các phương pháp xác định protein

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
*******
BÁO CÁO HĨA SINH THỰC PHẨM
BÁO CÁO HĨA SINH THỰC PHẨM
CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC
CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC


ĐỊNH PROTEIN
ĐỊNH PROTEIN
Nhóm 28 - Lớp HC04TP2
GVHD: ThS Tơn Nữ Minh Nguyệt
1
MỤC LỤC
ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯNG PROTEIN BẰNG NHỮNG PHẢN ỨNG ĐẶC
TRƯNG.........................................................................................................................2

A. Cơ sở xác đònh phản ứng.........................................................................................2
B. Phản ứng Biure..................................................... 2
C. Phương pháp Lowry..................................................... 5
D. Một số phản ứng màu khác ......................................................6
E. Phản ứng Xiorenxen .......................................................7
F. Phương pháp Van-Slyke .........................................................................................7
XÁC ĐỊNH PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP VẬT LÝ....................................8
A. Phương pháp quang phổ .....................................................8
B. Tính khuếch tán.................................................... 9
XÁC ĐỊNH PROTEIN DỰA VÀO KHẢ NĂNG TẠO TỦA CỦA NÓ.............10

XÁC ĐỊNH GIÁ TRỊ DINH DƯỢNG CỦA PROTEIN.......................................13
A. Chỉ số sinh học : TD, BV, PER, NPU, NDp Cal %, NPR..............................13
B. Chỉ số hoá học : CS. ...............................17
XÁC ĐỊNH NHU CẦU PROTEIN TRONG CƠ THỂ..........................................18
A. Phương pháp Bilăng .............................18
2
B. Phương pháp tính từng phần...........................18
ĐỊNH TÍNH-ĐỊNH LƯNG PROTEIN BẰNG NHỮNG
ĐỊNH TÍNH-ĐỊNH LƯNG PROTEIN BẰNG NHỮNG


PHẢN ỨNG ĐẶC TRƯNG
PHẢN ỨNG ĐẶC TRƯNG
A. CƠ SỞ XÁC ĐỊNH PHẢN ỨNG
 Axitamin là đơn vò cấu tạo cơ sở của peptit và protein, các axitamin kết hợp với
nhau qua liên kết peptit(-CO-NH-)tạo thành peptit có chiều dài mạch khác
nhaugọi là polypeptit,một phân tử protein có một hay nhiều chuổi polypeptit.
 Như vậy thông qua liên kết peptit, các gốc axitamin , nhóm - amin tự do đầu N
của chuỗi polypeptit ta có những phản ứng màu đặc trưng thường dùng để đònh
tính và đònh lượng protein .
B. PHẢN ỨNG BIURÊ (PHẢN ỨNG ĐẶC TRƯNG CỦA LIÊN KẾT PEPTIT)
Nguyên tắc
+ Trong môi trường kiềm mạnh ,liên kết peptit trong phân tử protein phản ứng
với CuSO4 tạo phức chất màu tím hoặc tím đỏ ở dạng anion .
+ Phản ứng tạo phức này có màu bền ,ổn đònh ,dùng để đònh lượng protein.
 Protein (có từ 2 liên kết peptit trở lên) + Cu2+ -> tạo phức màu xanh tím.(phản
ứng được coi là dương tính khi có màu tím rõ
Cách tiến hành
Cần chuẩn bò THUỐC THỬ :
3

Các dung dòch protein và axitamin:
Dung dòch protein trứng 0,1%
Dung dòch gelatin 0,1%
Dung dòch glycin 0,1%
Thuốc thử Biure (pha theo Gornall)
CuSO
4
.5H
2
O 1.5g Hoà tan trong
Na, K tartrat 6g
Bảo quản trong lọ pyrex hay polyethylen, đậy nút kín.
TIẾN HÀNH  Trong 3 ống nghiệm
 Lắc đều, phản ứng được coi là dương tính khi có màu tím rõ rệt.

Chú ý:
+ Chỉ các chất có từ 2 liên kết peptid trở lên mới cho phản ứng này(axitamin
và dipeptit không có phản ứng Biure).
+ Phức hợp màu có phổ hấp thụ cực đại ở bước sóng 540nm và độ đậm màu
(mật độ quang ) tỷ lệ thuận với nồng độ protein.
+ Độ nhạy của phản ứng tăng khi thêm vào thuốc thử Folin-Ciocalteau.Hiện
nay , người ta đã cải tiến phản ứng Biurê thành phản ứng Micrôbiure để
làm tăng độ nhạy của phản ứng lên hàng chục lần.
+ Bằng phương pháp này ta có thể đònh lượng protein tổng số , albumin ,
globulin , fibrinogen trong huyết thanh.
1 2 3
- Dung dòch protein trứng 0,1% (giọt)
- Dung dòch gelatin 0,1% (giọt)
- Dung dòch glycin 0,1% (giọt)
- Thuốc thử biure (giọt)

10
10
10
10
10
10
4
Nước cất 500ml
KI 1g
NaOH 10% 300ml
Nước cất vừa đủ 1000ml
Phaỷn ửựng taùo phửực maứu :
5
6
C. PHẢN ỨNG VỚI THUỐC THỬ FOLIN -CIACALTEAU(PHƯƠNG PHÁP
LOWRY)-PHẢN ỨNG ĐẶC TRƯNG CỦA MỘT HAY MỘT SỐ GỐC
AXITAMIN
Nguyên tắc
Tính hàm lượng protein nghiên cứu dựa vào đường chuẩn của protein và phản
ứng màu của protein với thuốc thử Folin-Ciocalteau.Cường độ màu dung dòch tỉ lệ
thuận với nồng độ protein.
Thuốc thử :
+ Dung dòch protein chuẩn có 10 –100 µg protein có trong 1ml.
+ Protein được hoà tan trong dung dòch NaCl 0,9% với lượng protein
trong 1ml có 10 , 20 , 30 , 40 , 80 , 100 µg protein . Dung dòch chuẩn
thường dùng tinh thể albumin huyết thanh bò .
+ Dung dòch A : dung dich Na
2
CO
3

2% trong NaOH 0,1N
+ Dung dòch B
1
: dung dòch CuSO
4
1%
+ Dung dònch B
2
: dung dòch muối Seignett 2% ( Kali tactarat )
+ Dung dòch C
+ Dung dòch D :dung dòch Folin 0,1 N.
Dung dòch D
7
Dung dòch B
1
0,5 ml
Dung dòch B
2
0,5 ml
Dung dòch A 50 ml
Nước cất 700ml
NaWO
4
. 2H
2
O 100g
NaMoO
4
. 2H
2

O 25g
Acid H
3
PO
4
85% 50ml
HCl đậm đặc 100ml
Li
2
SO
4
. H
2
O 150g
5 giọt Brom
Cách tiến hành
+ Lấy 1ml dung dòch protein nghiên cứu cho vào ống nghiệm , thêm 5 ml dung
dòch C .Lắc đều , để ở nhiệt độ phòng 10 phút .
+ Tiếp tục cho thêm 0,5 ml dung dòch D , lắc đều ,ø để ở 30 phút và đo trên máy
so màu ở bước sóng 750 nm.
Chú ý
+ Giai đoạn đầu thực hiện phản ứng Biure, sau đó thêm Folin-Ciocalteau tạo
thành phức xanh.
+ Thuốc thử Folin-Ciocalteau chủ yếu gồm:Natri molypđat (NaMoO4), Natri
wonframat (NaWO4) , Liti sunfat (LiSO
4
)
+ Tác dụng của thuốc thử :tăng độ nhạy của phản ứng Biurê ,phản ứng với
gốc Tyrosin và Trytophan trong phân tử prôtêin tạo phức chất màu xanh da
trời hấp thụ cực đại ở bước sóng 750nm.

 Đối với mỗi loại prôtein , cường độ màu của dung dòch tỉ lệ thuận
với nồng độ protein .Còn đối với các protein với nhau, cường độ màu phụ thuộc vào
loại protein(VD:cùng 1 nồng độ ,cường độ màu của tripxin, hemoglobin,gelatin theo
thứ tự giảm dần),do đó để kết quả chính xác protein phải qua tinh sạch ít nhiều.
+ Một số chất tăng cường độ màu: phenol, purin, pirimidin, axit uric, nhóm-
SH,1 số ion kim loại…Lí do :chúng sẽ cùng phản ứng với Folin-Ciocalteau.
+ Một số chất làm giảm cường độ màu:etanol, ete có nồng độ cao hơn 5%,
axeton, Ba(OH)2 có nồng độ cao hơn 1%, Cl3COOH, HClO4 trung hoà.
 Ưu điểm của phương pháp này : độ nhạy cao, phát hiện được protein trong dung
dich ở nồng 1g/cm3
D. MỘT SỐ PHẢN ỨNG MÀU KHÁC
 Phản ứng với axit piric: Đun dung dòch protein với axit piric và Na2CO3 sẽ có
màu cam đỏ, phản ứng đặc trưng cho prôtein nào có vòng dixentopiperazin
 Phản ứng Xantoprotein: Axit nitric đậm đặc tác dụng với protein sẽ có màu
vàng (do trong protein có axit amin có vòng thơm : fenylalanin , tyrozin , typtofan)
 Phản ứng Millon: Đặc trưng cho sự cò mặt của tyrosin, thuốc thử Millon(Hg-
NO3+HNO3) cho muối thuỷ ngân có màu đỏ
 Phản ứng Paulli: Thuốc thử diazo trong dung dòch kiềm của prôtein có màu đỏ
da cam , phản ứng đặc trưng của tyrosin , histidin có trong protein
8