Đề cương nuôi cấy mô tế bào pps

Câu 1: Nêu khái niệm về nuôi cấy mô, tế bào thực vật? Các kỹ thuật nuôi cấy
chính và ứng dụng?
Khái niệm: nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả
các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường
dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng.
Nuôi cấy mô, tế bào thực vật còn gọi là nuôi cấy thực vật in vitro
Nuôi cấy mô, tế bào thực vật bao gồm hoang loạt các kỹ thuật khác nhau và có khả
năng ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều lĩnh vực.
Các kỹ thuật nuôi cấy chính và ứng dụng của nó:
Nuôi cấy hạt giống: tăng khả năng nảy mầm của các hạt khó nảy mầm trong điều
kiện bình thường. Thúc đẩy quá trình này mầm bằng cách bổ sung các chất điều tiêt
sinh trưởng. Tạo ra cây con dùng cho nuôi cấy merisrem hoặc các bộ phận khác
Hoa cái: thụ phấn trong ống nghiệm phục vụ lai xa. Tạo đơn bội và tạo đa phôi
Hoa đực: tạo mô sẹo và cây đơn bội. Tạo đột biến ở mức đơn bội. Tạo dòng đồng
hợp tử
Phôi hợp tử: nuôi cấy cứu phôi khi lai xa. Nhân các dòng lai xa. Phá ngủ nghỉ của
hạt.
Mô sẹo: tạo phôi vô tính. Nuôi cấy tế bào đơn và tách tế bào trần. Tạo cây có biến
dị soma
Tế bào: tạo đột biến ở mức độ tế bào. Tạo tế bào trần để lai vô tính. Biến nạp gen.
Nuôi cấy tế bào đơn
Đỉnh chồi: tạo nhân nhanh dòng đồng nhất về di truyền. Làm sạch virus. Nguyên
cứu -sinh lý phát triển
Phân hóa phôi vô tính: là đường hướng tái sinh chủ yếu. ứng dụng: nhân nhanh,
sản xuất hạt nhân tạo. Cung cấp vật liệu để tạo các protoplast có khả năng sinh phôi.
Cho phép cơ khí hóa quá trình nuôi cấy và sử dụng bioreactor
Đột biến soma: phân lập các biến dị có ích ở kiểu hình lý tưởng song còn thiếu một
số tính trạng mong muốn. Phân lập các biến dị có tích để sản xuất các hợp chất
chống chịu stress tốt hơn. Tạo các biến dị di truyền không qua lại hữu tính ở những
dòng ưu tú
Câu 2: Nêu những ưu điểm của phương pháp nuôi cấy mô – tế bào thực vật so

với các phương pháp truyền thống khác?
 Thứ nhất: vi nhân giống (micropropagation)
- Thực hiện trong phòng thí nghiệm, không chịu ảnh hưởng của thời tiết, mùa
vụ. Chủ động sản xuất cây giống.
- Sinh sản vô tính tạo ra một lượng lớn cây giống giữ nguyên bản chất di truyền
như cây mẹ.
- Hệ số nhân cao, tốc độ tăng trưởng nhanh và rút ngắn thời gian ra hoa quả với
những cây lâu năm.
- Sản xuất hạt nhân tạo.
 Thứ hai, chọn và tạo giống in vitro
- Chọn các dòng kháng vi rút, chịu lạnh, chịu hạn,
1
- Tạo dòng thuần nhanh bằng cách nuôi cấy bao phấn rồi đa bội hoá nhờ hoá
chất.
- Tạo cây trồng biến đổi gen mang nhiều tính trạng quý.
- Dung hơp tế bào trần
 Thứ ba, sản xuất các hoá chất có hoạt tính sinh học
- Sản xuất chủ động và liên tục trong phòng thí nghiệm không phụ thuộc vào tự
nhiên và mua vụ.
- Nhiều hợp chất sinh học phức tạp nhân được từ tế bào nuôi cấy.
- Chọn các dòng tế bào sản xuất các chất với năng suất cao hơn cây ngoài tự
nhiên
- Thu nhân nhiều chất quý hiếm mà tổng hợp hoá học rất đắt. Bản thân cây đó
tăng trưởng chậm, sinh sản khó khăn thì nuôi cấy mô và khống chế tạo mô (mô
rễ) sản sinh ra nhiều chất đó
-
Câu 3: Trình bày cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô – tế bào?
*Cấu trúc chung của tế bào thực vật
-Học thuyết tế bào:Schleiden và Schwann (1839) đã độc lập đưa ra kết luận:
- Cơ thể thực vật vầ động vật đều do các tế bào hợp thành và tế bào là đơn vị cấu

trúc và chức năng của tất cả mọi cơ thể sống
- Tế bào là đơn vị cấu trúc và chức năng của cơ thể thực vật bởi tế bào rất đa dạng
nhưng tổ chức theo nguyên tác cấu trúc thống nhất và có tất cả các đặc tính của thệ
thống sống:
- Trao đổi chất và năng lượng
- Sinh trưởng, phát triển và sinh sản
- Di truyền cho thế hệ sau đặc tính của mình
- Có khả năng tồn tại độc lập và phân chia trên môi trường dinh dưỡng. Trong
điều kiện nuôi cấy thích hợp tế bào có thể tái sinh và phát triển thành cơ thể
nguyên vẹn.
* Tính toàn năng của tế bào (totipotency): Haberlandt (1902), lần đầu tiên quan niệm
răng: Mỗi một tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm
tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh.
- Theo quan niệm của sinh học hiện đại: Mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều
mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật
đó. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá
thể hoàn chỉnh.
- Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sơ lý luận của
phương pháp nuôi cấy mô - tế bào.
*Sự biểu hiện tính toàn năng của tế bào trong nuôi cấy in vitro:
• Quá trình từ nguồn vật liệu ban đầu là tế bào hoặc mô thực vật nuôi cấy phân
hóa thành cây hoàn chỉnh được gọi là sự biểu hiện về tính toàn năng của tế
bào thực vật.
2
Kh nng biu hin tớnh ton nng ca cỏc t bo, mụ ca c th l khỏc
nhau.
Tớnh ton nng ca t bo nuụi cy in vitro biu hin tri qua 3 giai on:
+ T bo phn bit húa vi s phỏt sinh t bo kh bin
+ nh hng phõn húa t bo
+ Phỏt sinh hỡnh thỏi, phỏt sinh c quan

*S phõn húa, phn phõn húa t bo v s hỡnh thnh t bo kh bin: S phõn húa
t bo :
T bo phụi sinh t bo mụ chuyờn húa, m bo chc nng chuyờn
bit.
Vd: mụ du, mụ bỡ, mụ mm, mụ dn
S phn phõn húa:
- S phn phõn húa l quỏ trỡnh t bo ó phõn húa (chuyờn húa) trong mt iu
kin nht nh, khụi phc kh nng phõn chia chuyn thnh t bo phõn sinh v hỡnh
thnh mụ so.
Trong ú cú mt b phn t bo hỡnh thnh t bo cm ng phỏt sinh hỡnh thỏi, tc
l t bo cú th cm th tớn hiu kớch thớch phõn t, t ú xỏc nh ng hng
mi ca s sinh trng v phỏt trin t bo
iu khin s phõn húa v phn phõn húa t bo thc vt dn n s phỏt
sinh hỡnh thỏi trong nuụi cy mụ t bo thc vt.
Nuụi cy mụ t bo thc vt chớnh l iu khin s phỏt sinh hỡnh thỏi ca t
bo, mụ nuụi cy
Cõu 4. Nờu cỏc thnh phn chớnh ca mụi trng dinh dng nuụi cy mụ t
bo thc vt in vitro
Môi trờng nuôi cấy là điều kiện tối cần thiết, là yếu tố quyết định cho sự phân hóa tế bào và
cơ quan trong nuôi cấy. Có nhiều loại môi trờng nuôi cấy cho các loại thực vật khác nhau và
mục đích nuôi cấy khác nhau. Môi trờng thờng bao gồm các thành phần chính sau đây:
Nguyên tố đa lợng
Nguyên tố vi lợng
Nguồn các bon hữu cơ
Các vitamin
Chất điều tiết sinh trởng thực vật
Các hỗn hợp chất tự nhiên
Chất làm đông môi trờng
Các nguyên tố đa lợng:
Các nguyên tố khoáng chất mà thực vật cần thiết khi nồng độ lớn hơn 0,5 mM/l gọi là

