chia thành 3 loài: Beauveria bassiana,
Beauveria brongniarti, Beauveria alba, trong đó 2 loài đầu là tác nhân gây bệnh côn
trùng (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997).

2.1.2. Đặc điểm hình thái
Theo Nguyễn Ngọc Tú - Nguyễn Cửu Thị Hương Giang (1997), “Nấm
Beauveria bassiana có bào tử trần hình cầu (đường kính 1 - 4 m) đến hình trứng (1,5-
5,5 x 1,3 m). Sợi nấm có chiều ngang khoảng 3 - 5 m phát triển dày đặt trên môi
trường, mang nhiều cuống sinh bào tử và bào tử. Mặt khuẩn lạc nấm dạng phấn trắng.”
Nấm khi mọc trên côn trùng thường có màu trắng hoặc vàng nhạt, đôi khi hơi sẫm, bề
mặt trơn và có nhiều bột, hiếm khi tập hợp thành bó sợi.
Khi mọc trên môi trường thạch, nấm Beauveria bassiana nhìn chung có màu
trắng, viền khuẩn lạc thường có màu kem hoặc vàng nhạt, thỉnh thoảng có màu đỏ nhạt
(Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997).
Beauveria bassiana tạo rất nhiều bào tử, bào tử thường có hình cầu, hình trứng,
có khi chiều dài lên tới 20 m với 1 m chiều rộng. Các sợi nấm khí sinh mang các giá
bào tử trần ngắn, phồng to 3 - 5 x 3 - 6 m. Các giá bào tử này hoặc tạo thành các

nhánh ở phần ngọn, hoặc trực tiếp tạo thành các tế bào sinh bào tử trần. Các tế bào
sinh bào tử trần thành cụm, được tạo thành từ giá hoặc từ nhánh của giá, hoặc được tạo
thành trực tiếp từ sợi nấm khí sinh hay từ nhánh ngang và ngắn của các sợi nấm này.
Phần gốc của tế bào sinh bào tử trần hình cầu, hình chai 2,5 - 3,5 x 3 - 6 m, phần
ngọn của tế bào dạng cuống hẹp, ngoằn ngoèo hình chữ chi, hoặc ngoằn ngoèo không

4
đều, có răng cưa 1 x 5 - 20 m. Bào tử trần không có vách ngăn, hình cầu hoặc elip,
đôi khi có gốc nhọn, nhẵn 2 – 3 x 2 – 4 m, màu trắng hay vàng nhạt (Nguyễn Ngọc
Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997).

2.1.3. Đặc điểm nuôi cấy
2.1.3.1. Môi trƣờng nuôi cấy
Do có hệ enzyme phong phú (lipase, protease, urease, aspatainase, amylase)
nên nấm này có khả năng phát triển trên nhiều loại môi trường dinh dưỡng với các
thành phần khác nhau. Trong đó môi trường thạch khoai tây hay được sử dụng và khả
năng phát triển của nấm trên môi trường này là tốt nhất (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn
Cửu Thị Hương Giang, 1997).

2.1.3.2. Điều kiện nhiệt độ
Nhiệt độ đóng vai trò quan trọng, hầu như ảnh hưởng tới toàn bộ hoạt động
sống của nấm, mỗi loại nấm chỉ có khả năng phát triển trong một giới hạn nhiệt độ
nhất định. Nhiệt độ thích hợp nhất cho sự nảy mầm, phát triển và tạo bào tử của nấm
Beauveria bassiana là 25 – 30
o
C (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang,
1997).

2.1.3.3. Điều kiện pH
Theo Veliska (1967), giá trị pH môi trường từ 3 - 9 không ảnh hưởng tới sự

phát triển tạo sinh khối của nấm Beauveria bassiana và theo Goral (1970) nấm
Beauveria bassiana thuộc vi sinh vật có khả năng điều chỉnh pH môi trường, pH thuận
lợi cho sự phát triển là 5,7 - 6,0. Ngoài ra, có nhiều nghiên cứu cho rằng khả năng phát
triển tốt nhất của nấm Beauveria bassiana là 6,2 - 6,3 (trích dẫn bởi Nguyễn Ngọc Tú
và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997).

2.1.4. Điều kiện phân bố
Nấm Beauveria bassiana phân bố rộng khắp. Giống như hầu hết các loại nấm
diệt sâu khác, khi rơi vào một nơi nào đó, chúng đều có khả năng trở thành thành viên
trong sinh quần nơi đó và tự sinh sôi nảy nở tăng lên. Vì là vật ký sinh chuyên hóa

5
rộng nên nấm này có khả năng tồn tại khi thiếu vật chủ chính. Khả năng nhiễm thành
công của nấm với côn trùng là khá lớn vì chúng có nhiều cách xâm nhiễm khác nhau:
qua lớp cutin, qua đường tiêu hóa, qua đường hô hấp và qua lỗ của thân. Ngoài ra, nấm
Beauveria bassiana còn có khả năng tồn tại trong điều kiện môi trường không thuận
lợi dưới dạng giả hạch nấm (các sợi nấm dinh dưỡng kết lại thành một thể rắn chắc).
Có thể sử dụng rộng rãi nấm Beauveria bassiana trong thực tiễn nông nghiệp vì:
chúng có thể phát triển trên môi trường dinh dưỡng, có thể được chế tạo ở dạng chế
phẩm sinh học, và tiêu diệt một lượng không nhiều các côn trùng có ích (Nguyễn Ngọc
Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997).
Nấm Beauveria bassiana có khả năng phát tán rộng trong thiên nhiên thông qua
các hoạt động phóng bào tử bằng cơ học (chúng có có khả năng bắn bào tử tới khoảng
cách gấp hàng nghìn lần lớn hơn kích thước của chúng), lan truyền nhờ dòng nước,
không khí và côn trùng (một số loài của bộ Collembola, như Lepidocyrtus giúp nấm
Beauveria bassiana di chuyển khá xa) (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương
Giang, 1997).

2.1.5. Độc tố của nấm Beauveria bassiana
Chất diệt côn trùng của nấm Beauveria bassiana là chất chúng tiết ra khi bào tử

nảy mầm. Tên thông thường của độc tố là beauverixin, công thức hóa học C
45
H
57
O
9
N
3
- ciclo (N - metyl - L - phenylalanin - D - - hydroxyizovalery)
3
. Đó là một loại
depxipeptit vòng có điểm sôi 93 - 94
o
C (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương
Giang, 1997).

