THỰC HÀNH PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM - BÀI 1 ppt

0

Trường Đại học Công nghiệp
thực phẩm TP.HCM




2010

ThS. Lê Thùy Linh

THỰC HÀNH PHÂN TÍCH

VI SINH THỰC PHẨM

Lưu hành n
ộ
i b
ộ

Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 1
Homepage:

NỘI DUNG Trang
Bài 1: Định lượng Coliforms và E. coli 2
1.1. Tóm tắt kiến thức cơ bản 2
1.2. Quy trình định lượng Coliforms và E. coli bằng phương pháp MPN 3
1.3. Cách tiến hành thí nghiệm 4

1.4. Cách tính kết quả 10
Bài 2. Định lượng Staphylococcus aureus 10
2.1. Tóm tắt kiến thức cơ bản 10
2.2. Quy trình định lượng Staphylococcus aureus bằng phương pháp MPN 10
2.3. Cách tiến hành và cách tính kết quả 11
Bài 3. Định tính Salmonella 14
3.1. Tóm tắt kiến thức cơ bản 14
3.2. Qui trình định tính Salmonella trong thực phẩm 14
Bài 4. Định lượng Bacillus cereus 20
4.1. Tóm tắt kiến thức cơ bản 20
4.2. Quy trình định lượng Bacillus cereus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 20
Bài 5. Định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí và tổng nấm men-nấm mốc 24
5.1. Tóm tắt kiến thức cơ bản 24
5.2. Quy trình phân tích 26
Tài liệu tham khảo
1. Trần Linh Thước, Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mĩ
phẩm, NXB Giáo dục, 2006
2.
3.
4.
5.



Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 2
Homepage:

Bài 1: Định lượng Coliforms và E. coli

1.1 Tóm tắt kiến thức cơ bản
1.1.1 Định nghĩa
Coliforms là những trực khuẩn gram âm không sinh bào tử,
hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý, có khả năng lên men lactose sinh acid và
sinh hơi ở 37
0
C trong 24 – 48 giờ. Coliforms được xem là nhóm vi
sinh vật chỉ thị: số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm, nước
hay các loại mẫu môi trường được dùng để chỉ thị khả năng hiện
diện của các loại vi sinh vật khác. Nhóm Coliforms gồm 4 giống là:
E. coli, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter. Tính chất sinh hóa
đặc trưng của nhóm này được thể hiện qua các thử nghiệm Indol (I),
Methyl Red (MR), Voges-Proskauer (VP) và Citrate (iC) thường được gọi là IMViC.
Coliforms chịu nhiệt là những Coliforms có khả năng lên men lactose sinh hơi
trong khoảng 24h khi ủ ở 44
0
C trong môi trường canh EC.
Coliforms phân (Faecal Coliforms) là Coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh
indole khi ủ khoảng 24h ở 44
0
C trong canh Trypton. E. coli là Coliforms phân cho kết
quả thử nghiệm IMViC là ++ (Indol +, Methyl Red +, Voges-Proskauer -, Citrate -)
1.1.2 Phương pháp Most Probable Number (MPN)
Đây là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm
được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau. Thông thường, việc định lượng này được
thực hiện lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng 3 x 3 = 9 ống nghiệm.
Quy trình thực hiện như sau:

Pha loãng mẫu phân tích ở 3 nồng độ pha
loãng bậc 10 liên tiếp.
Ủ

ở

nhi
ệ
t đ
ộ

và th
ờ
i gian thích h
ợ
p

Kết quả biểu kiến chứng minh sự tăng
trư
ở
ng c

ủ
a vi sinh v
ậ
t c
ầ
n
ki
ể
m đ
ị
nh

Ghi nhận số lượng ống nghiệm dương tính
ở từng độ pha loãng. Tra bảng Mac Crady
Mật độ vi sinh vật MPN/100 ml hay MPN/1g mẫu
Hình 1: phát hiện Coliforms và E.
coli trong thực phẩm hay nước bằng
môi trường CHROMagar ECC
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 3
Homepage:

Chú ý:
Đa số các bảng MPN cung cấp số liệu ở dạng số MPN trong 100ml dung dịch
được sử dụng để phân tích ở các liều lượng là 10ml, 1ml, 0.1 ml. Trên thực tế phân tích,
người ta thường dùng 1ml cho mẫu đã pha loãng 10
-1
, 10
-2

, 10
-3
. Lượng mẫu với các độ
pha loãng này tương đương với 1/100 lượng mẫu sử dụng theo bảng MPN/100ml tính
theo lượng mẫu là 10ml, 1ml, 0.1 ml nêu trên. Vậy số liệu của bảng MPN/100ml tính
theo lượng mẫu là 10ml, 1ml, 0.1 ml tương đương với MPN/ml mẫu chưa pha loãng khi
1ml của các dung dịch có độ pha loãng 10
-1
, 10
-2
, 10
-3
được dùng để phân tích.
Trường hợp mật độ vi sinh vật quá cao, cần phải sử dụng loạt nồng độ pha loãng
tiếp theo cần phải nhân trị số tra bảng MPN nêu trên với hệ số pha loãng. Ví dụ: sử dụng
1ml cho mỗi độ pha loãng 10
-2
, 10
-3
, 10
-4
tức là chỉ sử dụng 1/10 lượng mẫu ở mỗi nồng
độ so với trường hợp dùng 1ml mẫu ở các độ pha loãng 10
-1
, 10
-2
, 10
-3
. Do vậy, trị số tra
bảng MPN cần nhân thêm hệ số pha loãng là 10.

1.2 Quy trình định lượng Coliforms và E. coli bằng phương pháp MPN












Chuẩn bị dịch đồng nhất hoặc pha loãng mẫu để có độ
pha loãng 10
-1
, 10
-2
, 10
-3
…

Chuyển 1ml dung dịch 10
-
1
, 10
-
2
, 10
-

3
vào ống 10ml canh
LSB, mỗi nồng độ có 3 ống lặp lại, ủ ở 37
0
C, 48 giờ
Ghi nh
ậ
n các
ố
ng LSB (+)
(sinh hơi)

ở

m
ỗ
i n
ồ
ng đ
ộ

pha loãng

Cấy vào ống canh BGBL,
ủ ở 37
0
C ± 1
0
C, 48 giờ
Cấy vào ống canh EC, ủ

ở 44.5
0
C ± 0.2
0
C, 24 giờ
Số ống (+)(sinh hơi )ở
m
ỗ
i đ
ộ

pha loãng

Số ống (+) ở mỗi độ pha loãng
Coliforms
Cấy lên thạch EMB, ủ ở 37
0
C,
24 giờ
Xem
trang
sau
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 4
Homepage:

1.3 Cách tiến hành thí nghiệm
Mẫu phân tích: nước mía nguyên chất (dùng 10ml cho một tổ)
1.3.1 Pha môi trường và khử trùng dụng cụ
Bước 1: pha môi trường
Tên môi trường Thành phần Tổng thể tích

Ghi chú
SPW
(Saline Pepton
Water)
NaCl : 42.5g
Pepton: 5g
500 ml nước
cất
Phân phối cho mỗi tổ 27ml
SPW (9ml/ống nghiệm)
trước khi khử trùng. (buổi 1)

LSB
(Lauryl Sulphate
Broth)
Tryptose: 20g
Lactose: 5g
Sodium chloride: 5g
KH
2
PO
4
: 2.75g
K
2
HPO
4
: 2.75g
Lauryl sulphate: 0.1g
1000 ml nước
cất
pH 6.8 ± 0.2
Phân phối 90ml LSB cho
mỗi tổ (10ml/ống nghiệm)
trước khi khử trùng. (buổi 1)

BGBL
Peptone: 10g 1000 ml nước Phân phối 90ml BGBL cho
Tiếp
theo
Chọn khuẩn lạc (tròn, dẹt hình đĩa và có
ánh kim xanh), cấy vào Trypton, MR-VP,

