Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tới sự hình thành củ từ vảy củ hoa Lily (Lilium longiflorum) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào

Phần một
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Từ lâu con người đã gắn bó, gần gũi với thiên nhiên. Thiên nhiên là nơi đã
mang đến cho con người nhiều quà tặng vô giá, một trong những món quà vô giá
đó là hoa. Hoa làm cho cuộc sống của con người thêm phần thi vị và ý nghĩa. Khi
đời sống đang ngày càng được nâng cao, con người ngày càng hướng tới sự
hưởng thụ, thưởng thức cái đẹp thì nhu cầu về hoa lại càng không thể thiếu. Từ
đó mà một nghề mới đã được ra đời và đem lại lợi nhuận lớn đó là nghề trồng và
kinh doanh hoa.
Cùng với sự phát triển không ngừng của xã hội, nhu cầu hoa ngày càng lớn
đòi hỏi nghề trồng hoa phải có giống hoa mới lạ, hấp dẫn để đáp ứng được thị
hiếu của thị trường. Hoa lily (Lilium longoflorum) là một loài hoa cao cấp có vẻ
đẹp quyến rũ, màu sắc phong phú, có hương thơm và độ bền hoa cắt cành cao
1
(10-15 ngày), dễ thu hoạch và bảo quản đã và đang chiếm lĩnh thị trường hoa
tươi trên thế giới và ở Việt Nam. Hoa Lily không chỉ để trang trí mà còn được sử
dụng để điều chế nước hoa, mỹ phẩm, kem chống lão hoá Do đó hoa Lily là
một loại cây hoa mang lại lợi nhuận rất lớn. Hiện nay, ở nước ta giá trung bình
trên thị trường một cành hoa Lily là từ 15.000 đến 30.000 VN đồng/cành, thậm
chí là 60.000 VN đồng/cành vào các ngày lễ tết.
Ở Việt Nam hoa Lily đã trồng thành công ở nhiều tỉnh như Lâm Đồng, Lào
Cai, Hà Nội Tuy nhiên, chúng ta phải thường xuyên nhập giống từ nước ngoài
với chí phí khá cao (10.000-15.000đồng/củ giống) và không chủ động được
nguồn giống. Kỹ thuật nhân giống vô tính in-vitro với ưu điểm nhân nhanh
những cá thể đồng nhất về mặt di truyền, sinh trưởng và phát triển một cách đồng
đều và cho hệ số nhân giống cao. Chỉ cần một lượng nhỏ nguyên liệu ban đầu,
nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng trong điều kiện thích hợp có thể thu được
một lượng lớn cây (hoặc củ) giống trong thời gian ngắn hơn rất nhiều so với các
phương pháp truyền thống khác.
Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tới sự hình thành củ từ vảy củ hoa Lily
(Lilium longiflorum) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào”.
2. Mục tiêu của đề tài
Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo củ cây hoa Lily từ nuôi
cấy vảy củ bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào.
3. Nội dung của đề tài
- Nghiên cứu các phương pháp khử trùng mẫu nuôi cấy.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ saccharose đến khả năng tạo củ in
vitro của cây hoa Lily.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hoà sinh trưởng đến khả năng
tạo củ in-vitro của cây hoa Lily.
2
- Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hoà sinh trưởng đến khả năng
nhân nhanh củ in-vitro cây hoa Lily.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ chiếu sáng đến khả năng tạo củ của
cây hoa Lily
3
Phần hai
TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
2.1 Giới thiệu về cây Lily
2.1.1 Nguồn gốc, vị trí, phân loại thực vật của hoa Lily
Cây hoa Lily có tên khoa học là Lilium longiflorum Thumb., họ Liliaceae,
bộ phụ của thực vật một lá mầm. Cây hoa Lily có nguồn gốc từ Nhật Bản và các
nước ở Châu Âu. Hoa Lily được trồng tại Đà Lạt từ năm 1945 với các giống ở
Hà Nội. Từ 1970, Đà Lạt đã nhập giống Lily từ Hàn Quốc, Nhật Bản. Hiện nay,
hoa Lily đang được trồng phổ biến nhiều nơi như Hà Nội, Đà Lạt
Theo hệ thống phận loại của Takhtajan cây Lily thuộc ngành hạt kín
Angiospermae, lớp một lá mầm Monocotyledoneae hay lớp loa kèn Liliopsida,
phân lớp loa kèn Liliae, bộ loa kèn Liliales, họ loa kèn Liliaceae (Hoàng Thị Sản,
2003; Nguyễn Nghĩa Thìn, Đặng Thị Sy, 2001). Họ Liliaceae là một trong những

họ lớn nhất với 200 chi và hơn 3000 loài. Chi Lilium gồm khoảng 220 loài, trong
đó có một số loài đã được trồng cách đây 3000 năm. Sau năm 1950, khoảng 100
giống Lily mới đã được lai tạo và đăng ký tên trên thế giới với nhiều giống lai có
nguồn gốc từ hai loài Nhật Bản L.auratum và L.speciosum (Pelkonen, 2005) [1],
[5].
Trung Quốc là nước có nhiều chủng loại Lily nhất và cũng là trung tâm,
nguồn gốc Lily trên thế giới. Theo kết quả điều tra, ở Trung Quốc có khoảng 460
giống, 280 biến chủng (chiếm trên 1/2 tổng giống hoa Lily trên thế giới), trong
đó có 136 giống, 52 biến chủng do Trung Quốc tạo ra. Nhật, Hàn Quốc có 110
giống trong đó có 30 giống mang đặc trưng của nước này. Hà Lan có khoảng 320
giống, trong đó 805 là các giống do chính Hà Lan tạo ra…
Cuối thế kỷ XVI, các nhà thực vật học người Anh đã phát hiện và đặt tên
cho các cây giống Lily. Đầu thế kỷ XVII Lily được di thực từ Châu Âu đến Châu
Mỹ. Sang thế kỉ XVIII các giống Lily của Trung Quốc được di thực sang Châu
4
Âu do vẻ đẹp và mùi thơm hấp dẫn nên cây Lily đã nhanh chóng phát triển và
được coi là cây hoa quan trọng của Châu Âu, Châu Mỹ.
Vào cuối thể kỷ thứ XIX bệnh virut ở Lily lây lan mạnh, tưởng chừng cây
Lily bị hủy diệt. Đến đầu thế kỷ XX khi người ta phát hiện ra giống Lily thơm ở
Trung Quốc (L.regane) có khả năng chống chịu tốt với bệnh virut, giống này
được nhập vào Châu Âu và chúng đã được dùng vào việc lai tạo giống mới để tạo
ra rất nhiều giống có tính thích ứng rộng, khả năng chống chịu sâu bệnh tốt, cây
Lily lại được phát triển mạnh mẽ.
2.1.2 Đặc điểm hình thái
Lily là loài cây thân ngầm dưới đất có nhiều vảy bao bọc lại nên người ta
còn gọi là hoa bách hợp. Lily là cây thân thảo lâu năm. Phần dưới mặt đất gồm
thân vảy, rễ. Phần trên mặt đất gồm lá, thân, mầm hạt (một số không có mầm
hạt).
- Thân vảy (củ): là phần phình to của thân tạo thành, màu trắng hoặc màu
hồng nhạt, phía ngoài không có màng bao bọc nên gọi là thân vảy trần (không vỏ,