nguyên tố đại lợng
Các nguyên tố: N, P, K, S, Mg, Ca, là cần thiết vàthay đổi tùy theo đối tợng nuôi cấy. Nói
chung, nồng độ mỗi nguyên tố nói trên trong môi trờng > 30ppm. Chúng là nguyên liệu
để tế bào xây dựng nên thành phần cấu trúc của mình.
Các nguyên tố vi lợng: Các nguyên tố khoáng m thực vật cần thiết có nồng độ nhỏ hơn 0,5
mM/l gọi l nguyên tố vi l ợng.Fe, Cu, Zn, Mn, Mo, Bo, I, Co l các nguyên tố vi l ợng
thờng đợc dùng trong môi trờng nuôi cấy in vitro. Các nguyên tố ny đóng vai trò quan
3
trọng trong các hoạt động của enzym. Chúng đợc dùng với nồng độ mỗi nguyên tố <30ppm
v tuỳ thuộc v o loại môi tr ờng m h m l ợng v tỷ lệ của chúng sẽ thayđổi
Trong môi trờng nuôi cấy, Fe thờng đợc dùng dới dạng muối phức (chelat): Fe-EDTA,
Fe-citrate
Nguồn các bon hữu cơ:
Khi nuôi cấy in vitro tế b o, mô thực vật sống chủ yếu theo ph ơng thức dị dỡng. Vì vậy,
cần nguồn cac bon hữu cơ v th ờng dùng l đ ờng saccaroza v với liều l ợng 20 -30g/lít.
Trong một số trờng hợp đặc biệt, có thể sử dụng nguồn đờng khác nh glucoza, maltoza ,
galactoza v lactoza
Các vitamin.
Mô, tế b o nuôi cấy in vitro có thể tự tổng hợp vitamin nh ng không đủ cho hoạt động sống
của chúng nên cần bổ sung thêm vitamin v o môi tr ờng nuôi cấy Đáng chú ý l các vitamin:
thiamin, axit nicotinic, pyridoxin v riboflavin. Nồng độ th ờng dùng khoảng 1mg/lít. Các
vitamin n y đóng vai trò quan trọng trong tế b o vì chúng l các co-enzym. Myo-inositol cần
đợc bổ xung vo một lợng khá lớn 50 - 100mg/lít, chất n y tỏ ra có tác dụng khá rõ đến sự
phân chia của tế bo.
Các chất điều tiết sinh truởng.
Các chất điều tiết sinh trởng l yếu tố quan trọng nhất trong môi tr ờng quyết định kết quả
nuôi cấy auxin v xytokinin đ ợc sử dụng nhiều hơn cả trong nuôi cấy invitro.
*Auxin kích thích sự hình th nh mô sẹo v tạo rễ bất định, kích thích sự d_n của tế b o. Các
auxin thờng sử dụng l : 2,4 - Dicloro phenoxy axetic axit (2,4D), -naphtylaxetic axit ( -
NAA), Indolaxetic axit (IAA). Nồng độ sử dụng:10-5-10-7 M/l *Xytokinin kích thích sự phân

chia tế b o v quyết định sự phân hóa chồi. Các xytokinin th ờng đợc sử dụng l
Benzyladenin (BA), Kinetin, 2 isopentenyladenin (2 iP) v Zeatin (một chất tự nhiên). Nồng
độ sử dụng: 10-5 - 10-7 M
*Tỷ lệ Auxin/Xytokinin quyết định sự phân hóa của mẫu cấy theo hớng tạo rễ, chồi hay mô
sẹo.
Các hỗn hợp chất tự nhiên
L th nh phần th ờng đựoc sủ dụng nhng không phải l th nh phần bắt buộc. Chúng l m
gia tăng th nh phần dinh d ỡng v chất có hoạt tính sinh lý cho môi tr ờng nên kích thích sự
sinh trởng v phân hoá của mẫu cây.Th ờng bao gồm:
* Nớc dừa: thờng chứa các axit amin, axit hữu cơ, đờng, ARN, AND. Đặc biệt trong
nớc dừa có chứa những hợp chất quan trọng cho nuôi cấy invitro đó l : myoinositol, các hợp
chất có hoạt tính auxin, các glucosit của xytokinin.
* Dịch nghiền của 1 số rau, quả tơi (khoai tây, c rốt, chuối, táo ): Th nh phần hóa học
có: đờng, axit nucleic, axit amin, vitamin, khoáng
* Dịch thủy phân casein (casein hydrolysat) hay pepton : chủ yếu đợc sử dụng l m nguồn bổ
xung axit amin.
Chất l m đông cứng môi tr ờng - Agar.
Agar l một loại polysaccarit của tảo. ở 80 0C thạch ngậm nớc chuyển sang trạng thái sol
còn ở 40 0C thì trở về trạng thái gel. Khả năng ngậm nớc của thạch khá cao: 6 - 12 gam/lít
nớc. Thạch ở dạng gel nhng vẫn để cho các ion vận chuyển dễ dung v có độ thoáng khí
cao. Nồng độ trung bình 6 - 8g/lít
4
Câu 5 Có mấy nhóm chất điều hòa sinh trưởng? Nêu vai trò của chúng trong
điều khiển sự phát sinh hình thái của mô, tế bào thực vật nuôi cấy in vitro?
Bên cạnh các chất cung cấp dinh dưỡng cho mô nuôi cấy, việc bổ sung một hoặc
nhiều chất điều hòa sinh trưởng như auxin, cytokinin và giberellin là rất cần thiết để
kích thích sự sinh trưởng, phát triển và phân hoá cơ quan, cung cấp sức sống tốt cho
mô và các tổ chức. Tuy vậy, yêu cầu đối với những chất này thay đổi tuỳ theo loài
thực vật, loại mô, hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng nội sinh của chúng. Các chất
điều hoà sinh trưởng thực vật được chia thành các nhóm chính sau đây:

A. Nhóm auxin
Môi trường nuôi cấy được bổ sung các auxin khác nhau như: 1H- indole-3-acetic
acid (IAA), 1-naphthaleneacetic acid (NAA), 1H-indole-3-butyric acid (IBA), 2,4-
dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) và naphthoxyacetic acid (NOA)
Vai trò:
- Kích thích phân chia và kéo dài tế bào
- Chồi đỉnh cung cấp auxin gây ra ức chế sinh trưởng của chồi bên. Ưu thế chồi đỉnh
làm ức chế sinh trưởng của chồi nách. Nếu ngắt bỏ chồi đỉnh sẽ dẫn đến sự phát
chồi nách. Nếu thay thế vai trò của chồi đỉnh (đã bị ngắt bỏ) bằng một lớp chất keo
có chứa IAA thì chồi nách vẫn bị ức chế sinh trưởng. Cơ chế ức chế của chồi đỉnh
liên quan đến một chất điều hoà sinh trưởng khác là ethylene. Auxin (IAA) kích thích
chồi bên sản sinh ra ethylen làm ức chế sinh trưởng của chồi đỉnh.
- IAA đóng vai trò kích thích sự phân hoá của các mô dẫn (xylem and phloem).
- Auxin kích thích sự mọc rễ ở cành giâm và kích thích sự phát sinh chồi phụ trong
nuôi cấy mô.
- Auxin có các ảnh hưởng khác nhau đối với sự rụng lá, quả, sự đậu quả, sự phát
triển và chín của quả, sự
ra hoa trong mối quan hệ với điều kiện môi trường.
- Tạo và nhân nhanh mô sẹo (callus)
- Kích thích tạo chồi bất định (ở nồng độ thấp)
- Tạo phôi soma (2,4-D)
B. Nhóm các cytokinin
Các cytokinin là dẫn xuất của adenine, đây là những hormone liên quan chủ yếu đến
sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy mô.
Các cytokinin được sử dụng thường xuyên nhất là 6-benzylaminopurine (BAP) hoặc
6-benzyladenin (BA), 6-γ-γ-dimethyl-aminopurine (2-iP), N-(2-furfurylamino)-1-H-
purine-6-amine (kinetin), và 6-(4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butanylamino)purine
(zeatin). Zeatin và 2-iP là các cytokinin tự nhiên, còn BA và kinetin là các cytokinin
nhân tạo
Chức năng chủ yếu của các cytokinin được khái quát như sau:

1- Kích thích phân chia tế bào
5
2- Tạo và nhân callus
3- Kích thích phát sinh chồi trong nuôi cấy mô
4- Kích thích phát sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hưởng ưu thế của chồi đỉnh
5- Làm tăng diện tích phiến lá do kích thích sự lớn lên của tế bào
6- Có thể làm tăng sự mở của khí khổng ở một số loài
7- Tạo chồi bất định (ở nồng độ cao)
- Ức chế sự hình thành rễ
- Ức chế sự kéo dài chồi
8 - Ức chế quá trình già (hoá vàng và rụng) ở lá, kích thích tạo diệp lục
C. Gibberellin có các chức năng cơ bản sau:
1- Các mô phân sinh trẻ, đang sinh trưởng, các phôi non, tế bào đầu rễ, quả non,
hạt chưa chín hoặc đang nảy mầm đều có chứa nhiều gibberellic axit.
2- Kích thích kéo dài chồi do tăng cường phân bào và kéo dài tế bào, ví dụ kéo dài
thân và đòng lúa sau khi phun GA3, kéo dài đốt thân. Các cây lùn thường bị
thiếu gibberellin.
3- Phá ngủ hạt giống hoặc củ giống, ví dụ phá ngủ khoai tây sau thu hoạch.
4- Kiểm soát sự ra hoa của các cây 2 năm tuổi. Năm đầu thân mầm nằm in, sau
mùa đông mầm hoa kéo dài đốt rất nhanh và phân hoá hoa
5- Ức chế sự hình thành rễ bất định
6- Kích thích sinh tổng hợp của α-amylase ở hạt cây ngũ cốc nảy mầm, giúp tiêu
hoá các chất dự trữ trong nội nhũ để nuôi mầm cây
7- Các chất ức chế tổng hợp kích thích quá trình tạo củ (thân củ, thân hành và củ)
8- Kích thích sự nảy mầm của phấn hoa và sinh trưởng của ống phấn
9- Có thể gây tạo quả không hạt hoặc làm tăng kích thước quả nho không hạt
10 - Có thể làm chậm sự hoá già ở lá và quả cây có múi
D. Abscisic axít (ABA)
- Tham gia vào sự rụng lá, hoa, quả ở hầu hết các cây trồng và gây ra sự nứt
quả

- ABA thường được sản sinh khi có các yếu tố ức chế cây trồng như mất nước
và nhiệt độ thấp đóng băng
- Tham gia vào sự ngủ nghỉ, kéo dài thời gian ngủ nghỉ và làm chậm sự nảy
mầm của hạt
- Ức chế sự kéo dài thân và được sử dụng để kiểm soát sự kéo dài thân cành
- Gây ra sự đóng khí khổng
6
E. Ethylene
- Gây già hoá lá, kích thích sự rụng lá và quả
1 - Làm chín quả
1 - Sinh tổng hợp ethylene được tăng cường khi quả đang chín, cây đang bị úng,
lão hoá, tổn thương cơ giới và bị nhiễm bệnh
2- Điều khiển sự chín của một số loại quả
3- Ethylene kìm hãm sự ra hoa của đa số cây. Tuy vậy, sự ra hoa của xoài, dứa,
một số cây cảnh lại được kích thích bởi ethylene.
4 - Kích thích nở hoa, kích thích sự lão hoá của hoa và lá
5
Câu 6: Nêu khái niệm về nhân giống vô tính in vitro? Nêu các bước chính trong
quy trình nhân giống vô tính in vitro
a. Nhân giống vô tính in vitro
Khái niệm chung: Nhân giống vô tính in vitro là quá trình sản xuất một lượng lớn
cây hoàn chỉnh, từ các bộ phận, cơ quan như: chồi, mắt ngủ, vảycủ, đoạn thân,
lá, của cây mẹ ban đầu thông qua kỹ thuật nuôi cấy in vitro.
Nhân nhanh in vitro được ứng dụng vào:
 Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quí làm vật liệu cho công tác giống.
 Nhân nhanh các loài hoa, cây cảnh khó trồng bằng hạt.
 Duy trì nhân nhanh các dòng bố mẹ và các dòng lai để tạo hạt giống cây rau,
cây hoa và cây trồng khác.
 Nhân nhanh kết hợp với làm sạch virus.
 Bảo quản nguồn gen in vitro

b. Các bước chính:
Bước 1 . Chọn lọc và chuẩn bị cấy mẹ
 Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ (cây
cho nguồn mẫu nuôi cấy).
 Các cây này cần phải sạch bênh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai đoạn sinh
trưởng mạnh.
 Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm
sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu cấy sẽ làm giảm tỷ lệ
mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu cấy in vitro.
Bước 2. Nuôi cấy khởi động
 Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai đoạn này cần đảm
bảo các yêu cầu: Tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt.
 Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây: mô non,
ít chuyên hoá (đỉnh chồi, mắt ngủ, lá non, vảy củ )
 Xác định chế độ khử trùng mẫu cấy thích hợp:th-ờng dùng các chất: HgCl2
0,1% xử lý trong 5-10 phút, NaOCl, Ca(OCl)2 5-7% xử lý trong 15-20 phút,
hoặc H2O2, dung dịch Br

7
Bước 3. Nhân nhanh
 Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số lượng
thông qua các con đường: hoạt hoá chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô
tính.
 Vấn đề là phải xác định được môi trường và điều kiện ngoaị cảnh thích hợp để
có hiệu quả là cao nhất.
 Theo nguyên tắc chung môi trường có hàm lượng cytokinin> auxin sẽ kích
thích tạo chồi. Chế độ nuôi cấy thường là: 25-270C, 16 giờ chiếu sáng/ ngày,
cường độ ánh sáng 2000- 4000 lux.
Bước 4 Tạo cây in vitro hoàn chỉnh
 Để tạo rễ cho chồi, người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang môi

trường tạo rễ. Môi trường tạo rễ thường được bổ sung một lượng nhỏ auxin.
Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh
giàu cytokinin sang môi trường không chứa chất điều tiết sinh trưởng.
 Đối với các phôi vô tính thường chỉ cần gieo chúng trên môi trường không có
chất điều tiết sinh trưởng hoặc môi trường có chứa nồng độ thấp của cytokinin
để phôi phát triển thành cây hoàn chỉnh
Bước 5. Huấn luyện và đưa cây ra trồng ở vườn ươm
 Để đ-a cây từ ống nghiệm ra v-ờn -ơm với tỷ lệ sống cao, cây sinh tr-ởng tốt
cần đảm bảo một số yêu cầu:
 Cây trong ống nghiệm đ_ đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá, số rễ,
chiều cao cây).
 Có giá thể tiếp nhận cây invitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoát n-ớc.
 Phải chủ động điều chỉnh đ-ợc ẩm độ, sự chiếu sáng của v-ờn ươm cũng nh-
có chế độ dinh d-ỡng phù hợp.
Câu7: Nêu nguyên lí làm sạch virus và các kỹ thuật làm sạch virus trong
nuôi cấy mô, tế bào thực vật in vitro?
Nguyên lý làm sạch virus qua nuôi cấy meristem
Virus tồn tại ở mọi tế bào sống. Tuy nhiên, những nghiên cứu của White
(1934), Limasset và Cornuet (1950), Morel và Martin (1952) cho thấy:
 Nồng độ virus trong tế bào các cây bị bệnh phụ thuộc và tốc độ phân chia tế
bào và khả năng sinh trưởng của tế bào. Tế bào càng phân chia mạnh thì nồng
độ virus càng thấp, nghĩa là những tế bào càng gần đỉnh sinh trưởng thì càng
chứa ít virus hơn.
 Từ đây các ông đã đề xuất kỹ thuật: nuôi cấy meristem (mô phân sinh đỉnh) để
tạo ra cây hoàn toàn sạch virus từ cây đã bị nhiễm bệnh.
 White (1934) đã sử dụng phương pháp lây nhiễm nhân tạo để nghiên cứu sự
phân bố virus trong rễ cây cà chua bị bệnh virus Aucuba gây khảm lá. Kết quả
cho thấy 2 cm ở đầu rễ hầu như không phát hiện ra virus.
8
 Limasset và Cornuet (1950) đã dùng phương pháp huyết thanh định lượng,

