CÁC PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM, NUÔI CẤY, PHÂN LẬP, CHẨN ĐOÁN NẤM – PHẦN 1 pps

CÁC PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM,
NUÔI CẤY, PHÂN LẬP, CHẨN ĐOÁN NẤM –
PHẦN 1


4.1. Kỹ thuật lấy mẫu bệnh phẩm:
Trong la bo xét nghiệm chẩn đoán nấm thì công việc lấy mẫu rất quan trọng,
phục vụ cho việc xét nghiệm trực tiếp hoặc cho nuôi cấy phân lập. Kết quả xét
nghiệm phụ thuộc vào cách lấy mẫu từ bệnh nhân.
+ Những điều cần lưu ý:
- Khi sử dụng những dụng cụ lấy mẫu cần phải tiệt trùng để tránh nhiễm khuẩn
hoặc nấm mốc từ môi trường xung quanh, nếu không sẽ gây khó khăn cho việc xét
nghiệm cũng như nuôi cấy.
- Khoảng 10 ngày trước khi lấy mẫu bệnh nhân không được sử dụng thuốc
chống nấm.
- Khi soi phải quan sát ít nhất 30 vi trường trước khi kết luận.
+ Kỹ thuật lấy bệnh phẩm ở các vị trí khác nhau:
- Bệnh phẩm ở da: cạo lấy phần da cạnh chỗ bị nhiễm, trên bờ viền thường cho
kết quả tốt. Ngoài ra có thể sử dụng một loại băng dính đặt vào chỗ da nhiễm nấm
(như lang ben) rồi kéo ra soi hoặc cho vào môi trường nuôi cấy, kết quả thường
cao hơn phương pháp cạo vẩy khoảng 10%.
- Bệnh phẩm ở ngón chân: có thể dùng kéo, kẹp hoặc đầu mũi dao tù cạo lấy
mẫu từ chỗ da ngón chân bị nhiễm. Trong trường hợp da ngón chân không bị nứt
nẻ thì cần lấy những phần vẩy da đang bong để xét nghiệm.
- Bệnh phẩm ở móng tay: cần cạo móc lấy những mảnh vụn tơi ở dưới móng
bằng một dụng cụ có đầu tù để tránh bị đau.
- Bệnh phẩm ở tóc, ở da đầu: cắt lấy một ít tóc, nhổ chân tóc hoặc cạo ít vẩy da
ở chỗ bị nhiễm nấm xét nghiệm.
4.2. Phương pháp soi bệnh phẩm trực tiếp trong dung dịch KOH 20-30%:
+ Các bệnh phẩm là sợi tóc, mẩu vụn móng tay, vẩy da được đặt lên lam
kính có 1 - 2 giọt dung dịch KOH 20%, hơ lam kính trên ngọn lửa đèn cồn, dưới

tác dụng của kiềm và nhiệt những đám tế bào da sẽ tách rời nhau.
+ Trường hợp bệnh phẩm có nấm thì sẽ dễ dàng quan sát thấy những sợi nấm,
những bào tử đốt (arthrospora) sẽ tản ra dễ phân biệt với những tế bào của động
vật. Tuy nhiên cần phải chú ý phân biệt những hạt dạng sợi, hạt mỡ, những tế bào
sừng với tế bào nấm để tránh nhầm lẫn trong khi xét nghiệm. Kết quả soi trực tiếp
xem hình 4.1.