thân vảy là củ giống để trồng).[14]
- Rễ: có hai tầng, rễ mọc ở gốc của thân vảy gọi là rễ gốc, to, mềm, có ngay
trên củ giống hoặc mọc ra ngay sau khi trồng. Rễ mọc ở nơi tiếp giáp giữa củ và
thân trên mặt đất gọi là rễ thân.
- Lá: mọc rãi rác thành vòng thưa, hình kim, xoè hoặc hình thuôn, hình giải,
đầu lá hơi nhọn, dài 10 - 15cm, rộng từ 1,5 - 2cm, có cuống hoặc không có
cuống, trên lá có từ 1 - 7 gân, gân giữa rõ ràng hơn, lá mềm màu xanh bóng.
- Thân: trên trục thân mang nhiều lá, trong các nách lá có thể mọc lên các
mầm hạt (củ con).
- Củ con và mầm hạt: đại bộ phận Lily có nhiều củ con ở gần thân rễ, có
chu vi từ 0,5 - 3cm, số lượng củ tuỳ thuộc giống và điều kiện trồng trọt.
- Hoa: hoa đều, lưỡng tính, hoa mẫu ba. Hoa lớn có khi mọc đơn độc hoặc
mọc thành cụm ở trên ngọn. Bao hoa đơn, dạng cánh, không phân hoá thành đài
5
và tràng rõ rệt, gồm sáu cánh xếp xen kẽ nhau, cánh hợp lại thành hai vòng khác
nhau và không dính nhau. Bộ nhị gồm có 6 nhị, giữa có cuống màu xanh nhạt,
gắn với nhau thành hình chữ T. Trục hoa nhỏ dài, đầu trục phình to, có 3 khía, tủ
phòng ở phía trên. Màu sắc hoa phong phú, đẹp. Có màu trằng, màu vàng, màu
tím và nhiều màu. Màu cánh thường là đơn sắc hoặc có chấm màu nâu, màu tím,
có hương thơm.
- Quả: hình trứng dài, mỗi quả có vài trăm hạt, bên trong có ba ngăn. Hạt
hình dẹt, xung quanh có cánh mỏng, hình bán cầu, hoặc ba góc, vuông dài.
2.1.3 Phân loại các giống hoa Lily
Do việc mua bán Lily trên thế giới phát triển, nên công tác lai tạo giống mới
luôn được chú ý và mở rộng, giống mới ngày càng nhiều. Để tiện cho việc mua
bán, hiệp hội làm vườn Hoàng gia Anh (Royal Horticultural society Lily
commitie) năm 1963 đưa ra hệ thống phân loại Lily. Hệ thống này chủ yếu căn
cứ vào nguồn gốc bố mẹ con lai, tác giả tạo ra giống và năm tạo giống từ đó
người ta chia giống Lily trồng trọt làm 4 nhóm:
- Nhóm 1: Nhóm Lily Phương Đông: gồm các chủng: L.auratum,

L.spucicsum, L.faponicum, L.rubellum chủ yếu là các giống lai có nguồn gốc
khác nhau.
- Nhóm 2: Nhóm Lily Á châu: gồm L.lancipollium, L.lechttini var
maximwicgii, L.caculamabel, L.pumilum, L.bulboerem, L.dacidu, L.wiblanotiac
chủ yếu là nhóm Carotuoid là chính.
- Nhóm 3: Nhóm Lily thơm: với các chủng L.langflorcum, Lily Đài Loan
(L.porosanum), Lily trắng (L.candidum), Lily Vương (L.regala) là chính.
- Nhóm 4: Nhóm Lily Tinh Diệp: gồm Lily Hán Lâm (L.hansoni), Lily
Tinh Diệp (L.martagou) là chính cùng với L.chalcudonicum, Lily ốc đan lai
tạo chọn lọc ra.
Năm 1982, Hiệp hội Lily quốc tế đề ra hệ thống phân loại Lily trên cơ sở.
Hệ thống phân loại của Anh năm 1963. Hệ thống này dựa vào nơi nguyên sản
6
của bố mẹ, quan hệ huyết thống, đặc trưng hình thái, màu sắc hoa và quy các
giống Lily vào 8 nhóm:
- Nhóm Lily lai Á châu (Asiatic hybrids)
Do loại Lily Châu Á lai với chính con lai của nó (lai giữa các con lai bố mẹ
chủ yếu là Lily triển tiêu (L.mabile), Lily thân vảy (L.bullierum var croceum),
L.xhollamdicum, L.xmaculatum, L.xelegans, Lily lông (L.danricum), Lily ốc đan
(L.aoncoor, L.lancipolium, L.dacicii, L.cernum) Nhóm này có đặc điểm là hoa
hướng ra, màu hoa rất phong phú.
Dựa vào hình dáng hoa nhóm này lại được phân làm 3 loại:
+ Loại hoa hướng lên trên: Mọc đơn hoặc trên hoa tự, hoa ra sớm. Các
giống thường thấy là: Apeldoora, Enchatmemt, Conmicticusking.
+ Loại hoa hướng ra ngoài: các giống thường thấy là: Braudwine,
Corsage, Proopierity
+ Loại hoa chúc xuống: các giống thường thấy là BlackButtylly,
Conneticutyan, Wtonella
- Nhóm Lily lai Tinh Diệp (Martagon hybrids)
Do lai giữa L.martagon x L.hansonii. Các giống thường thấy là Marhan,

Achievement, Graylights, Baollerina, Dairy, Maid
- Nhóm Lily lai hoa trắng (Condidum hybrids)
Các giống thường thấy là: Beerensiik, Prankfonce, Hughes Apiricot, Whito
Might
- Nhóm lai Lily Châu Mỹ (American hybrids)
Bắt nguồn từ L.paradalinum, L.parrue, sinh trưởng ở Châu Mỹ. Các giống
thường thấy là: Shuksau, Belliungham, Bellauaud
- Nhóm lai Lily thơm (Longgiflorum hybrids)
Còn gọi là Lily pháo do Lily thơm (L.longiflỏum), Lily Đài Loan
(L.porosanum) lai tạo ra, đặc điểm là hoa có hình dáng giống loa kèn, các giống
thường thấy là: Avita Come, Gelria, Snow Qeen
7
- Nhóm Lily lai loa kèn (Trumpet hybrids)
Bắt nguồn từ Lily Thông Giang (L.sargeutac), Lily Nghi Xương
(L.lecauthum), Lily Hồ Bắc, Lily Vương lai với nhau. Dựa vào hình dạng hoa có
thể chia ra:
+ Hình hoa loa kèn, có các giống: Apricau Qeen, Black Dragon, Black
Magic
+ Hoa hình cái bát, thường thấy là: Firstlove, Hertsdesire, Newera
+ Hoa chúc xuống hoặc cong ngược lại, các giống thường thấy là:
Christmas day, Golldin Showers, Summer Song
+ Hình mặt trời mọc, cành hoa cong lại, các giống thường thấy là:
Brightstar, Golden sunburst, Magic
- Nhóm lai Phương Đông (Oriental hybrids)
L.aurtum, L.spociosum, Lily đỏ (L.rubellum), Lily Nhật (L.piponcum) lai
với Lily Hồ Bắc tạo ra. Căn cứ vào hình dáng hoa, nhóm này lại được phân làm 3
loại:
+ Loại hình hoa loa kèn (hiện nay chưa có giống đăng ký).
+ Loại hình hoa hình bát, các giống thường thấy là: Bonpire, Casa
Blanca, Empiress, Opchina