chứng minh được sự tồn tại một gradient nồng độ virus từ các mô non đến các
mô già ở cây thuốc lá bị bệnh. Nồng độ virus bằng không ở mô đỉnh và lá bao
thứ nhất sau đó tăng dần, đạt cực đại ở lá thứ năm rồi giảm dần ở các lá già
phía dưới.
Các kỹ thuật làm sạch virus trong nuôi cấy mô-tế bào thực vật in vitro
Nuôi cấy meristem
Nuôi cấy meristem kết hợp với xử lý nhiệt
Nuôi cấy meristem kết hợp với bổ sung hóa chất
Vi gép trong ống nghiệm
Câu 8: Trình bày các phương pháp chuẩn đoán bệnh virus ở thực vật?
Các phương pháp chuẩn đoán bệnh virus
1. Chuẩn đoán bằng mắt :Đây là phương pháp chuẩn đoán dựa trên các triệu
chứng bệnh của cây.
 Phải có kinh nghiệm, dễ lẫn với triệu chứng khác.
 Rất khó phát hiện khi cây bị nhiễm tổ hợp nhiều loài virus.
 Phụ thuộc vào ngoại cảnh, tuổi cây, đặc điểm giống.

2. Chuẩn đoán bằng cây chỉ thị : Cây chỉ thị là cây khi bị nhiễm virus sẽ xuất hiện
các triệu chứng đặc trưng. Phương pháp này đã được tiến hành từ 1940.
Ưu điểm:
- Nhạy, chính xác.
- Có thể phát hiện ở nồng độ virus thấp.
Hạn chế:
- Thời gian chuẩn đoán dài, cần quá trình ủ bệnh.
- Phụ thuộc vào điều kiện thí nghiệm
- Phương pháp lây nhiễm phức tạp
- Tốn công chăm sóc cây chỉ thị, môi giới truyền bệnh.
- Một số bệnh virus không tiến hành được (bệnh cuốn lá).
3. Phương pháp huyết thanh
Ưu điểm:

- Nhạy, đặc hiệu (kết quả thu được trong 48 giờ), chi phí thấp.
- Không cần có nhà cách ly nuôi cây chỉ thị
Hạn chế:
- Có thể lẫn với một số dạng kết tủa khác.
- Phản ứng khó xảy ra ở nồng độ virus trong dịch cây bệnh thấp.
4. Phương pháp kính hiển vi điện tử
Ưu điểm
 Thao tác đơn giản, nhanh
 Khá chính xác
9
Hn ch:
Ch phỏt hin c cỏc loi hỡnh a, hỡnh si
Nhiu loi virus cú cựng hỡnh dng, kớch thc.
5. Phng phỏp ELISA
Da vo phn ng khỏng nguyờn khỏng th nhng õy khỏng th c liờn kt
vi mt enzyme (enzyme linked). Phc khỏng nguyờn khỏng th enzyme d
dng nhn bit qua phn ng to mu do chớnh enzyme ú xỳc tỏc.
6. Phng phỏp lai AND
Xỏc nh trc tip s cú mt ca ARN lừi ca virus.
Chớnh xỏc, t tin.
S nguyờn lý:
ARN virus lai vi mu dũ >>> Phn ng lai nhn bit khi mu dũ gn ng v
phúng x hoc cht phỏt hunh quang.
Cõu 9. Trỡnh by k thut bo qun ngun gen thc vt in vitro?
Đây là giải pháp công nghệ có triển vọng trong việc bảo quản nguồn gen thực vật nhất là với
các cây nhân giốngvô tínhvà có hạt mất sức nảy mầm ở nhiệt độ và ẩm độ thấp (recalcitrant).
Trong vòng 20 năm gần đây công nghệ này đã đợc phát triển rộng và áp dụng với hơn 1000
loài th c vật khác nhau (F. Engelmann,1997)
Quá trình chuẩn bị mẫu bo qun:
- Thu thập nguồn gen trong tự nhiên hoặc thông qua quá trình trao đổi giống

- Chẩn đoán bệnh, khử bệnh.
- Nuôi cấy in vitro v nhân nhanh cho đủ số l ợng mẫu để bảo quản.
Sau đó tuỳ thuộc v o đối t ợng vi mc đích m lựa chọn cách bảo quản in vitro thích hợp.
Có 2 cách bảo quản nguồn gen thực vật in vitro :
1. Bảo quản sinh truởng chậm
Đặc điểm của phuơng pháp n y l kéo d i thời gian giữa 2 lần cấy chuyển nhờ ức chế sự sinh
truởng của mẫu cấy nhằm giảm đến mức tối thiểu chi phi trong quá trình bảo
quản. Trong thời gian bảo quản mô v tế b o thực vật vẫn tiếp tục sinh tr ởng nhng với tốc
độ rất chậm (thờng giảm từ 15 - 20 lần so với bình thờng). Thời gian bảo quản sinh trởng
chậm có thể kéo d i một v i năm. Ph ơng pháp n y th ờng áp d ng để bảo quản cây non
ho n chỉnh, chồi mầm, phôi để ít gây các biến dị sinh d ng v các đặc tính di truyền
không bị mất hay thay đổi trong thời gian bảo quản.
Các nhân tố ức chế sinh trởng(trong bảo quản sinh trởng chậm)
- Nhiệt độ thấp: giảm nhiệt độ của phòng nuôi cây Chất ức chế sinh trởng: bổ sung v o môi
trờng nuôi cấy axit abcisic(ABA), Clo cholin clorit (CCC)Các chất gây áp suất thẩm thấu: bổ
sung v o môi tr ờng nuôi cấy manitol, sorbitol, saccarose
- Thay đổi điều kiện nuôi cấy nh: giảm cuờng độ chiếu sáng, giảm nồng độ oxy
Chú ý:
Khi kết thúc một giai đoạn bảo quản các mẫu bảo quản đợc chuyển sang môi trờng tơi v
đặt một thời gian gắn trong điều kiện tối thích để kích thích sự tái sinh trởng trớc khi băt
đầu một chu kỳ bảo quản mới. Xác định thời gian tối đa an ton cho từng loại cây trồng trong
quá trình bảo quản sinh trởng chậm.
10
2. Bảo quản ngừng sinh trng tạm thời
Đặc điểm của kỹ thuật này là mẫu nuôi cấy đợc bảo quản trong nitơ lỏng (- 196 C ) và trong
thời gian bảo quản tế bào, mô hoàn toàn ngừng sinh trởng.
Đây là kỹ thuật bảo quản dài hạn và trớc khi đa vàobảo quản cần phải tiến hành xử lý tránh
sự kết tinh nớc trong tế bào làm chết các mẫu bảo quản.
Kỹ thuật này hiện đã đợc áp dụng cho khoảng 100 loài thực vật khác nhau và mẫu đa vào
bảo quản thờng gồm tế bào huyền phù, mô sẹo, phôi hợp tử, phôi soma, mầm ngủ, đỉnh