6

Hình 2.1 Cấu trúc phân tử của beauvericin (F. R. Champlin, 1979)
Tiến trình cấy chuyền Beauveria bassiana qua côn trùng vật chủ sống thì nồng
độ độc tố tạo thành tăng hơn so với Beauveria bassiana phân lập giữ trên môi trường
tổng hợp. Ngoài ra, nồng độ độc tố cao nhất với sâu được tạo thành khi nấm được nuôi
cấy trên chính sâu này. Như vậy, nguồn dinh dưỡng của nấm có ý nghĩa đối với sự
hình thành độc tố chuyên hóa (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang,
1997).
Ngoài ra, mô côn trùng bị nhiễm nấm thì bền vững dưới tác dụng của vi sinh
vật gây thối rữa chứng tỏ nấm này có khả năng tạo ra một số chất trao đổi giống kháng
sinh. Evlachova (1970) đã nghiên cứu tính chất kháng khuẩn của một số nòi nấm
Beauveria bassiana và kết luận rằng phổ diệt khuẩn của chúng khá rộng. Tính chất này
rất có ý nghĩa trong thực tiễn sản xuất (trích dẫn Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị

Hương Giang, 1997).

2.1.6. Quá trình nhiễm nấm vào côn trùng
2.1.6.1. Sự xâm nhập
Các nấm diệt sâu xâm nhập vào cơ thể côn trùng qua toàn bộ vỏ cutincun ngoài
nhờ enzyme phân hủy lớp chitin của cutincun (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị
Hương Giang, 1997).
Theo Robinson R.K. (1996), sự xâm nhập của nấm diệt sâu qua lớp cutincun
ngoài được thực hiện bằng lực cơ học, còn sự tiến sâu vào lớp cutincun trong thì được
thực hiện nhờ họat động của enzyme do chính nấm tiết ra. Ngoài ra, Robinson R.K.

7
cũng xác nhận rằng các nấm diệt sâu chuyên hóa cao tạo nên trên bề mặt cutincun một
kiểu giác bám phồng lên dạng kim xuyên vào bên trong cuticun của côn trùng. Sự xâm
nhập vào xoang thân côn trùng xảy ra khá nhanh chóng, qua 32 - 48 giờ đã làm đầy cơ
thể côn trùng với những đoạn sợi nấm đơn bào tự do bơi trong huyết tương dẫn đến sự
phá hủy tiếp theo mô thân côn trùng (trích dẫn Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị
Hương Giang, 1997).

2.1.6.2. Sự phát triển của nấm tới khi côn trùng chết
Theo Sekhurina J. A. (1964), khi các bào tử chồi của nấm Beauveria bassiana
bắt đầu sinh sôi nảy nở trong huyết tương của bọ rùa thì bọ rùa bắt đầu tê liệt, và sau
khi vật chủ chết thì nấm mọc thành sợi nấm chui vào trong các bắp cơ và khí quản của
côn trùng; các chế phẩm mô bệnh lý nhuộm cho thấy hạch thần kinh bị biến đổi màu
do ảnh hưởng của độc tố (ở giai đoạn đầu của bệnh tê liệt các hạch thần kinh có màu
xanh tím, khi bị nấm ký sinh có màu xanh đỏ đậm trong khi đó màu của hạch thần
kinh ở côn trùng khỏe có màu xanh lá cây) (trích dẫn Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn
Cửu Thị Hương Giang, 1997).

Hình 2.2 Quá trình nhiễm nấm vào côn trùng (Scholte E-J, 2004)

2.1.7. Triệu chứng của côn trùng nhiễm nấm
A: sự xâm nhập.
B: lớp cutin.
C: sợi nấm phát triển.
D: sợi nấm hình thành
vách ngăn.
E: túi bào tử hình thành.
F: bào tử động.
G: bào tử noãn.


8
Nhiều công trình nghiên cứu ảnh hưởng của nấm có lợi lên các đối tượng côn
trùng khác nhau đã đưa ra các kết quả mô tả triệu chứng khác nhau:
Làm biến đổi thành phần, hình dạng các nguyên tố enzyme và phản ứng huyết
tương, làm giảm khả năng sinh sản, làm giảm trọng lượng, phá hủy sự hô hấp và phá
hủy chức năng hệ thống nội tiết của côn trùng. Khi nghiên cứu về ảnh hưởng của nấm
Beauveria bassiana lên độ mắn đẻ của bướm Torticidae hại táo, Kondria V.S (1966)
đã đưa ra kết luận rằng việc xử lý nhộng bởi nấm này làm giảm độ mắn đẻ của bướm
rất nhiều. Trong các thí nghiệm nhiễm 5000, 15000, 45000 bào tử nấm Beauveria
bassiana lên các con cái thì số lượng trứng trung bình còn lại không bị hư lần lượt là
59, 47 và 29 so với đối chứng là 71 trứng. Zagae (1963) cho biết độ mắn đẻ của các
con cái bọ cánh cứng nhiễm Beauveria bassiana đã giảm tới 48 % so với đối chứng và
nếu kết hợp với DDT sẽ giảm tới 83 % (trích dẫn bởi Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn
Cửu Thị Hương Giang).
Phá hủy chức năng sinh lý của côn trùng. Theo Ferron P. (1967) thì sự nhiễm
nấm trắng và nấm xanh trên sâu Melolontha melolontha sẽ gây ra hiện tượng biến đổi
sinh hóa và giảm lực oxy hóa khử dẫn tới tình trạng hóa melanin trong huyết tương.
Ngoài ra, công trình nghiên cứu của Codaira (1967) cho thấy sự nhiễm nấm vào côn

trùng còn làm thay đổi độ nhớt của huyết tương. Một số các nhà nghiên cứu khác
(Dieuzeide R. 1926, Cordon T.C và Schwartz J.H. 1962) còn thấy các tinh thể được
tạo thành trong huyết tương khi côn trùng bị nhiễm nấm (trích dẫn bởi Nguyễn Ngọc
Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang).
Phá hủy quá trình biến thái và phát triển của côn trùng, cụ thể là các ấu trùng bị
nhiễm nấm không lột xác được (Benz G., 1963). Theo Gosswald K. (1938), nấm
Beauveria bassiana có thể nhiễm tất cả các pha phát triển của Bombyx mori. Theo
Prasertphon (1967), khi nấm B. bassiana nhiễm vào ấu trùng tuổi 4 và 5 của bọ rùa
gây hại thì biểu hiện của ấu trùng bị phá hủy như sau: ấu trùng và rệp non không thể
thoát ra khỏi tầng cutincun cứng và ở mức độ cao hơn thì côn trùng có dạng gù quái dị
(trích dẫn Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997).

2.1.8. Các chể phẩm sinh học từ nấm Beauveria bassiana

9
Theo danh mục thuốc bảo vệ thực vật được phép sử dụng ở Việt Nam (quyết
định số 15/2004/QD – BNN ngày 14 tháng 4 năm 2004, các loại chế phẩm nấm
Beauveria bassiana được phép sử dụng gồm có:
Boverit 5,0 x 10
8
bào tử/g (Viện Bảo vệ Thực vật) trừ rầy nâu hại lúa, sâu đo
xanh hại đay, sâu róm hại thông, sâu kèn hại tai tượng.
Biovip 1,5 x 10
9
bào tử/g (Viện lúa đồng bằng sông Cửu Long) trừ rầy và bọ xít
hại lúa.
Beauverine (Công ty Thanh Sơn Hóa Nông) trừ sâu tơ hại bắp cải, sâu đục quả
hại xoài.
Muskardin (Công ty cổ phần thuốc trừ sâu Cần Thơ) trừ sâu đục thân hại lúa và
ngô.