SC Citrate, ủ ở 44.5
0
C ± 0.2
0
C, 24 giờ
Thử nghiệm IMViC
Đếm số ống canh EC (+) và
IMViC ++ , tra bảng MPN
E. coli
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 5
Homepage:

(Brilliant Green
Bile Lactose
Broth)
Lactose: 10g
Mật bò: 20g
Brilliant green: 0.0133g
cất
pH 7.4
mỗi tổ (10ml/ ống nghiệm có
chứa ống Durham) trước khi
khử trùng. (buổi 1)
EC
(E.coli medium)
Trypticase or tryptose:
20g
Muối mật No.3: 1.5g

Lactose: 5g
KH
2
PO
4
: 1.5g
K
2
HPO
4
: 4g
NaCl: 5g
1000 ml nước
cất
pH 6.9
Phân phối 90ml BGBL cho
mỗi tổ (10ml/ ống nghiệm có
chứa ống Durham) trước khi
khử trùng. (buổi 1)
EMB
(Eosin Methylene
Blue Agar)
Pancreatic digest of
gelatin: 10g
Lactose: 10g
K
2
HPO
4
: 2g

Eosin Y: 0.4g
Methylene blue: 65mg
Agar: 15g
1000 ml nước
cất.
pH 7.1 ± 0.2
Phân phối 100ml EMB cho
mỗi tổ (20ml/petri) (buổi 2)
Tryptone water
Tryptone hoặc
trypticase:10g
1000ml nước
cất
pH 7.2 ± 0.2
Mỗi tổ chỉ dùng 20ml, phân
phối 10ml/ống nghiệm.
(buổi 3)
MR-VP Both
(Glucose
Phosphate)
Môi trường 1:
Buffered peptone-water
powder: 7g
Glucose: 5g
K
2
HPO
4
: 5g
Môi trường 2:

Casein Pancreatic
Digest: 3.5g
Peptic digest of animal
tissue:3.5g
Dextrose: 5g
Potassium phosphate: 5g
1000ml nước
cất.
pH 6.9 ± 0.2
Mỗi tổ chỉ dùng 30ml, phân
phối 10ml/ống nghiệm.
Kiểm tra lại môi trường cung
cấp nào để pha môi trường.
(buổi 3)
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 6
Homepage:

pH 6.9 ± 0.2
Môi trường 3:
Peptone: 5g
Glucose: 5g
Phosphate buffer: 5g
pH 7.5 ± 0.2
SCA
(Simmons Citrate
Agar)
Sodium citrate: 2g
NaCl: 5g

K
2
HPO
4
: 1g
NH
4
H
2
PO
4
: 1g
MgSO
4
: 0.2g
Bromothymol blue:
0.08g
Agar: 15g
1000ml nước
cất. Đun nóng
nhẹ và thỉnh
thoảng lắc.
Đun sôi 1-2
phút cho đến
khi hòa tan
hết. pH 6.8 ±
0.2
Mỗi tổ chỉ dùng 50ml, phân
phối 10ml/ống nghiệm.
(buổi 3)

Bước 2: khử trùng dụng cụ và môi trường đã pha.
Bao gói dụng cụ và phân phối môi trường vào dụng cụ, gắn nút và bao gói. Hấp
tiệt trùng ở 121
0
C trong 15 phút.
1.3.2 Cách tiến hành:
Bước 3: pha loãng mẫu

Hình 2: quy trình pha loãng mẫu
Pha loãng mẫu thành 3 nồng độ pha loãng 10
-1
, 10
-2
, 10
-3
.
ống
mẫu
10
-
1

10
-
2

10
-
3

10
-
4

10
-
5

10
-
6

Đ
ộ

pha loãng

1ml
1ml 1ml 1ml
1ml
1ml

9ml
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 7
Homepage:

Bước 4: Cấy mẫu vào canh LSB
Chuyển 1ml dung dịch 10

-1
, 10
-2
, 10
-3
vào ống 10ml canh LSB, mỗi nồng độ có 3
ống lặp lại, ủ ở 37
0
C, 48 giờ.