ngọn
Các giai đoạn của kỹ thuật của bảo quản ngừng sinh trởng tạm thời
Xử lý chống đông cho tế b o, mô của mẫu:
- Xử lý trực tiếp
- Xử lý gián tiết
- Chất chống đông: DMSO, Glycerol, Proline,, Mannitol, and ethylene glycol .
Xử lý lạnh đến nhiệt độ cần thiết (-300C, -400C)
L m lạnh chậm(1-0,1oC/phút)
L m lạnh nhanh( 720 oC/phút)
Bảo quản mẫu trong nitơ lng(-196oC).
Phục hồi mẫu bảo quản
- L m tan băng nhanh (120 oC/phút) cho các mẫu bảo quản ở nhiệt độ 37oC 40oC (1-2
phút)
- Ngâm rửa trong dung dịch saccarose hoặc môi trờng nuôi cấy trong 30 phút
- Nuôi cấy mẫu trên môi trờng thích hợp v tái sinh cây ho n chỉnh
Cõu 10: Khỏi nim bin d dũng soma? Cỏc nguyờn nhõn chớnh gõy nờn bin di dũng soma
trong nuụi cy mụ v ng dng?
A. Khái niệm: Biến dị dòng soma (somaclone variation) l khái niệm dùng để chỉ tất cả các
biến dị thể hiện ở các tế b o, mô nuôi cấy v cây có nguồn gốc từ nuôi cấy mô (Larkin v
Scowcropt, 1981). Biến dị dòng soma còn đợc gọi l biến dị dòng vô tính .
B. Các nguyên nhân chính gây biến dị dòng soma
1.Sự đa dạng di truyền tự nhiên của các tế b o nuôi cấy
Các mẫu cấy trên thực tế bao gồm nhiều loại tế b o khác nhau nh l phloem, xylem, nhu
mô, mô vỏ Những tế b o n y có thể có mức độ bội thể khác nhau. Nói cách khác, có sự đa
dạng tế b o giữa các loại tế b o trong cùng một mẫu cấy. Sự đa dạng tế b o nh vậy thờng
gọi l "polysomatic" (đa bội vô tính). Các lo i nh lúa mỳ, thuốc lá đó đợc công bố l có
các mô đa bội vô tính nh thế.
Nhiều thực vật tồn tại ở dạng thể khảm. Chúng chứa những lớp tế b o hoặc mô có cấu trúc di
truyền khác nhau đợc phát triển từ meristem có chứa lớp hay bộ phận mô bị đột biến.Hiện
tợng n y đặc biệt phổ biến ở các cây thân gỗ.

2.Tác động của các yếu tố trong quá trình nuôi cấy
Loại v nồng độ chất điều tiết sinh tr ởng sử dụng
Các mô nuôi cấy d i ng y trong môi tr ờng chứa các auxin mạnh nh 2, 4 - D hoặc 2,4,5 - T
thờng gây ra các sai khác trong các cây tái sinh. Thí dụ các cây dừa dầu tái sinh từ callus
nuôi cấy d i ng y trên môi tr ờng có chứa 2,4 - D có tỷ lệ rất lớn các biến dị khi trồng trên
đồng. ở nho, các tế b o phôi nuôi cấy kéo d i trong v i n m đó mất dần kh nng phân hoá
11
v tái sinh th nh cây.Khi nuôi cấy tiểu mạch trên môi tr ờng chứa 2mg/l 2,4,5-T l m t ng
tỷ lệ trao đổi chéo nhiễm sắc thể soma, nhng khi bổ sung thêm kinetin thỡ tỷ lệ n y gi m v
nu dùng 2,4 D thỡ không thấy hiện tợng n y.
Việc nuôi cấy d i ng y trong điều kiện in vitro cũng nh tng số lần cấy chuyển sẽ l m t ng
kh nng xuất hiện các biến dị soma. Ví dụ: trong nhân giống in vitro chuối tiêu Nainco sau
5,7,9,11 lần cấy chuyển liên tiếp tỷ lệ biến dị soma l 1,3%, 1,3%, 2,9% v 3,8% (Rodrigues
v cộng sự, 1998)
Loại mẫu cấy
Các loại mẫu cấy khác nhau thờng thể hiện mức độ biến dị khác nhau. Các mẫu cấy có
nguồn gốc từ các thể tiền chồi nh chồi nách, chồi đỉnh hay meristem thờng có mức độ biến
dị thấp hơn khi sử dụng các mẫu cấy có nguồn gốc không phi từ đỉnh sinh trởng nh l lá ,
rễ hay protoplast. Kh nng xy ra các biến dị soma còn phụ thuộc v o kiểu gen cũng nh
tuổi cây mẹ. Các dòng gi hơn th ờng tiềm ẩn các biến dị sẵn có ở mức cao hơn các dòng trẻ
hơn.
-Phơng thức nhân giống in vitro
Các phơng thức nhân giống khác nhau sẽ cho tỷ lệ xuất hiện các biến dị vô tính khác nhau.
Ví dụ: giống chuối tiêu Grande Naine tái sinh cây qua con đờng tạo phôi vô tính có tỷ lệ
biến dị soma 5,3%. còn tái sinh qua con đờng tạo chồi tỷ lệ n y l 3,6%. Nhỡn chung nếu
chồi bất định đợc tái sinh từ một tế b o thỡ cơ hội để xuất hiện các biến dị soma th ờng l
lớn hơn rất nhiều so với các chồi đợc tái sinh từ nhiều tế b o. Các quá trinh nuôi cấy tái sinh
cây từ callus, huyền phù hoặc protoplast do đó thờng có nhiều biến dị soma.
Cõu 11: Nờu cỏc phng phỏp nuụi cy bao phn v h t phn to n bi?
Các phơng pháp nuôi cấybao phấn v hạt phấn

Nuôi cấy bao phấn trên môi trờng đặc: callus v cây đơn bội xuất hiện trên bề mặt bao phấn
Nuôi cấy bao phấn trong môi trờng lỏng v lắc: hạt phấn giải phóng v o môi tr ờng, callus
v cây đơn bội xuất hiện từ hạt phấn Nuôi cấy hạt phấn tách rời trong môi tr ờng lỏng v lắc
hoặc trong môi trờng bán lỏng: callus v cây đơn bội xuất hiện từ hạt phấn
Nuôi cấy bao phấn
Qui trinh chung tạo cây đơn bội từ bao phấn:
Chọn bao phấn: tốt nhất l chọn bao phấn chứa hạt phấn ở giai đoạn sắp phân b o nguyên
nhiễm lần một. Bao phấn của những hoa đầu tiên của cây cho kết quả cao hơn hoa muộn.
Xử lý nụ hoa: Xử lý lạnh sẽ kích thích nhân dinh dỡng phân chia.Chế độ xử lý nhiệt độ phụ
thuộc v o loại cây. Ví dụ: lúa Japonica xử lý ở 10oC trong 2-3 tuần; lúa Indica xử lý ở 7oC
trong 1 tuần; ngô xử lý ở 4 oC trong 1 tuần
Chọn môi trờng nuôi cấy thích hợp: Tuỳ theo đối, tợng nuôi cấy khác nhau m sử dụng
môi trờng tơng ứng. Tuy nhiên có một số qui luật chung:
- Các cây ho th o cần nhiền auxin, đặc biệt l 2,4 D ở nồng độ cao để khởi động sự
phân chia đầu tiên (đối với lúa mỳ: 10-5mol 2,4 D trong 12 ng y), cây họ c cần ít hơn
(10-6 mol).
- H m l ợng đờng cao: đối với ngô 60 - 120 g saccaroza/ l, lúa 50 -60g saccaroza/ l,
cây họ c 20 - 40 g saccaroza/l.
Bổ sung các hỗn hợp chất tự nhiên: n ớc dừa, pepton
Kỹ thuật tách rời tiểu b o tử :
12
Các bao phấn vô trùng được nghie n hoặc ép trong môi trường lỏng để giảià
phóng hạt phấn ra ngoài bao phấn. Tách hạt phấn ra khỏi bã túi phấn bằng
cách rót dung dòch trên qua lưới lọc có kích thước phù hợp
Dung dòch sau lọcđược ly tâm 800-1000rpm trong 3-5 phút để tách và làm sạch
hạt phấn. Thành pha n nhẹ nổi trên được gạn đi trong khi hạt phấn lắng dướià
đáy được rửa sạch bằng môi trường mới và được ly tâm thêm 2 la n nữa đểà
loại bỏ các chất ức chế trong túi phấn.
Tạo huye n phù hạt phấn với mật độ 104 – 105 tế bào/mlà
Mét sè chó ý khi nu«i cÊy h¹t phÊn

