Thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật - Bài 4 pptx

172



Bài 4
Nuôi cấy đơn bội in vitro

I. Mục đích và yêu cầu
Trong công tác giống cây trồng, kỹ thuật tạo dòng thuần chủng
luôn luôn giữ vai trò quan trọng. Có nhiều phương pháp tạo dòng thuần
chủng khác nhau, nhưng thông thường nhất là tiến hành chọn lọc và kiểm
tra qua nhiều thế hệ tự phối. Cách làm này mang lại kết quả chắc chắn,
nhưng đòi hỏi chi phí lớn về trồng trọt và mất nhiều thời gian.
Bằng con đường đơn bội, nghĩa là chọn ra những cá thể 1n rồi sau
đó lưỡng bội hóa chúng, trong một thời gian ngắn sẽ thu được những cá
thể đồng hợp tử tuyệt đối, đó là những dòng thuần rất lý tưởng. Hai biện
pháp truyền thống để thu được cây đơn bội là:
- Chọn lọc đơn bội xuất hiện ngẫu nhiên.
- Lai xa và chọn lọc sau khi bộ nhiễm sắc thể của một trong hai
giao tử mất đi (thoái biến) sẽ thu được thể đơn bội, hiện tượng này chỉ mới
phát hiện được ở một số cặp lai khác loài của đại mạch.
Tuy nhiên, vấn đề đặt ra là làm sao để có được một số lượng cây
đơn bội lớn. Phương pháp này hầu như không thể giải quyết vấn đề nói
trên.
Năm 1964, Guha và Maheshawari đã đưa ra một phương pháp tạo
cây đơn bội mới, đó là tạo cây đơn bội từ hạt phấn thông qua nuôi cấy in
vitro. Trên nhiều đối tượng cây trồng, phương pháp này đã tạo được hàng
loạt cá thể đơn bội trong một thời gian ngắn (chỉ một vài tháng). Chính vì
vậy, đã có nhiều chương trình tạo giống cây trồng ra đời trên cơ sở áp
dụng kỹ thuật đơn bội in vitro và đã thu được kết quả tốt.

Có hai trường hợp tạ
o cây đơn bội từ hạt phấn: hạt phấn tạo trực
tiếp cây đơn bội (thường gặp ở thuốc lá) hay hạt phấn tạo gián tiếp cây
đơn bội thông qua giai đoạn phát triển callus (ở lúa). Để tạo cây đơn bội
kép có thể sử dụng hai phương thức: cây đơn bội kép tạo từ cây đơn bội
được xử lý colchicine hay cây đơn bội kép tái sinh từ callus của cây đơn
bộ
i (trường hợp này thường chỉ đạt hiệu suất khoảng 60 %).


173
II. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất
1. Dụng cụ
- Ống nghiệm (1,5 cm × 20 cm)
- Giấy thấm vô trùng
- Giấy nhôm
- Lọ khử trùng mẫu vật nuôi cấy
- Forceps, kéo, dao mổ, kim nhọn
- Đĩa petri vô trùng
- Cốc chịu nhiệt, ống đong, micropipette

2. Thiết bị
- Nồi khử trùng
- Tủ lạnh
- Laminar
- Tủ sấy
- Microwave
- Cân phân tích 10
-4
g

- Cân kỹ thuật 10
-2
g
- Máy cất nước 2 lần
- Kính hiển vi

3. Hóa chất
- Dung dịch stock môi trường Nt (Nt
1
, Nt
2
, Nt
3
, Nt
4
và Nt
5
)
- Dung dịch HgCl
2
0,1%
- Cồn 90%
- Agar
- Saccharose
- Nước cất vô trùng
- Dung dịch stock các chất kích thích sinh trưởng: IAA, BAP, KIN
và 2,4-D