Bermetent (Công ty hợp danh sinh học nông nghiệp Sinh Thành, Thành phố Hồ
Chí Minh), trừ bọ cánh cứng hại dừa, sâu đục thân, rệp sáp, rầy đen hại mía.
2.2. Tổng quan về ITS - rDNA
2.2.1. Giới thiệu về rDNA và vùng ITS
rDNA là nhóm gen mã hóa rRNA của ribosom, đóng vai trò quan trọng trong
các nghiên cứu quan hệ phát sinh loài. rDNA được quan tâm nghiên cứu vì nó là một
gen có nhiều bản sao và đặc biệt không mã hóa cho protein nào. Các bản sao của gen
nằm liên tiếp trên một locus và liên quan mật thiết tới quá trình tiến hóa. Hơn nữa,
ribosom hầu như tồn tại trong mọi sinh vật và có cùng nguồn gốc tiến hóa. Phần lớn
phân tử rDNA tương đối bảo tồn nên được xem là cơ sở để tìm ra sự tương đồng và
các khác biệt khi so sánh các sinh vật khác nhau. Các primer thiết kế dựa trên những
oligonucleotide có tính bảo tồn cao được sử dụng cho tất cả sinh vật nhằm khuếch đại
các vùng tương đương dùng trong so sánh. Ngoài ra, nhiều primer và probe cũng được
thiết kế dựa trên các vùng không bảo tồn dùng trong phát hiện và định danh vi sinh vật
(Van de Peer và cộng sự, 1996).
Các rDNA 5,8 S, 18 S, và 25 S phiên mã thành các tiền rRNA riêng rẽ, nằm xen
kẽ với các vùng phiên mã bên trong (ITS) và các vùng phiên mã bên ngoài (ETS).
Giữa các nhóm gen gồm nhiều bản sao lập lại là vùng không phiên mã. Có một rDNA
5 S thường không có vị trí cố định và có chiều sao mã ngược với các gen còn lại,
rDNA 5 S thường chỉ có ở nhân, không có ở ty thể của một số loài nấm. Kích thước
của mỗi vùng lập lại nằm trong khoảng 7,7 – 24 kbp (Guarro, 1999).

10

Hình 2.3 Sơ đồ nhóm gen rDNA nhân và rDNA ty thể (White và cộng sự, 1989)
rDNA 18 S thường được quan tâm nghiên cứu; rDNA 5,8 S có kích thước rất
nhỏ và ít có sự biến đổi song rRNA 5 S là thành phần không thể thiếu của nu - LSU-
rRNA, có vai trò ổn định cấu trúc ribosom và thúc đẩy quá trình tổng hợp protein
(Szymanski và cộng sự, 2001); rDNA 25 S mặc dù ít có sự biến đổi song lại rất có ý
nghĩa trong phân loại (Guarro, 1999).

Vùng ITS là vùng có rất nhiều sự biến đổi, mặc dù vùng ITS thường được sử
dụng trong nghiên cứu tiến hóa của vi sinh tuy nhiên phần lớn các so sánh trên vùng
này chỉ thường sử dụng ở mức độ xác định các biệt hóa trong cùng loài (Guarro,
1999).

2.2.2. Phân nhóm rDNA
Theo White và cộng sự (1989), rDNA có thể chia thành 2 nhóm: rDNA nhân
và rDNA ty thể.
rDNA nhân
rDNA nhân (nu - rDNA) gồm có nu - SSU - rDNA (17 - 18 S) mã hóa rRNA
tiểu đơn vị nhỏ (small subunit rDNA) và nu - LSU - rDNA (26 - 28 S) mã hóa rRNA
tiểu đơn vị lớn (large subunit rDNA).
Nu - SSU - rDNA tiến hóa tương đối chậm, thường được sử dụng trong nghiên
cứu các sinh vật có ít quan hệ về mặt di truyền. Nu - LSU - rDNA mặc dù có ít vùng

11
biến đổi nhưng lại rất có ý nghĩa trong nghiên cứu so sánh và phân loại ở nhiều cấp độ
(Guarro, 1999).
rDNA ty thể
rDNA ty thể (mt - rDNA) cũng gồm có hai loại: mt - SSU - rDNA (19 S) và mt
- LSU - rDNA. Các mt - rDNA tiến hóa khá nhanh, thường được sử dụng trong nghiên
cứu các sinh vật cùng họ (Yamamoto và cộng sự, 1995).
Theo nghiên cứu của Santos và cộng sự (2002), ở các loài sinh vật có lạp thể,
rDNA của lạp thể (cp - rDNA) cũng rất thay đổi về kích thước giữa các loài. Nghiên
cứu cũng kết luận rằng cp - LSU - rDNA (23 S) có sự thay đổi lớn về kích thước trong
các loài sinh vật có lạp thể, cp - SSU - rDNA (16 S) thường ít được sử dụng trong
nghiên cứu vì nó có đặc tính phái sinh.


2.2.3. Sơ lƣợc lịch sử nghiên cứu rDNA

rDNA được quan tâm nghiên cứu từ rất sớm. Bằng cách tách gen, nhân dòng và
đọc trình tự, người ta đã đọc được rất nhiều trình tự rDNA. Đặc biệt, phương pháp đọc
trình tự trực tiếp sản phẩm PCR ra đời tạo rất nhiều thuận lợi cho các nghiên cứu liên
quan đến rDNA (White và cộng sự, 1989).
Năm 1984, Hassouna và cộng sự đã giải trình tự toàn bộ gen mã hóa 28 S
rRNA trên chuột và phát hiện có gia tăng kích thước của gen này ở các sinh vật
eukaryote bậc cao.
Năm 1985, Hasegawa và cộng sự dựa trên trình tự rDNA nghiên cứu mối quan
hệ phát sinh loài của giới eukaryote.
Field và cộng sự (1988) là những người đầu tiên đề nghị nghiên cứu rDNA để
xác định mối quan hệ trong phát sinh loài của động vật đa bào. Đặc biệt, rDNA nhân
mã hóa rRNA 18 S được xem là đủ đa dạng có thể giải quyết nhiều vấn đề liên quan
đến lịch sử phát sinh động vật đa bào (Halanych và Kenneth M., 1998).
Năm 1989, Gams và cộng sự sử dụng phương pháp PCR - RFLP thay vì đọc
trình tự khi nghiên cứu rDNA.
Năm 1990, Palmer và cộng sự đã so sánh trình tự SSU - rDNA của nhân, ty thể
và lục lạp của thực vật hạt kín và thấy rằng trình tự rDNA 18 S của nhân là có nhiều