Các hạt phấn nuôi cấy tách rời thường phát sinh phôi trực tiếp Để kích thích
sự phát sinh phôi thường sử dụng phương pháp nuôi “trợ dưỡng”: nuôi kèm với
bao phấn hay loại mô khác của cây mẹ Môi trường nuôi cấy hạt phấn ca nà
bổ sung các axit amin (glutamin, serin ) với no ng độ cao (100-1000ppm) và có… à
trường hợp không cần dùng hết chất điều tiết sinh trưởng (thuốc lá, cải dầu )
Câu 12. Trình bày khái niệm về ni cấy dịch huyền phù tế bào và ứng dụng của
ni cấy dịch huyền phù tế bào thực vật?
1.1.Kh¸i niƯm chung
Caplin v Steward (1949) l nh÷ng ngà à ưêi ®Çu tiªn c«ng bè sù th nh c«ng cđa viƯc nu«i cÊ
c¸c tÕ b o thùc vËt trong m«i trà ưêng láng l¾c.
C¸c nh nghiªn cøu (Tulecke and Nickell, 1959) ®ã dù kiÕn trà ưíc sù s¶n xt sinh khèi lín
cđa tÕ b o thùc vËt b»ng nu«i cÊy chóng trong m«i trà ưêng láng v kh¶ n¨ng sư dơng phà ư¬ng
ph¸p n y ®Ĩ sinh tỉng hỵp c¸c hỵp chÊt thø cÊp cđa thùc vËt nhà ư alkaloit, steroit
Nu«i cÊy hun phï tÕ b o ®à ưỵc khëi ®Çu b»ng viƯc chun nh÷ng mÈu m« sĐo (callus) xèp
v o m«i trà ưêng láng trong nh÷ng b×nh nu«i cã dung tÝch phï hỵp (c¸c b×nh Erlenmeyer dung
tÝch 30S 60 ml) v l¾c nhĐ nh ng. à à
C¸c tÕ b o ®à ưỵc t¸ch rêi ra khái m« sĐo v ph©n t¸n trong m«i trà ưêng láng. ë ®ã chóng sinh
trưëng, ph©n chia v cã thĨ h×nh th nh nh÷ng cơm tÕ b o kÕt tËp. Dung dÞch nu«i cÊy tÕ b ồ à à à
chun th nh hun phï tÕ b o.à à
øng dơng cđa nu«i cÊy hun phï tÕ b ồ
S¶n xt c¸c hỵp chÊt thø cÊp:
C¸c s¶n phÈm cđa tÕ b o thùc vËt cã thĨ ®¬nà gi¶n như ®ưêng cho tíi c¸c hỵp chÊt cao ph©n
tư phøc t¹p như c¸c chÊt th¬m, chÊt nhm màu, dưỵc liƯu, chÊt trõ s©u.
S¶n phÈm cđa nu«i cÊy hun phï tÕ b ồ thưêng ®Ỉc trưng l nh÷ng chÊt cã gi¸ trÞ caồ và
cÇn ë lưỵng nhá.
Sử dơng trong c«ng t¸c gièng c©y trång:
Sư dơng ®Ĩ chän läc c¸c dßng tÕ b o mongà mn qua c¸c test thanh läc. Sau ®ã t¸i sinh c¸c tÕ
b o ®· chän läc ®à ưỵc th nh c©y ho nà à chØnh ®Ĩ cã thĨ nhËn ®ưỵc c¸c vËt liệu khëi ®Çu quan
träng trong c«ng t¸c gièng. Dïng ®Ĩ t¸ch protoplast hc l ngn ®Ĩà s¶n xt c¸c ph«i v«
tÝnh.

Câu 13. Trình bày phương pháp tách, ni cấy tế bào trần và ứng dụng?
Phư¬ng ph¸p t¸ch tÕ b o trÇn b»ng enzymà
1. Nguyªn t¾c:
- Sư dơng hçn hỵp enzym: xellulolaza, emixellulolaza vµ pectinaza ®Ĩ ph©n gi¶i thµnh tÕ bµo
vµ gi¶i phãng c¸c tÕ bµo trÇn
13
- Một nguyên tắc cơ bản là sau khi thành tế bào đợc tách ra, tế bào trần phải đợc phóng
thích vào môi trờng có áp suất thẩm thấu cao để tránh nớc xâm nhập vào không bào, gây vỡ
tế bào chất, bằng việc bổ sung các chất tạo áp suất thẩm thấu nh saccarose, mannitol,
sorbitol, Ca2+, v.v
- Nồng độ chất tạo áp suất thẩm thấu và thời gian lu giữ tối đa hay đổi cho thích hợp với từng
đối tợng cây trồng
Đây là phơng pháp dùng phổ biến và có hiệu quả cao: từ 1g lá tơi có thể thu nhận đợc từ
6-12 triệu tế bào trần
2. Các bớc tiến h nh:
- Chọn nguyên liệu: ex vitro: mô lá non (cần phải khử trùng), in vitro: lá, mô sẹo, tế bào
huyền phù
- Xử lý gây co nguyên sinh chất (CaCl2 , đờng, manitol 0,5 - 0,7M )
- Xử lý hỗn hợp enzym ( xellulolaza, hemixellulolaza, pectinaza )
- Tách và làm sạch protoplast: lọc, ly tâm
- Kiểm tra khả năng sống ( fluorescein diacetate ) và tạo huyền phù protoplast có mật độ phù
hợp (104 - 107/ml)
Nuôi cấy protoplast:
Thờng chia 2 giai đoạn:
Giai đoạn 1: Nuôi cấy để protoplast tái sinh thành (vỏ ) tế bào và phân chia tạo cụm nhỏ tế bào
( 4 - 10 tế bào): nuôi cấy trong tối hay trong điều kiện ánh sáng yếu, trong môi trờng lỏng có
lắc hay môi trờng bán lỏng. Môi trờng cần giàu dinh dỡng và áp suất thẩm thấu phù hợp.
Nhiều trờng hợp cần dùng lớp nuôi trợ dỡng
Giai đoạn 2: Nuôi cấy tạo mô sẹo ổn định và tái sinh cây hoàn chỉnh: nuôi cấy trong điều kiện
chiếu sáng tốt với quang chu kỳ phù hợp, trên môi trờng đặc. Cần chú ý đến hàm lợng và tỷ

lệ auxin và xytokinin để tái sinh đợc cây từ callus
Có hai con đờng phát sinh hình thái trong quá trình hình thành cây hoàn chỉnh đối với các
tế bào có nguồn gốc protoplast.
- Thông qua quá trình phát sinh cơ quan (organogenesis)
ví d: tế bào protoplast có nguồn gốc từ mô thịt lá của cây thuốc lá.
- Thông qua con đờng phát sinh phôi soma (somatic embryogenesis)
ví dụ: các tế bào protoplast có nguồn gốc từ các tế bào phôi đợc nuôi cấy dạng huyền phù
một số loài cây thuộc họ hoà thảo.
- Nếu đảm bảo đợc các môi trờng nuôi cấy phù hợp, thì phôi và các mô phân sinh sẽ hình
thành sau khoảng 3 - 5 tuần lễ. Nhng nếu điều kiện nuôi cấy không tối u, các biến đổi di
truyền có thể xảy ra.
Ví dụ: trong một số nghiên cứu nuôi cấy protoplast từ cây khoai tây, tần số cây 2n đợc tái
sinh chỉ khoảng 10%, còn lại chủ yếu là cây 4n.
ng dụng của tế b o trần
protoplast đợc ứng dụng vào 3 mục đích chính.
- Dung hợp protoplast (lai soma).
- Chọn dòng tế bào.
- Biến nạp di truyền: Chuyển cơ quan tử, AND ngoại lai vào protoplast.
14
Cõu 14. Trỡnh by cỏc phng phỏp dung hp t bo trn?
Phơng pháp dung hợp protoplast
1. Phơng pháp dùng hoá chất:
Năm 1972, Carlson tái sinh thnh công cây thuốc lá từ tế bo protoplast dung hợp trong môi
trờng bổ sung NaNO3. Năm 1974, Melchers phát triển ra môi trờng dung hợp tế bo trần
gồm 50 mM Ca2+, 0,4M mannitol, pH 10,5 tỏ ra thích hợp cho việc dung hợp tế bo trần
nhiều loi cây trồng khác nhau. Năm 1974, Kao phát hiện ra PEG (polyethylene glycol) có tác
dụng lm tăng hiệu quả dung hợp của protoplast. Khi đợc ngâm vo dung dịch PEG (20 - 40
% w/v), các protoplast kết dính lại với nhau. Sau đó, khi PEG đợc rửa bằng dung dịch Ca2+
có độ pH cao, m ng nguyên sinh chất ở chỗ tiếp xúc sẽ vỡ ra v các protoplast sẽ dung hợp
với nhau. Do PEG độc đối với tế b o, nồng độ PEG th ờng đợc giảm đi v bổ sung thêm