+ Loại hình hoa bằng dài là cánh hoa cong ngược lại.
- Nhóm Lily nguyên chủng
Bao gồm tất cả các loại, các biến chủng biến hình nguyên bản xuất xứ của
nó [5].
Ở Việt Nam, ngoài giống hoa Loa kèn màu trắng được trồng, mới chỉ phát
hiện hai loài là cây Bách Hợp (L.Brownii F.E Brown var oldiesterri wils) mọc
hoang dại trên núi đá Lạng Sơn, Cao Bằng và loài L.poilanei Gagenep có ở đồi
cỏ Sa Pa, Hoàng Liên Sơn [20].
8
2.1.4 Điều kiện sinh thái
Cây Lily chỉ sinh trưởng, phát triển tốt khi đáp ứng đầy đủ các yêu cầu về
điều kiện sinh thái. Trong đó các yếu tố như ánh sáng, nhiệt độ, nước, không khí,
đất và dinh dưỡng là những yếu tố quan trọng nhất, ảnh hưởng trực tiếp đến sinh
trưởng và phát dục của cây. Các yếu tố này không thể thay thế cho nhau và tác
động tương hỗ lẫn nhau, và cũng không thể thiếu một yếu tố nào cho sự sinh
trưởng và phát triển của cây Lily.
- Nhiệt độ
Nói chung Lily là cây chịu rét khá, chịu nóng kém, ưa khí hậu mát ẩm, nhiệt
độ thích hợp ban ngày là 20 - 25
0
C, ban đêm là 12
0
C. Các giống thuộc nhóm tạp
giao Phương Đông thời kỳ đầu thích hợp nhiệt độ ban ngày 20
0
C, ban đêm là
15
0
C. Nhóm Lily thơm chịu nóng tốt, nhiệt độ thích hợp: ban ngày 25- 28
0

C, ban
đêm 18 - 20
0
C. Dưới 12
0
C cây sinh trưởng kém, hoa dễ bị mù, thời gian đầu nhiệt
độ thấp có lợi cho sự ra rễ và phân hoá hoa.
Nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát dục của Lily, quan
trọng nhất ảnh hưởng đến sự nảy mầm của hạt, sự phát dục của thân và sự sinh
trưởng của lá, điều tiết sự phân hoá hoa và sự ra hoa
- Ánh sáng
Lily là cây ưa cường độ ánh sáng trung bình từ 12000- 15000lux, nếu trồng
vào mùa Hè phải che bớt ánh sáng, nhất là thời kỳ cây cao 20 - 30cm.
Vào mùa Hè với nhóm Lily Á châu và Lily thơm cần che bớt 50% ánh sáng,
nhóm Phương Đông nên che bớt 70% ánh sáng.
Ngược lại trồng trong nhà kính vào mùa Đông, ánh sáng không đủ, nhị đực
sẽ sản sinh etylen, dẫn đến sự rụng nụ. Đặc biệt là nhóm Á châu rất mẫn cảm với
thiếu ánh sáng, do vậy cần bỏ bớt lưới hoặc nilon che phủ để tăng cường ánh
sáng tự nhiên cho cây.
9
Lily là cây dài ngày, chiếu sáng nhiều hay ngắn không những ảnh hưởng tới
sự phân hoá hoa, mà còn ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát dục của hoa.
Chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát dục của củ.
- Nước
Đất quá khô hoặc quá nhiều nước đều ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát
dục của Lily. Thời kỳ đầu cây cần nhiều nước, thời kỳ ra hoa nhu cầu về nước
giảm bớt vì nước nhiều củ dễ bị thối và rụng nụ. Lily thích không khí ẩm uớt, ẩm
độ thích hợp nhất là 80 - 85%. Nếu ẩm độ biến động lớn dễ dẫn đến thối củ.
- Không khí
Lily là cây khá mẫn cảm với khí etylen, tuy nhiên độ mẫn cảm của các

giống khác nhau thì không giống nhau: giống Á châu mẫn cảm nhất, các dòng
giống khác yếu hơn.
- Đất
Lily có thể trồng ở mọi loại đất, nhưng đất nhiều mùn, đất thịt nhẹ là tốt
nhất. Lily là loại cây có rễ nông vì vậy đất thoát nước rất quan trọng. Lily rất mẫn
cảm với muối, đất nhiều muối cây không hút được nước, ảnh hưởng đến sinh
trưởng, phân hoá hoa và ra hoa. Nói chung hàm lượng muối không được vượt
quá 15mg/cm
2
, chất oxy hoá không cao quá 1,5mmol/l.
Đất quá chua cây hút ion sắt, nhôm, magie nhiều gây hại cho cây; đất kiềm
quá, lượng hút sắt, magie, lân không đủ sẽ dẫn đến thiếu các sắc tố. Các giống
thuộc nhóm tạp giao Á châu và Lily thơm yêu cầu độ pH thích hợp từ 6 - 7,
giống thuộc nhóm Phương Đông lại yêu cầu thấp hơn (pH từ 5,5 - 6,5).
- Dinh dưỡng
Lily yêu cầu mức độ phân bón cao nhất trong ba tuần đầu kể từ sau khi
trồng. Tuy nhiên, lúc này rễ non dễ bị ngộ độc muối. Muối trong đất có từ ba
nguồn: phân bón, nước tưới và hàm lượng dinh dưỡng của cây trồng trước vụ
trước. Vì vậy để tránh tác hại của muối trong đất, trước khi trồng 6 tuần cần phân
10
tích đất để biết hàm lượng muối. Lily cũng mẫn cảm với hợp chất chứa Clo, yêu
cầu lượng Clo trong đất không vượt quá 1,5 mmol/l, nếu không sẽ hại rễ.
Lily cũng mẫn cảm với Flo, nếu hàm lưọng Flo trong không khí cao dễ gây
cháy lá. Vì vậy không được bón phân có chứa Flo như muối Flophotphat mà phải
bón loại phân có hàm lượng Flo thấp như CaHPO
4
. Đất thiếu Ca, Lily dễ bị vàng
lá, lá phát triển không gọn [14].
2.1.5. Tình hình sản xuất hoa Lily trên thế giới và Việt Nam
2.1.5.1. Tình hình sản xuất hoa Lily trên thế giới