Hình 4.1: Những sợi nấm trong bệnh phẩm xét nghiệm trực tiếp.
1. Ở vẩy da; 2. Ở móng.
4.3. Phương pháp nuôi cấy, định loại nấm da:
+ Môi trường cơ bản Sabouraud nuôi cấy chẩn đoán nấm da:
Bằng phương pháp xét nghiệm trực tiếp soi bệnh phẩm dưới kính hiển vi chỉ
cho biết có nấm hay không nhưng không thể biết đó là loài nấm gì, vì vậy cần phải
tiếp tục nuôi cấy để phân lập nấm và định danh. Môi trường hay dùng nhất là môi
trường Sabouraud, thường nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, sau 1-2 tuần quan sát sự
phát triển của nấm có thể xác định loài. Trên thực tế tỉ lệ giữa triệu chứng lâm
sàng, kết quả soi trực tiếp và nuôi cấy là 3 : 2 : 1 (3 trường hợp có triệu chứng lâm
sàng soi trực tiếp dương tính 2 và nuôi cấy dương tính 1).
Thành phần môi trường: Pepton 10 gam.
Glucoza 40 gam.
Thạch (oxoid) 10 gam.
Nước cất vừa đủ 1000 ml.
+ Môi trường Sabouraud có kháng sinh:
Khi phân lập nấm da thường có các vi khuẩn và nấm hoại sinh phát triển do
vậy thường sử dụng môi trường Sabouraud có chứa kháng sinh thích hợp ức chế
sự phát triển của vi khuẩn và các nấm mốc khác, chỉ cho nấm da phát triển. Để
ngăn cản vi khuẩn có trong bệnh phẩm người ta thường cho vào môi trường
Sabouraud kháng sinh.
- Môi trường Sabouraud có penicilin, streptomycin và actidion: tiệt trùng môi
trường trong nồi hấp ở nhiệt độ 120

0
C trong 10-15 phút, để nguội khi nhiệt độ còn
khoảng 50
0
C cho 250.000 đơn vị penicilin, 250 mg streptomycin và 500 mg
actidion vào quấy đều, đóng vào ống nghiệm hoặc hộp lồng. Môi trường này được
dùng để cấy những mẫu bệnh phẩm vào để phân lập xác định nấm da.
- Môi trường Sabouraud có cloramphenicol và desertomycin: thành phần môi
trường Sabouraud như trên. Sau khi hấp tiệt trùng xong cho 50 mg cloramphenicol và
500 mg desertomycin vào quấy đều rồi cho vào ống nghiệm hoặc hộp lồng. Có thể
cho vào trước khi tiệt trùng trong nồi hấp cũng được vì hai chất này chịu nhiệt. Sử
dụng môi trường này cũng giống như môi trường trên.
- Môi trường Mycosel:
. Thành phần: Pepton 10 gam.
Glucoza 10 gam.
Thạch 15 gam.
Cycloheximid 0,4 gam.
Cloramphenicol 0,05 gam.
Nước cất vừa đủ 1000 ml.
. pH của môi trường sau khi tiệt trùng là 6,9. Cloramphenicol bền vững với
nhiệt nên được cho vào trong môi trường rồi tiệt trùng 121
0
C trong 15 phút. Sau
khi môi trường nguội khoảng 45-50
0
C thì cho actidion vào. Actidion được hoà tan
trong etanol hoặc aceton, lọc qua phễu lọc cản trùng rồi đưa vào môi trường trên,
lắc đều và cho vào ống nghiệm để nghiêng hoặc vào hộp lồng. Môi trường bảo
quản trong tủ lạnh dùng dần.
+ Nutritional test:

Nhiều loại nấm da cần một số chất như thiamine, inositol, histidine hoặc axit
nicotinic để phát triển. Người ta đã ứng dụng tính chất này vào định loại nấm bằng
cách cho vào môi trường cơ sở (thạch casamino axit, ammonium nitrate) những
vitamine hoặc những amino axit trên, môi trường cơ sở được dùng làm chứng. Khi
nuôi cấy, nấm da sẽ phát triển khi có chất thích hợp (bảng 9).
Bảng 9: Sự phát triển của nấm trên nutritional test medium.
Môi trường casamino acid
Môi trường
ammonium
nitrate
Loài
* 1 2 3 4 * 5
T. verrucosume
84%
0

4+ 0 0
T. verrucosume
16%
0 0 4+ 4+ 0
T.schoenleinii 4+ 4+ 4+ 4+ 4+
T.concentricum 4+ 4+ 4+ 4+ 4+
T.violaceum
 
