Phát triển hệ thống tái sinh ở cây đậu xanh (vigna radiata (l.) wilczek) phục vụ chọn dòng chịu hạn và chuyển gen

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM


NGUYỄN THỊ LUYỆN


PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG TÁI SINH Ở CÂY ĐẬU XANH
(VIGNA RADIATA (L.) WILCZEK) PHỤC VỤ CHỌN DÒNG
CHỊU HẠN VÀ CHUYỂN GEN


LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60.42.70




Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Chu Hoàng Mậu







THÁI NGUYÊN – 2009
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM




NGUYỄN THỊ LUYỆN


PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG TÁI SINH Ở CÂY ĐẬU XANH
(VIGNA RADIATA (L.) WILCZEK) PHỤC VỤ CHỌN DÒNG
CHỊU HẠN VÀ CHUYỂN GEN




LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC








THÁI NGUYÊN – 2009

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
THAI NGUYEN UNIVESSITY
THE COLLEGE OF EDUCATION
---------------------------




SUMMARY OF MASTER ESSAY FOR EDUCATION SCIENCE



NGUYEN THI LUYEN



DEVELOPMENT OF REGENERATION ON MUNG BEAN
TOCHOOSE THE DROUGHT – RESISTANT STRAIN AND
TRANSGENATION


Specialyty: GENETICS
Code: 60.42.70

Teacher: Prof.PhD. CHU HOANG MAU















THAI NGUYEN – 2009
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Công trình được hoàn thành tại:
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM - ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN


Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS CHU HOÀNG MẬU

Phản biện 1...................................................................
……………………………………………


Phản biện 2...................................................................
…………………………………………...










Luận văn sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận văn
Họp tại: Trường Đại học Sư phạm - ĐHTN

Ngày tháng năm 2009

Có thể tìm hiểu luận văn tại thư viện Đại học Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
------------------------------



NGUYỄN THỊ LUYỆN


PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG TÁI SINH Ở CÂY ĐẬU XANH
(VIGNA RADIATA (L.) WILCZEK) PHỤC VỤ CHỌN DÒNG
CHỊU HẠN VÀ CHUYỂN GEN






Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số : 60.42.70

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

















Thái nguyên - 2009
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
i

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu,
kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố.


Tác giả luận văn


Nguyễn Thị Luyện













Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
ii
Lời cảm ơn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn PGS.TS. Chu Hoàng Mậu đã tận tình hướng
dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu
này.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Sư phạm - Đại
học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Sinh – Kỹ thuật Nông nghiệp và các
thầy cô giáo, cán bộ của Khoa đã quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học
tập và hoàn thành luận văn. Tôi xin cảm ơn TS. Nguyễn Thị Tâm, và các chị Vi
Kiều Liên và Nguyễn Thị Thủy (Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào), xin cảm
ơn Bộ môn hệ thống canh tác - Viện Ngô Trung ương đã cung cấp các giống
đậu xanh làm vật liệu cho các thí nghiệm của đề tài.

Tác giả luận văn


Nguyễn Thị Luyện








Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
iii
MỤC LỤC

Trang
Lời cam đoan.................................................................................................. i

Lời cảm ơn.................................................................................................... ii
Mục lục........................................................................................................... iii
Những chữ viết tắt.......................................................................................... vi
Danh mục các bảng......................................................................................... vii
Danh mục các hình......................................................................................... viii
Mở đầu..............................................................................................................
1
Chương 1. Tổng quan tài liệu...........................................................................
3
1.1. Sơ lược về cây đậu xanh.............................................................................
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại........................................................................
1.1.2. Tình hình sản xuất đậu xanh trên thế giới và ở Việt Nam…………….
3
3
4
1.2. Ứng dụng công nghệ tế bào thực vật trong cải tiến giống cây trồng..........
7
1.2.1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật....................................
1.2.1.1. Cơ sở tế bào học của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật………...
1.2.1.2. Ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng đến quá trình nuôi cấy
mô tế bào thực vật…………………………………………………………….
7
7

8
1.2.2. Hệ thống nuôi cấy để chọn dòng……………………………………….
10
1.2.3. Phương thức chọn dòng………………………………………………. .
12
1.2.4. Tái sinh cây…………………………………………………………….