Hoa Lily cắt cành là một loại hoa đẹp, hiện đang là một trong 6 loại hoa cắt
phổ biến và có giá trị nhất (Hồng, Cúc, Phăng, Layơn, Đồng tiền, Lily). Hoa Lily
được nhiều người biết đến và ưa chuộng bởi vẻ đẹp sang trọng, quyến rũ và
hương thơm thanh nhã cũng như độ bền của hoa (9 - 15 ngày). Trên thế giới, cây
hoa Lily được trồng ở nhiều nước Châu Âu như: Hà Lan, Pháp, Đức, Bỉ, Nga
Hiện nay cây hoa Lily cũng đã xuất hiện nhiều ở Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn
Quốc, Việt Nam, Kenia
Ở Hà Lan, cây hoa Lily được phát triển mạnh, diện tích trồng hoa Lily đứng
thứ 2 trong tổng số diện tích hoa trồng bằng củ, đặc biệt nguồn cung cấp giống từ
nuôi cấy mô đã đạt đến 8.020.133.000 cây (1986) so với 1982 là 802.585.000
cây. Lượng hoa này năm 1986 cũng vượt xa cây hoa Lan (chỉ đạt 1.053.709.000
cây). Sở dĩ có được sự tăng vọt này là do người Hà L an đã tạo ra rất nhiều giống
mới có hoa đẹp chống chịu sâu bệnh tốt, năng suất cao. Ngoài ra do kỹ thuật
trồng hoa rất tiên tiến nên có thể trồng hoa quanh năm và giá thành giảm; vì vậy,
hiệu quả kinh tế mang lại từ việc trồng hoa Lily cao hơn hẳn trước đây. Hiện nay,
Hà Lan mỗi năm trồng 18.000 ha hoa Lily, trong đó xuất khẩu 70%.[5], [11].
Nhật Bản là một trong nhưng nước tiêu thụ và nhập khẩu hoa lớn nhất Châu
Á (mỗi năm khoảng 500 triệu USD). Hiện nay, cây hoa Lily đã xuất hiện nhiều ở
Nhật Bản. Theo số liệu thống kê của Nhật Bản, trong tổng số 1558 ha trồng các
loại hoa có củ (hoa Lily, hoa Tulip, hoa Layơn ), hoa Lily đã chiếm diện tích
11
508 ha, cho sản lượng hoa cắt cao đạt doanh thu lớn (15068 triệu Yên Nhật so
với tổng doanh thu các loại hoa củ là 33047 triệu Yên Nhật của năm 1991) [4].
Cùng với Nhật Bản, Hàn Quốc cũng là một nước phát triển nghề trồng hoa
mạnh, lượng hoa xuất khẩu của Hàn Quốc lớn nhất khu vực Đông Bắc Á. Theo
thống kê năm 2000, Hàn Quốc có 15.000 ha trồng hoa, giá trị sản lượng đạt 700
triệu USD, gấp 8 lần năm 1989. Trong đó, Lily là loại cây có giá trị hiệu quả kinh
tế cao nhất trong các loại hoa.
Ở Châu Phi, Kenia là nước sản xuất hoa chủ yếu và là nước xuất khẩu hoa
tươi lớn nhất châu lục này. Hiện nay, Kenia có 3 vạn nông trường chủ yếu trồng

hoa Phăng, Hoa Hồng, Hoa Lily. Mỗi năm nước này xuất khẩu sang Châu Âu 65
triệu USD, trong đó riêng Lily chiếm 35%.
Ngoài ra một số nước khác cũng có lượng hoa Lily xuất khẩu và diện tích
trồng hoa Lily tương đối cao như Đài Loan: năm 2001 có 490 ha trồng Lily,
trong đó xuất khẩu đạt 7,4 triệu USD [5].
2.1.5.2. Tình hình sản xuất hoa Lily ở Việt Nam
Theo dự án sản xuất hoa thương mại, hoa Lily được xem là một trong 4 loại
hoa quan trọng, được đưa vào nghiên cứu. Tuy nhiên, ở nước ta diện tích trồng
hoa Lily chiếm rất ít và tập trung chủ yếu ở Đà Lạt, Sa Pa, Hà Nội Tại Đà Lạt,
hàng năm sản xuất được hàng triệu cành hoa cắt phục vụ cho nhu cầu trong nước
và xuất khẩu. Lily là một trong những loại hoa đem lại hiệu quả kinh tế cao nhất
cho một số công ty hoa tại Đà Lạt. Với lượng hoa sản xuất ra còn hết sức hạn chế
so với nhu cầu thị trường, nên việc mở rộng quy mô sản xuất hoa Lily là rất cần
thiết.
Thực tế cho thấy ở nước ta, hoa Lily có giá trị kinh tế cao. Trên thị trường
hiện nay đang bán phổ biến các loại hoa Lily với giá khá đắt so với các loại hoa
khác và so với cả thu nhập của người Việt Nam (khoảng 20.000 - 30.000 đồng/
cành). Vì vậy, nếu chúng ta chú trọng đầu tư và nhanh chóng mở rộng diện tích
12
trồng hoa Lily sẽ đem lại hiệu quả kinh tế cao, tăng thu nhập đáng kể cho người
trồng hoa, nâng cao mức sống giải quyết vấn đề việc làm cho người lao động.
2.1.6. Các phương pháp nhân giống hoa Lily
Để nhân giống hoa Lily thì có thể thực hiện theo con đường hữu tính và vô
tính.
2.1.6.1. Phương pháp nhân giống hoa Lily bằng con đường nhân
giống hữu tính.
Nhân giống hữu tính là dùng hạt đã được thụ phấn để trồng. Nhân giống
Lily bằng hạt được áp dụng trong thực tế trên vài loài như L.regale,
L.longiflorum, L.pumilum, L.henryi và L.martagon (Baardse, 1977). Ở Nhật Bản,
hoa cắt cành được sản xuất chủ yếu từ các hạt của L.longiflorum x L.formosarum

vào thời điểm hè thu. Hạt có thể nảy mầm trên mặt đất (L.regale, L.longiflorum,
L.pumilum, L.henryi, L.formosarum) hoặc nảy mầm dưới mặt đất (L.speciosum,
L.martagon) (Hartmann và Kester, 1975) [1].
Nhân giống bằng phương pháp hữu tính có ưu điểm là có thể thu được
nhiều hạt trong một thời gian ngắn từ một vài cây mẹ có chất lượng cao, đặc biệt
là ở chi Lilium thì virus không thể lây lan từ cây mẹ sang cây con bằng hạt. Do
vậy, mức độ nhiễm virus của các cây nhân giống bằng hạt là khá thấp. Tuy nhiên,
do cây nảy mầm từ hạt thường không đồng nhất và hay xuất hiện các biến dị di
truyền và mất nhiều thời gian, từ gieo hạt đến khi cây ra hoa có chất lượng tốt
phải mất 3 - 4 năm, vì vậy phương pháp nhân giống này ít được ứng dụng.[1],
[5].
2.1.6.2. Phương pháp nhân giống hoa Lily bằng con đường nhân
giống vô tính.
a, Giâm vảy (cắm vảy)
Đây là phương pháp nhân giống cổ truyền. Trên thân vảy (củ) của Lily có
rất nhiều vảy, mỗi vảy có thể sinh ra vài vảy nhỏ ở gốc, mỗi thân vảy nhỏ sẽ hình
thành một cơ thể mới.
13
b, Nhân giống bằng cách tách củ
Tách củ là phương pháp nhân giống bằng cách tách củ con được sinh ra từ
củ mẹ. Có thể trồng cây chuyên để nhân giống. Cũng có thể kết hợp với sản xuất
hoa vụ hè để nhân giống, nhưng do trong thời điểm này, khí hậu nóng nên chất
lượng củ loại này kém. Mỗi củ mẹ đều có thể có 3 - 5 củ con tương đối lớn (chu
vi 5cm trở lên) và 4 - 8 củ nhỏ (chu vi 1 - 3cm). Những củ có chu vi 5cm trở lên
đem trồng sau một vụ có thể thành củ nhỡ để sản xuất hoa (10cm trở lên), củ có
chu vi 1 - 3cm thì phải trồng hai vụ mới thành củ sản xuất hoa được.
c, Nhân giống bằng mầm hạt
Có một số Lily nách lá có thể sinh ra nhiều mầm hạt màu đen tím. Mầm hạt
là do một số vảy hợp lại, nó có thể ra rễ, ra lá; nếu hái xuống rồi trồng có thể
thành cây con, cách trồng tương tự như trồng bằng hạt.