4+ 4+


T.tonsurans
 
4+ 4+



T.rubrum 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 2+
T.mentagrophytes 4+ 4+ 4+ 4+ 4+
T.equinum 0 0 0 0 4+
T.equinum
Chủng New
Zealand
4+ 4+ 4+ 4+ 4+
T.soudanense 3+ 3+ 3+ 3+ 3+ 0 0
T.megninii 2+ 0 4+
T.gallinae 3+ 4+ 4+
*. Base medium: môi trường cơ sở.
1. Thêm inositol. 2. Thêm inositol thiamine.
3. Thêm thiamine. 4. Thêm nicotinic acid. 5. Thêm histidine.
+ Môi trường DTM (Dermatophyte Test Medium): dùng để xét nghiệm một
mẫu bệnh phẩm nghi ngờ có nấm da hay không. Khi nuôi cấy nấm da trong môi
trường này ở nhiệt độ phòng trong 2 tuần, nếu môi trường chuyển màu từ đỏ sang
vàng là nấm da.
- Thành phần môi trường:
Phytone 10 gam.
Glucose 10 gam.
Thạch 20 gam.
Dung dịch đỏ phenol 40 ml.
HCl 0,8 N 6 ml.
Cycloheximid 0,5 gam.
Gentamycin sulfat 0,1 gam.
Chlortetracycline HCl 0,1 gam.
Nước 1000 ml.
- Cho phenol, glucose, thạch vào nước, đun sôi để hòa tan thạch. Cho 40 ml

dung dịch đỏ phenol vào trong khi đang lắc (0,5 gam đỏ phenol hòa tan trong 15
ml NaOH 0,1N, bổ sung thêm nước vừa đủ 100 ml). Cho 6 ml axit HCl, hòa tan
0,5 gam cycloheximid trong 2 ml acetone và cho vào môi trường đang nóng trong
khi lắc. Hòa tan vừa đủ gentamycin bột trong 2 ml nước để tạo thành nồng độ
trong môi trường là 100 g/100 ml. Tiệt khuẩn môi trường trong 10 phút ở nhiệt
độ 121
0
C và để nguội đến 47
0
C. Hòa tan 0,1 gam chlortetracycline HCl trong
25ml nước tiệt trùng, tiệt khuẩn, bổ sung vào môi trường, lắc kỹ để thuốc hòa đều
trong môi trường. Rót ra hộp lồng, nếu chưa dùng ngay cần để vào trong tủ lạnh.
4.4. Phương pháp phân lập nấm da từ đất:
Vanbreuseghem đã đưa ra phương pháp phân lập nấm da từ đất bằng cách
dùng tóc người hoặc lông của động vật (như bờm ngựa) để “bẫy nấm”. Phương
pháp này được coi là hoàn thiện nhất và được nhiều nhà nghiên cứu nấm da ứng
dụng. Từ khi phương pháp này ra đời ngừơi ta đã tìm thấy thêm một số loài nấm
da mới như T.georgiae, T.longifusum, T.vanbreuseghemii, T.gloriae và số dạng
sinh sản hữu tính của nấm da cũng được phát hiện ngày càng nhiều.
Cách thực hiện:
+ Chuẩn bị tóc: lấy một ít tóc trẻ em rửa mỡ (bằng ether, acetone hay cồn), cắt
nhỏ thành những đoạn 1 cm, để tóc vào hộp lồng đậy nắp và tiệt trùng trong nồi
hấp ở nhiệt độ 120
0
C/ 10-15 phút. Tóc đã xử lý như vậy có thể để hàng năm.
+ Cách lấy mẫu: đất để phân lập có thể là đất cày bừa, đất hoang, đất đồi, đất
vườn…. Gạt lớp đất ở phía trên và lấy ở lớp đất phía dưới sâu khoảng 3 cm đựng
vào dụng cụ vô trùng.
+ Nuôi cấy: đất cho vào hộp lồng mỗi hộp khoảng 20-30 gam đất. Trường hợp
đất khô cần làm ẩm bằng một ít nước cất vô trùng (2-4 ml). Đặt vào phía trên mặt