13
1.3. Nghiên cứu chọn giống cây trồng bằng kỹ thuật chọn dòng soma và hệ
thống tái sinh ở thực vật và cây đậu xanh........................................................
1.3.1. Nghiên cứu chọn giống cây trồng bằng kỹ thuật chọn dòng tế bào soma……..
1.3.2. Nghiên cứu hệ thống tái sinh ở thực vật và ở cây đậu xanh ………………

15
15
16
Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu…………………………..
18
2.1. Vật liệu nghiên cứu………………………………………………………..
18
2.1.1.Vật liệu thực vật………………………………………………………….
18
2.1.2. Hoá chất và thiết bị……………………………………………………..
19
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
iv
2.2. Phương pháp nghiên cứu............................................................................
19
2.2.1. Nhóm phương pháp nuôi cấy in vitro......................................................
20
2.2.2. Phương pháp đánh giá khả năng chịu mất nước của mô sẹo....................
2.2.2.1. Phương pháp xử lý mô sẹo bằng thổi khô ...........................................
2.2.2.2. Chọn lọc mô sẹo sống sót sau khi xử lý bằng thổi khô và tái sinh cây.............
2.2.2.3. Tạo cây hoàn chỉnh từ mô sẹo chọn lọc………………………………
2.2.2.4. Phương pháp ra cây……………………………………………………
22
22

22
23
23
2.2.3. Phương pháp tạo đa chồi từ mắt lá mầm………………………………..
24
2.2.4. Phương pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu.......................................
24
Chương 3. Kết quả và thảo luận……………………………………………..
26
3.1. Hệ thống tái sinh cây đậu xanh từ mô sẹo………………………………..
26
3.1.1. Ảnh hưởng nồng độ các chất đến kết quả khử trùng hạt………………..
26
3.1.2. Ảnh hưởng của các chất 2.4D, BAP,GA3, NAA đến khả năng tạo
mô sẹo và tái sinh cây từ mô sẹo.....................................................................
3.1.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ 2,4 D đến khả năng tạo mô sẹo từ phôi đậu xanh..............
3.1.2.2. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh cây từ mô sẹo phôi đậu xanh.............
3.1.2.3. Ảnh hưởng của GA3 đến khả năng kéo dài chồi của đậu xanh.............
3.1.2.4. Ảnh hưởng của α-NAA đến khả năng ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh...................

26
26
31
34
35
3.1.3. Nhận xét về môi trường nuôi cấy mô cây đậu xanh……………………
37
3.2. Độ mất nước và khả năng chịu mất nước của mô sẹo phôi đậu xanh
các giống nghiên cứu …………………………………………………………

37
3.2.1.Mức độ mất nước của mô sẹo phôi đậu xanh của các giống nghiên cứu...
37
3.2.2. Khả năng chịu mất nước của mô sẹo phôi đậu xanh sau khi xử lý bằng
thổi khô……………………………………………………………………….

39
3.2.3. Nhận xét về khả năng chịu mất nước của mô sẹo sau khi xử lý bằng
thổi khô của các giống đậu xanh nghiên cứu…………………………………

42
3.3. Kết quả tái sinh cây đậu xanh từ mắt lá mầm....................................................
43
3.3.1.Môi trường nảy mầm của hạt……………………………………………..
43
3.3.2. Môi trường tạo đa chồi…………………………………………………
43
3.3.3. Môi trường kéo dài chồi............................................................................ 45
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
v
3.3.4. Môi trường ra rễ ......................................................................................... 46
3.3.5. Ra cây và chế độ chăm sóc ...................................................................... 46
3.3.6. Nhận xét về môi trường tái sinh từ mắt lá mầm........................................ 47
Kết luận và đề nghị............................................................................................. 48
Công trình công bố liên quan đến luận văn………………………………... 49
Tài liệu tham khảo............................................................................................
50

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
vi
NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

2,4D 2,4-Dichlorphenoxyacetic acid (Axit 2,4-Dichlorphenoxyacetic)
ADN Axit deoxyribonucleic (Deoxiribonucleic acid)
ASTT áp suất thẩm thấu
BAP 6 - Benzyl Amino Purin
cs Cộng sự
đvms đơn vị mô sẹo
MS Murashige – Skoog

α-NAA Naphthyl acetic acid (Axit naphthyl acetic)
IAA Axit ß – indol axetic

















Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
vii
DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng Tên bảng Trang
2.1
Đặc điểm các giống đậu xanh nghiên cứu
18
3.1
Khả năng tạo mô sẹo của các giống đậu xanh (%)
27

3.2
Hình dạng mô sẹo của các giống đậu xanh
28
3.3 Tốc độ sinh trưởng mô sẹo của các giống đậu xanh 29
3.4
Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tái sinh cây từ
mô sẹo phôi đậu xanh (%)
32
3.5 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo chồi ở đậu xanh 33
3.6
Ảnh hưởng củ α-NAA tới khả năng ra rễ của cây tái sinh
từ mô sẹo phôi đậu xanh
36
3.7
Độ mất nước của mô sẹo phôi đậu xanh sau khi xử lý bằng
thổi khô (%)
38
3.8
Tỷ lệ sống sót (%) của mô sẹo phôi đậu xanh sau thổi khô
1 tuần nuôi phục hồi
39
3.9
Khả năng tái sinh cây từ mô sẹo phôi đậu xanh sống sót sau khi
xử lý bằng thổi khô
41
3.10
Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo đa chồi ở đậu xanh
44

