Đánh giá chất lượng hạt và nghiên cứu đặc điểm cấu trúc gen LTP ở đậu xanh (Vigna radiata L.Wilczek)

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Đậu xanh (Vigna radiata L.Wilczek) là một trong ba cây đậu đỗ chính
trong nhóm các cây đậu ăn hạt. Đây cũng là cây trồng có vị trí quan trọng
trong nền nông nghiệp của nhiều nước, trong đó có Việt Nam [7], [11].
Trồng đậu xanh không những cung cấp nguồn thực phẩm giàu đạm,
đáp ứng nhu cầu về dinh dưỡng của con người và vật nuôi mà còn có tác dụng
cải tạo và bồi dưỡng đất, do rễ cây đậu xanh có các nốt sần chứa vi sinh vật cố
định đạm sống cộng sinh [4], [5].
Hiện nay, các giống đậu xanh trồng ở Việt Nam chủ yếu là các giống có
khả năng chịu hạn kém và thường bị nhiễm một số bệnh như: sâu keo, sâu xanh…
Trong những năm gần đây, có một số công trình nghiên cứu về đậu
xanh đã tiếp cận phân tích các đại phân tử protein và DNA như: nghiên cứu
tính đa hình protein của các giống đậu xanh địa phương bằng kỹ thuật phân
tích thành phần điện di protein dự trữ trong hạt, nghiên cứu hiện tượng đa
dạng DNA được nhân bản ngẫu nhiên [6], [10], [17]. Một số nghiên cứu về
khả năng chịu hạn đã được tiến hành trên một số loại cây trồng như đậu
tương, ngô, lúa… [1], [2], [9]. Các nghiên cứu đều thống nhất rằng đặc tính
chịu hạn của cây trồng rất phức tạp do nhiều gen quy định, trong đó có gen
LTP (Lipid Transfer Protein).
LTP là gen liên quan đến sinh tổng hợp lớp biểu bì. Khi gặp stress hạn,
LTP kích thích tăng tổng hợp ngoại bì làm thực vật có thể giảm mất nước nhờ
tăng độ dày của lớp vỏ ngoài [36]. Tuy nhiên, các nghiên cứu về mối liên quan
giữa đặc điểm sinh lí, hoá sinh và sinh học phân tử của gen LTP với khả năng
chịu hạn của cây đậu xanh còn hạn chế.
Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:
“Đánh giá chất lượng hạt và nghiên cứu đặc điểm cấu trúc gen LTP ở
đậu xanh (Vigna radiata L.Wilczek)” nhằm phục vụ việc thiết kế vector
chuyển gen mang gen LTP góp phần tạo cây đậu xanh chịu hạn.
1
2. Mục tiêu nghiên cứu

- Đánh giá chất lượng hạt của các giống đậu xanh nghiên cứu thông qua
phân tích một số chỉ tiêu hoá sinh.
- Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non của một số
giống đậu xanh.
- Phân lập và nghiên cứu cấu trúc của gen LTP liên quan đến tính chịu hạn.
3. Nội dung nghiên cứu
- Phân tích một số đặc điểm hình thái như: màu gốc thân mầm, màu vỏ
hạt, hình dạng hạt, khối lượng 1000 hạt, chiều dài thân và rễ của các
giống đậu xanh thu thập được ở giai đoạn cây non.
- Phân tích các chỉ tiêu hoá sinh sau: hàm lượng lipid, protein tan tổng số
của các giống đậu xanh thu thập được.
- Đánh giá khả năng chịu hạn của các giống đậu xanh thu thập được ở
giai đoạn cây non.
- Tách chiết DNA tổng số của 1 số giống đậu xanh.
- Nhân gen LTP bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction).
- Tách dòng gen LTP của giống đậu xanh chịu hạn tốt và chịu hạn kém nhất.
- Xác định trình tự gen LTP.
- Phân tích cấu trúc gen LTP.
4. Ý nghĩa khoa học
Là cơ sở cho việc thiết kết vector chuyển gen nhằm tạo cây đậu xanh
mang gen LTP.
2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. SƠ LƯỢC VỀ CÂY ĐẬU XANH
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây đậu xanh
Nguồn gốc: Đậu xanh (Vigna radiata L. Wilczek), có bộ NST 2n = 22,
là loại cây đậu ăn hạt, thân thảo. Theo Vavilov, đậu xanh có nguồn gốc từ Ấn
Độ, được phân bố rộng rãi ở các vùng nhiệt đới trong đó chủ yếu là ở các
nước Đông và Nam Á. Dạng dại của V. radiata cũng được tìm thấy ở
Madagasca, bên bờ Ấn Độ Dương, Đông Phi [11].

Phân loại khoa học của cây đậu xanh:
- Giới (regnum): Plantae
- Ngành (division): Magnolyophita
- Lớp (class): Magnolyopsida
- Bộ (order): Fabales
- Họ (Familia): Fabaceae
- Chi (genus): Vigna
- Loài (species): V. radiata
Chi Vigna là một trong những chi lớn trong họ Đậu, bao gồm khoảng
150 loài thuộc 7 chi phụ là Vigna; Plectotropis; Ceratotropis; Lasionspron;
Sigmoidotropis; Haydonia; Macrohynchus, trong đó đậu xanh là một trong số
16 loài của phân chi Ceratotropis [5].
1.1.2. Đặc điểm nông sinh học của cây đậu xanh
Cây đậu xanh thuộc loại cây thân thảo, là loại cây trồng cạn thu quả và
hạt bao gồm các bộ phận rễ, thân, lá, hoa, quả, hạt.
 Đặc điểm của rễ
Hệ rễ đậu xanh thuộc loại rễ cọc bao gồm rễ chính và các rễ phụ. Rễ
chính thường ăn sâu khoảng 20 - 30 cm, trong điều kiện thuận lợi có thể ăn
sâu tới 70 - 100 cm. Rễ phụ thường gồm 30 - 40 cái, dài khoảng 20 - 25 cm.
3
Trên rễ phụ có nhiều lông hút do biểu bì rễ biển đổi thành, có vai trò
tăng cường sức hút nước và các chất dinh dưỡng cho cây. Tuy nhiên, bộ rễ
của cây đậu xanh yếu hơn nhiều so với các cây đậu đỗ khác nên khả năng
chịu hạn và chịu úng của cây đậu xanh tương đối kém. Nếu bộ rễ phát triển
tốt thì bộ lá xanh lâu, cây ra nhiều hoa, quả, hạt mẩy. Ngược lại, bộ rễ phát
triển kém thì cây sẽ chóng tàn, các đợt ra hoa sau sẽ khó đậu quả hoặc quả sẽ
bị lép [7], [11]. Trên rễ cây họ Đậu có nhiều nốt sần chứa vi khuẩn cổ định
đạm Rhizobium. Các nốt sần trên rễ bắt đầu hình thành khi cây có 2 - 3 lá thật
và đạt tối đa khi cây ra hoa rộ. Trên mỗi cây có khoảng 10 - 20 nốt sần, tập
trung chủ yếu ở cổ rễ. Kích thước của các nốt sần không giống nhau, đường

kính dao động từ 4 - 5 mm, so với đậu tương và lạc thì nốt sần của cây đậu
xanh ít và nhỏ hơn. Trên các loại rễ thì lớp rễ đầu tiên có nhiều nốt sần, còn
các lớp rễ mọc ra từ cổ rễ về sau ít nốt sần hơn. Người ta nhận thấy rằng
những nốt sần hình thành sau khi cây ra hoa (nốt sần thứ cấp) hoạt động mạnh
hơn loại nốt sần sinh ra ở nửa đầu thời kỳ sinh trưởng. Trung bình mỗi vụ, 1
ha đậu xanh có thể bù lại cho đất tương ứng 85 - 107 kg nitơ làm cho đất tơi
xốp hơn [8], [9].
 Đặc điểm của thân và cành
Thân cây đậu xanh thuộc loại thân thảo hình trụ, phân đốt, cao khoảng
40 - 70 cm mọc thẳng đứng, có khi hơi nghiêng. Thân đậu xanh nhỏ, tròn, có
màu xanh hoặc màu tím tùy thuộc vào kiểu gen, có một lớp lông màu nâu
sáng bao bọc. Trên thân chia 7 - 8 đốt, ở giữa hai đốt gọi là lóng. Độ dài của
các lóng thay đổi tùy theo vị trí trên cây và điều kiện khác. Các lóng dài
khoảng 8 - 10 cm, các lóng ngắn chỉ 3 - 4 cm. Từ các đốt mọc ra các cành,
trung bình có 1 - 5 cành. Các cành mọc ra từ các nách lá thứ 2, 3 phát triển
mạnh gọi là cành cấp I, trên mỗi cành này lại có trung bình 2 - 3 mắt, từ các
mắt này mọc ra các chùm hoa. Các đốt thứ 4, 5, 6 thường là mọc ra các chùm
hoa. Thời kỳ trước khi cây có 3 lá chét thì tốc độ tăng trưởng của thân chậm,
sau đó mới tăng nhanh dần đến khi ra hoa và hoa rộ, đạt chiều cao tối đa lúc
4
đã có quả chắc. Đường kính trung bình của thân chỉ từ 8 - 12 mm và tăng
trưởng tỷ lệ thuận với tốc độ tăng trưởng của chiều cao cây [11].
 Đặc điểm của lá
Lá cây đậu xanh thuộc loại lá kép, có ba lá chét, mọc cách. Trên mỗi
thân chính có 7 - 8 lá thật, chúng xuất hiện sau khi xuất hiện lá mầm và lá
đơn. Lá thật hoàn chỉnh gồm có: lá kèm, cuống lá và phiến lá. Cả hai mặt trên
và dưới của lá đều có lông bao phủ. Diện tích của các lá tăng dần từ dưới lên,
các lá mọc ở giữa thân rồi lại giảm dần lên phía ngọn. Chỉ số diện tích lá (m
2
lá/m

2
đất) có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất quang hợp và năng suất thu hoạch.
Số lượng lá, kích thước, hình dạng và chỉ số diện tích lá thay đổi tuỳ thuộc
vào giống, đất trồng và thời vụ [5], [11].
 Đặc điểm của hoa
Hoa đậu xanh là loại hoa lưỡng tính, tự thụ phấn, mọc thành chùm to,
xếp xen kẽ nhau ở trên cuống. Các chùm hoa chỉ phát sinh ra từ các mắt thứ
ba ở trên thân, nhiều nhất là ở mắt thứ tư, còn ở các cành thì tất cả các mắt
đều có khả năng ra hoa. Thường sau khi cây mọc 18 - 20 ngày thì mầm hoa
hình thành , sau 35 - 40 ngày thì nở hoa. Trong một chùm hoa, từ khi hoa đầu
tiên nở đến hoa cuối cùng kéo dài 10 - 15 ngày. Mỗi chùm hoa dài từ 2 - 10
cm và có từ 10 - 125 hoa. Khi mới hình thành hoa có hình cánh bướm, màu
xanh tím, khi nở cánh hoa có màu vàng nhạt [11]. Hoa đậu xanh thường nở
rải rác, các hoa ở thân nở trước, các hoa ở cành nở sau, chậm hơn, có khi còn
chậm hơn các chùm hoa cuối cùng ở ngọn cây. Trên cùng một cành, các chùm
hoa cũng nở chênh lệch nhau có khi đến 10 - 15 ngày. Trong một chùm hoa
cũng vậy, từ khi hoa đầu tiên nở đến hoa cuối cùng có thể chênh 10 - 15 ngày.
Hoa nở được 24h là tàn, sau khi nở hoa và thụ tinh khoảng 20 ngày là quả
chín. Số lượng hoa dao động rất lớn, từ 30 đến 280 hoa trên một cây. Công
thức hoa là: K5C5A10G1. Thời gian nở hoa có thể chia thành 3 nhóm:
- Nhóm ra hoa tập trung: Hoa nở kéo dài < 16 ngày.
- Nhóm ra hoa không tập trung: Hoa nở liên tiếp > 30 ngày.
5
- Nhóm ra hoa trung gian: Hoa nở từ 16 đến 30 ngày.
 Đặc điểm của quả
Quả đậu xanh thuộc loại quả giáp, có dạng hình trụ, dạng tròn hoặc
dạng dẹt với đường kính 4 - 6 mm, dài 8 - 14 cm, dài khoảng 8 - 10 cm, có 2
gân nổi rõ dọc hai bên quả, đa số là quả thẳng, có một số hơi cong, khi còn
non quả có màu xanh, khi chín vỏ quả có màu nâu vàng hoặc xám đen, đen...
gặp nắng rễ bị tách vỏ. Một cây trung bình có khoảng 20 - 30 quả, mỗi quả có

từ 5 - 10 hạt. Trên vỏ quả được bao phủ một lớp lông mịn. Mật độ lông phụ
thuộc vào đặc điểm của giống và khả năng chống chịu của cây. Những giống
đậu xanh chống chịu bệnh khảm vàng virus và sâu đục quả có mật độ lông
dày, vào thời kì chín hoàn toàn lông trên quả thường rụng đi hoặc tự tiêu biến
[4], [5]. Các quả của những lứa hoa đầu lại thường chín chậm hơn các quả ra
lứa sau đó, nhưng quả to và hạt mẩy hơn. Các quả của những đợt hoa ra sau
thường ngắn, ít hạt, hạt không mẩy, màu hạt cũng nhạt và bé hơn. Các quả
sinh ra từ các chùm hoa trên thân nhiều quả và quả to, dài hơn quả của các
chùm hoa ở cành. Quả đậu xanh chín rải rác, có khi kéo dài đến 20 ngày [8].
 Đặc điểm của hạt
Hạt không nội nhũ, phôi cong, hai lá mầm dày, lớn và chứa nhiều chất
dinh dưỡng. Hạt gồm vỏ hạt, rốn hạt 2 lá mầm và 1 mầm non. Mầm non là
nơi thu nhỏ của mầm rễ, 2 lá đơn, thân chính và lá kép đầu tiên.
Hạt có hình tròn, hình trụ, hình ô van, hình thoi... và có nhiều màu sắc khác
nhau như: màu xanh mốc, xanh bóng, xanh nâu, vàng mốc, vàng bóng nằm
ngăn cách nhau bằng những vách xốp của quả. Ruột hạt màu vàng, xanh,
xanh nhạt. Hình dạng hạt kết hợp với màu sắc và độ lớn của hạt là chỉ tiêu
quan trọng để đánh giá chất lượng của hạt. Mỗi quả có từ 8 - 15 hạt. Hạt của
những quả trên thân thường to, mẩy hơn hạt của các quả ở cành. Hạt của các
quả lứa đầu cũng to và mẩy hơn các quả lứa sau. Số lượng hạt trung bình
trong một quả là một trong những yếu tố chủ yếu tạo thành năng suất của đậu
6
xanh. Trọng lượng hạt của mỗi cây biến động lớn từ 20 - 90 gam tùy giống,
thời vụ và chế độ canh tác. Trọng lượng 1000 hạt từ 50 - 70 gam [4].
1.1.3. Sinh trưởng và phát triển của cây đậu xanh
Sinh trưởng và phát triển của đậu xanh là kết quả thể hiện các đặc điểm
của giống trong các mối quan hệ tương tác chặt chẽ với các điều kiện môi
trường bên ngoài và với các yếu tố kỹ thuật canh tác. Cần lưu ý, cây đậu xanh
có khả năng vừa sinh trưởng sinh dưỡng, vừa sinh trưởng sinh thực đồng thời
ở một số giai đoạn phát triển [11].

Có 2 giai đoạn sinh trưởng và phát triển chủ yếu ở đậu xanh:
- Các giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng (SD)
- Các giai đoạn sinh trưởng sinh thực (ST)
Bảng 1.1. Các giai đoạn sinh trưởng và phát triển của cây đậu xanh
Sinh trưởng sinh dưỡng Sinh trưởng sinh thực
Ký hiệu Thể hiện bên ngoài Ký hiệu Thể hiện bên ngoài
SD
m
Hạt nảy mầm ST
1
Cây bắt đầu ra hoa
SD
l
Lá mầm xuất hiện ST
2
Hoa phát triển đầy đủ
SD
1
Hình thành đốt thứ nhất ST
3
Bắt đầu hình thành quả
SD
2
Hình thành đốt thứ hai ST
4
Quả phát triển đầy đủ
SD
3
Hình thành đốt thứ ba ST
5

Bắt đầu hình thành hạt
..... ST
6
Hạt phát triển đầy đủ
SD
n
Hình thành đốt thứ n ST
7
Hạt bắt đầu chín
ST
8
Hạt chín hoàn toàn
* Giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng (SD): Được bắt đầu bằng thời kỳ
SDm, là lúc hạt đậu giống nảy mầm. Tiếp theo là thời kỳ SDl, lúc này cây bắt
đầu xuất hiện lá mầm. Các thời kì tiếp theo là SD2, SD3...tương ứng với thứ
tự hình thành các đốt trên cây. Kết thúc giai đoạn SDn tương ứng với số đốt
cuối cùng trên cây. Số đốt hình thành trên cây đậu xanh thay đổi tùy thuộc
vào đặc điểm của giống.
* Giai đoạn sinh trưởng sinh thực của đậu xanh (ST): Được chia thành
8 thời kì bắt đầu từ ST1 đến ST8, tương ứng với các thời kì hình thành hoa,
quả, hạt đậu. Cây đậu xanh có đặc điểm sinh trưởng vô hạn hoặc bán vô hạn,
7
nên việc xác định các thời kì sinh trưởng sinh thực thường gặp nhiều khó
khăn, vì trên một cây đồng thời vừa có cả nụ, hoa, quả non và quả chín. Vì
vậy, thời kì sinh thực của đậu xanh chỉ mang tính chất tương đối.
Các thời kỳ sinh dưỡng, có thể gọi là các thời kỳ hình thành đốt trên
cây đậu xanh (không kể thời kỳ SDm và SDl), các thời kỳ tiếp theo của sinh
dưỡng được tính bằng số đốt đã mang lá hoàn chỉnh. Một đốt được xem là
hoàn chỉnh khi đốt phía trên nó có một lá kép đã xòe rộng (không còn cuốn
nữa). Đốt lá đơn là đốt đầu tiên có hai lá đơn mọc đối diện hai bên thân và có

cuống lá ngắn nhất. Các lá thật trên thân đều có 3 lá chét, mọc cách trên thân
chính với cuống lá dài [5], [11].
1.1.4. Đặc điểm hoá sinh của hạt đậu xanh
Hạt đậu xanh chứa 23 - 28% protein, 1,3% lipid, 56 - 60% glucid, 12%
nước, các vitamin B1, B2, C… các muối khoáng như Ca, Na, Fe, K … [11].
Đối với cây trồng thu hạt nói chung và cây đậu xanh nói riêng, đánh giá
chất lượng hạt được thực hiện bằng những phân tích thành phần hoá sinh
trong hạt như: hàm lượng protein, lipid, đường, thành phần amino acid, hàm
lượng và hoạt độ của các enzyme trong hạt ở giai đoạn nảy mầm... Trong đó,
hai thành phần quan trọng có ảnh hưởng lớn đến sự nảy mầm của hạt và sự
phát triển của cây là protein và lipid.
1.1.4.1. Protein
Protein thực vật nói chung và protein đậu xanh nói riêng là nguồn
cung cấp đạm dễ tiêu hoá cho con người và một số vật nuôi. Trong hạt đậu
xanh, các phân tử protein chiếm khoảng 23 - 28% và được chia thành hai
nhóm: nhóm protein đơn giản và nhóm protein phức tạp. Trong nhóm protein
đơn giản chủ yếu là globulin, chiếm từ 60 - 80%, còn lại là albumin và một số
loại khác. Chức năng chính của protein dự trữ là cung cấp amino acid và nitơ
cho quá trình nảy mầm của hạt [11]. Protein đậu xanh có chứa đầy đủ các tính
chất chung nhất của protein. Ngoài ra, protein đậu xanh còn có một số tính
chất riêng biệt như khả năng hút nước và dầu tạo nhũ tương, khả năng hoà tan
8
trong nước. Đó là một trong những yếu tố quan trọng trong nghiên cứu và
công nghệ sản xuất các sản phẩm từ đậu xanh.
Protein đậu xanh được đánh giá là có chất lượng tốt do có chứa đầy đủ
các amino acid không thay thế và hàm lượng của chúng tương đối trùng với
tiêu chuẩn dinh dưỡng dành cho trẻ em do tổ chức nông lương thế giới (FAO)
và tổ chức y tế thế giới (WHO) đưa ra [20].
1.1.4.2. Lipid
Lipid là những hợp chất hữu cơ có trong tế bào sống, không hoà tan

trong nước nhưng tan trong các dung môi hữu cơ không phân cực như ether,
petroleum ether, benzen... Lipid cũng là thành phần cấu tạo quan trọng của
màng sinh học, là nguồn dự trữ nhiên liệu cung cấp năng lượng cho cơ thể.
Lipid cùng với protein và polysaccarid cung cấp năng lượng cho sự nẩy mầm
của hạt. Tuy hàm lượng lipid trong hạt đậu xanh chiếm tỷ lệ thấp (trung bình
khoảng 1,3%) [11], nhưng đó lại là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá phẩm
chất và khả năng bảo quản hạt.
Tóm lại, việc nghiên cứu và xác định hàm lượng protein và lipid có ý
nghĩa rất quan trọng trong việc đánh giá chất lượng hạt đậu xanh.
1.1.5. Tầm quan trọng của cây đậu xanh
Cây đậu xanh là loại cây trồng có giá trị kinh tế cao. Hạt đậu xanh là
nguồn thực phẩm giàu đạm (khoảng 24 - 28%), ngoài ra, còn có lipid khoảng
1,3%, glucid 60,2% và các chất khoáng như Ca, Fe, Na, K, P... cùng nhiều
loại vitamin hoà tan trong nước như vitamin B1, B2, C... Protein hạt đậu xanh
chứa đầy đủ các amino acid không thay thế như leucine, isoleucine, lysine,
methionine, phenylalanine, valine... Hạt đậu xanh không chỉ phù hợp với nhu
cầu tiêu dùng trong nước mà còn là mặt hàng xuất khẩu có giá trị. Hạt đậu
xanh được dùng để chế biến ra nhiều loại thực phẩm ngon, bổ, hấp dẫn như
các loại bột dinh dưỡng, các loại bánh, chè, xôi đỗ và một số đồ uống... Lá
non và ngọn của cây đậu xanh có thể được dùng để làm rau, muối dưa. Thân,
lá xanh có thể dùng làm thức ăn cho vật nuôi [4], [5].
9
Ngoài ra đậu xanh còn có giá trị trong y học, vỏ hạt đậu xanh có vị
ngọt, tính mát, không độc nên có tác dụng giải nhiệt, giải bách độc [13].
Trồng cây đậu xanh còn có tác dụng cải tạo và bồi dưỡng đất. Nhờ hệ
rễ đậu xanh có các nốt sần chứa các vi khuẩn cộng sinh thuộc chi Rhizobium
có khả năng cố định nitơ từ khí trời, cung cấp một phần đạm cho cây và để lại
lượng đạm đáng kể trong đất sau khi thu hoạch. Vì vậy, đất sau khi trồng đậu
xanh sẽ trở nên tơi xốp và giàu dinh dưỡng hơn [11].
1.1.6. Tình hình nghiên cứu và sản xuất đậu xanh

1.1.6.1. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống đậu xanh trên thế giới
Hiện nay, công tác chọn tạo giống đậu xanh trên thế giới được tiến
hành theo một số hướng chính sau: tạo giống cho năng suất cao, tạo giống
nâng cao chất lượng, tạo giống có khả năng chống chịu tốt, tạo giống có khả
năng kháng sâu, bệnh hại [1], [10].
Để tạo các giống đậu xanh có khả năng chống chịu tốt với điều kiện
ngoại cảnh bất lợi, các nhà khoa học đã tập trung vào nghiên cứu các đặc
điểm sinh lý, sinh hoá và các gen liên quan đến khả năng chống chịu của cây
đậu xanh.
Nghiên cứu về khả năng chịu hạn, cơ chế chịu hạn và phân lập gen
liên quan đến tính chịu hạn của cây đậu xanh cũng được nhiều nhà khoa học
trên thế giới quan tâm nhằm chọn tạo ra các giống đậu xanh có khả năng
chịu hạn tốt.
Liu K.H. và cs (2003) đã phân lập và đọc trình tự gen LTP ở đậu xanh,
đặt tên là Vrltp1 và Vrltp2 [41].
Pandurangam V. và cs (2006) đã nghiên cứu biểu hiện gen Rubisco ở
đậu xanh [47].
Chen Y.J. và cs (2004) đã tiến hành phân lập ba gen Hsc70 ở đậu xanh
là VrHsc70 - 1, VrHsc70 - 2, VrHsc70 - 3 nhằm nghiên cứu cơ chế và chọn
tạo giống đậu xanh có khả năng chịu hạn, chịu nóng [28].
10
Kim Y. J. và cs (2003) đã phân lập và đọc trình tự gen PLC3 với chiều
dài của gen là 5213 nucleotide, vùng mã hoá gồm 1776 nucleotide mã hoá
cho 591 amino acid, có khối lượng phân tử 67,4 kDa [40].
Kang S. J. và cs (2002) đã phân lập gen cystatin ở đậu xanh với mã số
AF454396 trên Ngân hàng gen quốc tế [37].
Gần đây, nhiều nhà khoa học cũng bàn luận về mối liên quan giữa
cystatin với hạn, lạnh, muối, sự già và bảo vệ thực vật, chống côn trùng, vi
sinh vật gây bệnh.
Malgorzata G. và cs (2004) đã tiến hành phân lập gen mã hoá cystatin ở

đậu xanh nhằm nghiên cứu, chọn tạo giống đậu xanh có khả năng chống chịu
tốt [42].
Trong tương lai, với sự phát triển ngày càng mạnh của khoa học kỹ
thuật, các loại cây trồng nói chung và cây đậu xanh nói riêng sẽ còn được
nghiên cứu kĩ hơn, sâu hơn để có thể đáp ứng được nhu cầu sử dụng đậu xanh
ngày càng lớn của con người.
1.1.6.2. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống đậu xanh ở Việt Nam
Từ sau cách mạng tháng tám năm 1945, chúng ta đã xây dựng được
nhiều trạm nghiên cứu thí nghiệm về đậu đỗ nói chung và về đậu xanh nói
riêng ở nhiều nơi khác nhau như ở Định Tường (Thanh Hoá), Mai Nham
(Vĩnh Phúc), Pú Nhung (Lai Châu), Thất Khê (Cao Bằng) và đã tiến hành thu
thập, chọn tạo ra nhiều giống mới với các đặc tính ưu việt hơn trước.
Từ những năm 1980 đến nay, nước ta có thêm nhiều cơ sở nghiên cứu
về đậu xanh như: Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam, Viện cây
lương thực thực phẩm, các trường Đại học Nông nghiệp, Đại học Khoa học
Tự nhiên cùng nhiều cơ sở nghiên cứu khoa học khác. Các Trung tâm này đã
tập trung và đi sâu vào hai hướng nghiên cứu cơ bản trong sản xuất đậu đỗ
nói chung và đậu xanh nói riêng là:
11
- Chọn tạo giống thích hợp cho từng vùng sinh thái, từng mùa vụ khác
nhau, giống có năng suất cao, phẩm chất tốt, có khả năng chống chịu điều
kiện ngoại cảnh bất lợi, đặc biệt là các giống có giá trị thương mại cao.
- Đưa cây đậu xanh vào hệ thống trồng trọt nhằm cải tiến hệ thống
trồng độc canh hoá ở các vùng và cải tạo các vùng đất bị thoái hoá [4], [5].
Với những định hướng trên, công tác chọn tạo giống đậu xanh ở nước ta
đã được quan tâm phát triển và đã đạt được một số thành tựu nổi bật sau:
Lê Khả Tường và cs (2000), nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lí, khả
năng chống chịu sâu bệnh hại và thử nghiệm giống KP11. Kết quả đã được
Hội đồng khoa học công nhận là giống tiến bộ kỹ thuật năm 2001 áp dụng
cho vùng Bắc Trung Bộ [9].

Chu Hoàng Mậu (2001), bằng phương pháp gây đột biến thực nghiệm
đã tạo được 2 dòng đậu xanh MX1103 và TX16012 có năng suất cao, ổn định
và có khả năng chịu hạn tốt [15].
Chu Hoàng Mậu (2001) đã tiến hành nghiên cứu hàm lượng protein,
thành phần và hàm lượng các amino acid trong hạt các giống đậu xanh đột
biến và giống gốc để đánh giá chất lượng hạt của các giống đậu xanh. Kết quả
cho thấy hạt của giống đậu xanh đột biến MX103 có hàm lượng protein là
20,58%, cao hơn so với các giống còn lại, hàm lượng amino acid của các
giống đậu xanh đột biến cũng cao hơn các giống đối chứng [16].
Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2003) đã nghiên cứu một số chỉ tiêu hoá
sinh của 9 giống đậu xanh do Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam cung
cấp. Kết quả cho thấy hàm lượng protein của các giống này dao động trong
khoảng 20,72% - 26,86% [17].
Cùng với việc áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử vào nghiên cứu đậu
xanh của các nước trên thế giới, ở Việt Nam bước đầu cũng có nhiều ứng
dụng và đã thu được những kết quả khá quan trọng. Các nhà khoa học đã
thành công trong việc phân lập các gen liên quan đến khả năng chống chịu
12
như gen chịu hạn, chịu nóng, chịu muối... và đánh giá quan hệ di truyền của
một số giống đậu xanh.
Điêu Thị Mai Hoa, Lê Trần Bình (2005) đã nghiên cứu tính đa dạng di
truyền của 57 giống đậu xanh bằng kỹ thuật RADP [6].
Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2006) đã phân lập và đọc trình tự gen PLC3
(Phospholipase C3) có liên quan đến khả năng chịu hạn của hai giống đậu
xanh KP11 và MN93. Gen có chiều dài 4215 nucleotide gồm 8 đoạn intron và
9 đoạn exon, vùng exon gồm 1776 nucleotide mã hoá 591 amino acid [18].
Nguyễn Thị Thu Trang (2008) đã phân lập gen cystatin có khả năng
chịu hạn ở 2 giống đậu xanh là DX208 và PAEC3 [21].
1.1.6.3. Tình hình sản xuất đậu xanh trên thế giới
Tình hình sản xuất đậu xanh trên thế giới ngày một tăng. Đặc biệt, trong

những năm gần đây do nhu cầu của con người về dinh dưỡng protein thực vật
tăng nhanh đã làm thúc đẩy việc sản xuất đậu xanh trên thế giới phát triển mạnh.
Trung tâm nghiên cứu và phát triển rau quả châu Á đóng tại Đài Loan
đã có một bộ sưu tập giống đậu xanh với khoảng 6000 mẫu giống, trong đó có
những giống cho năng suất cao từ 18 - 25 tạ/ha. Gần đây, một số nước láng
giềng của Việt Nam như Thái Lan, Philippin, Trung Quốc... đã chọn ra được
những giống đậu xanh cho năng suất từ 10 - 12 tạ/ha trở lên, hạt to, màu hạt
đẹp, thời gian sinh trưởng ngắn, chín tập trung, có sức chống chịu tốt với các
điều kiện cực đoan của môi trường [11].
Cho đến nay, trên thế giới cây đậu xanh được trồng với diện tích
khoảng 928 ngàn ha, sản lượng đạt hơn 6445 triệu tấn (2002 - 2006). Ấn Độ
là nước trồng nhiều đậu xanh nhất với diện tích 15000 ha (năm 2008), chiếm
trên 70% diện tích đậu xanh toàn cầu, sản lượng đạt 420000 tấn (2008), năng
suất đạt 2800 kg/ha (2008). Thái Lan là nước sản xuất lớn thứ hai và là nước
đứng đầu về xuất khẩu đậu xanh với sản lượng đạt 92000 tấn (năm 2008),
chiếm khoảng 40% sản lượng thế giới. Nước nhập nhiều đậu xanh nhất là
Nhật 80 tấn/năm, Hoa Kỳ 50 tấn/năm [33].
13
Diện tích, năng suất, sản lượng của đậu xanh trên toàn thế giới trong 5
năm gần đây được thể hiện trong bảng sau:
Bảng 1.2. Diện tích, sản lượng, năng suất đậu xanh trên thế giới
trong 5 năm gần đây
Năm
2004
Năm
2005
Năm
2006
Năm
2007

Năm
2008
Diện tích (ha) 940188 938893 943149 938112 985679
Sản lượng (tấn) 6551886 6578870 6816377 6752646 6818948
Năng suất (kg/ha) 6968,6 7007 7227,2 7198,1 6918
Nguồn: FAOSTAT, 2008.
1.1.6.4. Tình hình sản xuất đậu xanh ở Việt Nam
Ở Việt Nam, cây đậu xanh cũng được trồng từ lâu đời ở các vùng đồng
bằng, trung du và miền núi trên khắp cả nước. Tuy nhiên, nó vẫn chỉ được xem
như một loại cây trồng phụ nhằm tận dụng đất đai, lao động dư thừa... Vì thế,
năng suất sản xuất đậu xanh còn chưa cao. Từ năm 1991 - 1995 năng suất sản
xuất đậu xanh bình quân đạt khoảng 5,5 - 12 tạ/ha. Từ 1996 - 2000 năng suất
dao động trong khoảng 15 - 20 tạ/ha. Đến năm 2000, Việt Nam có diện tích và
sản lượng đậu xanh đứng thứ 6 trên thế giới [9].
Đậu xanh của nước ta sản xuất ra chủ yếu để đáp ứng nhu cầu tiêu dùng
trong nước như làm rau, làm bánh.... Các sản phẩm làm từ đậu xanh rất phong
phú, nhưng hiện nay chỉ có một số ít sản phẩm có chất lượng ổn định và có
thương hiệu lâu năm trên thị trường [20].
Đậu xanh phân bố chủ yếu ở các vùng:
- Vùng núi phía Bắc: Tập trung ở các tỉnh Sơn La, Lai Châu, Hòa Bình.
Năng suất trung bình đạt 600 kg/ha.
- Vùng đồng bằng và trung du Bắc Bộ: Năng suất trung bình dao động
800 - 1000 kg/ha.
- Vùng duyên hải Trung Bộ và Tây Nguyên: Là vùng sản suất đậu xanh
lớn về diện tích và sản lượng. Nhưng do ảnh hưởng của thời tiết nên cũng thất
thu nhiều về năng suất và sản lượng.
14
- Vùng Đông Nam Bộ: Là vùng sản xuất đậu xanh quy mô lớn chiếm
26% diện tích gieo trồng cả nước, năng suất bình quân còn thấp đạt khoảng
500 kg/ha do sử dụng giống đậu xanh cũ, khả năng chống chịu kém [5].

Ngày nay, đậu xanh có xu hướng tăng về diện tích và sản lượng do nhu cầu sử
dụng. Để đạt được kết quả tốt cần có các phương pháp lai tạo, chọn ra các
giống mới có năng suất cao, chống chịu được với các điều kiện khắc nghiệt
của môi trường ngoại cảnh.
1.2. GEN LTP VÀ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU XANH
1.2.1. Hạn và tác động của hạn đối với cây trồng
1.2.1.1. Hạn và các loại hạn đối với cây trồng
Hạn là hiện tượng thường xuyên xảy ra trong thiên nhiên và liên quan
trực tiếp đến vấn đề nước trong thực vật. Khái niệm hạn dùng để chỉ tình
trạng thiếu nước của thực vật do môi trường gây nên, làm ảnh hưởng đến sự
sinh trưởng và phát triển của thực vật, từ đó ảnh hưởng đến năng suất và sản
lượng cây trồng [10]. Có 3 dạng hạn đối với thực vật là: hạn đất, hạn không
khí và hạn sinh lý.
• Hạn đất
Hạn đất xảy ra khi lượng nước dự trữ cho cây hấp thu trong đất bị cạn
kiệt nên cây không hút đủ nước và mất cân bằng nước. Hạn đất thường xảy ra
ở các vùng có lượng mưa trung bình rất thấp và kéo dài nhiều tháng trong
năm như các tỉnh miền Trung, Tây nguyên... vào mùa khô.
• Hạn không khí
Hạn không khí xảy ra khi độ ẩm không khí quá thấp làm cho quá trình
thoát hơi nước của cây quá mạnh và cũng có thể dẫn đến mất cân bằng nước
trong cây. Hạn không khí thường xảy ra ở các vùng có gió khô và nóng như
gió Tây Nam của các tỉnh miền Trung, mùa khô ở Tây Nguyên hoặc đôi lúc
gió mùa Đông Bắc cũng có độ ẩm không khí thấp.
• Hạn sinh lý
Hạn sinh lý xảy ra khi trạng thái sinh lý của cây không cho phép cây
hút được nước mặc dù trong môi trường không thiếu nước. Rễ cây không lấy
15
được nước trong khi quá trình bay hơi nước vẫn diễn ra nên cây mất cân bằng
nước. Hạn sinh lý nếu nghiêm trọng và kéo dài cũng tác hại như hạn đất và

hạn không khí. Nếu hạn đất kết hợp với hạn không khí thì mức độ tác hại đối
với cây còn tăng lên nhiều.
1.2.1.2. Tác hại của hạn đối với cơ thể thực vật
• Hệ thống keo nguyên sinh chất bị thay đổi mạnh:
- Thay đổi các tính chất lý hoá của chất nguyên sinh: tăng độ nhớt chất
nguyên sinh làm chậm các hoạt động sống, giảm mức độ phân tán, khả năng
thuỷ hoá và tính đàn hồi của keo nguyên sinh chất…
- Thay đổi đặc tính hoá keo từ trạng thái sol rất linh động thuận lợi cho
các hoạt động sống sang trạng thái coaxecva hoặc gel kém linh động, cản trở
các hoạt động sống.
• Quá trình trao đổi chất lúc thiếu nước sẽ bị đảo lộn từ hoạt động tổng
hợp là chủ yếu khi đủ nước chuyển sang hướng phân giải khi thiếu nước. Quá
trình phân giải quan trọng nhất là phân giải protein và axit nucleic, kết quả là
giải phóng và tích lũy NH
3
gây độc cho cây và có thể làm cây chết.
• Hoạt động sinh lý bị kìm hãm
- Thiếu nước sẽ ức chế hoạt động quang hợp. Do khí khổng đóng nên
thiếu CO
2
, lục lạp có thể bị phân huỷ, ức chế tổng hợp diệp lục, lá bị héo và
khô chết, diện tích quang hợp giảm, sự vận chuyển các sản phẩm quang hợp
ra khỏi lá và về cơ quan dự trữ bị tắc nghẽn.
- Thiếu nước ban đầu sẽ làm tăng hô hấp, về sau giảm hô hấp nhanh, hiệu
quả sử dụng năng lượng của hô hấp rất thấp vì hô hấp sản sinh nhiệt là chính.
- Hạn làm mất cân bằng nước trong cây: lượng nước thoát ra lớn hơn
lượng nước hấp thu vào cây làm cho cây bị héo.
- Dòng vận chuyển vật chất trong cây bị ức chế rất mạnh: sự hút chất
khoáng giảm do tốc độ dòng thoát hơi nước giảm. Thiếu nước kìm hãm tốc độ
vận chuyển chất đồng hoá về các cơ quan dự trữ và có thể có hiện tượng

16
“chảy ngược dòng” các chất đồng hoá từ các cơ quan dự trữ về các cơ quan
dinh dưỡng. Kết quả làm giảm năng suất kinh tế của cây trồng.
• Quá trình sinh trưởng và phát triển bị kìm hãm
- Ức chế sinh trưởng: thiếu nước thì đỉnh sinh trưởng không tiến hành
phân chia được, quá trình dãn của tế bào bị ức chế làm cho cây sinh trưởng
chậm nên nước được xem là yếu tố nhạy cảm trong sự sinh trưởng của tế bào.
- Ức chế ra hoa, kết quả: thiếu nước ảnh hưởng đến quá trình phân hoá hoa và
đặc biệt là quá trình thụ tinh. Khi gặp hạn, hạt phấn không nảy mầm, ống
phấn không sinh trưởng được, sự thụ tinh không xảy ra và hạt sẽ bị lép, dẫn
đến giảm năng suất cây trồng.
1.2.2. Cơ sở hóa sinh và sinh học phân tử của tính chịu hạn
Thực vật có khả năng ngăn ngừa thương tổn khi bị tổn thương gọi là
tính chống chịu. Mỗi cây trồng có một giới hạn nhất định đối với các nhân tố
sinh thái của môi trường như hạn, nóng, lạnh, sương… Khi các nhân tố này
vượt quá giới hạn sẽ ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây
trồng, dẫn đến giảm năng suất. Phản ứng chủ yếu của cây đối với hạn là sự
đóng khí khổng, giảm sự thoát hơi nước, giảm quang hợp, tăng tích lũy ABA,
prolin, manitol, sorbitol… Nhờ vậy mà thực vật có thể thích nghi với các điều
kiện khắc nghiệt của môi trường ngoại cảnh.
Một trong những xu hướng để thực vật chống lại hạn là dựa vào khả
năng làm tăng áp lực nội tại, tăng tính đàn hồi của màng tế bào cũng như
giảm kích thước tế bào. Trên phương diện hóa sinh, thực vật xảy ra nhiều biến
đổi nhằm chống lại hạn hán như giảm phức hợp CO
2
, giảm tổng hợp protein
và các axit nucleic, tăng hoạt tính RNase và hàm lượng prolin, tăng nồng độ
các chất hòa tan. Ngoài ra, thực vật còn chống lại sự khô hạn bằng cách giữ
không để mất nước hoặc nhanh chóng bù lại sự thiếu nước thông qua những
sự biến đổi về cấu trúc và hình thái như: rễ to, khỏe, dài, có khả năng xuyên

sâu; giảm diện tích lá; rút ngắn chu kỳ sống…[18].
17
Theo các nhà khoa học, tính chống chịu của đậu xanh nói riêng và tính
chống chịu của thực vật nói chung rất phức tạp liên quan đến đặc điểm sinh lý
hoá sinh và do nhiều gen quy định. Đã có nhiều cơ chế phân tử liên quan đến
tính chịu hạn ở thực vật đã được biết đến như: vai trò của bộ rễ, khả năng điều
chỉnh áp suất thẩm thấu, abscisic acid (ABA), aquaporin, các nhân tố ức chế
protease, các gen điều khiển phiên mã và các gen chức năng (HSP, LEA,
LTP, PLC...) [10].
Vai trò của bộ rễ: khả năng nhận nước của cây phụ thuộc vào bộ rễ.
Nhiều nghiên cứu cho thấy cây nào có bộ rễ dài, khoẻ, mập thì có khả năng
hút nước ở những tầng đất sâu, vì vậy cây nào có bộ rễ dài sẽ có khả năng lấy
được nhiều nước. Ở cây đậu xanh, hình thái rễ rất đa dạng. Các giống đậu
xanh địa phương thường có bộ rễ dài hơn các giống khác.
Khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu là một đặc tính của tế bào khi bị
mất nước do hạn, nóng, lạnh... Trong điều kiện hạn, áp suất thẩm thấu tăng
lên giúp rễ cây nhận được một lượng nước rất nhỏ còn lại trong đất. Các chất
và các gen tương ứng có khả năng tạo áp suất thẩm thấu cao trong tế bào để
cạnh tranh nước với môi trường xung quanh bao gồm: ion K
+
; các amino acid
như prolin, estonine; các chất đường như sucarose, fructant, manitol, pinitol
và các chất khác như glycine betain, β- alanin betain. Các chất này có khả
năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu nhờ khả năng hút nước và giữ nước vào tế
bào hoặc ngăn chặn sự xâm nhập của ion Na
+
[19].
Abscisic acid (ABA) là hormone thực vật liên quan đến sự điều chỉnh
sinh lý, sinh trưởng và phát triển đáp ứng với môi trường của thực vật bậc
cao. ABA chủ yếu được tổng hợp ở rễ cây do phản ứng với stress nhờ gen cis-

epoxycarotenoids với sự tham gia của enzyme 9-cis-epoxycarotenoid
dioxygenase [46]. ABA đóng vai trò then chốt trong nhiều quá trình của tế
bào thực vật như: sự phát triển của hạt, sự ngủ, sự nẩy mầm, sinh trưởng phát
triển và đáp ứng với stress của môi trường. Đối với stress hạn, ABA có vai trò
điều chỉnh sự trao đổi nước trong cây, hạn chế sự mất nước làm cây thích
18
nghi với điều kiện khô hạn. Về cơ chế tác động người ta cho rằng ABA làm
biến đổi điện thế hoá qua màng và do đó điều tiết sự tiết ion K
+
[38].
Các nhân tố gây ức chế protease: khi stress hạn xảy ra, các protein bị
biến tính và bị tổn thương. Cystein protease tham gia loại bỏ các protein biến
tính. Quá trình này có thể bị cản trở bởi các chất ức chế cystein protease gọi là
cystatin [42].
Các gen điều khển phiên mã có khả năng hoạt hóa hoặc ức chế biểu
hiện của các gen chức năng thông qua việc bám vào trật tự DNA điều khiển
(cis acting element) trên vùng khởi động gen (promotor) và tương tác với
RNA polymerase tạo thành phức hợp khởi đầu quá trình phiên mã các gen
chức năng. Có nhiều nhân tố khởi đầu phiên mã điều khiển tính chịu hạn đã
được quan tâm nghiên cứu như: DREB, ABEB, NAC, MYB, MYC, bZIP,
WRKY. Mỗi nhóm nhân tố khởi đầu phiên mã tham gia điều khiển tính chịu
hạn có trật tự cis acting element riêng biệt và promotor trên mỗi gen chức
năng chứa một hay nhiều nhóm nhân tố khởi đầu phiên mã.
Các gen chức năng có liên quan đến khả năng chịu hạn được biết đến
là: protein sốc nhiệt (Heat Shock Protein - HSP), môi giới phân tử (Molecular
chaperone), protein LEA (Late embryogenesis abundant), Phospholipase C
(PLC), protein vận chuyển lipit (LTP).
HSP được tổng hợp trong quá trình sinh trưởng, các giai đoạn biệt hóa
các mô, thời kì sinh sản, đặc biệt được tổng hợp khi tế bào gặp điều kiện cực
đoan như hạn, nhiệt độ cao, muối cao. Sự xuất hiện của HSP có chức năng

ngăn cản hoặc sửa chữa sự phá hủy của stress. Dựa vào khối lượng phân tử
người ta chia HSP ở thực vật thành 6 nhóm khác nhau: HSP 8.5, 20, 60, 70,
90, 110kDa. Trong nhóm HSP có rất nhiều đại diện của chất môi giới phân tử
(MGPT) (HSP70, HSP60) nhưng cũng có những HSP không phải là môi giới
phân tử, ví dụ HSP 8,5 kDa (Ubiquitin).
Các MGPT là yếu tố chìa khóa tham gia nội cân bằng tế bào trong các
điều kiện sinh trưởng cực thuận và đối lập. Chức năng chính của MGPT là
19
tham gia tạo cấu trúc không gian đúng cho protein mới được tổng hợp,
chuyển protein qua màng, duy trì cấu trúc đặc hiệu của protein, ngăn chặn sự
hủy hoại protein chưa tạo cấu trúc không gian, khởi đầu cho sự phân hủy
protein biến tính [10]. MGPT có 5 họ chính là: HSP 70 (Dnak), HSP 60
(Chaperonin), HSP 90, HSP 100 và sHSP (small HSP) trong đó có hai họ môi
giới phân tử được nghiên cứu nhiều nhất là chaperonin và HSP70. HSP70 đã
được phân lập ở đậu xanh [28].
Protein LEA cũng được chú ý trong điều kiện thực vật bị stress do thiếu
nước [32], [50], [58], [59]. Protein LEA được phân chia thành 5 nhóm chính
trên cơ sở chuỗi trình tự amino acid của nó: nhóm 1-D19, nhóm 2-D11
(dehydrin), nhóm 3-D7, nhóm 4-D113, nhóm 5-D29 [30]. Protein LEA thực
hiện các chức năng như: cô lập ion, bảo vệ protein màng tế bào, phân hủy
protein biến tính, điều chỉnh áp suất thẩm thấu. Nó không những chỉ được
phát hiện trong hạt mà còn trong các mô tăng trưởng khi cây bị stress do thiếu
nước, do mặn, và do lạnh. Sự biểu hiện của protein LEA và đặc điểm cấu trúc
đại phân tử của nó cho thấy nó có vai trò trong bảo vệ cây trồng chống chịu
sự mất nước [57]. Protein LEA được tạo ra hàng loạt trong giai đoạn muộn
của quá trình hình thành phôi.
Gen PLC liên quan đến sự huy động canxi. Canxi hoà tan được xem
như chất truyền tín hiệu thứ cấp truyền đến ngoại bào kích thích các tế bào có
phản ứng bảo vệ. Sự truyền tín hiệu canxi trong suốt stress hạn và muối đã
được nghiên cứu nhiều ở thực vật bậc cao [40].

Gen LTP liên quan đến quá trình sinh tổng hợp biểu bì. Khi bị stress
hạn, LTP được kích thích tăng tổng hợp ngoại bì giúp thực vật có thể giảm
mất nước nhờ tăng độ dày của lớp vỏ ngoài [27]. Ở đậu xanh, gen LTP cũng
đã được phân lập và công bố trên ngân hàng gen quốc tế [34].
1.2.3. Protein vận chuyển lipid (LTP) và gen LTP (Lipid Transfer Protein)
1.2.3.1. Protein LTP
20
LTP là tên thường gọi của một nhóm protein có khả năng vận chuyển
lipid, có liên quan đến tính chịu hạn ở thực vật.
LTP có khả năng tạo phức với một số acid béo và xúc tác cho quá trình
vận chuyển lipid qua màng tế bào, giúp hạn chế sự mất nước. LTP được gắn
tại một vị trí cố định trên màng sinh chất của tế bào, nó có đặc điểm như một
receptor vận chuyển acid béo qua màng tế bào. Phức hợp LTP - linoleic acid
đã được chiết ra từ màng sinh chất của cây thuốc lá trong điều kiện gây hạn
nhân tạo [39].
Bên cạnh đó, LTP còn liên quan đến quá trình hình thành tầng cutin của
tế bào thực vật, làm tăng khả năng chống chịu và hạn chế tác hại của stress
muối và stress hạn. Nghiên cứu trên cây đậu xanh, Liu K.H. và cs (2003)
nhận thấy rằng hàm lượng mRNA của LTP sẽ tăng cao trong điều kiện stress
muối, stress hạn hay khi hàm lượng ABA ngoại bào tăng cao [41].
LTP còn tham gia vào hệ thống miễn dịch của thực vật. Nghiên cứu trên
cây lúa, Blilou I. và cs (2005) nhận thấy tốc độ tổng hợp LTP tăng nhanh khi có
sự xâm nhập của loài nấm Glomus mosseae vào biểu bì rễ và giảm khi nấm tấn
công vào khoảng gian bào [24]. Carvalho A.O. và cs (2006) khi nghiên cứu trên
cây đậu đũa (Vigna unguiculata (L.) Walp) nhận thấy LTP là peptide kháng khuẩn
tham gia vào việc bảo vệ cây chống lại các mầm bệnh [26].
LTP được chia thành hai dạng khác nhau về khối lượng phân tử. Dạng
thứ nhất có khối lượng phân tử khoảng 9 kDa (LTP1) và dạng thứ hai có khối
lượng phân tử khoảng 7 kDa (LTP2). Cả LTP1 và LTP2 đều có một vùng bảo
thủ gồm 8 amino acid loại cystatin và 4 amino acid loại prolin [36].

1.2.3.2. Gen LTP
LTP thuộc họ gen pathogenesis relate, có khả năng tổng hợp ra protein
thúc đẩy quá trình vận chuyển phospholipid giữa các màng. Vai trò của LTP
là tham gia vào cấu tạo cutin, phản ứng bảo vệ chống bệnh của cây và đáp
ứng sự thích nghi biến đổi của môi trường [25], [29], [35].
Khi gặp các điều kiện cực đoan của môi trường, các nhân tố như
hormone, các quá trình trao đổi ion, các con đường truyền tín hiệu… sẽ điều
khiển gen LTP hoạt động và tổng hợp nên các sản phẩm protein tương ứng
21
nhằm giúp cho cây tăng khả năng chống chịu stress, chịu bệnh… Những phân
tử protein này thường bao gồm nhiều đặc điểm chung như: điểm đẳng điện
cao, khối lượng phân tử khoảng 9,12 kDa và sự có mặt của 8 phân tử cystein
làm nhiệm vụ tạo ra 4 cầu nối disulfide [36].
LTP đã được chứng minh trong việc ngăn chặn nguồn gây bệnh như:
Pseudomonas solanacearum, Clavibacter michiganasis, Fuarium solani,
Rhizoctonia solani, Trichodelmar viride và Cercospora beticola [36], [45].
Trong những năm gần đây, gen LTP đã được nghiên cứu ở một số thực vật
như: Arabidopsis thaniana L. [22], Paphanus sativus L. [53], Zea mays L. [49],
[51], Capsicum annuum [55], Vigna radiata L. [41], Triticum L. [44], Daucus
carota L. [52], Nicotiana tabacum L. [43], [48], Oryza sativa L. [56], Valencia
orange [60], Lycopesium esculentum [54].
LTP có khả năng xúc tác tới sự vận chuyển phospholipid giữa các lớp
màng của tế bào. LTP có thể hỗ trợ việc tạo ra các lớp sáp hoặc lớp biểu bì
giúp thực vật bảo vệ, phản ứng và đáp ứng lại những thay đổi của môi trường
[23], [25].
Hiện nay, LTP ở thực vật được biết có 4 nhóm lớn:
- Nhóm I: Bao gồm các CsLTP chứa các bộ mã hoá protein
đã được cô lập và biểu hiện ở trong quả.
- Nhóm II: Bao gồm những gen LTP tổng hợp ra protein được
biểu hiện trong hạt.

- Nhóm III: Bao gồm các gen LTPs tổng hợp ra protein được
biểu hiện trong mô lá. Chúng được tạo ra khi có những ảnh
hưởng của môi trường như tình trạng khô hạn và các tác
nhân có thể gây bệnh.
- Nhóm IV: Bao gồm các gen LTP tổng hợp nên các chuỗi
polypeptide được cô lập và biểu hiện trong hoa [36], [45].
Ở cây đậu xanh, Liu K.H. và cs (2003) đã phân lập thành công hai dạng
khác nhau của gen LTP và đặt tên là Vrltp1 và Vrltp2 [41]. Trình tự các
amino acid suy diễn của Vrltp1 và Vrltp2 đều có hai đoạn pentapeptide mang
tính bảo thủ cao ở thực vật. Trong hạt đậu xanh ở giai đoạn nảy mầm, nhóm
nghiên cứu chỉ tìm thấy mRNA của Vrltp1, còn trong mô sinh dưỡng thì
22
mRNA của cả Vrltp1 và Vrltp2 chỉ tìm thấy ở lá và thân, không có ở chóp rễ.
Các tác giả cũng nhận thấy, khi gặp điều kiện bất lợi như stress hạn hay muối
hoặc khi hàm lượng ABA ngoại bào quá cao sẽ làm tăng tốc độ phiên mã của
mRNA Vrltp1 và Vrltp2. Từ đó đưa ra giả thuyết rằng gen LTP có ảnh hưởng
rõ rệt tới sự phát triển các mô non và rất có thể đóng vai trò quan trọng trong
sự thích nghi của thực vật trong điều kiện khô hạn.
23
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU
Hạt của 13 giống đậu xanh do Viện nghiên cứu Ngô cung cấp và một số
giống thu thập tại các tỉnh Bắc Giang, Thái Nguyên, Lạng Sơn, Hà Nội, Hà
Giang. Danh sách các giống đậu xanh nghiên cứu được trình bày trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Các giống đậu xanh nghiên cứu
TT Tên
giống
Nguồn gốc
1 ĐXVN 4 Do Viện NC Ngô lai tạo giữa giống Mungo 113 với ĐX 113
2 ĐXVN 5 Do Viện NC Ngô lai tạo giữa giống ĐX 04 với ĐX 113

3 VN 99-3 Do Viện NC Ngô lai tạo giữa giống VN 93-1 với Vigna mungo
4 044/ĐX06 Do Viện NC Ngô lai tạo giữa giống ĐX 044 với ĐX 06
5 TN Đồng Hỷ - Thái Nguyên
6 LS Bắc Sơn - Lạng Sơn
7 HN 1 Ba Vì - Hà Nội
8 HN 2 Mỹ Đức - Hà Nội
9 BG 1 Việt Yên - Bắc Giang
10 BG 2 Yên Dũng - Bắc Giang
11 BG 3 Sơn Động - Bắc Giang
12 HG 1 Bắc Quang - Hà Giang
13 HG 2 Hoàng Su Thùy - Hà Giang
24
Hình 2.1. Hạt của các giống đậu xanh nghiên cứu
2.2. HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ, ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
Các loại hóa chất: các hoá chất phục vụ nghiên cứu phân lập gen do các
hãng Invitrogen, Fermentas, Bioneer cung cấp.
Các loại thiết bị máy móc: các thiết bị máy móc phục vụ sinh học phân
tử như máy PCR, máy li tâm, máy soi gel, bộ điện di, box cấy, máy lắc, lò vi
sóng, cân điện tử, tủ sấy, tủ lạnh, bể ổn nhiệt, máy xác định trình tự nucleotide
tự động, pipetman, máy làm khô DNA (Speed Vac) và một số thiết bị, máy
móc cần thiết khác.
Địa điểm nghiên cứu: Các thí nghiệm được tiến hành tại Bộ môn Sinh
học phân tử và Công nghệ gen - Viện Khoa học Sự sống - Đại học Thái
Nguyên; Phòng thí nghiệm Di truyền và Sinh học hiện đại - Khoa Sinh - Kỹ
thuật Nông nghiệp - Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên và
Phòng Miễn Dịch học - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học và Công
nghệ Việt Nam.
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
25
VN 99-3 LS 044/ĐX06

BG 1
HG 2
BG 2
22
BG 3
ĐXVN 5
HN 2
HG 1
ĐXVN 4
TN
HN 1