đất một lớp tóc người đã cắt nhỏ. Sau đậy nắp hộp lồng, đặt vào chỗ tối và để ở
nhiệt độ phòng khoảng 20-25
0
C, hàng tuần kiểm tra xem nấm mọc chưa.
+ Kết quả: thường sau 3-4 tuần nấm phát triển tốt trên các sợi tóc, màu hơi
trắng hoặc hơi vàng nâu tùy thuộc từng loài nấm (hình 4.2). Trong một số trường
hợp dạng sinh sản hữu tính cũng được hình thành trên những sợi tóc. Khi có nấm
mọc thì ta dùng kẹp lấy một vài sợi tóc có nấm mọc đặt lên lam kính có một giọt
nước hay lactophenol, đậy lamen rồi soi dưới kính hiển vi, dựa vào hình dạng của
nấm có thể định danh được loài nấm da. Tuy nhiên ta cần nuôi cấy nấm trên vào
môi trường Sabouraud có chứa kháng sinh để tiếp tục định danh nấm.

1 2
Hình 4.2: Nấm da phân lập từ đất, theo phương pháp bẫy tóc.
1. M.gypseum, phát triển sau 5 tuần.
2. T.ajelloi, phát triển sau 5 tuần.
4.5. Phương pháp nuôi cấy vi thể trên lam kính (microculture):
Ballagi đã đưa ra phương pháp nuôi cấy nấm trên lam kính để nghiên cứu các
cơ quan khác nhau của nấm như các cơ quan sinh sản vô tính và các cơ quan khác.
Do đó, người ta đã nghiên cứu nấm một cách rõ ràng, đầy đủ và không bị dập nát.
Người ta đã ứng dụng phương pháp này nhiều trong nghiên cứu phân loại xác định
các loài nấm da.
Phương pháp này được cải tiến như sau:
+ Chuẩn bị hộp lồng: sử dụng lam kính sạch và tiệt trùng bằng cách hơ đi hơ
lại vài lần trên ngọn lửa đèn cồn. Đặt lên một que thủy tinh uốn thành hình chữ U
ở trong hộp lồng, bên trong hộp lồng đặt một miếng bông hoặc giấy có thấm nước
cất để duy trì độ ẩm tạo điều kiện cho nấm phát triển tốt.
+ Chuẩn bị thạch: dùng cái khoan đục lỗ hoặc cắt thạch thành những hình
vuông kích thước 5-10 mm, cao khoảng 3 mm. Đặt thạch vào giữa lam kính.
+ Dùng que cấy nấm vào bề mặt và xung quanh khoanh môi trường, dùng

lamen đã tiệt trùng trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội đậy vào mặt thạch.
+ Để ở nhiệt độ phòng, sau 7-10 ngày nấm sẽ phát triển, lan ra xung quanh và
lan ra lamen.
+ Nhấc nhẹ nhàng lamen có nấm phát triển ra khỏi cục thạch đặt lên lam kính.
Lấy lam kính có nấm phát triển ở dưới ra đậy một lamen khác lên. Cho một giọt
dung dịch không màu hay thuốc nhuộm thích hợp rồi đem soi kính hiển vi (hình
4.3).



Hình 4.3: Kỹ thuật nuôi cấy vi thể trên lam kính.
1. Chuẩn bị hộp lồng,
2. Chuẩn bị thạch,
3. Đặt thạch lên lam kính,
4. Cấy nấm vào rìa của thạch,
5. Đậy lamen lên thạch, nuôi cấy ở nhiệt độ phòng,
6. Lấy lamen ra đặt lên một lam kính khác có thuốc nhuộm,
7. Lấy lam kính, nhỏ thuốc, đậy một lamen khác lên, dán nhãn.
4.6. Kỹ thuật nuôi cấy phát hiện cơ quan “đâm chọc” của nấm trên sợi tóc
(test xuyên tóc - hair penetration test):
Nhiều chủng T.rubrum và T.mentagrophytes rất khó phân biệt nếu chỉ dựa vào
hình thể đại thể cũng như vi thể. Test xuyên tóc để phát hiện cơ quan “đâm chọc”
của nấm trên sợi tóc là một phương pháp để phân biệt hai loại này. Nếu thấy
những cơ quan “đâm chọc” hình chêm vuông góc với sợi tóc (hình 4.4) (test
dương tính) đó là nấm T.mentagrophytes, nếu test âm tính là T.rubrum.
Phương pháp: có thể tiến hành
theo một trong hai phương pháp sau.
+ Phương pháp của Thammayya,
Ajello, Galgoczy: dùng pipet vô trùng lấy
môi trường Sabouraud có chứa kháng

Hình 4.4: Cơ quan “đâm chọ
c”
(cái khoan) của nấm trong sợi tóc.
Hình 4.5: Test xuyên tóc (phương pháp
của Thammayya, Ajello, Galgoczy).
1. Sợi tóc; 2. Nấm được cấy vào; 3. Giọt thạch.