Tóm lại, các phương pháp nhân giống trên có rất nhiều ưu điểm nhưng nếu
nhân giống liên tục nhiều năm thì virus tích luỹ lại và truyền từ thế hệ này sang
thế hệ khác, làm hoa sinh trưởng, phát triển yếu, hoa nhỏ và hệ số nhân giống
chưa có thể đáp ứng nhu cầu trồng và sản xuất hoa Lily trong nước ta. Đặc biệt là
quy mô sản xuất công nghiệp đang phát triển mạnh. Hiện nay, nếu phải nhập nội
củ giống từ Hà Lan, Hàn Quốc, Trung Quốc với giá thành 10.000 - 12.000
đồng/củ thì chi phí bỏ ra cho sản xuất là rất cao. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào
là phương pháp nhân giống mới hiện nay trên thế giới và rất mới ở Việt Nam,
phương pháp này có thể khắc phục được các nhược điểm trên và đáp ứng được
nhu cầu của sản xuất.[5].
2.1.7. Các kết quả nghiên cứu về nhân giống In vitro cây hoa Lily
2.1.7.1. Ở Việt Nam
Năm 1993, Mai Xuân Lương và cộng sự đã thăm dò quy trình nhân giống
cây hoa Lily trên môi trường đa lượng với các mức dinh dưỡng khác nhau như
MS, White, Knop, cho thấy sự nhân chồi tốt nhất vẫn trên môi trường MS và bổ
14
sung các nguyên tố vi lượng (theo Heller) + vitamin (theo Morel) + 100mg/l
Inositol + 20g sacaroza +15g/l agar. [12].
Năm 1994, Dương Tấn Nhựt đã công bố kết quả nghiên cứu giống hoa huệ
tây bằng phương pháp nuôi cấy vảy củ. Vảy củ được khử trùng bằng HgCl
2
0,2%
trong thời gian 5 phút, sau đó cấy trên MS có bổ sung các thành phần vitamin,
chất hữu cơ, và đường sacaroza. Sau khi tạo được cây con có thể tiếp tục nhân
bằng cách tách các vảy củ đã được tạo thành đem cấy vào môi trường nhân.[16].
Năm 1995, Dương Tấn Nhựt cũng đã thành công trong nghiên cứu nhân
giống hoa loa kèn bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng được tách từ chồi phát triển
đến khi thân chính phân đốt thì tiến hành cắt thân chính thành nhiều đốt nhỏ và
tiến hành nhân nhanh.
Năm 1996, Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Nhẫn, Nguyễn Phương Thảo

đã nghiên cứu sử dụng phương pháp nuôi cấy in vitrio trên giống hoa Lily màu
tím mới nhập nội từ Pháp và đưa ra quy trình nhân giống kể từ khi đưa mẫu vào
đến khi sản xuất ra củ giống.[18].
Năm 1997, Hoàng Minh Tấn và Cao Ngọc Thuý đã khẳng định hiệu quả
kinh tế của việc xử lý nhiệt độ thấp cho củ hoa Lily. Xử lý giống ở điều kiện 5
0
C
trong 20 ngày đã giúp cho củ nảy mầm trước 1 tháng và rút ngắn thời gian sinh
trưởng từ 193 xuống 114 ngày.
Năm 2000, Dương Tấn Nhựt đã ứng dụng thành công kỹ thuật cắt lát mỏng
tế bào đoạn thân vào nuôi cấy in vitro giống hoa Lily L.longiflorum.
Năm 2001, Nguyễn Thị Nhân, Nguyễn Quang Thạch đã thành công trong
lĩnh vực nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật tạo củ in vitro trong công tác nhân giống
hoa Lily.
Năm 2003, Đỗ Năng Vịnh đã nghiên cứu về ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy
bằng phản ứng sinh học trong nhân giống cây hoa Lily.[8]
Năm 2004, Dương Tấn Nhựt và cộng sự đã nghiên cứu về hạt nhân tạo của
hoa Lily [17].
15
Năm 2005, Nguyễn Thị Lý Anh; Nguyễn Thị Hương; Nguyễn Quang Thạch
đã nghiên cứu tạo củ Lily bằng in vitro và sự sinh trưởng của cây Lily trồng từ củ
bằng phương pháp in vitro.[2]
Năm 2006, Cao Thị Huyền Trang, Dương Minh Nga nghiên cứu tạo củ trực
tiếp từ lát cắt vảy củ Lily in vitro [22].
Năm 2007, Dương Tấn Nhựt đứng đầu nhóm các nhà khoa học của Phân
viện Công nghệ sinh học Đà Lạt thuộc Viện KH&CN Việt Nam cùng với Trường
ĐH Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh vừa nhân giống thành
công cây hoa Lily bằng kỹ thuật nuôi cấy bioreactor.
Qua đây, ta có thể thấy ở nước ta việc nghiên cứu nhân giống in vitro cây
hoa Lily chủ yếu tập trung vào việc tạo củ in vitro từ vảy củ, còn phương pháp

tạo cây con in vitro từ vảy củ ít được đề cập đến.
2.7.1.2. Trên thế giới
Năm 1969, Goutheret nghiên cứu hàm lượng dinh dưỡng muối khoáng có
vai trò trong sự sinh trưởng và phân chia tế bào khi nuôi cấy mô hoa Lily.
Năm 1994, Asjes và cộng sự đã ứng dụng thành công kỹ thuật nuôi cấy
meristem (mô phân sinh đỉnh) để tạo ra các giống hoa Lily hoàn toàn sạch virus ở
Hà Lan. Khi nghiên cứu nguồn vật liệu nuôi cấy ban đầu. Robb đã chỉ ra bộ phận
nuôi cấy thích hợp nhất với cây hoa Lily là vảy củ. Nuôi cấy vảy củ rút ngắn thời
gian tái sinh chồi và tỷ lệ tái sinh chồi luôn cao hơn các bộ phận khác.
Niimi và Onozwa đã sử dụng lá để làm vật liệu khởi đầu cho nuôi cấy tạo
callus.[8].
Khi nuôi cấy chồi đỉnh giống hoa Lily (Lilium formllongihrot.R) trên môi
trường sử dụng các loại đường khác nhau: Sacaroza, glucoza, fructoza, và
Sorbitol (30g/l) và nghiên cứu sự nảy mầm của củ Lily trên các môi trường đó,
Matsui - K và cộng sự cho biết hiệu quả hình thành cây cao nhất đạt được 73,7%
trên môi trường có chứa glucoza. Ngoài ra hàm lượng đường sử dụng trong môi
trường nuôi cấy còn liên quan chặt chẽ đến sự ngủ nghỉ của củ sau khi nuôi cấy.
Theo Tapayma và Takashige (1982) nếu môi trường chứa 30g/l sacaroza, để phá
ngủ nghỉ của củ cần xử lý nhiệt độ thấp khoảng 70 ngày. Nếu hàm lượng đường
lên tới 90g/l thì cần đến 120 - 140 ngày để phá sự ngủ nghỉ của củ.
16
Năm 1981, Van và Blom đã xác định được vai trò của BAP phối hợp với α-
NAA trong sự tái sinh chồi. Ngoài ra BAP cũng ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và
phát triển của chồi.
Năm 1986, một số tác giả đã nghiên cứu quy trình nhân nhanh củ cây hoa
Lily bằng phương pháp nuôi cấy in vitro trên môi trường bổ sung axit Abcisic.
Kết quả cho thấy rằng axit Abcisic có thể ức chế quá trình tạo mô sẹo, kích thích
quá trình hình thành củ và làm mập chồi.
Năm 1993, Stanilova.M và Zagorska (Bungari) cũng khẳng định vảy củ là
nguyên liệu tốt cho việc tái sinh chồi từ mô nuôi cấy trên môi trường MS có bổ