Bước 5: Định lượng Coliform và E. coli
Định lượng Coliform Định lượng E. coli
Ghi nhận số ống có sinh hơi (+) Ghi nhận số ống có sinh hơi (+)
Dùng que cấy vòng cấy chuyển dịch mẫu
từ các ống LSB (+) sang các ống có chứa
canh BGBL và ủ ở 37
0
C ± 1
0
C, 48 giờ
Dùng que cấy vòng cấy chuyển dịch mẫu
từ các ống LSB (+) sang môi trường canh
EC, ủ ở 44.5

0
C ± 0.2
0
C, 24 giờ
Ghi nhận số ống có sinh hơi (+) ứng với
mỗi độ pha loãng
Ghi nhận số ống có sinh hơi (+) ứng với
mỗi độ pha loãng
Tính kết quả (xem 1.4) Dùng que cấy vòng ria dịch mẫu từ các ống
(+) trên canh EC sang môi trường thạch đĩa
EMB. Ủ ở 37
0
C, 24 giờ.
Chọn khuẩn lạc đường kính lớn hơn 1mm
(tròn, dẹt hình đĩa và có ánh kim xanh)
(xem hình 4), cấy vào Trypton, MR-VP, SC
Citrate, ủ ở 44.5
0
C ± 0.2
0
C, 24 giờ


10
-
1

10
-
2

10
-
3

Hình 3: Sơ đồ cấy mẫu từ các độ pha loãng
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 8
Homepage:


Bước 6: thử nghiệm IMViC

Hình 5: Kết quả IMViC của Escherichia coli sau 24giờ ủ ở 37°C. (Anne Hanson, University of Maine, Orono)
Ống A: dương tính thử nghiệm indole trên môi trường tryptone. Xuất hiện lớp màu đỏ trên bề mặt môi
trường sau khi nhỏ thuốc thử Kovács.
Ống B: dương tính thử nghiệm methyl red xuất hiện màu đỏ của methyl red.
Ống C: âm tính thử nghiệm Voges-Proskauer biểu hiện qua sự không thay đổi màu sau khi cho thuốc
thử Barritt’s A và Barritt’s B.
Ống D: âm tính thử nghiệm citrate biểu hiện qua sự thay đổi màu sắc và không có khuẩn lạc trong ống
nghiệm.
a. Thử nghiệm Indol (I):
Nguyên tắc: Tryptophan là một acid amin có thể bị oxi hóa bởi một số vi sinh vật
có hệ enzyme tryptophanase tạo nên các sản phẩm chứa gốc indol. Việc phát hiện indol
được thực hiện bằng phản ứng của phân tử này với các thuốc thử chứa p-
Dimethylaminbenzaldehyde (p-DMABA) tạo nên một phức chất dạng quinone có màu
đỏ.
Phương pháp tiến hành: Môi trường sử dụng cho thử nghiệm này là nước
tryptone. Sinh khối chủng thuần được cấy vào môi trường lỏng tryptone, ủ ở nhiệt độ

37
0
C trong 24-48 giờ. Bổ sung 1ml ether hoặc xylene vào ống nghiệm, lắc đều để chiết
Hình 4: E.coli nuôi trên môi trường thạch EMB
cho khuẩn lạc màu kim xanh (theo Naowarat
Cheeptham, Thompson Rivers University,
Kamloops, BC, Canada)
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 9
Homepage:

tách indol lên lớp dung môi hữu cơ. Nhỏ 5 giọt thuốc thử
vào ống dịch nuôi cấy, để yên vài phút, theo dõi sự tạo màu
đỏ trong lớp dung môi hữu cơ.
Đọc kết quả: (+) xuất hiện của lớp màu đỏ trên bề mặt
môi trường. (-) lớp màu vàng của thuốc thử. Đôi khi có sự
xuất hiện của màu cam do skatol, là tiền chất của methyl hóa
của indol, tạo ra.
b. Thử nghiệm Methyl Red (MR):
Nguyên tắc: chỉ thị đỏ methyl red giúp phân biệt nồng độ H
+
hiện diện trong môi
trường sau khi vi sinh vật lên men glucose. Chỉ thị này thay đổi màu như sau: pH<4.4 đỏ;
pH 5.0-5.8 màu cam; pH>6.0 màu vàng.
Phương pháp tiến hành: Môi trường sử dụng cho thử nghiệm này là môi trường
lỏng Glucose Phosphate (MR-VP Broth). Dùng que vòng cấy một lượng nhỏ khuẩn lạc
trên môi trường MR-VP, ủ ở 37
0
C trong khoảng 2-5 ngày. Thêm vào vài giọt thuốc thử