4. Hộp lồng; 5. Miếng bông thấm ướt.

sinh ở dạng lỏng, nhỏ từng giọt riêng biệt vào đáy một hộp lồng vô trùng, để cho
đông lại. Dùng một kẹp vô trùng đặt vào mặt giọt thạch vài sợi tóc (chuẩn bị như
phương pháp bẫy tóc), sau đó cấy nấm lên trên, lật ngược hộp lồng lên và phía
dưới cũng đặt một miếng bông thấm nước để giữ ẩm môi trường (hình 4.5). Để ở
nhiệt độ phòng, hàng ngày kiểm tra sợi tóc dưới kính hiển vi để quan sát sự tạo
thành cơ quan “đâm chọc” của nấm.
+ Phương pháp thứ hai: cho 20-30 ml nước tiệt trùng vào hộp lồng đã có 10-20
sợi tóc, thêm 2-3 giọt dịch chiết men 10% vào hộp lồng. Cấy một ít nấm vào dung
dịch, đậy nắp, ghi nhãn và để ở nhiệt độ phòng. Sau 2-4 tuần kiểm tra.
4.7. Những phương pháp kiểm tra hình dạng vi thể của nấm:
4.7.1. Kiểm tra hình dạng nấm in situ:
Trong một số trường hợp có thể kiểm tra trực tiếp hình dạng của nấm ngay trên
khuẩn lạc trong hộp lồng hoặc ngay trong ống nghiệm. Với độ phóng đại và ánh sáng
thích hợp có thể quan sát thấy các cơ quan của nấm và có thể nhận xét ban đầu về
một loài nấm.
Phương pháp: đặt ống nghiệm nằm ngang trên bàn của kính hiển vi và điều
chỉnh vật kính ra rìa của ống nghiệm (có thể soi trực tiếp một khuẩn lạc nấm trong
hộp lồng với một lớp môi trường mỏng) có thể thấy đầy đủ các cơ quan của nấm
như bào tử nhỏ, bào tử lớn, bào tử áo cũng như các vòng xoắn của nấm. Dựa vào

đặc điểm hình dạng của bào tử lớn người có thể định danh được một số loài nấm.
4.7.2. Tiêu bản nấm trong nước cất:
Trong một số trường hợp có thể soi hình dạng nấm trong giọt nước. Lợi ích
của phương pháp này là chỉ số khúc xạ của ánh sáng đi qua tiêu bản và chỉ số khúc
xạ của nước khác nhau ít nên hình ảnh của nấm được nhìn rõ. Mặt khác do sự
chênh lệch về nồng độ giữa trong và ngoài tế bào nấm nên nước khuếch tán vào
trong tế bào, làm tế bào nấm tăng kích thước, dễ dàng quan sát. Trường hợp cần
đo kích thước thì không ứng dụng được phương pháp này.
Phương pháp: trên lam kính giỏ một giọt nước, dùng que cấy lấy một ít nấm từ
ống nuôi cấy hay từ hộp lồng, dùng hai đinh ghim nhỏ “xé” làm nhỏ chất nấm rồi
đặt lamen lên trên, đem soi kính hiển vi.
4.7.3. Tiêu bản nấm trong dung dịch glycerin:
Nhược điểm của tiêu bản trong nước là không giữ tiêu bản được lâu vì nước dễ
bay hơi, làm khô tiêu bản. Tiêu bản trong glycerin giữ được lâu hơn vì glycerin
hạn chế sự bay hơi và hình ảnh quan sát vẫn rõ.
4.7.4. Tiêu bản nấm trong dung dịch lactophenol:
Trong labo xét nghiệm nấm, dung dịch lactophenol thường được sử dụng để
soi trực tiếp, với dung dịch này hình dạng và kích thước của nấm không thay đổi
trong quá trình soi. Dung dịch có độ nhớt, có thể quan sát với vật kính lớn mà hình
ảnh của nấm không bị xê dịch. Với dung dịch này có thể đo kích thước các cơ
quan của nấm. Tiêu bản có thể bảo quản duy trì lâu dài mà không bị khô.
Nhược điểm là trong một vài trường hợp ảnh không được nét vì chỉ số khúc xạ
của dung dịch lactophenol và ánh sáng có độ khác nhau lớn.
Thành phần dung dịch lactophenol như sau:
Phenol tinh thể 20 gam.
Axit lactic 20 gam.
Glycerin 40 gam.
Nước cất 20 ml.
4.7.5. Tiêu bản nhuộm:
Trong labo nấm, để nhận biết, phân biệt các cơ quan hay các bộ phận của