sung 0,5mg/l α-NAA +0,1mg/l Kinetin tạo ra các giống cây trồng đồng đều về
chất lượng.
Năm 1995, các nhà nghiên cứu người Mỹ Wicksemesinhe - E, Holcomb - E,
Arteca - R đã tạo ra được mô sẹo từ mô lá non của Easter Lily khi nuôi cấy trên
môi trường MS có bổ sung B5 + 20g/l Gelrite trong điều kiện bóng tối hoặc có
chiếu sáng 16h/ngày ở nhiệt độ 25
0
C. Sau 3 tuần và được cấy chuyển sang môi
trường 0,1ppm 2,4D + 0,5 ppm BAP thì các mô sẹo bắt đầu phát sinh các cơ
quan.
Năm 1995, Verron và cộng sự đã thành công khi tiến hành nuôi cấy đoạn
thân, chồi đỉnh, chồi nách của cây hoa Lily trên môi truờng MS có bổ sung
vitamin và 0,1 - 10,7 ppm α-NAA +1,3 - 8,0 ppm BAP = 30g/l glucoza.
Năm 1997, Takayama và Misawa đã nghiên cứu khả năng tái sinh chồi Lily
nuôi cấy từ cánh hoa Lily.
Hà Lan là nước thành công nhiều trong lĩnh vực nuôi cấy in vitro cây hoa
Lily trên môi trường đặc (agar), chồi phát triển mạnh, cho hệ số nhân chồi cao.
Trong những năm 1986 - 1992 nguồn giống hoa Lily in vitro ở Hà Lan đã đạt gấp
10 lần so với các loại cây hoa khác như: hoa Cúc, Layơn
Hiện nay, Nhật Bản đã thành công trong việc tạo giống cây hoa Lily in vitro
bằng kỹ thuật di truyền (năm 1994, Miyoshi - H, Tanaka - I đã chuyển gen bằng
phương pháp sốc điện vào tế bào của cây hoa Lily).
17
Ngoài lĩnh vực nuôi cấy in vitro, cũng có nhiều nghiên cứu khác trên cây
hoa Lily của nhiều tác giả trong và ngoài nước như: Kéo dài thời gian bảo quản
hoá bằng chất kháng etylen (Swart, 1981), ngâm củ giống trong dung dịch kháng
etylen làm tăng chất lượng hoa (Vanmeeteren và Proft, 1982), phá ngủ cho củ
giống bằng nhiệt độ (Nhật Bản, 1998). Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ thấp
làm tăng khả năng phát triển và rút ngắn thời gian ra hoa (Nguyễn Quang Thạch
và cộng sự, 1986). Năm 1992, Nguyễn Mạnh Khải và cộng sự nghiên cứu làm

tăng chiều cao cây và tăng số bông bằng cách tăng thời gian chiếu sáng và phun
GA
3
nhiều lần lên cây hoa trái vụ Như vậy bằng cách tổng hợp các biện pháp
vật lý, hóa học cho củ giống và trong quá trình sinh trưởng, phát triển của cây ta
có thể điều khiển sự ra hoa trái vụ hoa Lily. Ở Việt Nam, Bộ môn Sinh lý - Khoa
học Nông học - Trường ĐH nông nghiệp I đã thành công trong tạo hoa Lily trái
vụ, được ứng dụng trong sản xuất, cho phép cung cấp hoa Lily vào các dịp tết, lễ
mà trước đó chưa hề có ở miền Bắc Việt Nam.
Trong lĩnh vực chọn giống, mục tiêu nghiện cứu hiện nay đối với hoa Lily
là chọn tạo được các giống mới mang các đặc tính chống chịu bệnh (các bệnh
nấm (Fusarium oxysporum, Pythium) và virus), các tính trạng chất lượng (hoa có
tuổi thọ kéo dài, có khả năng mọc mầm tốt), lai khác loài và biến nạp gen. Ngoài
ra, hệ thống các marker phân tử cũng được phát triển nhằm phát hiện các marker
di truyền liên kết với các đặc tính kháng bệnh, nấm, virus và góp phần xây
dựng bản đồ di truyền của cây hoa Lily (van Tuyl và CS, 1996). Các nghiên cứu
về hệ thống thụ phấn in vitro, cứu phôi cũng đã nghiên cứu ứng dụng nhằm khắc
phục các hạn chế của kỹ thuật lai khác loài, từ đó tạo ra một loạt các nhóm hoa
Lily mới hiện nay.
Tóm lại, tình hình nghiên cứu hoa Lily đã được thực hiện ở nhiều nước trên
thế giới cũng như ở nước ta. Việc nghiên cứu nhân giống hoa Lily đã được thực
hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau như: nuôi cấy mô tế bào, chuyển gen,
biến nạp di truyền và đã mang lại những kết quả thành công góp phần ứng dụng
vào thực tiễn sản xuất hoa Lily nhằm phục vụ cho nhu cầu thị trường.
18
2.2. Công nghệ nuôi cấy mô, tế bào thực vật - Ứng dụng của nuôi cấy
mô, tế bào thực vật trong công tác giống cây trồng
2.2.1. Khái niệm chung về nuôi cấy mô, tế bào thực vật
Nuôi cấy mô, tế bào thực vật hay nhân giống vô tính in vitro là các phương
thức nuôi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường xác

định ở điều kiện vô trùng với các mục đích khác nhau. Mội trường có chứa các
chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, các hoocmon tăng trưởng
và đường.
2.2.2. Lịch sử phát triển của nuôi cấy mô, tế bào thực vật.
Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã trải qua hơn một trăm năm phát
triển. Có thể chia quá trình phát triển thành 4 giai đoạn: [24].
a, Giai đoạn khởi xướng (1898 - 1930)
Bắt đầu từ những thí nghiệm đầu tiên của Haberlandt (1898) khi ông đề
xướng ra tính toàn năng của tế bào và tìm cách nuôi cấy tế bào phân lập từ tầng
tế bào lược, tế bào tầng nhu mô, tầng biểu bì và lông hút của thực vật để chứng
minh cho luận điểm của ông, nhưng ông đã không thành công. Vì ông đã tách
những mô đã qua chuyên hoá hoàn toàn vào môi trường dinh dưỡng quá đơn
giản.
Winkler (1902, Thielman (1924), Kuster (1928) cũng đã tiến hành tương tự
như ông nhưng không nhận được tế bào phân chia nào. Winkler đã có những
quan sát rất tinh tế. Ông nhận thấy: tế bào noãn trương lên khi hạt phấn nảy mầm
và đề nghị nuôi tế bào phân lập cùng với ống phấn trong một giá treo để bắt ống
phấn kích thích tế bào dinh dưỡng phân chia. Ngoài ra ông còn đề nghị bổ sung
vào môi trường dinh dưỡng dịch chiết từ các mô dinh dưỡng khác, ví dụ như dịch
lấy từ túi phôi và ông tin rằng bằng con đường đó có thể nuôi thành công một tế
bào dinh dưỡng phân lập thành phôi.
Phải đến năm 30 của thế kỷ XX người ta mới đạt được những tiến bộ thực
sự. Schmucker (1929), Schettrer (1931), Pfeifer (1931), Larue (1933) đã thành
công trong việc nuôi cấy mô tế bào tực vật từ đầu rễ tách rời của cây hoà thảo
19
trên môi trường dinh dưỡng gồm có đường glucoza và muối khoáng. Đây là tiến
bộ đánh dấu một giai đoạn phát triển mới.
b, Giai đoạn nghiên cứu sinh lý (1930 - 1950)
Năm 1934, White đã thành công khi nuôi cấy rễ cà chua. Tế bào của mô
nuôi cấy đã sinh trưởng và phân chia liên tục trong 4 tháng trên môi trường lỏng

có chứa muối khoáng, glucoza, và dịch chiết nấm men.
Cùng năm đó, Gauthret thông báo thành công trong việc nuôi cấy mô tách
từ tượng tầng của cây Salix apraea và cây Populus nigra. Mô nuôi cấy đã liên
tục phân chia trong nhiều tháng trên môi trường Knop bổ sung glucoza và
cysteinhyochloride.
Trong thời kỳ này, Went và Thiman (1937) đã phát hiện ra IAA (Indoaxetic
axit) là một auxin tồn tại trong tự nhiên trong cơ thể thực vật. IAA được công
nhận là một hoocmon thực vật, có chức năng như một chất điều khiển sinh
trưởng tác động lên quá trình phân chia tế bào và hình thành rễ. Gautheret đã sử
dụng IAA vào môi trường nuôi cấy, kết quả thu được mới chỉ hạn chế ở mô
tượng tầng của cây Salix.
Năm 1938, Nobecout nhận được phân bào ở mô củ cà rốt Daucus carota.
White nuôi cấy mô tượng tầng của cây thuốc lá lai.
Thành công quan trọng của thời kỳ này là đã xây dựng và sử dụng có kết
quả một số loại môi trường bán nhân tạo, đồng thời phát hiện được vai trò của
một số vitamin đảm bảo sự thành công đối với việc nuôi cấy cơ quan (rễ) và mô
(tượng tầng) ở thực vật.
c, Giai đoạn nghiên cứu phát triển hình thái (1950 -1960).
Đại diện cho giai đoạn này là: Miler, Skoog, Steward, Reinet.
Năm 1949, Camus đã ghép chồi trên mô nuôi cấy và quá trình phân hoá ống
mạch trong khối mô. Đây là tiền đề để nghiên cứu về sự điều khiển quá trình
phân hoá trong mô nuôi cấy.
Tiếp theo là công trình của Miler và Skoog (1956) tạo chồi thành công từ
mô thuốc lá nuôi cấy.
20
Trong giai đoạn này, Skoog đã phát hiện ra Kinetin là một chất điều khiển
quá trình phân bào (thuộc nhóm Cytokinin) và phân hoá mầm chồi.
Năm 1958 - 1959, Steward và Retnet đã sử dụng nước dừa (có chứa các
chất thuộc nhóm Cytokinin) vào nuôi cấy tế bào cà rốt và đã thu được phôi từ
nuôi cấy tế bào cà rốt.

Năm 1960, Bergmann đã phát triển kỹ thuật tế bào đơn lên một bước mới
tạo được khối mô sẹo từ một tế bào đơn bằng kỹ thuật gieo trải tế bào thực vật
trên đĩa thạch như trải tế bào vi sinh vật. Và ông đã tái sinh được cây thuốc lá
hoàn chỉnh từ một tế bào đơn.
d, Giai đoạn nghiên cứu di truyền (1960 - nay)
Năm 1960, Cooking tách được tế bào trần Protoplast.
Năm 1964, Guha và Mahesawari tạo được cây cà độc dược (Datura
innoxia) có bộ nhiễm sắc thể đơn bội từ nuôi cấy bao phấn.
Nisch (1967), Nakata (1968) tạo được cây đơn bội từ bao phấn cây thuốc lá.
Năm 1968, Niieki và Ono nuôi cấy thành công bao phấn và tạo được cây
đơn bội từ lúa (Oryza sativa).
Năm 1971, Takebe tái sinh được cây thuốc lá hoàn chỉnh protoplast thuốc lá
Xanthi.
Năm 1977, Melchert lai soma thành công cây cà chua và cây khoai tây.
Năm 1985, cây thuốc lá mang gen biến nạp đầu tiên được công bố.
Năm 1994, giống củ cải đường mang gen kháng bệnh virus biến nạp được
đưa vào sản xuất đại trà tại Nauy. Tại Mỹ có hàng trăm giống cây mang gen biến
nạp đã được người tiêu dùng chấp nhận. Thế nhưng cho đến nay những quy định
về an toàn sinh học của các nước đang còn khác nhau. Vì thế việc đưa cây trồng
mang gen biến nạp vào sản xuất đại trà còn phụ thuộc vào trình độ khoa học và
chính sách của từng nước.
21
2.2.3. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào
a, Tính toàn năng của tế bào
Năm 1902, Haberlandt (Đức) là người đầu tiên đề xướng học thuyết về tính
toàn năng của tế bào (topipotency) trong cuốn sách "Thực nghiệm về nuôi cấy
mô tế bào tách rời" [21]. Theo ông: "Mỗi tế bào của một cơ thể đa bào đều mang
trong mình đầy đủ các thông tin di truyền để kiến tạo nên một cơ thể hoàn chỉnh.
Vì vậy khi đặt tế bào vào trong điều kiện thuận lợi, nó có thể phát triển thành một
cơ thể."[8]. Tính toàn năng cho phép từ những cơ quan, bộ phận của cơ thể có thể

tái sinh thành cây hoàn chỉnh đồng nhất về mặt di truyền với cây mẹ.
b, Sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào thực vật
Cơ thể sinh vật trưởng thành gồm nhiều cơ quan có nhiều chức năng khác
nhau được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau. Nhưng tất cả các loại tế bào
đó đều bắt nguồn từ một tế bào ban đầu (tế bào hợp tử). Ở giai đoạn đầu, tế bào
hợp tử phân chia thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng chuyên biệt
(chuyên hoá). Sau đó, từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi
thành các tế bào chuyên hoá đặc hiệu cho các mô, cơ quan có chức năng khác
nhau.
Sự phân hoá (diffrentation) của tế bào thực vật là sự chuyển hoá các tế bào
phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hoá để đảm nhận các chức năng sinh lý
khác nhau.[8].
Tuy nhiên khi các tế bào đã phân hoá thành các tế bào có chức năng chuyên
biệt, chúng không hoàn toàn mất đi khả năng biến đổi của mình. Trong trường
hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng có thể về dạng tế bào phôi sinh và
phân chia mạnh mẽ. Quá trình đó gọi là quá trình phản phân hoá
(dediffrentation), ngược lại với quá trình phân hoá tế bào.
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là kết quả
của quá trình phân hoá và phản phân hóa tế bào dựa trên tính toàn năng của tế
bào thực vật.[1], [21].
22
2.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực
vật
a, Vật liệu nuôi cấy
Cơ thể thực vật đa bào có tính toàn năng nghĩa là có khả năng phân hóa và
khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh từ một tế bào, mô, cơ quan trong môi
trường dinh dưỡng nhân tạo thích hợp. Do vậy, về nguyên tắc bất kỳ một bộ phận
nào của cây cũng có thể sử dụng làm vật liệu nuôi cấy, có thể là cơ thể thực rễ,
các tổ chức phôi non, phôi đã trưởng thành hoặc các mô sẹo, các tế bào đơn, tế
bào trần

Tuy nhiên khả năng này phụ thuộc vào từng loài. Có loài dễ tái sinh từ mô
nuôi cấy như khoai tây, cà chua, thuốc lá, những cũng có những loài rất khó tái
sinh như trầm hương Thông thường các bộ phận khác nhau của cây khi nuôi
cấy sẽ cho kết quả khác nhau [9], [10]. Như vậy việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy
ban đầu rất quan trọng, lựa chọn vật liêu nuôi cấy phụ thuộc vào giống, loài, tuổi
mẫu, vị trí, kích thước mẫu, mùa lấy mẫu trong năm và mục tiêu nuôi cấy (Nhựt
et al., 2003) [9], [1].
Đối với Lily, Nguyễn Xuân Linh đã tổng kết tất cả các nghiên cứu và khẳng
định rằng có thể sử dụng nhiều bộ phận khác nhau như vảy củ, đoạn thân, cuống
hoa, nhị hoa, nhụy, cánh hoa, để tạo vật liệu khởi đầu. Nhưng qua quá trình
quan sát đánh giá thì vảy củ là bộ phận tốt nhất, cho hiệu quả cao nhất trong việc
tạo vật liệu khởi đầu [11].
b, Môi trường nuôi cấy
Mô nuôi cấy bị tách rời ra khỏi cơ thể mẹ nên mất khả năng tự dưỡng vì vậy
để cho mô tồn tại và phân hoá thì trong các giai đoạn nuôi cấy phải tạo ra được
môi trường nuôi cấy có đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho mô nuôi cấy.
Cho đến nay, đã có nhiều loại môi trường dinh dưỡng được tìm ra: Môi trường
Murashige và Skoog (1962) viết tắc là MS, môi trường Linsmainer và Skoog
(1963), môi trường Gamborg (1968), môi trường Knop (1974) Đây là những
23
môi trường cơ bản và sẽ được cãi biến ra nhiều loại môi trường khác nhau cho
phù hợp với mỗi đối tượng nghiên cứu và mục đích thí nghiệm. Trong số đó, môi
trường MS được đánh giá là phù hợp nhất cho đa số các loài thực vật (Smith và
Gould) và chính Murashige (1974) đã dùng môi trường này để nuôi cấy nhiều
loại cây trồng [10], [23].
Thành phần của môi trường nuôi cấy tế bào thay đổi tuỳ theo từng loại thực
vật, loại tế bào, mô, cơ quan được nuôi cấy, các giai đoạn sinh trưởng, phát triển
của mẫu cấy, cũng như mục đích nuôi cấy. Tuy nhiên môi trường nuôi cấy mô tế
bào thực vật đặc trưng đều chứa các thành phần sau:
- Các nguyên tố đa lượng (gồm muối nitơ, phốt pho, magie, canxi, kali,

lưu huỳnh): là thành phần không thể thiếu được vì chúng tham gia cấu thành các
cơ quan tử trong cơ thể thực vật (Anderson, 1980) [21].
- Các nguyên tố vi lượng (muối sắt, kẽm, đồng, mangan, coban, molipden,
bo, iôt). Các nguyên tố này tuy có hàm lượng thấp nhưng có vai trò quan trọng
trong việc thúc đẩy sự phát triển của thực vật ở giai đoạn xuân hóa (Lê Văn Chi,
1992), ngoài ra nó còn là thành phần của enzym xúc tác cho các phản ứng sinh
hoá trong cơ thể [21]. Ví dụ thiếu sắt tế bào mất khả năng phân chia; thiếu
mangan thì phân bào kém; thiếu bo gây thừa auxin làm mô nuôi cấy có biểu hiện
mô sẹo hoá mạnh nhưng lại xốp, mọng nước và tái sinh kém; molipđen tác động
trực tiếp lên quá trình trao đổi đạm trong tế bào thực vật [3].
- Nguồn cacbon: Khi nuôi cấy in vitro thì các tế bào thực vật không có khả
năng quang hợp và do đó đòi hỏi phải cung cấp nguồn cacbon để tạo năng lượng
cho các quá trình sinh lý, sinh hoá diễn ra bình thường trong tế bào. Đường
sucrose là nguồn cacbon tốt nhất thường được sử dụng với nồng độ là 2 - 3%
ngoài ra glucose cũng là nguồn cacbon rất tốt. Ở một số mô có thể dùng mantose,
fructose và glactose. Đường có thể bị caramen hoá nếu bị hấp khử trùng quá lâu
(Peer, 1971 và Ball, 1953) và sẽ ức chế phản ứng với các hợp chất melanoidin,
một chất sẫm màu có phân tử lượng cao, ức chế sự phát triển của tế bào [10].
24
- Các vitamin: Mô và tế bào nuôi cấy tuy có tổng hợp được vitamin nhưng
không đủ nên thường phải bổ sung vitamin vào môi trường nuôi cấy chủ yếu là:
thiamin (B
1
) đóng vai trò quan trọng trong quá trình biến đổi cacbon và tham gia
vào thành phần tổ hợp enzym xúc tác quá trình oxi hoá khử cacbon ở axit hữu cơ;
axit nicotinic (B
3
) đi vào các thành phần các enzym oxi hoá khử dehydrogennase
xúc tác việc tách hydro ra khỏi các axit hữu cơ; pyridoxin (B
6

) tham gia vào
thành phần các enzym khử cacbon và thay đổi vị trí nhóm amin trong các axit
amin; myo - insitol giúp cải thiện sự tăng trưởng của mô, có vai trò trong sinh
tổng hợp thành tế bào. Vitamin rất nhạy cảm với sự tăng trưởng của mô nuôi cấy,
vitamin được sử dụng ở nồng độ thấp, nó có vai trò quan trọng trong sinh tổng
hợp tế bào [3], [21].
- Các chất có nguồn gốc tự nhiên phức tạp: nước dừa, dịch chiết chuối,
dịch chiết cà chua, dịch chiết nấm men, dịch thuỷ phân cazein cũng được sử
dụng trong nuôi cấy in vitro vì thành phần của chúng có nhiều chất thúc đẩy tăng
trưởng tế bào và mô nuôi cấy. Năm 1941, Overbeek đã chứng minh nước dừa có
khả năng kích thích sự phân chia và phân hoá tế bào (Đỗ Năng Vịnh, 2003) [21].
Theo Tukele và cộng sự (1981) nước dừa bổ sung vào môi trường các loại
đường, protein, các axit hữu cơ, các axit amin các chất kích thích sinh trưởng
(cytokinin ), các vitamin (insitol) và các chất quan trọng khác có tác dụng tốt
trong tăng trưởng của mô [23].
- Các chất làm rắn môi trường: agar là một polysaccarit thu được từ một
số tảo thuộc ngành tảo đỏ. Agar được sử dụng để làm rắn môi trường, tạo giá thể
nâng đỡ cây. Tuỳ đặc điểm nuôi cấy và chất lượng agar mà nồng độ sử dụng thay
đổi từ 0,8 - 1,0%. Nếu sử dụng với nồng độ quá cao sẽ làm môi trường quá cứng
và ảnh hưởng tới sự khuyếch tán cũng như hấp thu dinh dưỡng của mô, tế bào
(Collin, 1998; Bhojwani & Razan,1983) [1]. Nếu như agar không tinh sạch thì nó
có thể làm đục màu môi trường do các chất cặn trong agar gây nên. Agar có thể
ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm (Griffis et al., 1991;Debergh,1983; Halquist et
25