đỏ methyl red (0.02% trong hỗn hợp cồn nước có tỷ lệ 3:2, bảo
quản ở 4
0
C) vào trong ống nghiệm dịch nuôi cấy, đọc kết quả
ngay.
Đọc kết quả: (+) môi trường có màu đỏ sau khi bổ sung
thuốc thử. (-) khi có màu vàng. Trường hợp màu cam, cần tiếp
tục ủ ống môi trường có giống trong 4 ngày và thực hiện lại
thử nghiệm.
c. Thử nghiệm Voges-Proskauer (VP) (xem mục 3.3, bài 3)
d. Thử nghiệm Citrate (iC)
Nguyên tắc: sự biến dưỡng citrate bởi vi sinh vật sẽ tạo ra CO
2
làm kềm hóa môi
trường. Mặt khác mọi VSV có khả năng sử dụng citrate làm nguồn carbon duy nhất đều
có khả năng dùng muối ammonium làm nguồn đạm duy nhất. Sự phân giải của muối
ammonium dùng làm nguồn đạm trong môi trường sẽ sinh NH
3
làm kiềm hóa môi
trường. Sự gia tăng giá trị pH này được chỉ thị bằng sự đổi màu của chỉ thị pH trong môi
trường.
Hình 6: thử nghiệm Indol
Hình 7: thử nghiệm MR
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 10
Homepage:

Phương pháp tiến hành: Môi trường sử dụng cho thử nghiệm này là môi trường
lỏng SCA. Dùng que vòng cấy ria một lượng nhỏ khuẩn lạc lên

môi trường SCA rắn trong ống nghiệm thạch nghiêng, ủ ở 35
0
C
trong khoảng 24-48 giờ.
Đọc kết quả: (+) khi xuất hiện khuẩn lạc và môi trường
chuyển sang màu xanh dương. (-) khi không có khuẩn lạc và môi
trường giữ nguyên màu xanh lục.
1.4 Cách tính kết quả
Từ số lượng các ống nghiệm có E. coli (+) ở mỗi độ pha loãng của mẫu, dùng bảng
MPN loạt 3 ống nghiệm ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp để tính ra mật độ vi sinh vật
trong mẫu và biểu diễn dưới dạng trị số MPN/ml mẫu ban đầu chưa pha loãng.

Bài 2. Định lượng Staphylococcus aureus
2.1. Tóm tắt kiến thức cơ bản
Staphylococcus aureus là vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy ý,
hình cầu, gram dương, có thử nghiệm coagulase, phản ứng
DNAse, phosphatease (+) có khả năng lên men và sinh acid từ
mannitol, trehalose, sucrose. Tất cả các dòng S. aureus đều mẫn
cảm với novobiocine, có khả năng tăng trưởng trong môi trường
chứa đến 15% NaCl. Một số dòng có khả năng tăng trưởng làm
tan máu trên môi trường thạch máu. S. aureus có thể nhiễm vào
thực phẩm qua con đường tiếp xúc với người thao tác trong quá trình chế biến thực phẩm.
Sự hiện diện với mật độ cao của S. aureus trong thực phẩm chỉ thị điều kiện vệ sinh và
kiểm soát nhiệt độ kém của quá trình chế biến.

2.2 Quy trình định lượng Staphylococcus aureus bằng phương pháp MPN
Phương pháp này được dùng để định lượng S. aureus trong mẫu có mật độ S. aureus thấp
nhưng mật độ vi sinh vật cạnh tranh cao.

Hình 8: thử nghiệm Citrate
Hình 9: S. aureus trên BPA