nấm như bào tử lớn, bào tử nhỏ, thành tế bào, bề mặt của bào tử hay vách ngăn
của nấm người ta thường nhuộm nấm với một trong các dung dịch thuốc nhuộm sau:
+ Thuốc nhuộm xanh cotton C4B:
Lactophenol 100 ml.
Xanh cotton 0,5 gam.
+ Thuốc nhuộm xanh cotton bão hoà Sudan:
Lactophenol bão hoà Sudan 100 ml
Xanh cotton 0,5 gam.
+ Dung dịch nhuộm Fuchin:
Fuchin bão hoà trong dung dịch cồn và nước: 4 ml.
Xanh methylen bão hoà trong dung dịch cồn và nước: 2 ml.
Nước cất: 27 ml.
+ Dung dịch đỏ Công Gô:
Đỏ Công Gô 0,1 gam.
Amonium hydroxit 10% 100 ml.
Với dung dịch này dưới kính hiển vi có ánh sáng phân cực (plazizacios) thì độ
dày của thành tế bào hay độ dày của bào tử áo quan sát rất rõ.
4.7.7. Phương pháp PAS nhuộm nấm ở tổ chức:
Khi nhuộm tổ chức theo phương pháp hematoxylin thường không thấy rõ nấm,
muốn phân biệt nấm với các tổ chức khác của cơ thể người hoặc động vật người ta
thường nhuộm tiêu bản với thuốc nhuộm Schiff (còn gọi là PAS).
+ Các bước chuẩn bị thuốc nhuộm:
- Dung dịch axit Periodic (HJO
4
) 1%:
(HJO
4
) 1%.
Nước cất vừa đủ 100 ml.
Dung dịch cần bảo quản nơi tối và có thể sử dụng lâu dài.

- Dung dịch Schiff:
Hoà tan 0,5 gam Fuchin vào 100 ml nước sôi để nguội 50
0
C, đem lọc, sau cho
vào dịch lọc 5 ml HCl 1N và 1 gam kalimetabisulfat (K
2
S
2
O
5
). Để yên một ngày ở
chỗ tối, quan sát nếu dung dịch không màu hoặc có màu vàng rơm thì cho vào
dung dịch 0,5 gam than hoạt quấy đều rồi lọc. Dung dịch lọc được bảo quản trong
tủ lạnh có thể sử dụng dài ngày.
- Dung dịch axit HCl 0,05N: hoà tan 0,5 gam NaHSO
3
(natrihydroxisulfat) hoặc
K
2
S
2
O
5
(kalimetabisulfat) vào trong 100 ml HCl 0,05N.
- Dung dịch Lichgrun: hoà tan 1 gam Lichgrun vào 100 ml dung dịch axit
acetic 1% được đun sôi.
+ Quá trình tiến hành nhuộm tiêu bản:
- Tiêu bản kiểm tra nấm ở các tổ chức được cố định trong methyl alkohol với
thời gian 2-4 phút.
- Tráng tiêu bản bằng cồn 96% trong 1 phút.