III. Phương pháp tiến hành
1. Nguyên liệu thực vật

174
Sử dụng bao phấn của cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) đế nuôi
cấy đơn bội.

2. Môi trường nuôi cấy

Bảng 4.1. Thành phần các môi trường nuôi cấy bao phấn thuốc lá

Thành phần môi trường
(1)
Tạo cây 1n
(2)
Tạo callus 1n
(3)
Tạo chồi 1n
(4)
Tạo rễ 1n
(5)
Nitsch đầy đủ (Nt
1
, Nt
2
,
Nt
3
, Nt
4
và Nt
5

)
+ + + +
Saccharose (%) 2 2 2 2
Agar (%) 0,8 0,8 0,8 0,8
IAA (mg/L) 0,1 - - 0,1
2,4-D (mg/L) - 0,1-0,5 - -
KIN (mg/L) 0,1 0,1 0,1-1 -
BAP (mg/L) - - 0,1-1 -

Chú ý
Môi trường được chuẩn bị trong ống nghiệm (làm thạch nghiêng).

3. Nuôi cấy bao phấn
Nụ thuốc lá hái ở giai đoạn cánh hoa sắp ló ra khỏi lá đài (nụ dài
khoảng 10-15 mm) được khử trùng theo thứ tự: 2 phút trong cồn 70%, 5
phút trong dung dịch HgCl
2
0,05% và rửa bằng nước cất vô trùng từ 4-5
lần. Trong điều kiện vô trùng, dùng forceps và dao mổ tách nụ lấy các bao
phấn cấy vào ống nghiệm chứa môi trường dinh dưỡng đã chuẩn bị sẵn
(Bảng 4.1, cột 2). Mỗi ống nghiệm cấy 5-10 bao phấn và đặt ở nhiệt độ
25-27
o
C, chiếu sáng từ 10-12 giờ/ngày với cường độ chiếu sáng 2000-
3000 lux.
Sau 6-8 tuần nuôi, vỏ bao phấn sẽ nứt ra và xuất hiện các cây thuốc
lá đơn bội, cấy chuyển những cây thuốc lá này sang những bình tam giác
loại 250 mL chứa 50 mL của cùng một loại môi trường để cây đơn bội
phát triển.

175
Chú ý: Các thí nghiệm nuôi cấy đơn bội chỉ thành công với điều kiện hạt
phấn phải ở giai đoạn tứ tử hoặc đơn nhân, do đó thường người ta phải làm tiêu
bản hiển vi để quan sát sự phát triển của hạt phấn, chọn giai đoạn thích hợp rồi
mới tiến hành nuôi cấy.

4. Nhị bội hóa thông qua giai đoạn callus
Thân của cây thuốc lá đơn bội nuôi cấy trong ống nghiệm được cắt
thành từng đoạn dài 5 mm và cấy lên môi trường tạo callus (Bảng 4.1, cột
3). Sau 7-10 ngày, từ đoạn thân cây thuốc lá 1n sẽ hình thành một khối
callus nhỏ được gọi là callus sơ cấp. Tế bào callus sơ cấp thường dễ tái
sinh thành chồi khi gặp điều kiện thuận lợi. Các cây tái sinh từ tế bào
callus nuôi cấy trên môi trường ở bảng 4.1, cột 4 có độ biến động về số
lượng nhiễm sắc thể rất lớn.

- Phương pháp kiểm tra nhiễm sắc thể
Mảnh lá non (1-2 mm) hoặc đầu rễ (2 mm) được tách ra từ cây
thuốc lá đơn bội nuôi cấy trong ống nghiệm, cố định bằng hỗn hợp cồn:
acetic (3:1) trong 24 giờ. Mẫu được bảo quản ở cồn 70%, nhuộm nhiễm
sắc thể bằng acetocarmin. Đếm số lượng nhiễm sắc thể dưới kính hiển vi.
Kết quả phân tích số lượng nhiễm sắc thể của các cây tái sinh từ
quần thể tế bào callus đơn bội là không đồng nhất, cho thấy: cây 1n chiếm
tỷ lệ khoảng 21,9 %, cây 2n khoảng 61,5 % và khoảng 11,5 % là những
cây có mức bội thể cao hơn nhị bội.