v o đó l DMSO (dimethyl sulfuside )
2. Phơng pháp dùng xung điện (Zimmermann,Scheurich,1982)
Zimmerman (1982) là ngời đầu tiên đề xớng phơng pháp dung hợp tế bào trần nhờ xung
điện (electrofusion).
- Nguyên tắc: các protoplast tích điện nên dịch chuyển trong điện trờng v tạo chuỗi giữa
hai thanh điện cực, dùng xung điện để lm thủng mng của hai protoplast sát cạnh nhau khiến
chúng ho trộn v o nhau
- Thiết bị: máy tạo xung điện, kính hiển vi đảo pha, buồng dung hợp
- Tạo điện trờng: đặt trong buồng dung hợp các điện cực platin có khoảng cách 0,2 - 1,0mm
v nối với nguồn điện có hiệu điện thế 200V/cm
- Tạo xung : hiệu điện thế: 500 - 1000V/cm, thời gian cực ngắn: 1 -200 miligiây
Hiệu quả dung hợp cao nhng đầu t thiết bị lớn
Cõu 15. Nờu khỏi nim v cỏc bc tin hnh ca phng phỏp th phn in vitro?
1.Khái niệm
Để khắc phục hiện tợng bất hợp trong lai xa (lai khác lo i v khác chi) có thể tiến h nh
thụ phấn in vitro hoặc nuôi cấy phôi in vitro.
Hiện tợng bất hợp trong lai xa thờng thể hiện ở hai khâu:
- Bất hợp của giao tử trớc khi thụ tinh: Nếu một hạt phấn lạ rơi trên núm nhụy, lập tức nhụy
sẽ tiết ra chất ức chế sự phát triển của ống phấn hoặc l m biến dạng ống phấn ngăn cản sự thụ
tinh.
- Bất hợp của giao tử sau khi thụ tinh: Trong một số trờng hợp, quá trình thụ tinh vẫn xảy ra
bình thờng khi hạt phấn rơi trên nhụy. Tuy nhiên phôi lai xa lại không phát trin c.
Nguyờn nhân l do giữa nội nhũ v phôi đó th nh một cơ chế ức chế sự phát triển của phôi.
2.Các bớc tiến h nh:
Lấy nụ hoa của cây mẹ ở thời điểm trớc khi nở hoa 2 ng y, khử trùng, tách lấy bầu quả hay
lá noón nuôi cấy in vitro
Lấy nụ hoa của cây bố v o ng y nở hoa, khử trùng, tách lấy bao phấn v để trong điều kiện
vô trùng đến khi chúng tung phấn
Lấy hạt phấn rắc trực tiếp lên mặt cắt của bầu quả hay lá noón để thụ phấn in vitro, hoặc dùng
cách cắt ngắn vòi nhị, ghép vòi nhuỵ khi thụ phấn Khi noón thụ tinh, chúng hình th nh hợp

15
tử v tạo phôi. Các phôi lai in vitro th ờng bỏ qua giai đoạn nghủ, nghỉ v mọc th nh cây in
vitro
Cõu 16. Khỏi nim v chuyn gen thc vt? Trỡnh b y cỏc ph ng phỏp chuyn gen
trc tip v o t b o th c vt?
Khái niệm : Kỹ thuật chuyển gen vào thực vật là kỹ thuật đa một hay nhiều gen lạ đã đợc
thiết kế ở dạng ADN tái tổ hợp vào tế bào làm cho gen lạ gắn vào bộ gen tế bào chủ. Trong tế
bào chủ, các gen này hoạt động tổng hợp nên các protein/enzyme đặc trng dẫn tới việc xuất
hiện các đặc tính mới của cơ thể chuyển gen.
Trc tip: sỳng bn gen
Phng phỏp chuyn gen bng sỳng bn gen:
l s dng nhng cụng c (sỳng bn gen) cú th to c ỏp lc trong khụng khớ
y c cỏc viờn n (bng kim loi tr, ng kớnh khong 1àm) cú ph cỏc
vector chuyn gen i vi tc 1300 ms. Vi tc bn ny, viờn n cú th xuyờn
quan cỏc lp t bo bờn ngoi ca mụ v xõm nhp vo cỏc t bo bờn trong gp
nhõn v gn vo nhim sc th ca t bo. Chn lc t bo mang gen v tỏi sinh
thnh cõy chuyn gen
u im:
- Cú th ỏp dng vi hu ht cỏc loi mụ, t bo.
- Quỏ trỡnh chuyn gen nhanh, n gin v mt k thut.
- Cú th x lý mt lng mu ln trong thi gian ngn.
- Cỏc vector mang gen mc tiờu cú cu to n gin.
- Ch cn mt lng nh plasmid DNA.
- Biu hin tm thi gen bin np cú th quan sỏt thy trong vi ngy sau khi bin
np.
+ Nhc im:
- Cú th chuyn nhiu bn sao c chuyn vo t bo gõy khú khn cho vic phõn
tớch biu hin ca gen.
- Hiu qu chuyn gen thp.
- ũi hi thit b t tin nh sỳng bn gen, n vng, tungten, xung in

Phng phỏp chuyn gen bng xung in:
- Thng c s dng cho vic chuyn gen vo t bo trn. T bo trn
(protoplast) l t bo c loi b thnh t bo bng vic x lý t bo vi enzyme
xenlulaza, pectinaza.
- S dng dũng in cú hiu in th cao phỏt xung trong thi gian cc ngn khong
5-6/1000 giõy to ra trờn b mt t bo trn tm thi cỏc l cú ng kớnh 30 m,
m qua ú cỏc ADN bin np cú th xõm nhp vo t bo.
+ u im: Hiu qu chuyn gen cao, n nh, c bit i vi cỏc gen n.
+ Nhc im: H thng tỏi sinh t bo trn ca nhiu loi thc vt cũn khú khn vi
tiờm Chuyn gen bng phng phỏp vi tiờm (micoinjection):
S dng cỏc thit b hin vi, vi thao tỏc. S dng cỏc kim tiờm rt mnh a cỏc
on ADN trc tip vo nhõn ca t bo trn, t bo tin phụi ca hp t hay ht
phn.
+ u im:
- Lng ADN c bin np tu ý v xỏc nh.
16
- ADN được đưa đúng vị trí mong muốn, thậm chí nhân tế bào.
- Có thể áp dụng đối với các tế bào có kích thước nhỏ bé như tế bào hạt phấn, phôi
non mà các kỹ thuật khác không thực hiện được.
+ Nhược điểm:
- Mỗi lần biến nạp chỉ đưa vào một tế bào duy nhất. Do vậy, đây là phương pháp tốn
nhiều thời gian và công sức.
- Chỉ có thể thực hiện bởi các kỹ thuật viên có kỹ năng cao.
- Đòi hỏi thiết bị tương đối đắt tiền.
hóa chất.
Phương pháp chuyểng gen nhờ PEG (polyethylen glycol):là phương pháp chuyển
gen vào tế bào trần. Ở nồng độ cao PEG làm ADN cần biến nạp không còn ở trạng
thái hoà tan mà kết dinh lại trên màng sinh chất. Bằng cách loại bỏ PEG và xử lý
nồng độ cao của Ca2+ hoặc pH cao ADN biến nạp sẽ được chuyển vào trong tế bào
trần.