- Ngâm tiêu bản vào dung dịch Periodic trong 20 phút.
- Rửa tiêu bản bằng nước máy chảy liên tục trong 5 phút.
- Nhuộm tiêu bản trong thuốc nhuộm Schiff 15 phút.
- Nhúng tiêu bản vào dung dịch axit sulfuric trong 5 phút.
- Nhúng lại tiêu bản vào dung dịch axit sulfuric khác trong 5 phút.
- Nhúng tiêu bản vào cốc, đặt dưới vòi nước máy chảy liên tục 8 phút.
- Nhúng tiêu bản vào dung dịch Lichgrun trong 2-5 phút.
- Tráng tiêu bản bằng nước máy trong 1 phút.
- Tráng tiêu bản bằng cồn 96% trong phút.
- Tráng tiêu bản bằng xilon trong 1 phút.
- Cuối cùng nhỏ 1 giọt gôm Canada lên lam kính rồi đặt lamen nhỏ, mỏng lên
trên, tiêu bản có thể giữ hàng năm.
+ Kết quả: khi soi nấm bắt màu đỏ, tế bào của tổ chức bắt màu xanh.
4.8. Phương pháp phân biệt bào tử lớn với các cơ quan khác của nấm:
+ Thuốc nhuộm:
Dung dịch axit Fuchin trong lactophenol.
Dung dịch Lichgrun 1%.
+ Cách nhuộm:
- Cố định chất nấm trên lam kính bằng cồn methylic trong 5 phút.
- Cho vài giọt thuốc nhuộm Fuchin lactophenol vào tiêu bản, để yên 1-2 giờ.
- Tráng tiêu bản vào dung dịch axit sulfuric 1-2 phút.
- Nhúng tiêu bản vào dung dịch Lichgrun trong 5 phút.
- Dùng giấy thấm đặt lên tiêu bản loại dung dịch Lichgrun thừa.
- Gắn tiêu bản bằng nhựa gôm Canada rồi soi kính.
+ Kết quả: bào tử lớn của nấm da bắt màu đỏ còn các sợi nấm và bào tử nhỏ
bắt màu xanh phân biệt rất rõ rệt trên tiêu bản.
4.9. Phương pháp gây nhiễm nấm trên động vật thí nghiệm:
Để nghiên cứu khả năng gây bệnh của các loài nấm da người ta thường tiến
hành gây nhiễm thực nghiệm (in vivo) trên da một số động vật như thỏ, chuột lang,
chuột nhắt trắng.

+ Cách tiến hành:
- Dùng kéo cắt sạch lông ở lưng chuột, ở tai thỏ hay ở phía trên sống mũi của
chuột lang thành một đám tròn 1-2 cm. Dùng giấy ráp mịn xát đi xát lại vài lần
trên phần da làm da bị xước, dùng bông nhúng vào hỗn dịch nấm da đã chuẩn bị
bôi mạnh vào da của động vật, day đi day lại để nấm bám vào da.
- Chuẩn bị hỗn dịch nấm: nấm được nuôi cấy trên môi trường Sabouraud 7-10
ngày, lấy tất cả khuẩn lạc của nấm cho vào dụng cụ Potter (cối nghiền) đã tiệt trùng,
nghiền làm đồng nhất trong dung dịch nước muối sinh lý vô trùng.
- Gây nhiễm động vật xong theo dõi hàng ngày, thường sau vài ngày nếu nấm
có khả năng gây bệnh thì chỗ da xù xì, có vẩy màu hơi vàng. Có thể lấy vẩy da soi
trực tiếp kiểm tra hoặc lấy một ít da để làm tiêu bản nhuộm với thuốc nhuộm
Schiff.
+ Kết quả: nấm có màu đỏ còn các tế bào của tổ chức da sẽ có màu xanh. Trên
cơ sở gây nhiễm thực nghiệm người ta sẽ biết khả năng gây bệnh của các loài nấm
da và kết quả hỗ trợ cho việc phân biệt các loài với nhau.
4.10. Phân biệt nấm da dưới kính hiển vi điện tử:
Trong những năm gần đây người ta đã sử dụng kính hiển vi điện tử để quan
sát hình dạng hoặc siêu cấu trúc của nấm da. Trên cơ sở sự khác nhau của siêu
hình dạng và siêu cấu trúc mà người ta có thể phân biệt được các tip của một loài
với nhau.
Một số tác giả đã sử dụng kính hiển vi điện tử “không gian” scanning để
nghiên cứu hình dạng của một số nấm da, đặc biệt là nghiên cứu bề mặt của bào tử
lớn và đã xác định được sự khác nhau của hai tip thuộc loài Microsporum
gypseum. Típ có dạng sinh sản hữu tính là Nannizzia incurvata trên bề mặt của
bào tử lớn có những hạt dạng hình cầu không đều nhau và sắp xếp không theo quy
luật trong khi đó trên bề mặt bào tử lớn của típ có dạng sinh sản hữu tính là
Nannizzia gypsea những hạt hình cầu sắp xếp theo từng hàng nhất định. Những đặc
điểm này dưới kính hiển vi thường không thể quan sát được.
4.11. Chẩn đoán nấm da bằng phản ứng miễn dịch:
Phản ứng miễn dịch thường được ứng dụng để chẩn đoán, phát hiện, phân loại