12
biến đổi nhất. Cũng trong năm này, Devereux và cộng sự lần đầu tiên chú ý tới những
tương đồng trong trình tự 16 S của vi khuẩn khi nghiên cứu phân loại.
Các nghiên cứu sinh học phân tử nhằm phân loại nấm trên cơ sở rDNA được
phát triển những năm đầu của thập niên 90 (Bruns và cộng sự, 1991; ). So sánh những
thay đổi của nu - SSU - rDNA (18 S), Bruns và cộng sự (1992) đã tìm được quan hệ di
truyền của nhiều loài nấm sợi.
Năm 1994, Gutell đã tổng hợp những biến đổi trong cấu trúc bậc hai của rRNA
16 S từ các đại diện thuộc giới cổ vi khuẩn, vi khuẩn và eukaryote trên cả nhân, ty thể
và lạp thể.
Các nghiên cứu phát sinh loài thực vật dựa trên vùng ITS được tiến hành bởi
Baldwin và cộng sự (1995).

Những năm gần đây, ngoài ý nghĩa phân loại, rDNA và vùng ITS rất được quan
tâm nghiên cứu ở cấp độ phân tử. Năm 1998, Chilton và cộng sự chứng minh cấu trúc
ITS2 bậc hai có sự tương đồng giữa các họ phụ của lớp giun tròn. Năm 1999, Joseph
và cộng sự đã chứng minh vùng trung tâm trong cấu trúc ITS2 bậc 2 của động vật có
xương sống và nấm men có nhiều điểm tương đồng. Năm 2004, Colette và cộng sự
nghiên cứu về vai trò của vùng ITS2 trong tiến trình tạo tiền rRNA ở nấm men.

2.2.4 Sơ đồ vị trí và trình tự các primer dùng trong nghiên cứu rDNA và vùng ITS
2.2.4.1 Vị trí và trình tự primer khuếch đại nu - rDNA
Vị trí primer

Hình 2.4 Sơ đồ vị trí primer trên nu - rDNA (White và cộng sự, 1989)
Các primer từ NS1 đến NS8 được thiết kế dựa trên vùng trình tự bảo tồn của
rDNA 18 S của S. cerevisiae, Distyostelium discoideum và Stylonicha pustulata. Các
primer NS1 và NS2 có thể sử dụng cho hầu hết các loại nấm, tảo đỏ và sinh vật đơn

13
bào, NS3 và NS4 dùng cho hầu hết các loại nấm, NS7 và NS8 chỉ khuếch đại được
rDNA của thực vật và động vật có xương sống. NS1 và NS8 thường dùng để đọc trình
tự hầu hết các loại rDNA nhưng không đọc được trình tự vùng primer. NS2 và NS3,
NS4 và NS5, NS6 và NS7 có trình tự bổ sung, được thiết kế để đọc được trình tự cả
vùng primer (White và cộng sự, 1989).
Các primer vùng ITS được thiết kế dựa trên vùng bảo tồn của các gen 18 S, 5,8
S, 28 S. ITS1 là trình tự bổ sung của NS8. Primer ITS2 và ITS3 được thiết kế và sàng
lọc dựa trên vùng bảo tồn thuộc 5,8 S của N. crassa, Schizosaccharomyces pombe và
S. cerevisiae, Vicia faba và chuột. Vùng bảo tồn trên rDNA 28 S của S. prombe, S,
cerevisiae và lúa (Oryza sativa) được so sánh để thiết kế ITS4. Primer ITS5 có trình tự
giống với rDNA 18 S của N. crassa, có đầu 5’ chỉ cách primer ITS1 25 bp (White và
cộng sự, 1989).

Trình tự primer
Bảng 2.1 Trình tự primer dùng khuếch đại nu – rDNA
(Bruns và cộng sự, 1990; White và cộng sự, 1989)
Primer Trình tự Tm (
0
C)
Nu – SSU – rDNA primer

NS1
NS2
NS3
NS4
NS5
NS6
NS7
NS8
GTAGTCATATGCTTGTCTC
GGCTGCTGGCACCAGACTTGC
GCAAGTCTGGTGCCAGCAGCC
CTTCCGTCAATTCCTTTAAG
AACTTAAAGGAATTGACGGAAG
GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC
GAGGCAATAACAGGTCTGTGATGC
TCCGCAGGTTCACCTACGGA
56
68
68
56
57

65
65
65
ITS Primer

ITS1
ITS2
ITS3
ITS4
ITS5
TCCGTAGGTGAACCTGCGG
GCTGCGTTCTTCATCGATGC
GCATCGATGAAGAACGCAGC
TCCTCCGCTTATTGATATGC
GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG
65
62
62
58
63
Nu - LSU – Rdna
NL1F TGGGTGGTAAATTCCATCTA 51

14
NL2F
NL13
NL14
GTGAAATTGTTAAAAGGGAAAC
CAAGCGAACTTTCATCATGCACG
CTTTAGAACAAGGGTTGAAC

53
63
51


2.2.4.2. Vị trí và trình tự primer khuếch đại mt - rDNA
Vị trí primer
Các primer ML1, ML2, ML4, MS1, MS2 được sử dụng để khuếch đại các trình
tự đặc trưng ở hầu hết các loại nấm. Ở vài loài nấm, trình tự khuếch đại bởi 2 primer
ML6 và ML5 chứa một intron khá lớn nên việc khuếch đại thường không hiệu quả.
Các đột biến thay đổi kích thước như vậy thường rất phổ biến ở các gen ty thể, do đó
kích thước vùng khuếch đại thay đổi rất đáng kể (White và cộng sự, 1989).


Hình 2.5 Vị trí primer trên rDNA ty thể (White và cộng sự, 1989).