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
viii

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình Tên hình Trang
2.1 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 19
3.1 Ảnh mô sẹo phôi đậu xanh nuôi cấy trên môi trường có bổ sung 2,4D 31
3.2 Hình ảnh tái sinh đậu xanh trên môi trường bổ sung 3mg/l BAP 34
3.3 Hình ảnh kéo dài chồi đậu xanh trên môi trường bổ sung GA3 35
3.4 Hình ảnh cây đậu xanh ra rễ trên môi trường bổ sung 0,3mg/l α-NAA 36
3.5 Độ mất nước của mô sẹo phôi đậu xanh sau xử lý bằng thổi khô 38
3.6 Tỷ lệ sống sót (%) của mô sẹo phôi đậu xanh sau thổi khô và nuôi
phục hồi trên môi trường tái sinh

40
3.7 Khả năng tái sinh cây của các mô sẹo phôi đậu xanh sống sót
sau khi xử lý bằng thổi khô

41
3.8 Tái sinh mô sẹo sau khi xử lý bằng thổi khô 42
3.9 Hạt đậu xanh nảy mầm sau 3 ngày (A, B), hạt đậu xanh được tách
ra để tạo đa chồi (C, D)

43
3.10 Hình ảnh tạo đa chồi từ mắt lá mầm 45

3.11 Hình ảnh kéo dài chồi đậu xanh trên môi trường bổ sung GA3 46
3.12 Hình ảnh cây đậu xanh ra rễ trên môi trường bổ sung 0,3mg/l α- NAA 46
3.13 Cây đậu xanh tái sinh được trồng trong chậu. 47



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
1
MỞ ĐẦU
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Cây đậu xanh Vigna radiata (L.) Wilczek là một loại cây đậu đỗ quan
trọng của nền nông nghiệp châu Á. Cây đậu xanh chủ yếu được trồng lấy hạt để
chế biến thức ăn như giá đỗ, chè đậu xanh, dịch cốt đậu xanh, bánh đậu
xanh…Không chỉ được coi như nguồn thức ăn mà hạt đậu xanh còn được coi
như một thứ dược liệu có tác dụng giải độc thanh nhiệt, bớt sưng phù, điều hoà
ngũ tạng chữa bệnh… cho con người. Hạt đậu xanh là một mặt hàng nông sản
xuất khẩu có giá trị. Ngoài ra, sản phẩm phụ của cây đậu xanh còn được dùng
làm thức ăn cho gia súc. Trồng cây đậu xanh còn có tác dụng chống xói mòn và
cải tạo đất. Hạt đậu xanh chứa khoảng 25,98% protein, 1,3% lipit, 4,79% chất xơ,
62,12% hydratcacbon (trong đó có 51,8% tinh bột), các loại vitamin A, B
1,
B
2,
C
và một số nguyên tố khoáng như: K, Na, Mg, P, Fe, Ca…
Trên thế giới đậu xanh được trồng nhiều ở Ấn Độ, Thái Lan, Philippin,
Myanma, Bangladesh, Srilanca… với năng suất từ 18 – 20 tạ/ha.
Ở Việt Nam do nhiều nguyên nhân khác nhau nên từ trước tới nay đậu xanh
được trồng chưa nhiều, chủ yếu là xen canh, luân canh tăng vụ. Chỉ trong thời
gian gần đây đậu xanh mới được quan tâm phát triển. Chương trình chọn tạo

giống đậu xanh ở nước ta hiện nay là hướng tới mục tiêu tạo giống đậu xanh có
tiềm năng năng suất cao và ổn định, sinh trưởng mạnh, thời gian sinh trưởng
ngắn, chín tập trung, chất lượng hạt cao, có khả năng chống chịu hạn, úng, sâu
bệnh tốt và chịu thâm canh.
Trong công tác chọn giống cây trồng nói chung và chọn giống đậu xanh
nói riêng các nhà khoa học đã sử dụng phương pháp đột biến thực nghiệm (Chu
Hoàng Mậu, 2001) [10] hoặc lai giống (Trần Đình Long và Lê Khả Tường,
1998) [8] để tạo nguồn biến dị làm nguyên liệu cho quá trình chọn lọc. Một
trong các kỹ thuật được quan tâm ứng dụng vào chọn giống đậu xanh là sử dụng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
2
công nghệ tế bào thực vật và xây dựng hệ thống tái sinh phục vụ chuyển gen
nhằm cải tiến, nâng cao khả năng chống chịu của cây đậu xanh (Jayanti Sen và
Spra Guha Mukherjee (1998) [31], Ignacimuthu và Franklin (1999) [30], Renato
và cs (1999, 2001) [41], [42], Mai Trường và cs (2001) [15], Sita và cs (2006)
[43], Kaviraj và cs (2006) [33], Sonia và cs (2007) [44].
Những lý do trên đây là cơ sở để chúng tôi xây dựng đề tài cho luận văn
thạc sĩ là: “Phát triển hệ thống tái sinh ở cây đậu xanh (Vigna radiata (L.)
Wilczek) phục vụ chọn dòng chịu hạn và chuyển gen”
2. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU
- Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật vào việc chọn dòng tế bào chịu
mất nước ở đậu xanh.
- Xác định hệ thống tái sinh ở đậu xanh phục vụ chuyển gen.
3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Nghiên cứu điều kiện khử trùng hạt sử dụng trong tái sinh cây từ mô sẹo và tạo
đa chồi từ mắt lá mầm.
- Phân tích ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tạo mô
sẹo, tái sinh cây từ mô sẹo, kéo dài chồi, ra rễ và tạo cây đậu xanh.
- Đánh giá khả năng chịu mất nước của mô sẹo phôi đậu xanh dưới tác dụng của
thổi khô.

- Khảo sát môi trường tạo đa chồi từ mắt lá mầm, môi trường kéo dài chồi, ra rễ
và tạo cây hoàn chỉnh.





Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
3
Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. SƠ LƢỢC VỀ CÂY ĐẬU XANH
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại
Cây đậu xanh là loại cây trồng có giá trị kinh tế cao, có nguồn gốc từ Ấn
Độ và được phân bố rộng rãi ở các nước châu Á.
Cây đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek) thuộc ngành Magnoliopyta,
lớp Magnoliopsida bộ Fabales, họ đậu (Fabaceae), chi Vigna. Chi Vigna là một
trong những chi lớn của họ đậu, bao gồm 7 chi phụ là: Vigna, Haydonia,
Plectropic, Macrohynchus, Ceratotropic, Lasionspron, Sigmoidotrotopis. Đậu
xanh theo quan điểm lấy hạt bao gồm các loại thuộc hai chi phụ là Vigna và
Ceratotropic. Chi phụ Ceratotropic còn được gọi là nhóm đậu châu Á mang
những đặc điểm điển hình thể hiện ở mức độ cao nhất cho Vigna. Năm 1970,
Vercourt đã công bố 5 trong số 16 loài của Ceratotropic đã được thuần hoá là:
Đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek), Đậu gạo (Vigna Umbellata(thumb), đậu
adzukia (Vigna anguilaris (Willd), đậu ván (Vigna aconiti folia (Jacq)), Vigna
trilobata (L) Wildzek.
Thân đậu xanh thuộc loại thân thảo, mọc thẳng đứng hoặc hơi nghiêng,
thân yếu có lớp lông mịn màu nâu sáng, chiều cao trung bình khoảng 40 – 70
cm, đường kính trung bình từ 8 – 12 mm. Thân cây gồm 7 – 8 đốt. Thân phân
cành muộn và có trung bình từ 10 -12 cành, một số giống có từ 9 – 10 cành.

Lá thuộc loại lá kép mọc cách, lá chét có ba thuỳ với các hình dạng như
ovan, thuôn dài, lưỡi mác, chẻ thuỳ. Trên thân chính của cây có từ 7 – 8 lá. Số
lá, hình dạng lá có thể thay đổi tuỳ theo giống, đất trồng và thời vụ. Diện tích
của các lá tăng từ các lá ở phía dưới lên các lá ở giữa thân rồi giảm dần lên các
lá phía ngọn. Hoa đậu xanh là hoa lưỡng tính mọc thành chùm trên các trục hoa.
Mỗi trục hoa có thể phát triển thành hai hàng hoa mọc đối nhau, các hoa trên
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
4
hàng xếp liên tục với nhau tạo cho hoa có hình dạng co rút. Hoa đậu xanh có
màu tím hoặc màu vàng nhạt với công thức hoa là K5C5A10G1. Đậu xanh là
loài thực vật tự thụ phấn, tỷ lệ hoa hình thành quả từ 10 – 25%.Thụ phấn xong
tràng hoa rụng, quả hình thành và phát triển.
Quả đậu xanh thuộc loại quả giáp, hình trụ, dạng tròn, hơi dẹp, dài từ 8 –
10 cm, đường kính từ 4 – 6 mm, có hai gân nổi rõ dọc theo hai bên cạnh quả.
Quả chín có màu vàng, nâu hoặc đen. Cũng như các bộ phận khác trên cây đậu
xanh (thân, cành, cuống, lá) trên vỏ quả đậu xanh thường bao phủ một lớp lông
dài khoảng 0,3 – 0,4 mm. Những giống thuộc nhóm kháng virus gây bệnh khảm
vàng và bệnh sâu đục quả thì mật độ lông khá dầy, mầu trắng. Mỗi cây có từ 8 –
35 quả, mỗi quả có từ 8 – 15 hạt.
Hạt đậu xanh có hình dạng khá phong phú như hình trụ, hình trụ hơi cạnh,
ovan, tròn, thoi, tam giác... Màu vỏ hạt có thể là xanh lục, xanh mỡ (xanh sáng),
xanh tối (nâu), vàng rơm... Ruột hạt có màu trắng, vàng hay xanh nhạt khối
lượng 1000 hạt có thể dao động từ 25 – 70g.
Rễ đậu xanh thuộc loại rễ cọc bao gồm rễ cái và rễ con, rễ cái sâu khoảng
20 – 30 cm, có khi sâu tới 70 – 100 cm. Đặc biệt do rễ đậu xanh có khả năng
sống cộng sinh với vi khuẩn cố định đạm Rhizobium nên từ các kẽ nhánh rễ,
nhất là sát rễ cái hình thành các nốt sần. Các nốt sần có khả năng cố định Nitơ
thường có kích thước 4 – 5 mm, có màu đỏ, hồng hay nâu. Nốt sần bé hơn, dạng
que, ruột màu xanh hay đen đều không có hoạt tính. Hạn chế của bộ rễ cây đậu
xanh là dễ bị thối khi gặp úng.

1.1.2. Tình hình sản xuất đậu xanh trên thế giới và ở Việt Nam
Theo kết quả điều tra củatrung tâm nghiên cứu và phát triển rau quả châu
Á (AVRCD), hàng năm trên thế giới có khoảng 20 nước sản xuất đậu xanh,
trong đó Thái Lan, Ấn Độ, Trung Quốc, Pakistan, Philippin, Srilanca... được coi
là những trọng điểm về diện tích, năng suất và sản lượng đậu xanh. Trong những
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
5
năm 1950 Trung Quốc là nước sản xuất đậu xanh, với diện tích gieo trồng là
1,64 triệu ha và sản lượng là 800.000 tấn, tuy nhiên năng suất còn thấp và chỉ
đạt khoảng 488 kg/ ha. Sự sản xuất đậu xanh của Trung Quốc suy giảm qua
những năm 1960 và những năm 1970. Sau đó chính phủ Trung Quốc đã có
những thay đổi về chính sách nông nghiệp liên quan đến sản xuất đậu xanh, áp
dụng khoa học kỹ thuật tiên tiến vào trong sản xuất nên sản xuất đậu xanh lại
được phục hồi vào những năm 1980 và đến năm 2000, diện tích trồng là 772000
triệu ha, sản lượng đạt 891000 triệu tấn và năng suất bình quân đạt 1154 kg / ha.
Trong đó năm 1995 giá trị xuất khẩu đậu xanh đạt ở mức 104 triệu USD (72%
tổng giá trị xuất khẩu nông nghiệp) và năm 1999 đạt ở mức rất cao tới 109 triệu
USD (93%).
Ở Srilanca, tình hình sản xuất đậu xanh từ năm 1997 đến năm 2001 có xu
hướng giảm: về diện tích trồng từ 16.636 ha (1997) xuống 10.976 ha (2001), sản
lượng từ 15.000 triệu tấn (1997) xuống 10.072 triệu tấn (2001), và tăng nhập
khẩu từ 2091 triệu tấn (1997) lên 8916 triệu tấn (2001).
Mặc dù diện tích gieo trồng và sản lượng đậu xanh hàng năm ở Srilanca
khá lớn song vẫn chưa đáp ứng được nhu cầu tiêu thụ lớn ở trong nước. Do đó
lượng đậu xanh nhập khẩu có xu thế tăng nhanh từ năm 2000, 2001. Các giống
đậu xanh được gieo trồng phổ biến như Harsha năng suất trung bình 1200 kg/ha,
MI-5 năng suất trung bình 1500 kg/ha, Ari năng suất trung bình 1700 kg/ha.
Ở Việt Nam, cây đậu xanhđược gieo trồng ở nhiều địa phương trên cả
nước. Căn cứ vào đặc điểm địa hình, điều kiện khí hậu...có thể phân chia các
vùng trồng cây đậu xanh như sau:

- Vùng núi phía Bắc bao gồm các tỉnh Sơn La, Lai Châu, Hoà Bình, Cao Bằng,
Bắc Kạn, Thái Nguyên, Tuyên Quang và Quảng Ninh. Thời vụ gieo trồng từ
tháng 4,5 thu hoạch tháng 7,8 là thời điểm có khí hậu nómg ẩm thuận lợi cho
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
6
sinh trưởng của cây. Tập quán canh tác ở đây đơn giản, ít thâm canh, năng suất
thấp.
- Vùng Đồng bằng, Trung du Bắc bộ bao gồm các tỉnh Hà Tây, Vĩnh Phúc, Phú
Thọ, Bắc Ninh, Bắc Giang, Hà Nội, Hải Dương, Hưng Yên, Hải Phòng, Hà
Nam, Ninh Bình, Thái Bình và Thanh Hoá. Đậu xanh ở vùng này được gieo
trồng từ tháng 2 đến tháng 9 hàng năm, tập trung ở 3 thời vụ: vụ xuân, vụ hè, vụ
thu đông. Hàng năm do xu hướng thâm canh tăng vụ, tăng năng suất vì có hệ
thống tưới tiêu khá hoàn chỉnh và đầu tư khá nên năng suất đậu xanh vùng này
cao, việc tiếp nhận mô hình đậu xanh cao sản khả thi hơn. Đây là những điều
kiện cơ bản trong phát triển sản xuất.
- Vùng Duyên hải Trung Bộ và Tây Nguyên. Đây là vùng có diện tích và sản
lượng gieo trồng đậu xanh lớn. Do không chịu ảnh hưởng của khí hậu mùa đông
lạnh, mùa mưa, mùa khô phân bố rõ rệt nên thuận lợi để trồng quanh năm. Hàng
năm đậu xanh được gieo trồng từ 2 – 3 vụ, với phương thức trồng thuần là chủ
yếu. Hạn chế lớn nhất ở đây là thời điểm thu hoạch vụ hè thu thường gặp mưa
bão nên thất thoát nhiều về năng suất và sản lượng.
- Vùng Đông Nam bộ. Đây là vùng sản xuất đậu đỗ có quy mô lớn chiếm 26%
diện tích gieo trồng cả nước. Tuy nhiên, do không có thâm canh và việc sử dụng
các giống đậu xanh năng suất thấp nên năng suất trung bình của vùng này còn
thấp.
Một số giống đậu xanh được trồng phổ biến hiện nay như: ĐX044,
VC2768A năng suất vụ hè thu khoảng 2000 kg/ha, có thể trồng 3 vụ/ năm, cây
thấp,cứng, chịu mưa và chống đổ tốt. ĐX044 đang được trồng nhiều ở vùng
đồng bằng và trung du Bắc bộ; V123 năng suất đạt 1800 – 2000 kg/ha, thâm
canh có thể đạt 2000 - 7000 kg/ha, có thể trồng 3 vụ /năm; T135 năng suất đạt

2900 kg/ha trồng ở các tỉnh phía Bắc; V91-15 năng suất từ 1200 – 1400 kg/ha
cây cứng, ít đổ, ít nhiễm bệnh vàng lá, trồng được trên nhiều loại đất ở các tỉnh
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
7
phía Nam; HL-115 năng suất từ 1000 – 1300 kg/ha trồng vụ hè và 1400 – 2200
kg/ha trong vụ thu đông tại các tỉnh phía nam, cây cứng, ít đổ...
1.2. ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG
CẢI TIẾN GIỐNG CÂY TRỒNG
1.2.1. Cơ sở khoa học của công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.2.1.1. Cơ sở tế bào học của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật
Năm 1838, hai nhà sinh học người Đức là Schleiden và Schwann đã đề
xướng ra học thuyết tế bào và nêu rõ: Mọi cơ thể sinh vật đều bao gồm các đơn
vị nhỏ tồn tại độc lập, riêng rẽ và tách biệt đó là các tế bào.
Tất cả các tế bào của một cơ thể đều mang bộ máy thông tin di truyền giống
nhau. Do đó chúng có tiềm năng tổng hợp nên các protein giống nhau. Bằng
phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật các nhà khoa học đã đạt được những
thành công chứng minh cho khả năng tồn tại và phát triển độc lập của tế bào.
Các tế bào lấy từ bất kỳ mô sống nào của cơ thể thực vật (bao phấn, đỉnh sinh
trưởng, lá mầm, đoạn thân, rễ…) nếu được nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy
thích hợp đều có thể phát triển thành cây hoàn chỉnh đặc trưng cho loài và ra
hoa kết quả bình thường. Các loại mô đã phân hoá tách từ cơ thể thực vật có khả
năng tái sinh trực tiếp thành cây hoàn chỉnh, ngoài ra chúng còn có khả năng
phát triển thành tế bào mô sẹo (callus). Đó là loại tế bào không phân hoá, phân
chia liên tục và có khả năng phân hoá thành phôi, chồi và cây hoàn chỉnh. Như
vậy mỗi một tế bào bất kỳ lấy từ cơ thể thực vật đều có khả năng tiềm tàng để
phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Khả năng đó gọi là tính toàn năng của tế
bào.
Tính toàn năng là cơ sở của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào, là cơ sở của công
nghệ tế bào thực vật đang ngày càng phát triển và hoàn thiện. Kỹ thuật nuôi cấy
mô và tế bào nhanh chóng trở thành công cụ hữu hiệu trong nhiều lĩnh vực của

công tác giống cây trồng, đưa nghề trồng trọt vào thế kỷ của công nghệ hiện đại.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
8
1.2.1.2. Ảnh hƣởng của các chất điều tiết sinh trƣởng đến quá trình nuôi
cấy mô tế bào thực vật
Hiện nay người ta đã phát hiện thấy 5 nhóm chất điều tiết sinh trưởng ở
thực vật đó là auxin, cytokinin, ethylen, giberelin, axit absixic. Những chất này
được phân thành các nhóm dựa vào tính tương đồng về cấu trúc và chức năng
sinh lý, tuy nhiên về chức năng nhiều khi chúng có tác động chồng chéo và hỗ
trợ nhau. Còn một số nhóm khác điều khiển từng giai đoạn sinh trưởng nhất
định. Trong nuôi cấy mô tế bào người ta thường sử dụng ba nhóm chất điều tiết
sinh trưởng là dẫn xuất của auxin, cytokinin và giberelin.
- Nhóm auxin là nhóm kích thích sinh trưởng chính được các nhà sinh lý học
thực vật phát hiện và quan tâm sớm nhất. Auxin là những hoocmon thực vật có
tác dụng kích thích sinh trưởng, kéo dài tế bào và phân hoá cơ quan, kiểu tác
động của nó liên quan đến làm chuyển đổi và mềm hoá màng tế bào. Chính chức
năng này đã được người ta sử dụng và đánh giá hoạt tính của nó, ví dụ bằng
cách đo phần kéo dài lá mầm cây yến mạch trồng trong điều kiện tối sẽ biết
được hoạt tính của auxin. Nhóm auxin bao gồm các chất sau: 2,4
Diclorophenoxy axetic axit (2,4D), α – naphtylaxetic axit (α – NAA),
Indolaxetic axit (IAA), trong đó 2,4D dễ gây độc nhưng có tác dụng kích quá
trình phân chia tế bào thường được sử dụng nhiều nhất, α – NAA có tác dụng
tạo rễ cho cây con. Tuy nhiên, tầm quan trọng của bất kỳ chất điều tiết sinh
trưởng nào đều có thể được đánh giá thông qua số cấc công trình nghiên cứu
chúng. Ramakishnan và cs đã sử dụng 2,4D bổ sung vào môi trường tạo mô sẹo
từ mắt lá mầm của cây đậu đen, sau 5 ngày nuôi cấy xuất hiện mô sẹo với tỷ lệ
60,8% [32]. Kaviraj và cs cũng sử dụng 2,4D để tạo mô sẹo từ lá sơ cấp của đậu
xanh và kết quả là khi sử dụng 2,4D với nồng độ 10mg/l tỷ lệ tạo mô sẹo là
100%. Ngoài sử dụng 2,4D bổ sung vào môi trường tạo mô sẹo, Kaviraj và cs sử
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

9
dụng α – NAA kết hợp với kinetin và BAP để tái sinh cây và tạo cây hoàn chỉnh
ở đậu xanh …[34].
- Nhóm giberelin là nhóm được phát hiện qua nghiên cứu bệnh nấm lúa von. Nó
tác động làm tế bào dãn ra và phân chia, làm cây lùn có thể cao lên được, như
ngô lùn thành ngô cao, đậu dạng bụi thành dạng đứng. Đại diện cho nhóm này là
axit giberilic (GA3), được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp [15].
- Nhóm cytokinin là nhóm chất hoá học có ảnh hưởng quyết định đến kích thích
phân chia tế bào. Đại diện cho nhóm cytokinin gồm: Kinetin; 6 – Benzyl amino
purine (BAP); 6- Dimethylalylamino purine (2iP); Zeatin.
Rất nhiều cytokinin được phát hiện trong những nghiên cứu liên quan đến
nuôi cấy mô, nó kích thích phân hoá cơ quan của những tế bào không phân chia.
Ignaccimuthu và cs sử dụng BAP và α – NAA để tạo chồi từ cuống tử điệp của
đậu xanh sau 15 ngày nuôi cấy. Chỉ sử dụng BAP, Mai Trường và cs(2001) đã
xây dựng được hệ thống tái sinh cây đậu xanh từ cuống tử điệp…[31].
- Ethylen là nhóm có ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và phát triển của cây
nhưng gần đây nó mới được coi là một hoocmon thực vật. Ethylen thường được
sử dụng để làm chín quả ở chuối, ra hoa đồng loạt ở dứa, nó cũng ảnh hưởng
đến quá trình phân bào. Đối với cà chua trong điều kiện ethylen nồng độ cao sẽ
kéo dài khoảng ra rễ của thân…[15].
- Axit absixic là hợp chất ức chế sinh trưởng thực vật tự nhiên ảnh hưởng đến
tính ngủ nghỉ của hạt, mầm và rụng lá, tăng cường ra hoa cho một số cây ngắn
ngày thông qua hiệu quả tổng hợp ARN và protein [15].
Trong nuôi cấy tuỳ theo cây trồng, bộ phận và kiểu gen nuôi cấy, môi
trường và giai đoạn phát triển cụ thể trong quá trình nuôi cấy mà thành phần,
chủng loại và nồng độ các chất điều tiết sinh trưởng có khác nhau.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
10
1.2.2. Hệ thống nuôi cấy để chọn dòng