+ Ưu điềm:
- Hiệu quả chuyển gen cao, ổn định nếu quá trình biến nạp thành công.
- Không đòi hỏi thiết bị đắt tiền.
+ Nhược điểm:
- Quá trình biến nạp khó điều khiển. Số bản sao của gen trong tế bào biến nạp có thể
lớn.
- Tần số biến nạp thành công biên động giữa các thí nghiệm.
- Dễ dẫn đến hiện tượng dung hợp tế bào trần, gây khó khăn việc phân tích biểu hiện
gen.
- Hệ thống tái sinh tế bào trần của nhiều loài thực vật
Câu 17. Trình bày cơ chế chuyển gen gây khối U ở thực vật do vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens?
Cơ chế chuyển gen gây u: Khi cây bị thường sẽ tiết ra 1 chất độc vết thương có cấu
trúc dạng hợp chất phenol. Acetosyringone hấp dẫn vi khuẩn đất tới các mô đó, là
chất hoạt hoá nhóm gen vir (gồm 6-9 đơn vị sao mã) điều khiển sinh tổng hợp các
sản phẩm (protein/enzyme). Các protein/enyme có các chức năng sau:
+ Cắt vùng bờ trái, bờ phải (T-DNA) giải phóng sợi đơn T-DNA
+ Bảo vệ sợi đơn T-DNA vừa cắt.
+ Vận chuyển sợi đơn T-DNA xâm nhập TBTV và gắn vào NST (hệ gen).
Do trên đoạn T-DNA chứa một số gen mã hoá sinh tổng hợp phytohormone (auxin và
cytokinin) kích thích phân chia tế bào mạnh mẽ, không được kiểm soát dẫn đến hình
thành khối u.
Đây là cơ chế chuyển gen tự nhiên vào thực vật của vi khuẩn A. tumefaciens.
Câu 18. Trình bày cấu trúc Ti-plasmid tự nhiên và nguyên lý chung của thiết kế
vector chuyển gen thực vật?
Vector Ti-plasmid tự nhiên của vi khuẩn A. tumefaciens có một số hạn chế trong khi
chuyển gen vào thực vật vì:
- Ti-plasmid có kích thước lớn (200-800 kb).
17
- Ti-plasmid không tự tái bản trong E. coli.

- Đoạn T-DNA của Ti-plasmid mang các gen điều khiển sinh tổng hợp auxin và
cytokinin cản trở sự tái sinh của cây trong qúa trình nuôi cấy. Nó còn chứa các gen
điều khiển tổng hợp opine sử dụng các nguyên liệu của cây ảnh hưởng đến năng
suất.
- Ti-plasmid không mang gen chỉ thị (reporter, seletion genes) nên khó chọn lọc cây
chuyển gen.
- Các điểm cắt của RE nằm rải rác nên khó thao tác.
Do đó, cần thiết kế lại Ti-plasmid tự nhiên để đáp ứng tiêu chuẩn cần thiết của một
vector chuyển gen thực vật. Quá trình thiết kế vector này như sau:
* Nguyên lý chung:
- Giữ lại các gen Vir cần thiết cho quá trình vận chuyển T-DNA gắn vào NST tế bào
thực vật.
- Giữ lại vùng bờ trái (LB), bờ phải (RB) và thay thế các gen cần thiết vào vùng T-
DNA
Có 2 loại hệ thống vector chuyển gen vi khuẩn A. tumefaciens:
Vector đồng liên hợp (co-integrated vector)
Dựa trên sự tái tổ hợp của 2 loại plasmid.
- Plasmid 1: Có nguồn gốc từ plasmid vi khuẩn E. coli nên tái bản được trong E. coli.
Có chứa phần bờ trái hoặc bờ phải, có các gen mục tiêu và các gen chỉ thị, có đoạn
ADN tương đồng Ti-plasmid.
- Plasmid 2: là Ti-plasmid cải tiến. Cắt bỏ toàn bộ phần T-DNA, giữa lại vùng bở phải
hoặc bờ trái, giữ lại vùng gen Vir, bỏ đi vùng tổng hợp enzyme di hóa opine. Vector
này được nhân dòng trong vi khuẩn A. tumefaciens.
Sau đó, cho tương tác 2 loại plasmid 1 và plasmid 2, kết quả tạo ra vector liên hợp
được sử dụng chuyển gen vào
Vetor nhị thể (Binary vector): là hệ thống dùng 2 plasmid riêng biệt:
- Plasmid 1: Có nguồn gốc từ E. coli nhưng được thiết kế lại:
+ Thêm gốc tái bản trong A. tumefaciens.
+ Gắn các gen mục tiêu, promoter, gen chỉ thị nằm giữa LB, RB.
- Plasmid 2: là Ti-plasmid được cắt bỏ toàn bộ các phần LB, RB, T-DNA, gen mã hóa

enzyme sử dụng opine nhưng vẫn giữ lại góc tái bản trong A. tumefaciens, vùng gen
Vir.
Chuyển cả plasmid 1 và plasmid 2 vào tế bào vi khuẩn A. tumefaciens.
Câu 19. Trình bày các bước chính trong qui trình chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens?
Tạo cây in vitro.
- Cắt tạo các đĩa lá nhằm tạo vết thương cho mô thực vật.
- Ngâm đĩa lá trong dung dịch có chứa vi khuẩn A.tumefaciens mang hệ thống vector
chuyển gen trong vài phút đến vài chục phút. Trong dung dịch có bổ sung
acetosyringone.
- Nuôi cấy trên môi trường đồng nuôi cấy. Cho thêm thời gian để vi khuẩn A.
tumefaciens sống và chuyển gen vào tế bào lá trong thời gian 2-5 ngày.
18
- Lấy mẫu ra và diệt khuẩn A. tumefaciens bằng dung dịch kháng sinh cefotaxim
(không gây độc cho mô thực vật) trong thời gian 15-30 phút.
Vớt mô, thấm khô và cấy nuôi cây trên môi trường chọn lọc (kháng sinh, mantose,
PPT, v.v.) trong một thời gian nhất định tuỳ thuộc loài cây.
- Chọn lọc các mô sống mang gen chuyển, cấy lên môi trường tái sinh.
- Phân tích sự có mặt và biểu hiện của gen chuyển bằng các kỹ thuật sinh học phân
tử (PCR, Southern blot, Norhern blot, Western blot).
- Thu được các dòng cây chuyển gen.
- Đánh giá các dòng cây chuyển gen (biotest) trong phòng cách ly.
- Giới thiệu vật liệu chuyển gen
Câu 20. Nêu một số thành tựu tiêu biểu của việc ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô –
tế bào thực vật ở Việt Nam?
Người ta có thể sản xuất giống trong phòng thí nghiệm để đưa ra sản xuất nhanh
chóng hơn nhiều phương pháp cổ điển. Nhờ kết quả này mà một người có thể sản
xuất ra 130.000 cây Hồng/năm từ một gốc hồng.
Ở miền Bắc, Nhân bản vô tính thực vật được ứng dụng ở hầu hết các nông, lâm sản,
bảo tồn thành công nguồn gene của các loại gỗ quý như: Vù hương - Loại gỗ chiết

tinh dầu dùng trong dược, mỹ phẩm, cây Đăng lấy gỗ, Chè vang - một loại chè rất
khó trồng. Kĩ thuật này giúp lai tạo thành công giống lúa chịu hạn DR1, nhân bản
nhiều loại khoai tây, mía
- Chỉ với 3 người, Phòng nuôi cấy mô – Trung tâm Giống và Kĩ thuật cây trồng
Phú Yên có thể tạo 500.000 cây lan cấy mô theo yêu cầu cầu của khách hàng.
- Từ năm 2001 đến nay, Sở Khoa học – Công nghệ Lạng Sơn, hàng năm cung
cấp hàng vạn cây giống Bạch Đàn Europhylla.
- Trung tâm Ứng dụng và chuyển giao tiến bộ công nghệ tỉnh
Vĩnh Phúc vừa ứng dụng thành
công CNNCMTB để nhân giống cây Lô hội - một
loài dược liệu quý của địa phương.
Việt Nam có thể trở thành quốc gia sản xuất phong lan lớn trong khu vực.
- Hiện nay, 100% nông dân Đà Lạt sử dụng cây giống từ nuôi cấy mô.
Bước sang năm 2008 công nghệ nuôi cấy mô đã có những bước đột phá mới:
Nhân giống thành công giống sâm Ngọc Linh quý hiếm, khôi phục nhiều loài Lan
rừng quý hiếm khỏi nguy cơ tuyệt chủng đặc biệt là loài lan Hài hồng - loài lan hài
duy nhất có hương thơm trên thế giới
19