Trình tự primer
Bảng 2.2 Trình tự primer dùng khuếch đại mt - rDNA
(Bruns và cộng sự, 1990; White và cộng sự, 1989)
Primer Trình tự Tm (
0
C)
Mt – SSU - rDNA
MS1
MS2
MS4
CAGCAGTCAAGAATATTAGTCAATG
GCGGATTATCGAATTAAATAAC
AACCACCATTCATCGTTGAC
65

63
63
Mt – LSU – rDNA
ML1
GTACTTTTGCATAATGGGTCAGC
68

15
ML2
ML3
ML4
ML5
ML6
ML7
ML8
TATGTTTCGTAGAAAACCAGC
GCTGGTTTTCTACGAAACATATTTAAG
GAGGATAATTTGCCGAGTTCC
CTCGGCAAATTATCCTCATAAG
CAGTAGAAGCTGCATAGGGTC
GACCCTATGCAGCTTCTACTG
TTATCCCTAGCGTAACTTTTATC
63
67
68
66
65
63
57

2.2.5. Ý nghĩa của ITS - rDNA trong phân loại nấm
Nghiên cứu so sánh trình tự rDNA (ribosomal RNA gene) đóng vai trò quan
trọng trong phân loại và xác định quan hệ di truyền (Woese and Olsen (1986), Zimmer
và cộng sự (1988), Medlin và cộng sự (1989)) và đặc biệt có ý nghĩa trong ngành phân
loại nấm. Từ trước đến nay nấm thường được phân loại dựa trên đặc điểm hình thái, cơ
chế trao đổi chất, cấu trúc vách tế bào và thành phần protein nên kết quả phân loại
thường không chính xác; các so sánh dựa trên trình tự nu được xem là cơ sở chính xác
nhất, rất có ý nghĩa trong phân loại nấm (Guarro, 1999).
Nhờ những phân tích trên nu - SSU - rDNA có thể chia giới nấm thành 4 lớp
Acrasiomycota, Myxomycota,

Oomycota, và Fungi (Bruns và cộng sự, 1991).
Cũng dựa trên cơ sở so sánh SSU - rDNA, người ta cũng đã chứng minh
Schizosaccharomycetales có nguồn gốc từ lớp Myxomycota (Guarro, 1999).
Các phân tích trên mt - LSU - rDNA (24 S) cho thấy P. carinii thuộc lớp nấm
men Basidiomycete trong khi đó người ta thường lầm tưởng loài này thuộc nhóm động
vật nguyên sinh (Wakefield, 1992).
Trên cơ sở so sánh trình tự LSU - rDNA và trình tự SSU - rDNA, Leclerc
(1994) chứng minh S. apiospermum

and S. prolificans có quan hệ về di truyền.
Muthumeenakshi

và cộng sự (1994) đã chứng minh có sự đa hình xảy ra khi
nghiên cứu những thay đổi trong vùng ITS của các dòng Trichoderma harzianum.
Dựa trên trình tự rDNA 18 S, 5,8 S và vùng ITS, Berbee và cộng sự (1995) đã
chứng minh Penicillium, Aspergillus, và Paecilomyces thuộc lớp Trichocomaceae.

2.3. Giới thiệu kỹ thuật PCR
2.3.1. Khái niệm

16
Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) được mô tả bởi Mulis và cộng sự.
(1985) là kỹ thuật cho phép làm tăng bội đáng kể các đoạn DNA cần được nghiên cứu.
Khác với sự tăng bội DNA qua sự tạo dòng nhờ vi khuẩn, PCR được thực hiện in vitro
theo con đường enzyme.

2.3.2. Nguyên tắc phản ứng PCR
Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ
khuôn đều cần sự hiện diện của những primer chuyên biệt. Primer là những đoạn
oligonucleotide có khả năng bắt cặp bổ sung vào đầu 3’ của khuôn, DNA polymerase
sẽ nối dài primer để hình thành mạch mới (Bùi Trang Việt, 2002).
Hiện tượng trên chính là cơ sở của phương pháp PCR. Nếu được cung cấp hai
primer (forward primer và reverse primer) có khả năng bắt cặp chuyên biệt với hai đầu
của một trình tự DNA, phản ứng PCR sẽ nhân bản trình tự nằm giữa hai primer này
(PCR thường được dùng để nhân bản các trình tự DNA có chiều dài khoảng 200-2000
bp) (Bùi Trang Việt, 2002).

2.3.3. Thành phần cơ bản của phản ứng PCR và các yếu tố ảnh hƣởng
2.3.3.1. Primer và nhiệt độ lai
Primer là yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới tính đặc hiệu và tính hiệu quả của
phản ứng khuếch đại. Trình tự của primer thường được chọn sao cho không có có sự
bắt cặp bổ sung giữa primer xuôi và primer ngược, không có những cấu trúc “kẹp tóc”
do sự bắt cặp bổ sung trong mỗi primer và T
m
của 2 primer phải không quá cách biệt
nhau. Ngoài ra, thành phần nucleotide của primer phải cân bằng tránh lập lại nhiều lần
các cặp GC. Primer được chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không
trùng với các trình tự trên gen. Trình tự nằm giữa hai primer không quá lớn, phản ứng
PCR sẽ tối ưu trên những trình tự nhỏ hơn 1 kb (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998).

2.3.3.2. DNA mẫu
Kết quả phản ứng PCR phụ thuộc rất lớn vào độ tinh sạch cũng như lượng
DNA mẫu. Tuy nhiên, trong kỹ thuật chẩn đoán nhanh bằng PCR, DNA thu nhận trực
tiếp từ dịch chiết tế bào nhưng kết quả vẫn tốt. Lượng DNA mẫu thường được sử dụng

17
là 100 ng. Lượng mẫu phù hợp có tác dụng hạn chế sự khuếch đại tạo các sản phẩm
không mong muốn (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998).

2.3.3.3. Enzyme DNA polymerase
Enzyme được sử dụng đầu tiên là đoạn Klenow của DNA polymerase I.. Đây là
enzyme không chịu nhiệt nên thao tác ph ức tạp và hiệu quả thấp. Phương pháp PCR
trở nên thuận lợi hơn với việc phát hiện ra enzyme DNA polymerase chịu nhiệt được
tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus hiện diện trong suối nước nóng, viết tắt là Taq
polymerase, không bị mất hoạt tính ở nhiệt độ biến tính DNA và có khả năng xúc tác
tiổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng. Một enzyme có nhiều chức năng chuyên
biệt và hoàn thiện hơn là Tth polymerase được tách từ Thermus thermophilus, có khả
năng hoạt động như một enzyme phiên mã ngược khi có mặt của RNA khuôn và Mn
2+

(khuếch đại bản mẫu RNA thông qua sự hình thành cDNA), ngược lại khi khuôn là
DNA và có ion Mg
2+
, Tth polymerase lại xúc tác phản ứng khuếch đại DNA (Hồ
Huỳnh Thùy Dương, 1998).

2.3.3.4. dNTP
Mỗi loại dNTP thường được sử dụng với nồng độ từ 20 – 200 M. Nồng độ cao
hơn sẽ dẫn đến việc tạo ra các sản phẩm không mong muốn. Sự mất cân bằng trong

thành phần các nucleotide sẽ làm tăng các lỗi sao chép của polymerase (Hồ Huỳnh
Thùy Dương, 1998).

2.3.3.5. Mg
2+
và nồng độ Mg
2+
Mg
2+
là cofactor cho hầu hết các DNA polymerase, đặc biệt là các DNA
polymerase chịu nhiệt. Nồng độ Mg
2+
ảnh hưởng mạnh tới quá trình chạy PCR. Nồng
độ Mg
2+
quá thấp (< 0,5 mM) sẽ làm giảm phản ứng kéo dài mạch DNA do hoạt động
của Taq polymerase bị ức chế. Nồng độ Mg
2+
quá cao tuy ổn định mạch kép DNA
nhưng lại hạn chế sự biến tình hoàn toàn sản phẩm trong mỗi chu kỳ dẫn đến giảm sản
phẩm cuối cùng. Quá thừa Mg
2+
dẫn đến sự bắt cặp sai giữa primer và khuôn, kết quả
là tạo ra nhiều sản phẩm không đặc hiệu. Nồng độ tối ưu Mg
2+
phải được xác định cho
từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998).


18

2.3.4. Những ứng dụng quan trọng của phản ứng PCR
Kể từ khi ra đời, phương pháp PCR ảnh hưởng sâu sắc tới các nghiên cứu về
sinh học phân tử. Các ứng dụng tiêu biểu của PCR bao gồm: sản xuất mẫu dò dùng
trong phương pháp lai phân tử, xác định trình tự acid nucleic, tạo đột biến điểm định
hướng. Ngoài ra, PCR còn được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác như:
Trong y học, PCR được dùng trong chẩn đoán nhanh các bệnh có nguyên nhân là
các vi sinh vật mà không có khả năng mọc trên môi trường nuôi cấy hoặc chậm phát
triển như virus HIV, Mycobacterium tuberculosis, Chlamydia thông qua việc khuếch
đại va phát hiện đoạn DNA đặc hiệu.
Trong lĩnh vực pháp y, PCR được ứng dụng để thiết lập dấu vân tay DNA.
Trong ngành khảo cổ học, PCR giúp khuếch đại những đoạn DNA của những sinh
vật đã tuyệt chủng như khủng long, voi răng mấu và những hóa thạch khác.
Gần đây nhất là sự đóng góp thiết thực của kỹ thuật PCR trong việc giải mã bộ gen
người.

2.4. Nguyên tắc đọc trình tự
2.4.1. Nguyên tắc phƣơng pháp đọc chuỗi mã Sanger
Phương pháp đọc chuỗi mã Sanger dựa trên sự tổng hợp sợi DNA bổ sung của
sợi cần được xác định trình tự. Trong các phản ứng tổng hợp sợi bổ sung,
dideoxynucleotide được bổ sung vào thành phần phản ứng. Dideoxynucleotide
(ddNTP) là các deoxynuckeotide đã được khử nhóm OH ở 3’, khi dideoxynucleotide
gia nhập vào chuỗi, sự kéo dài chuỗi sẽ ngưng lại (Khuất Bửu Thanh, 2003).

2.4.2. Nguyên tắc giải trình tự gen bằng máy sequencer
Nguyên tắc chung của máy giải trình tự gen tự động dựa trên cơ sở phương
pháp dideoxy. Máy đọc trình tự cả trên hai mạch đơn, do vậy có thể phát hiện và giảm
các nhầm lẫn do kỹ thuật. Cả hai loại primer xuôi và ngược đều được sử dụng để đọc
cả hai mạch đơn DNA (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999).
Giải trình tự theo phương pháp tự động không phải dùng chất phóng xạ mà sử
dụng các chất huỳnh quang để đánh dấu DNA, máy sequencer có thể phát hiện cùng

một lúc hiện tượng huỳnh quang ở bốn độ dài sóng khác nhau (Bùi Chí Bửu và
Nguyễn Thị Lang, 1999).

19

2.4.3. Đọc trình tự sản phẩm PCR
Có hai phương pháp đọc trình tự sản phẩm PCR:
Một là, người ta sẽ tạo ra các dòng phụ (subclone) của sản phẩm PCR sau đó đọc
trình tự các subclone này.
Hai là, đọc trình tự sản phẩm PCR một cách trực tiếp, phương pháp này là một cải
tiến kỹ thuật rất quan trọng trong phân tích genome. Phương pháp này được ưa thích
sử dụng hơn vì người nghiên cứu có thể nhanh chóng có được đặc điểm của trình tự
của đối tượng nghiên cứu mà không cần phải xây dựng một kho lưu trữ clone.



2.5. Nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về nấm Beauveria bassiana
2.5.1. Nghiên cứu trong nƣớc
Ở nước ta kể từ năm 1990 đến nay, các nghiên cứu về nấm Beauveria bassiana
chủ yếu là các nghiên cứu về công nghệ sản xuất các chế phẩm từ nấm và hiệu suất
phòng trừ côn trùng của chúng.
Theo Phạm Thị Thùy và cộng sự (1991 - 1995), nguồn nấm Beauveria ở nước
ta khá phong phú. Chế phẩm nấm Beauveria bassiana được sản xuất bằng phương
pháp lên men xốp, sinh khối nấm đạt 5 x 10
8
bào tử/gam, thời gian thu hoạch nấm tốt
nhất theo phương pháp này là 10 ngày, chế phẩm được làm khô ở nhiệt độ 45
o
C trong
8 giờ và có thể được bảo quản trong thời gian 6 tháng. Khi thử nghiệm phương pháp

lên men chìm có sục khí trong nồi lên men 5 lít chứa môi trường có pepton, cao nấm
men và muối khoáng thì sau 48 giờ ở 30 phút bào tử nấm Beauveria đạt 8,5 x 10
9
bào
tử/gam. Hiệu quả sử dụng tốt nhất của chế phẩm nấm là trên rầy nâu hại lúa, sâu đo
xanh hại đậu, châu chấu sống lưng vàng với nồng độ sử dụng là 5 - 6 x 10
8
bào tử/ml.
Hiệu lực của thuốc nấm phụ thuộc chủ yếu vào nhiệt độ và độ ẩm.
Theo Viện sinh học nhiệt đới, Thành phố Hồ Chí Minh, các nòi nấm có hiệu lực
diệt sâu cao có thể mất dần tính độc trong quá trình nuôi cấy. Sử dụng phương pháp
tách tế bào đơn từ sâu nhiễm đã chọn được các chủng nấm diệt sâu có độc tính cao. Từ
các mẫu sâu chết ngoài đồng ruộng đã phân lập được 9 chủng nấm Beauveria bassiana
từ sâu xanh da láng, châu chấu và bọ hà khoai lang Đà Lạt, Hóc Môn và Indonesia.

20
Thử nghiệm trong phòng thí nghiệm cho thấy 9 chủng đều có hiệu lực diệt trùng ấu
trùng tằm, ấu trùng bọ hà, bọ hà trưởng thành và sâu xanh da láng nhưng ở các mức độ
khác nhau. Thử nghiệm kết hợp nấm Beauveria bassiana với pheromon trên ruộng
khoai lang ở Thủ Đức làm giảm 10 % số củ khoai lang bị hà (trích dẫn bởi Nguyễn
Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997).
Nguyễn Xuân Niệm (2003) khi nghiên cứu hiệu lực trừ sâu hại của chế phẩm
Bemetent (được phối từ 3 loại nấm Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana và
Entomopthorales) của Công ty Hợp danh Sinh Thành trong phòng trừ bọ cánh cứng
hại dừa tại Kiên Giang đã kết luận rằng Bemetent có hiệu lực phòng trừ cả thành
trùng và ấu trùng của bọ cánh cứng hại dừa.


2.5.2. Nghiên cứu ngoài nƣớc
Glare và Inwood (1998) đã so sánh di truyền các giống Beauveria phân lập từ

New Zealand bằng hai phương pháp RAPD và RFLP. Kết quả phân tích RAPD sử
dụng 10 primer khác nhau đã chia các giống phân lập được thành 4 nhóm có kiểu di
truyền khác nhau: nhóm nhân không đồng nhất B. bassiana/B. brongniartii, nhóm B.
bassiana, nhóm B. brongniartii và một nhóm gồm các giống Beauveria khác. Sử dụng
enzyme cắt giới hạn vùng ITS của rDNA nhân cho thấy có sự khác biệt về di truyền
giữa giống B. bassiana và nhóm nhân không đồng nhất B. bassiana/B. brongniartii.
Hegedus và cộng sự (1998) đã giải toàn bộ vùng gen mã hóa SSU-RNA của ti
thể nấm Beauveria bassiana. Khi so sánh trình tự này với các trình tự ở vùng tương tự
của nấm sợi thì thấy có sự khác biệt lớn. Các kết quả từ việc phân tích cây phát sinh
loài cho thấy nấm Beauveria bassiana có mối liên hệ chặt chẽ với nấm bột hơn là nấm
túi, kết quả này không giống với các kết quả so sánh trước đó tiến hành ở nấm sợi.
Theo Wang C. – Z., Li Z. – Z. và Butt T. M. (2002), các dòng đơn bào tử của
nấm Beauveria bassiana là Bb 123 (phân lập từ Ammophila sp.) và Bb 151 (phân lập
từ Brachyderes incanus) có thể được phân biệt dựa vào marker phân tử là một đoạn
intron trong vùng 11 của 28 S rDNA. Khi sử dụng hai primer I21 và I22 để khuếch đại
vùng 11 này thì sản phẩm khuếch đại của hai dòng này có kích thước không bằng
nhau. Kết quả đọc trình tự cho thấy một trong hai đoạn khuếch đại có thêm một vùng
intron 405 bp, đoạn intron này cũng có thể được phân biệt bằng phương pháp RAPD

21
với các primer : OPA - 03, OPA - 08, OPA - 11, OPA - 13, OPB - 07, OPE - 01, OPE
- 04. Thử nghiệm chủng đồng thời hai dòng nấm này trên Galleria mellonella cũng
như trên môi trường nhân tạo sau đó phân tích kết quả bằng RAPD cho thấy luôn luôn
có một dòng chiếm ưu thế hơn dòng còn lại. Hơn nữa, sự nhiễm đồng thời hai dòng
lên cùng ký chủ dẫn đến việc tạo ra các thể dị nhân, tuy nhiên các thể dị nhân này
thường không ổn định và có khuynh hướng trở lại dạng bình thường giống dòng mẹ
sau nhiều lần cấy chuyền. Các phân tích ở mức độ phân cũng cho thấy không có sự tái
tổ hợp ở các dòng phân tách từ ký chủ thí nghiệm nhiễm đồng thời hai dòng nấm trên.
Talaei - hassanloui và cộng sự (2002) đã so sánh trình tự đoạn gen mã hóa RNA
ribosom 5.8 S, vùng ITS và vùng gen mã hóa các yếu tố kéo dài trong quá trình phiên

mã của 10 nguồn Beauveria bassiana khác nhau. Kết quả so sánh trình tự của vùng
ITS1 - 5.8 S - ITS2 gồm 595 nucleotide của 10 nguồn nấm trên cho thấy chỉ có 0,16 -
1,77 % trình tự là có sự biến đổi. Sử dụng phần mềm UPGMA xác định được 10
nguồn trên thuộc 3 nhóm khác nhau, các nhóm này có liên quan nguồn gốc nơi nấm
được phân lập. Ngoài ra, kết quả so sánh trình tự gene tef-1a mã hóa cho protein chỉ ra
rằng có 1,8 % trình tự có sự thay đổi và dựa trên trình tự gen này cũng có thể chia 10
nguồn trên thành 3 nhóm kiểu gen khác nhau, các nhóm kiểu gen này có liên quan tới
vùng phân bố của các nguồn nấm thu thập được. Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu cũng
cho thấy không có mối liên hệ ý nghĩa giữa các kiểu gen của nấm Beauveria bassiana
với đặc tính gây bệnh trên các côn trùng như Plutella xylostella, Leptinotarsa
decemineata, côn trùng cánh cứng hại khoai tây.
Shih HL và cộng sự (2002) đã giải trình tự hoàn toàn gene mã hóa 5.8 S rDNA
và vùng ITS lân cận 2 dòng Beauveria bassiana. Sự giống trên toàn vùng trình tự giải
được của hai dòng này là 96 %. Sự giống nhau ở vùng ITS1 là 96 %, vùng ITS2 là 100
%. Sự tương đồng của hai vùng trình tự gen mã hóa 5.8 S rRNA là 98 %.
Theo Eiji và cộng sự (2002) đã nghiên cứu vùng intron nhóm 1 trong trình tự
rDNA mã hóa tiểu đơn vị ribosom (SSU rDNA) của nấm Beauveria bassiana và chỉ ra
rằng tổ tiên của Cordicepts prolifera và C. kanzashiana có được các vùng intron trong
trình tự rDNA là do nhận được từ các nấm khác. Khi tiến hành đọc trình tự của SSU
rDNA cua nấm Beauveria bassiana và các nấm có liên quan thì thấy có sự đa hình xảy
ra giống như sự đa hình giữa các dòng Beauveria bassiana. Sự đa hình này xảy ra do
có sự chèn các intron nhóm 1 vào trình tự.

22
Theo Martin Kendall J and Rygiewicz Paul T (2005), các vùng ITS của rDNA
nấm có sự thay đổi lớn trong trình tự, trên cơ sở các khác biệt trong trình tự này có thể
phân biệt các loài nấm nhờ phản ứng PCR. Hai primer ITS1 và ITS2 thường được sử
dụng để khuếch đại vùng gen 5,8 S tạo các đoạn khuếch đại kích thước không giống
nhau giữa các loài.

23
Phần III. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Thời gian, địa điểm và đối tƣợng nghiên cứu
3.1.1. Thời gian và địa điểm
Đề tài được tiến hành từ 28/2/2005 - 30/7/2005 tại phòng thí nghiệm Bảo vệ
thực vật - Khoa Nông học và phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học Bảo vệ thực vật -
Trung tâm phân tích thí nghiệm hóa sinh.

3.1.2. Đối tƣợng nghiên cứu
Bảng 3.1 Đối tƣợng nghiên cứu
Ký chủ Nơi thu thập Tên khoa học Ký hiệu
Nguồn
tham khảo
Rệp vảy mềm
nâu tím
Bình Chánh
Quận 2
Pulvinaria sp.
(Coccidae-Homoptera)
PUL-BC
PUL-Q2
1
1
Sâu cuốn lá nhỏ Long An
Kiên Giang
Cnaphalocrosis medinalis
G. (Pyralidae-Lepidoptera)
SCL-LA
SCL-KG

1
2
Bọ xít đen Quận 9 Scotinophora spp.
(Pentatomidae-Hemiptera)
BXD-Q9 1
Bọ hà Bình Dương Cylas formicalus
(Curculionidae-Coleoptera)
BH-BD 1
Cào cào Thủ Đứ Oxya sp.
(Acrididae-Orthoptera)
CC-TD 1
Rầy mềm Thủ Đức Pulvinaria sp.
(Coccidae-Homoptera)
RM-TD 1
Sâu đục thân bắp

Thủ Đức
Ostrinia furnacalis H.
(Pyralidae-Lepidoptera)
DTB

1
Sâu xanh da láng Bình Dương Spodoptera exigua H.
(Noctuidae-Lepidoptera)
DP-BD

1
Bọ Trĩ Phan Thiết Thrips SNPT 1
Sâu xanh Bình Dương Spodoptera litura Fab.
(Noctuidae-Lepidoptera)

SX-BD 1
Rầy nâu Long An Nilaparvata lugens RN-LA 1
Nhiều chủng nấm khác

24
Ghi chú:
Nguồn tham khảo (1): Lê Thị Kim Thoa, 2004.
Nguồn tham khảo (2): Mới thu thập và phân lập. .

3.2. Phân lập và nhân sinh khối các nguồn Beauveria bassiana
3.2.1. Hóa chất và dụng cụ
3.2.1.1. Hóa chất
Môi trường sử dụng: Agar, PGA, CZA
Bảng 3.2 Thành phần môi trƣờng phân lập và nhân nấm
Môi trƣờng agar (1 lít) Môi trƣờng PGA (1lít) Môi trƣờng CZA (0,5 lít)
Agar: 15 g
Nước cất một lần: 1 lít
Khoai tây: 200 g
Đường glucose: 17 g
Agar: 15 g
Nước cất một lần
Glucose: 15 g
Yeast extract: 2,5 g
NaNO
3
: 1,5 g
K
2
HPO
4

: 0,5 g
MgSO
4
.7H
2
O: 0,25 g
Nước cất 2 lần: 500 ml
pH: 6 - 6,5

3.2.1.2. Dụng cụ thí nghiệm
Đĩa petri, đèn cồn, các loại que cấy, lame, lamel, kính hiển vi, cân phân tích,
giấy lọc, giấy bạc.

3.2.2. Phƣơng pháp phân lập nấm
Cách nấu môi trường agar: đong 1 lít nước cất một lần nấu sôi, cho 15 g agar
vào đun cho đến khi agar tan hoàn toàn, rót vào bình tam giác, hấp vô trùng ở 121
o
C, 1
atm trong 25 phút.
Cách nấu môi trường PGA: gọt vỏ khoai tây, rửa sạch, cắt nhỏ, cho vào nước
cất đang sôi, nấu khoảng 25 phút, lọc bỏ khoai tây và thêm nước cất cho đủ 1 lít, đun
sôi trở lại, cho agar và agarose vào, tiếp tục đun sôi cho đến khi agarose và agar tan
hoàn toàn, rót môi trường vào bình tam giác đem hấp vô trùng, đổ đĩa petri.
Nấm từ mẫu côn trùng chết được phân lập bằng môi trường PGA và agar
(Nguyễn Thị Bích Lập, 2005).

25
Đặt côn trùng nhiễm nấm trên một lame sạch và chuyển vào một đĩa petri có
sẵn lớp giấy ẩm, để ở nhiệt độ phòng trong 3 - 7 ngày. Sau khi nấm phát triển mạnh và
tạo thành một lớp bột trắng phủ đầy trên mình côn trùng, dùng que cấy chấm bào tử

cấy 3 điểm vào môi trường PGA, để ở nhiệt độ phòng trong 7 ngày. Quan sát cách
mọc bào tử của nấm dưới kính hiển vi, khi đã khẳng định nấm được phân lập là
Beauveria bassiana thì tiến hành tách đơn bào tử.
Đặt các lame sạch vào đĩa petri, hút 1 ml môi trường agar cho vào lame và trang
thành một lớp mỏng. Dùng nước cất 2 lần vô trùng để pha loãng bào tử nấm. Hút 10
ml nước cho trực tiếp vào đĩa nấm, quan sát mật độ bào tử dưới kính hiển vi và pha
loãng tới mật độ thích hợp thuận lợi cho quá trình tách đơn bào tử.
Hút 0,1 ml dịch bào tử chuyển lên lame agar đã chuẩn bị, dùng que cấy tam
giác trang đều cho đến khi bề mặt agar khô hoàn toàn. Sau 12 giờ, quan sát lame agar
dưới kính hiển vi, tìm vị trí bào tử mọc thưa, cắt phần agar chứa từng bào tử đơn
chuyển sang môi trường PGA.

3.2.3. Phƣơng pháp nhân sinh khối
Nấm sau khi phân lập được tiến hành nhân sinh khối trong môi trường CZA
(Rakotonirainy, 1991).
Cách nấu môi trường CZA: Đong 0,5 lít nước cất 2 lần cho vào becher 1 lít, đặt
lên máy khuấy từ ở 100
o
C. Cho yeast extract vào khuấy tan, tiếp tục cho các muối
NaNO
3
, K
2
HPO
4
, MgSO
4
.7H
2
O khuấy cho đến khi các muối này tan hoàn toàn thì

ngưng, để nguội và đo pH, rót 80 ml môi trường vào mỗi bình tam giác 250 ml, hấp vô
trùng ở 121
o
C trong vòng 30 phút.
Các dòng nấm sau khi tách đơn bào tử đem nuôi cấy trên môi trường PGA
trong đĩa petri, sau khi nấm mọc được 15 ngày tuổi dùng que cấy mốc nhúng ướt hớt
ngang bề mặt khuẩn lạc để thu bào tử chuyển sang môi trường lỏng CZA, lắc 120
vòng/phút ở 27
o
C trong 1 tuần, thu sợi nấm, phơi khô, gói vào giấy bạc và bảo quản ở
-70
o
C.