Cơ sở khoa học của kỹ thuật chọn dòng tế bào soma là hiện tượng các tế
bào thực vật khi được nuôi cấy ở dạng mô sẹo trong điều kiện in vitro thường có
những biến đổi di truyền tự phát, được gọi chung là biến dị soma. Thông qua
phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật có thể chọn ra được những dòng tế
bào thích hợp theo định hướng của người thực nghiệm. Tuy vậy, đối với mỗi
loại thực vật cần thiết phải có nghiên cứu tối ưu kỹ thuật nuôi cấy thích hợp cho
việc chọn dòng. Sau đây là một số hệ thống nuôi cấy đã được thực hiện:
Nuôi cấy mô sẹo: Mô sẹo là khối các tế bào mô mềm có mức độ cấu trúc
thấp, chưa phân hoá, phân chia một cách hỗn loạn và có tính biến động di truyền
cao. Mô sẹo thu được bằng nuôi cấy in vitro từ các cơ quan của thực vật như
thân, lá, rễ, hoa…trong môi trường chứa chất điều hoà sinh trưởng nhóm auxin
và điều kiện nuôi cấy thích hợp. Mô sẹo có thể được duy trì trên môi trường
nuôi cấy bằng cách cấy chuyển có định kì, tuy nhiên trong thực nghiệm thấy
rằng: i) mô sẹo qua cấy chuyển nhiều lần có ảnh hưởng không tốt đến khả năng
tái sinh của cây; ii) tăng tính biến động di truyền của mô.
Các tế bào di truyền có tính ổn định khá thấp. Nhiều tác giả đã thông báo
nhận được cây tái sinh từ mô sẹo qua nhiều lần cấy chuyển có sự thay đổi nhiễm
sắc thể (dị bội, đa bội) và những biến đổi di truyền khác. Vì vậy việc nhân
nhanh và duy trì tính đồng nhất di truyền thông qua nuôi cấy mô sẹo cần thận
trọng đối với nhiều loại thực vật và nhất định chỉ sử dụng mô sẹo sơ cấp để tái
sinh cây hoàn chỉnh thông qua con đường tạo phôi vô tính. Mặt khác những cây
tái sinh từ mô sẹo với những biến đổi di truyền phong phú lại rất có ý nghĩa
trong việc chọn giống và như vậy vật liệu di truyền của cây đó trở nên phong
phú hơn (Lê Trần Bình và cs 1997,1998) [1], [2]. Bằng cách này nhiều tác giả đã
thông báo thu được kết quả ở những giống cây trồng mới (Bertin và cs, 1995,
1997) [22], [23].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
11
Nuôi cấy tế bào huyền phù: Nuôi cấy tế bào huyền phù là nuôi cấy tế bào
đơn (single cell) hoặc cụm nhỏ tế bào (cell agregate) trong môi trường lỏng. Các

tế bào này cũng được tạo ra từ mô sẹo có nguồn gốc thân, lá, rễ, hoa, phôi….
Muốn thu được tế bào huyền phù nhỏ, mịn cần phải sàng lọc liên tục qua các
loại sàng có mắt lọc nhỏ (<0,5 mm). Để đạt được dạng nuôi cấy huyền phù
tương đối đều nhau cần phải sàng lọc ít nhất hàng chục lần, như vậy thời gian
cần thiết để thiết lập được môi trường nuôi cấy huyền phù ít nhất là 2 – 3 tháng.
Đây là điều trở ngại trong nghiên cứu với thực vật vì thời gian nuôi cấy dài các
tế bào huyền phù sẽ mất khả năng tái sinh cây. Lúc đó việc chọn dòng sẽ gặp
khó khăn để ứng dụng cho thực tiễn tạo giống. Vì vậy chỉ trong trường hợp nhất
định, khi tác nhân chọn lọc bắt buộc phải tác động lên toàn bộ bề mặt tế bào thì
hệ thống nuôi cấy huyền phù mới được áp dụng.
Kỹ thuật nuôi cấy tế bào đơn có ưu điểm trong chọn dòng vì các tế bào có
kích cỡ tương đối đều nhau dưới tác động của điều kiện chọn lọc các dòng tế
bào sẽ được chọn lọc một cách tương đối triệt để. Điều đáng quan tâm là khả
năng tái sinh cây của các tế bào đơn là rất thấp. Nhiều nhà nghiên cứu thực
nghiệm chỉ thu được các dòng tế bào chọn lọc, nhưng rất tiếc là không thu được
cây tái sinh (Dix và cs,1990) [28]. Mặc dù vậy cũng đã có một số cây tái sinh từ
nuôi cấy tế bào huyền phù đã được công bố như ở cây lúa, cây thuốc lá…(Collin
và cs, 1990) [24].
Nuôi cấy tế bào trần: Tế bào thực vật bị phá bỏ toàn bộ lớp vỏ bao bọc
(cell wall) chỉ còn lại khối nguyên sinh chất được bao bọc bởi màng nguyên sinh
được gọi là tế bào trần (protoplast). Tế bào trần có thể được tách từ nhiều bộ
phận khác nhau của cây nhưng chủ yếu là từ lá, mô sẹo, tế bào đơn và phôi.
Các protoplast sau khi tách được nuôi cấy trong môi trường thích hợp thì
tái tạo lại thành tế bào, phát triển thành mô sẹo và tái sinh thành cây hoàn chỉnh.
Vì trong giai đoạn chưa có thành tế bào các protoplast rất mẫn cảm với nồng độ