một số nấm gây bệnh hệ thống như Candida albicans, Aspergillus, Histoplasma
capsulatum…. Với nấm da việc ứng dụng các phản ứng miễn dịch để chẩn đoán
còn hạn chế do tính đặc hiệu thấp. Theo một số tác giả, bằng thực nghiệm trên
động vật thấy kháng nguyên của các loài nấm da ít tính đặc hiệu, không có tính
đặc hiệu loài mà chỉ có tính đặc hiệu chi. Phương pháp thường được sử dụng là
phương pháp khuếch tán miễn dịch và điện di miễn dịch.
* Chuẩn bị kháng nguyên và kháng thể:
+ Điều chế kháng nguyên (antigen) của nấm da:
- Thành phần môi trường nuôi cấy:
Glucoza 20 gam.
Pepton 10 gam.
Nước cất vừa đủ 1000 ml.
Tiệt trùng bằng nhiệt độ 120
0
C trong 10 phút, để nguội.
- Dùng que cấy cấy nấm muốn kiểm tra vào các bình nón có chứa môi trường
trên, đặt vào tủ ấm 24-26
0
C, để trong 2-3 tuần. Nấm sẽ phát triển tạo thành một
lớp váng dày, lọc lấy các sợi nấm, dịch lọc bỏ đi.
- Đặt các sợi nấm vào từng cốc riêng, để ở nhiệt độ âm (-15 đến -20
0
C) để tạo
thành băng sau 24 giờ.
- Đặt ở nhiệt độ phòng cho đến khi băng tan hết, đem nghiền nhỏ trong dung
dịch nước muối sinh lý bằng máy Êtaminia (máy nghiền làm đồng nhất).
- Đem hỗn dịch được nghiền nhỏ để phá thành tế bào bằng máy siêu âm
(MSE) trong 25-30 phút.
- Để yên ở 4
0

C (trong tủ lạnh) 12-24 giờ.
- Ly tâm hỗn dịch 4000 vòng/phút trong 15 phút, bỏ cặn.
- Tủa kháng nguyên trong dịch ly tâm: dịch ly tâm 1 thể tích, natri acetat 1%,
aceton 2 thể tích trộn đều và đặt ở nhiệt độ -15 đến -20
0
C trong 4 - 6 giờ.
- Ly tâm hỗn dịch 4000 vòng/phút trong 15 phút sẽ thu được kháng nguyên ở
dạng cặn.
- Đông khô cặn kháng nguyên, hoặc làm khô trong tủ sấy chân không.
- Kháng nguyên cần được bảo quản ở nhiệt độ thấp trong tủ lạnh.
- Nếu tiến hành phản ứng khuếch tán miễn dịch thì pha kháng nguyên có nồng
độ 25 mg/ml, còn nếu tiến hành phương pháp điện di miễn dịch thì cần pha nồng
độ kháng nguyên 25-250 g/ml.
+ Điều chế kháng thể (antibody) từ thỏ: