Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật hữu ích phục vụ cho việc sản xuất các chế phẩm probiotic dùng trong chăn nuôi

Website: Email : Tel (: 0918.775.368
đại học quốc gia hà nội
Trờng đại học khoa học tự nhiên
--------------------
Nguyễn Thị Tuyền
Vi khuẩn oxy hóa fe(ii) và khử nitrate ở việt nam:
tính đa dạng và tiềm năng ứng dụng
Luận văn thạc sĩ khoa học
Hà Nội - 2009
đại học quốc gia hà nội

Website: Email : Tel (: 0918.775.368
Trờng đại học khoa học tự nhiên
--------------------
Nguyễn Thị Tuyền
Vi khuẩn oxy hóa fe(ii) và khử nitrate ở việt nam:
tính đa dạng và tiềm năng ứng dụng
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60 42 40
Luận văn thạc sĩ khoa học
Ngời hớng dẫn khoa học: ts. đinh thúy hằng
Hà Nội - 2009
Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Tuyền - Cao học K16

Lời cảm ơn
Đề tài luận văn đợc thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài Đặc biệt cấp Đại
học Quốc gia Hà Nội, mã số QG.07.23.
Để có thể hoàn thành luận văn này, trớc tiên, tôi muốn bày tỏ lỏng biết ơn sâu
sắc tới Tiến sĩ Đinh Thúy Hằng, Trởng phòng Sinh thái Vi sinh vật, Viện Vi sinh vật và
Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội đã định hớng nghiên cứu, trực tiếp hớng

dẫn và chỉ bảo tận tình cho tôi trong suốt thời gian nghiên cứu.
Tôi cũng mong muốn đợc gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới Ban lãnh đạo và
các cán bộ Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo
điều kiện thuận lợi về trang thiết bị và cơ sở vật chất cho tôi hoàn thành nghiên cứu
này.
Qua đây, tôi cũng muốn đợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các thầy cô
giáo, cán bộ Khoa Sinh học, Trờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà
Nội đã giúp đỡ và trang bị những kiến thức hữu ích cho tôi trong suốt thời gian học
tập tại trờng.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè thân thiết,
những ngời đã luôn cổ vũ, động viên tôi vợt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập
và nghiên cứu.
Hà Nội, ngày tháng năm
Học viên
Nguyễn Thị Tuyền
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Tuyền - Cao học K16

mục lục
danh mục các chữ viết tắt......................................................................................................7
ARDRA Amplified ribosomal DNA Restriction Analysis..............................................7
bp Base pair...............................................................................................................................7
BSA Bovin serum albumin.....................................................................................................7
DNA Deoxyribonucleic acid...................................................................................................7
CI Chloroform-isoamyl alcohol.............................................................................................7
CTAB Cetyl trimethyl ammonium bromide......................................................................7
DAPI 4 6-diamidino-2-phenylindole ...................................................................................7
ddNTP Dideoxyribonucleotide triphosphate.....................................................................7
DGGE Denaturing gradient gel electrophoresis...........................................................7
dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate.........................................................................7

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid...........................................................................7
FISH Fluorescence in situ hydridization..........................................................................7
MQ Mili-Q....................................................................................................................................7
MPN Most probable number.................................................................................................7
OD Optical density..................................................................................................................7
PBS Phosphate-buffered saline..........................................................................................7
PCI Phenol-Chloroform-isoamyl alcohol............................................................................7
PCR Polymerase chain reaction..........................................................................................7
rDNA Ribosomal deoxyribonucleic acid.............................................................................7
RNA Ribonucleic acid..............................................................................................................7
rRNA Ribosomal ribonucleic acid........................................................................................7
SDS Sodium dodecyl sulfate...............................................................................................7
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Tuyền - Cao học K16

TAE Tris-Acetic-EDTA (đệm)..............................................................................................7
TE Tris-EDTA (đệm)................................................................................................................7
Taq Thermus aquaticus DNA...............................................................................................7
UV Ultraviolet............................................................................................................................7
Mở đầu............................................................................................................................................1
Chơng 1- Tổng quan tài liệu.....................................................................................................3
1.1. Quá trình oxy hóa Fe(II) nhờ vi khuẩn...........................................................................3
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu vi khuẩn oxy hóa Fe(II) (FOM).................................3
1.1.2. Vai trò của vi khuẩn trong chu trình oxy hóa - khử sắt.............................4
1.1.3. Vi khuẩn hiếu khí oxy hóa Fe(II) ở pH trung tính....................................5
1.1.4. Vi khuẩn quang hợp kỵ khí oxy hóa Fe(II) ..............................................6
1.1.5. Vi khuẩn kỵ khí oxy hóa Fe(II) ...............................................................6
1.2.Khử nitrate nhờ vi khuẩn..................................................................................................7
1.3. Vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate..............................................................................8
1.4. Cơ chế phân tử của quá trình oxy hóa Fe(II) và các gen liên quan..............................9

1.5. ảnh hởng của ô nhiễm nitrate và thừa sắt trong nguồn nớc sinh hoạt..........................12
1.5.1. ảnh hởng của nitrate đến sức khỏe con ngời...........................................12
1.5.2. ảnh hởng của thừa sắt đến sức khỏe con ngời.........................................14
1.6. ý nghĩa của việc nghiên cứu tính đa dạng di truyền và tiềm năng ứng dụng của các
vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate....................................................................................14
1.7. Các phơng pháp sinh học phân tử hiện đại đợc sử dụng trong các nghiên cứu về tính
đa dạng và cấu trúc di truyền của quần xã vi khuẩn .......................................................15
1.7.1. DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis).................................15
1.7.2. FISH (Fluorescence In Situ Hybridization).............................................16
1.7.3. ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis) ................16
Chơng 2 - Nguyên vật liệu và phơng pháp nghiên cứu...................................................17
2.1. Nguyên vật liệu.............................................................................................................17
2.1.1. Đối tợng nghiên cứu...............................................................................17
2.1.2. Hóa chất.................................................................................................18
2.1.3. Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu............................................18
2.2. Phơng pháp nghiên cứu..................................................................................................19
2.2.2. Phân lập vi khuẩn kỵ khí oxy hóa Fe(II), khử nitrate .............................22
2.2.3. Tách DNA tổng số từ mẫu bùn và trầm tích và chủng đơn.....................23
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Tuyền - Cao học K16

2.2.4. Phân tích đa dạng di truyền các chủng đơn bằng phơng pháp ARDRA..24
2.2.5. Phơng pháp điện di biến tính DGGE......................................................25
2.2.6. Giải trình tự gen 16S rDNA và dựng cây phân loại.................................26
2.2.7. Phơng pháp FISH....................................................................................27
Lai với đầu dò:..................................................................................................28
2.2.8. Định lợng Fe(II), Mn(II) và nitrate.........................................................29
Chơng 3 - Kết quả và thảo luận.........................................................................................32
3.1. Xác định số lợng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate tại các môi trờng sinh thái khác
nhau.......................................................................................................................................32

3.2. Phân tích cấu trúc quần xã vi khuẩn bằng điện di biến tính (DGGE)................34
3.3.Đánh giá đa dạng di truyền vi khuẩn trong các môi trờng nghiên cứu bằng phơng pháp
FISH......................................................................................................................................35
3.4. Mức độ oxy hóa Fe(II) và khử nitrate của vi khuẩn trong các mẫu nghiên cứu.........37
3.5. Phân lập vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate từ các mẫu nghiên cứu ......................38
3.6. Đánh giá tính đa dạng di truyền của các chủng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate
bằng phơng pháp ARDRA....................................................................................................40
3.7. Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, phân loại và hoạt tính sinh học của các chủng vi
khuẩn đại diện.....................................................................................................................43
Kết luận......................................................................................................................................49
hớng nghiên cứu tiếp theo....................................................................................................50
Tài liệu tham khảo....................................................................................................................51
Phụ lục........................................................................................................................................62
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Tuyền - Cao học K16

danh mục các chữ viết tắt
ARDRA Amplified ribosomal DNA Restriction Analysis
bp Base pair
BSA Bovin serum albumin
DNA Deoxyribonucleic acid
CI Chloroform-isoamyl alcohol
CTAB Cetyl trimethyl ammonium bromide
DAPI 46-diamidino-2-phenylindole
ddNTP Dideoxyribonucleotide triphosphate
DGGE Denaturing gradient gel electrophoresis
dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid
FISH Fluorescence in situ hydridization
MQ Mili-Q

MPN Most probable number
OD Optical density
PBS Phosphate-buffered saline
PCI Phenol-Chloroform-isoamyl alcohol
PCR Polymerase chain reaction
rDNA Ribosomal deoxyribonucleic acid
RNA Ribonucleic acid
rRNA Ribosomal ribonucleic acid
SDS Sodium dodecyl sulfate
TAE Tris-Acetic-EDTA (đệm)
TE Tris-EDTA (đệm)
Taq Thermus aquaticus DNA
UV Ultraviolet
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Tuyền - Cao học K16

Mở đầu
Sắt là một trong những kim loại phổ biến trên trái đất. Thông thờng sắt tồn tại
ở dạng Fe
2
O
3
ít tan trong nớc và có màu vàng nâu. Trong môi trờng pH trung tính,
dạng hòa tan trong nớc, Fe(II), chỉ tồn tại ở điều kiện không có oxy, ví dụ nh ở đáy
các thủy vực, nơi oxy hòa tan trong nớc đã bị các vi sinh vật hiếu khí sử dụng để
phân hủy các hợp chất hữu cơ. Với hiệu điện thế oxy hóa khử Fe(III)/Fe(II) tại pH 7
vào khoảng +200 mV, ion Fe(II) có thể trở thành nguồn điện tử cho các quá trình hô
hấp kỵ khí, điển hình là khử nitrate thành N
2
do một số nhóm vi khuẩn đảm nhiệm

(Straub và cs, 1996; Benz và cs, 1998; Weber và cs, 2006 c). Quá trình oxy hóa
Fe(II), khử nitrate đợc tóm tắt nh sau:
10 Fe
2+
+ 2 NO
3

+ 24 H
2
O = 10 Fe(OH)
3
+ N
2
+ 9 H
2

Trong tự nhiên, quá trình oxy hóa Fe(II) với chất nhận điện tử là nitrate chủ
yếu diễn ra ở ranh giới hiếu khí (có oxy) và kỵ khí (không có oxy) trong lớp trầm
tích ở đáy các thủy vực. Oxy hóa Fe(II) kết hợp với khử nitrate có thể đóng vai trò
quan trọng trong môi trờng ô nhiễm với nồng độ Fe(II) cao (do thiếu oxy) và nitrate
cao (do chất hữu cơ bị phân hủy tạo thành) (Weber và cs, 2006 c). Các loài vi khuẩn
với khả năng tiến hành phản ứng oxy hóa khử này có thể cùng một lúc thực hiện đợc
hai nhiệm vụ, thứ nhất là chuyển Fe(II) hòa tan trong nớc về dạng Fe(III) kết tủa, và
hai là loại bỏ nitrate, chuyển thành dạng N
2
không độc hại.
Vi khuẩn dùng ion Fe(II) làm nguồn cho điện tử để khử nitrate đợc phân lập
đầu tiên từ các lớp trầm tích ao, hồ nớc ngọt tại Bremen, Đức năm 1996 (Straub và
cs, 1996). Một số công trình nghiên cứu tiếp sau cho thấy sự có mặt khá phổ biển
của nhóm vi khuẩn này với mật độ khá cao (10

6
tế bào/g trầm tích) trong các điều
kiện môi trờng khác nhau, bao gồm cả nớc ngọt, nớc lợ và nớc mặn và tại nhiều vi
trí địa lý khác nhau trên thế giới (Straub và Buchholz-Cleven, 1998). Các loài vi
khuẩn phổ biến nhất trong nhóm này đợc biết đến hiện nay là các loài thuộc chi
Chromobacterium và Klebsiella (Benz và cs, 1998; Senko và cs, 2005; Weber và cs,
Chuyên ngành Vi sinh vật học
1
Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Tuyền - Cao học K16

2006 b). Các nghiên cứu về nhóm vi khuẩn này ở châu Âu với điều kiện sinh thái
hoàn toàn khác biệt với nớc ta.
Hiện nay, ở Việt Nam cũng nh trên thế giới, tình trạng ô nhiễm các kim loại
nặng và nitơ trong nguồn nớc sinh hoạt và nớc thải đang là vẫn đề đợc quan tâm
hàng đầu. Nồng độ ammonium hay nitrate cao trong nớc uống cũng nh nớc thải có
thể gây ra nhiều vấn đề nghiêm trọng liên quan đến môi trờng sinh thái và sức khỏe
cộng đồng (Avery, 1999; Lundgerg và cs, 2004; Tricker và Preussmann, 1991).
Thừa sắt trong cơ thể đợc cho là một trong những nguyên nhân gây ra các bệnh về
thần kinh và ung th (Moon, 2008).
Các kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong nghiên cứu sinh thái vi sinh vật
đã có nhiều bớc tiến đáng kể trong những năm gần đây. Trong số các phơng pháp
đó, có thể kể đến PCR-DGGE và FISH (không cần phân lập và nuôi cấy) hay
ARDRA và giải trình tự gen (thông qua bớc phân lập và nuôi cấy) là các phơng
pháp hữu hiệu đợc sử dụng phổ biến trong đánh giá tính đa dạng, phân tích cấu trúc
di truyền các nhóm loài của các vi sinh vật trong các môi trờng sinh thái khác nhau.
Từ những thực tế kể trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: Vi khuẩn oxy
hóa Fe(II) và khử nitrate ở Việt Nam: Tính đa dạng và tiềm năng ứng dụng
với mục đích đánh giá tính đa dạng di truyền của vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử
nitrate ở Việt Nam và tìm hiểu khả năng ứng dụng của chúng trong xử lý nguồn nớc
nhiễm ion sắt kim loại và các hợp chất chứa nitơ.

Chuyên ngành Vi sinh vật học
2
Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Tuyền - Cao học K16

Chơng 1- Tổng quan tài liệu
1.1. Quá trình oxy hóa Fe(II) nhờ vi khuẩn
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu vi khuẩn oxy hóa Fe(II) (FOM)
Khái niệm vi sinh vật liên quan đến oxy hóa sắt có từ nửa đầu thế kỉ 19, khi
Ehrenberg cho rằng các quặng sắt có thể đợc hình thành do kết quả của hoạt động
sinh học. Vi khuẩn liên quan trực tiếp đến sắt oxit, Gallionella ferruginea, cũng đã
đợc ông mô tả một cách chi tiết (Ehrenberg, 1919). Trong suốt thời gian sau đó,
nhiều đối tợng vi sinh vật đã đợc sử dụng để chứng minh rằng vi khuẩn có khả năng
oxy hóa sắt ở pH trung tính ví dụ nh Leptothrix ochracea (Kỹtzing, 1919). Tuy
nhiên vào thời điểm đó các bằng chứng đa ra vẫn cha đợc hoàn toàn xác thực. Cũng
vào thời điểm này, Harder, một giáo viên địa chất ngời Mỹ đã công bố một công
trình nghiên cứu về vi khuẩn sắt (Harder, 1919), trong đó vi khuẩn đợc chứng minh
là một trong các yếu tố địa hóa của chu trình sắt. Những vi khuẩn mà Harder đề cập
này sau đó đợc phát hiện trong một vài môi trờng nớc ngọt và phơng pháp làm giàu
cũng đợc sử dụng để cung cấp các bằng chứng cụ thể về hình thức sinh trởng tự d-
ỡng vô cơ của nhóm vi khuẩn này. Tuy nhiên vào thời điểm đó, chủng đơn vẫn cha
phân lập đợc.
75 năm sau đó, nhiều nghiên cứu đã cung cấp các hiểu biết về tập tính của vi
sinh vật oxy hóa Fe(II) (FOM- Ferrous oxidizing Microbiology) cũng nh vai trò
quan trọng của chúng trong phản ứng địa hóa và ăn mòn sinh học. Mặc dù vậy số
chủng phân lập đợc còn giới hạn, do đó mức độ đa dạng, phân loại, hình thái cũng
nh sinh lý của nhóm vi khuẩn này vẫn cha đợc mô tả chi tiết (Emerson, 2000). Năm
1984, tổng quan của Ghiorse đã thảo luận nhiều vấn đề về pháp danh và phân loại
của nhóm vi khuẩn này (Ghiorse, 1984). Quá trình oxy hóa Fe(II) kỵ khí mới đợc
biết đến nhờ việc phân lập đợc vi khuẩn tía quang hợp không lu huỳnh, có khả năng
sử dụng Fe(II) làm chất cho điện tử (Widdel và cs, 1993). Tiếp sau đó, vào năm

1996 Straub và cộng sự lần đầu tiên phân lập đợc vi khuẩn kỵ khí oxy hóa Fe(II),
khử nitrate (Straub và cs, 1996). Năm 1997 lần đầu tiên vi khuẩn vi hiếu khí ở pH
Chuyên ngành Vi sinh vật học
3
Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Tuyền - Cao học K16

trung tính có khả năng oxy hóa Fe(II) đợc phân lập và mô tả đặc điểm bởi Emerson
và Moyer năm 1997 (Emerson và Moyer, 1997).
Cho đến nay nhiều nghiên cứu tập trung về nhóm vi khuẩn có khả năng oxy
hóa Fe(II) cho thấy chúng có mặt phổ biến ở hầu hết các môi trờng từ nớc ngọt, nớc
lợ đến nớc mặn, trong đất, nớc và trầm tích, ở pH acid đến pH trung tính với số lợng
tơng đối lớn (Ehrenreich và Widdel, 1994; Straub và cs, 1996, 1998; Emerson và
Moyer, 1997; Benz và cs, 1998; Heising và cs, 1999; Hauck và cs, 2001; Ratering
và Schnell, 2001; Edwards và cs, 2003; Emerson và Weiss, 2004; Weber và cs, 2006
b, c).
1.1.2. Vai trò của vi khuẩn trong chu trình oxy hóa - khử sắt
Quá trình oxy hóa - khử giữa Fe(II) và Fe(III) (hình 1) có vai trò thiết yếu
trong chu trình sinh địa hóa môi trờng và là quá trình sinh địa hóa quan trọng có mặt
từ rất sớm trên trái đất. Fe(II) là thành phần của các dạng khoáng phổ biến nh
siderite (khoáng chất có chứa FeCO
3
), vivianite (Fe
3
(PO
4
)
2
.8H
2
O) hoặc Pyrite (FeS

2
)
trong môi trờng kỵ khí có tính acid yếu đến môi trờng trung tính (Straub và cs,
2001). Trớc khi phản ứng oxy hóa khử nhờ vi khuẩn đợc phát hiện ra thì cơ chế vô
sinh đã đợc cho là chi phối quá trình oxy hóa khử sắt trong môi trờng. Tuy nhiên,
đến nay thì rõ ràng là sự chuyển hóa sắt chủ yếu là do vi khuẩn điều khiển trong hầu
hết các điều kiện môi trờng. Nhiều loài vi khuẩn, kể cả vi khuẩn cổ, có khả năng sử
dụng thế oxy hóa khử của cặp Fe(II)/Fe(III) (+770 mV đối với môi trờng acid; +200
mV đối với môi trờng trung tính) và các cặp oxy hóa - khử khác để trao đổi điện tử,
tạo năng lợng. ở đây, Fe(II) đợc sử dụng nh là chất cho điện tử để cung cấp đơng l-
ợng khử cho các quá trình đồng hóa carbon thành sinh khối nhờ các vi khuẩn oxy
hóa Fe(II) trong cả điều kiện kỵ khí và hiếu khí, còn Fe(III) có thể đợc sử dụng nh là
chất nhận điện tử cuối cùng trong điều kiện kỵ khí cho các vi khuẩn tự dỡng vô cơ
và tự dỡng hữu cơ khử Fe(III) (Weber và cs, 2006 a).
Mặc dù vai trò của quá trình chuyển hóa sắt nhờ vi khuẩn trong môi trờng là
rất lớn nhng những hiểu biết của chúng ta về sinh lý, sinh hóa của chúng vẫn còn
giới hạn. Hầu hết các nghiên cứu và công bố về quá trình oxy hóa Fe(II) đều tập
Chuyên ngành Vi sinh vật học
4
Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Tuyền - Cao học K16

trung vào các vi khuẩn hiếu khí, a acid nh Thiobaccillus ferrooxidans (Temple và
Colmer, 1951; Yamanaka và Fukumori, 1995), là vi khuẩn phát triển trong môi tr-
ờng có pH 1-2 và tồn tại Fe(II) và Fe(III) ở dạng ion hòa tan. Tuy nhiên, ở pH trung
tính cơ chất và sản phẩm của quá trình chuyển hóa sắt lại ít hòa tan, điều này gây
khó khăn cho việc nghiên cứu (Straub và cs, 2001).
Hình 1. Chu trình sắt trong tự nhiên (Ehrlich và Newman, 2008). 1 - Vi sinh vật
trong môi trờng acid; 2 - Vi sinh vật kỵ khí ở môi trờng trung tính (khử nitrate,
quang hợp kỵ khí); 3 - Quá trình hóa học trong môi trờng trung tính với nồng độ O
2

cao; 4 - Quá trình hóa học; 5 - Quá trình sinh học; 6 - H
2
S từ vi sinh vật; 7 - +O
2
,
quá trình sinh học hoặc hóa học; 8 - +CO
3
2

, quá trình hóa học; 9 - chuyển H
+
, quá
trình sinh học hoặc hóa học; 10 - Quá trình sinh học hoặc hóa học.
1.1.3. Vi khuẩn hiếu khí oxy hóa Fe(II) ở pH trung tính
Sự cạnh tranh của các vi khuẩn hiếu khí có khả năng oxy hóa Fe(II) (FOM)
với động học của quá trình oxy hóa vô sinh Fe(II) bằng O
2
đã đợc chứng minh là
góp phần hoàn thiện chu trình sắt trong môi trờng hiếu khí (Emerson và Moyer,
1997; Sobolev và Roden, 2001; Edwards và cs, 2003). Quá trình oxy hóa Fe(II) nhờ
vi khuẩn đi kèm với khử oxy ở pH trung trính và acid đã đợc biết đến trong hơn một
thế kỷ nay. ở thời điểm đầu vai trò của oxy hóa Fe(II) ở pH trung tính nhờ vi khuẩn
hiếu khí đã bị xem nhẹ vì phản ứng hóa học oxy hóa Fe(II) bằng oxy không khí xảy
ra rất nhanh. Cho đến nay, mức độ đa dạng của FOM trong môi trờng hiếu khí đã đ-
Chuyên ngành Vi sinh vật học
5
Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Tuyền - Cao học K16

ợc nghiên cứu chi tiết, các loài đợc phát hiện đều thuộc 3 chi Gallionella, Leptothrix
và Marinobacter (Kỹtzing, 1919; Ehrenberg, 1919). Một số FOM hiếu khí a pH

trung tính gần đây đã đợc xác định thuộc vào các phân lớp -, -, - Proteobacteria
(Edwaras và cs, 2003; Emerson và Weiss, 2004; Dhillon và cs, 2005; Rentz và cs,
2007).
1.1.4. Vi khuẩn quang hợp kỵ khí oxy hóa Fe(II)
Trong những khu vực có ánh sáng, Fe(III) có thể cũng đợc tạo thành thông
qua hoạt tính oxy hóa Fe(II) của vi khuẩn quang hợp có khả năng sử dụng Fe(II) nh
một nguồn cho điện tử để tạo các đơng lợng khử cho quá trình đồng hóa carbon vô
cơ (Weber và cs, 2006 a). Vi khuẩn quang hợp kỵ khí là vi khuẩn oxy hóa Fe(II)
bằng con đờng kỵ khí đợc biết điến đầu tiên (Widdel và cs, 1993). Vi khuẩn này phổ
biến đợc biết đến hiện nay thuộc các chi Chlorobium, Rhodobacter, Thiodictyon,
Rhodovulum, Rhodomicrobium (Ehrenreich và Widdel, 1994; Heising và Schink,
1998; Heising và cs, 1999; Straub và cs, 1999; Kappler và Newman, 2004; Miot và
cs, 2009). Những nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng vi khuẩn quang hợp oxy hóa
Fe(II) không có khả năng sử dụng Fe(II) ở dạng khoáng mà chỉ có thể oxy hóa
Fe(II) ở dạng ion hòa tan (Kappler và Newman, 2004), do đó chúng chỉ đóng vai trò
nhỏ trong quá trình oxy hóa - khử sắt và sự phong hóa sắt trong môi trờng trên cạn.
1.1.5. Vi khuẩn kỵ khí oxy hóa Fe(II)
Gần đây, việc xác định đợc các vi khuẩn kỵ khí oxy hóa Fe(II) đã lấp đầy chỗ
trống trong bức tranh tổng thế về chu trình oxy hóa - khử sắt nhờ vi sinh vật (Widdel
và cs, 1993; Straub và cs, 1996). Các bằng chứng gần đây cũng đã chỉ ra rằng vi
khuẩn kỵ khí oxy hóa Fe(II) có thể đóng vai trò quan trọng trong chu trình oxy hóa -
khử sắt (Senn và Hemond, 2002; Straub và cs, 2004; Weber và cs, 2006 c), trong
chu trình sinh địa hóa đất, trầm tích, khoáng hóa, và quá trình cố định các chất
phóng xạ và kim loại nặng (Chaudhuri và cs, 2001; Weber và cs, 2001; Lack và cs,
2002; Weber và cs, 2006 c). Trong môi trờng không có oxy, quá trình oxy hóa
Fe(II) nhờ vi khuẩn đã đợc chứng minh là thờng đi kèm với quá trình khử
Chuyên ngành Vi sinh vật học
6
Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Tuyền - Cao học K16

perchlorate, chlorate và đặc biệt là nitrate (Straub và cs, 1996; Bruce và cs, 1999;
Weber và cs, 2006 c).
1.2. Khử nitrate nhờ vi khuẩn
Hình 2. Chu trình nitơ trong tự nhiên.
Nguồn nitơ chủ yếu cho quá trình đồng hoá ở các sinh vật tự dỡng và dị dỡng
là ammonium và nitrate (đợc khử thành ammonium trớc khi sử dụng). Trong tế bào,
nitơ tập trung ở thành phần của protein (các axit amin) và đợc chuyển hoá thành
dạng vô cơ thông qua quá trình oxy hoá hoặc khử nhóm amin (-NH
2
) trong axit
amin thành ammonium. Ngoài tự nhiên, ammonium tồn tại ở dạng NH
3
tại pH kiềm
và ở dạng NH
4
+
tại pH acid và trung tính.
Cố định nitơ không khí chuyển thành ammonium là quá trình tiêu tốn nhiều
năng lợng. Trong tự nhiên chỉ có một số loài vi khuẩn và tảo lam có khả năng thực
hiện phản ứng này nhờ sản sinh ra enzyme nitrogenase. Các loài vi khuẩn cố định
nitơ đợc chia vào hai nhóm (1) các loài sống cộng sinh trong nốt sần ở rễ của thực
vật (Rhizobium) và (2) các loài sống tự do trong đất, tập trung quanh vùng rễ thực
vật (Azotobacter) (Shapleigh, 2000).
Nitrate hoá là quá trình chuyển hoá ammonium thành nitrate do hai nhóm vi
khuẩn riêng biệt đảm nhiệm. Nhóm thứ nhất là các loài thuộc chi Nitrosomonas (và
một số chi khác nh Nitrospira, Nitrococcus, Nitrosolobus và Nitrosovibrio) oxy hoá
Chuyên ngành Vi sinh vật học
7
NO
2

NO
3

NH
3
Nitrate hoá
Khử Nitrate
Pseudomonas, Alcaligenes
Bacillus, Agrobacterium

Cố định Nitơ
Azotobacter, Rhizobium
NO
2

N
2
NO
N
2
O
Nitrosomonas
Nitrobacter
Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Tuyền - Cao học K16

ammonium thành nitrite: NH
4
+
+ 1,5 O

2
NO
2

+ 2 H
+
+ H2O. Nhóm thứ hai đại
diện là chi Nitrobacter tiếp tục oxy hoá nitrite thành nitrate: NO
2

+ 0,5 O
2
NO
3

.
Ngoài ra hai chi Nitrospira và Nitrococcus thuộc nhóm thứ nhất cũng có khả năng
tham gia bớc phản ứng oxy hoá nitrite thành nitrate (Shapleigh, 2000).
Khử nitrate thành khí nitơ là quá trình diễn ra trong điều kiện không có oxy,
trong đó nitrate đợc vi sinh vật sử dụng làm chất nhận điện tử cuối cùng khép kín
chuỗi hô hấp trong tế bào. Khử nitrate diễn ra qua một số bớc trung gian, mỗi bớc
do một loại enzyme làm chất xúc tác: NO
3

NO
2

NO N
2
O N

2
. Các
nghiên cứu về đa dạng và sinh thái cho thấy phổ biến nhất trong các môi trờng đất,
nớc và nớc thải là các loài thuộc chi Pseudomonas (P. fluorescens, P. aeruginosa, P.
denitrificans) và Acaligenes (Shapleigh, 2000).
Trong tự nhiên, vi khuẩn có khả năng sinh trởng bằng cách khử nitrate tơng
đối đa dạng, thuộc nhiều nhóm phân loại khác nhau (Shapleigh, 2000). Nguồn điện
tử cho nhóm vi khuẩn này sử dụng để khử nitrate cũng rất phong phú, bao gồm các
acid hữu cơ, cacbuahydro mạch thẳng hay mạch vòng, kể cả một số chất khó phân
hủy (Shapleigh, 2000). Trong môi trờng nớc ngọt nitrate là chất nhận điện tử quan
trọng thứ hai sau oxy, vì thế nhóm vi khuẩn khử nitrate ở đây cũng đa dạng hơn so
với môi trờng nớc lợ và nớc mặn, nơi có vi khuẩn khử sulfat chiếm u thế do ảnh h-
ởng của nồng độ sulfate (SO
4
2-
) cao từ nớc biển.
1.3. Vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate
ở pH trung tính, oxy hóa Fe(II) hòa tan và Fe(II) ở dạng khoáng nhờ vi
khuẩn kỵ khí không phụ thuộc ánh sáng xảy ra đồng thời với quá trình khử nitrate
đã đợc chứng minh trong các môi trờng nớc mặn và nớc ngọt khác nhau, bao gồm cả
đất ruộng, ao, suối, mơng, phá nớc lợ, hồ, đầm lầy, lớp ngập nớc, thủy nhiệt, trầm
tích đáy biển (Straub và cs, 1996; Benz và cs, 1998; Chaudhuri và cs, 2001; Ratering
và Schnell, 2001; Hauck và cs, 2001; Senn và Hemond, 2002; Edwards và cs, 2003).
Những môi trờng này chứa quần xã vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate khoảng 10
3
-
5ì10
8
tế bào/g trầm tích tham gia vào chu trình oxy hóa - khử sắt.
Chuyên ngành Vi sinh vật học

8
Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Tuyền - Cao học K16

ở pH 7, tất cả các cặp oxy hóa khử của quá trình khử nitrate có giá trị dơng
(NO
3
/NO
2
= +430 mV; NO
2
/NO = +350 mV; NO/N
2
O = +1180 mV; N
2
O/N
2
=
+1350 mV (Thauer và cs, 1977)) hơn so với cặp oxy hóa khử Fe(III)/Fe(II) do đó
nitrate là chất nhận điện tử thích hợp cho quá trình oxy hóa Fe(II). Về mặt nhiệt
động học, oxy hóa Fe(II) có thể xảy ra đồng thời với khử nitrate thành NH
4
+
(NO
3
/NH
4
+
= + 360 mV (Thauer và cs, 1977), nhng thực tế cha có bằng chứng nào
chứng minh vi khuẩn oxy hóa Fe(II) tạo ra NH
4

+
từ việc khử nitrate (Straub và cs,
1996, 1998; Benz và cs, 1998). Trong tất cả các vi khuẩn đợc biết đến, oxy hóa
Fe(II) luôn đi kèm với khử nitrate thành N
2
(Straub và cs, 1996; Benz và cs, 1998).
Gần đây, Weber và cộng sự (2006 c) mới phát hiện đợc chủng Geobacter sp. có cả
hai khả năng khử Fe(III) và oxy hóa Fe(II) bằng nitrate tạo NH
4
+
là sản phẩm của
quá trình khử.
Vì quá trình oxy hóa Fe(II), khử nitrate không bị giới hạn bởi vùng tiếp xúc
ánh sáng nên có thể có vai trò quan trọng hơn quá trình oxy hóa kỵ khí nhờ vi khuẩn
quang hợp (Straub và cs, 2001). Đáng chú ý là hầu hết các thí nghiệm làm giàu hay
nuôi cấy vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate đã tiến hành đều phụ thuộc vào nguồn
carbon hữu cơ (nh Na-acetate) (Straub và cs, 1996; Benz và cs, 1998), tức là điều
điện sinh trởng dị dỡng vô cơ. Phơng pháp MPN đã cho thấy FOM dị dỡng chiếm
0,8% tổng số vi khuẩn khử nitrate và thờng gặp hơn so với FOM tự dỡng (Straub và
cs, 1998). Vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate tự dỡng mới chỉ đợc biết đến với hai
chủng Ferroglobus placidus, là một vi khuẩn cổ a nhiệt (Hafenbradl và cs, 1996) và
chủng 2002, là vi khuẩn a ấm thuộc phân lớp -Proteobacteria (Weber và cs, 2006
b).
1.4. Cơ chế phân tử của quá trình oxy hóa Fe(II) và các gen liên quan
Cho đến nay cha có bất cứ công bố nào về cơ chế phân tử của quá trình oxy
hóa Fe(II) ở vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate. Tuy nhiên, quá trình oxy hóa
Fe(II) ở vi khuẩn hiếu khí, a acid Acidithiobacillus ferrooxidans đã đợc nghiên cứu
khá chi tiết.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
9

Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Tuyền - Cao học K16

Hình 3. Cơ chế tạo năng lợng trong quá trình oxy hóa Fe(II) ở vi khuẩn A.
ferrooxidans theo Ingledew và cộng sự (Ehrlich và Newman, 2008).
Theo mô hình về quá trình oxy hóa Fe(II) ở A. ferrooxidans do Ingledew mô
tả năm 1986 (hình 3) (Ehrlich và Newman, 2008), Fe(II) đợc oxy hóa ở bề mặt
ngoài của màng ngoài tế bào bằng cách chuyển 1 điện tử cho lớp Fe(III) nằm trong
màng ngoài của tế bào, lớp sắt này bị khử thành Fe(II). Điện tử sau đó đợc chuyển
lần lợt cho enzyme X (cha xác định), protein rusticyanin và cytochrome c nằm trong
khoảng gian màng. Cytochrome c sau đó gắn lên bề mặt ngoài của màng sinh chất
để thuận tiện cho việc chuyển điện tử qua màng tới cytochrome a
1
định vị ở mặt
trong của màng sinh chất. Cytochrome a
1
sau đó chuyển điện tử cho O
2
để tạo thành
H
2
O (hình 3) (Ehrlich và Newman, 2008).
Sau đó, Blake và cộng sự (1992) đã đa ra một mô hình chuỗi dẫn truyền điện
tử trong quá trình oxy hóa Fe(II) ở A. Ferrooxidans, theo đó điện tử đợc chuyển rất
nhanh từ Fe(II) đến rusticyanin nhờ xúc tác bởi enzyme (iron rusticyanin
oxidoreductase). Quá trình đợc chứng minh là phụ thuộc vào sự có mặt của ion
sulfate. Tuy nhiên vào thời điểm đó các tác giả lại cha xác định đợc vị trí của
cytochrome c (chất khử rusticyanin) và cách chuyển điện tử từ Fe(II) đi vào khoảng
gian bào (nơi rusticyanin kh trú).
Chuyên ngành Vi sinh vật học
10

Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Tuyền - Cao học K16

Hình 4. Mô hình mới nhất hiện nay về cơ chế dẫn truyền điện tử từ Fe(II) đến
O
2
trong quá trình oxy hóa Fe(II) ở A. ferrooxidans (Ehrlich và Newman, 2008).
OM, màng ngoài; PP, khoảng gian màng; PM, màng sinh chất; Cyc1, cytochrome
c
1
; Cyc2, cytochrome c
2
; rc, rusticyanin; bc
1
, phức hợp cytochrome bc
1
; aa
3
,
cytochrome aa
3
; mũi tên chỉ hớng dòng điện tử.
Cho đến năm 2002, Yarzábal và cs đã xác định đợc cytochrome c có khối l-
ợng phân tử lớn (Cyc2) trên màng ngoài của A. ferrooxidans chủng 23270 và chủng
33020 bằng phơng pháp sinh học phân tử (Yarzábal và cs, 2002a, b). Trớc đó gen
mã hóa cho Cyc2 cũng đã đợc chứng minh là gen thuộc operon rus (Appia-Ayme và
cs, 1999). Operon này bao gồm các gen mã hóa cho tất cả các protein liên quan đến
chuỗi dẫn truyền điện tử từ Fe(II) tới O
2
và chúng đợc điều hòa rất nghiên ngặt
(Yarzábal và cs, 2004). Những protein đợc mã hóa từ operon rus sẽ vận chuyển điện

tử đến chất nhận điện tử cuối cùng là O
2
lần lợt là cytochrome Cyc2, rusticyanin,
cytochrome Cyc1, và cytochrome oxidase (aa
3
) (hình 4). Vị trí của cytochrome
Cyc2 trên màng ngoài có liên quan trực tiếp đến quá trình vận chuyển một điện tử từ
mỗi Fe(II) vào trong tế bào chứng minh rằng Fe(II) đợc sử dụng nh một nguồn năng
lợng của A. ferrooxidans nhng không xâm nhập vào bên trong tế bào.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
11
Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Tuyền - Cao học K16

Các gen liên quan đến quá trình oxy hóa Fe(II) mới chỉ đợc đề cập ở các
FOM hiếu khí nh A. ferrooxidans và FOM quang hợp kỵ khí nh Rhodopseudomonas
palustris, chủng TIE-1 (Jiao và cs, 2005; Jiao và Newman, 2007) hay Rhodobacter
capsulatus SB1003 (Croal và cs, 2007). Những gen liên quan và cơ chế dẫn truyền
điện tử trong quá trình oxy hóa Fe(II) kỵ khí đi kèm với quá trình khử nitrate trong
môi trờng pH trung tính vẫn cha đợc làm rõ, và cho đến nay cha có công bố nào đề
cập đến vấn đề này. Khó khăn trong việc nghiên cứu có thể là do môi trờng sống kỵ
khí của những vi khuẩn quyết định hoặc là do trong môi trờng pH trung tính, cơ chất
và sản phẩm của quá trình oxy hóa Fe(II) ít hòa tan gây khó khăn trong quá trình
nghiên cứu sinh lý cũng nh di truyền hay cơ chế chuyển hóa diễn ra trong tế bào
(Straub và cs, 2001).
1.5. ảnh hởng của ô nhiễm nitrate và thừa sắt trong nguồn nớc sinh hoạt
Ô nhiễm nitrate và sắt trong nớc sinh hoạt là một trong những vấn đề quan
trọng đang đợc quan tâm ở Việt Nam cũng nh trên thế giới. Hàm lợng nitrate cho
phép trong các nguồn nớc sinh hoạt là 10 mg/L theo tiêu chuẩn quốc tế và 45 mg/L
theo tiêu chuẩn Việt Nam. Một nghiên cứu của Kross và cộng sự (1993) cho thấy n-
ớc giếng ở Iowa, Mỹ có nồng độ nitrate vợt quá 10 mg/L so với lợng tiêu chuẩn cho

phép. Hàm lợng nitrate trong vùng nớc châu thổ sông Cửu Long, Việt Nam lên đến
80 mg/L (Mai Thanh Truyết, 1997), trong khi hàm lợng cho phép là 45 mg/L
(TCVN 5944 - 1995). Nghiên cứu của Viện Vệ sinh dịch tễ Tây Nguyên cho biết
tình trạng ô nhiễm các kim loại nặng nh sắt và mangan rất đáng báo động, hàm lợng
sắt lên tới 50 mg/L, trong khi hàm lợng tiêu chuẩn cho phép là 1 - 5 mg/L (TCVN
5944 - 1995).
1.5.1. ảnh hởng của nitrate đến sức khỏe con ngời
Hội chứng trẻ da xanh (methemoglobinaemia): Hội chứng
methemoglobinemia đợc hình thành do nhiều nguyên nhân, trong đó bao gồm cả
việc thiếu hụt các enzyme khử methemoglobin (mang tính di truyền), sự khác thờng
về mặt di truyền của hemoglobin (dễ bị oxy hóa), và ảnh hởng của dợc phẩm và hóa
chất có tính oxy hóa bao gồm cả nitrate và nitrite (Avery, 1999). Nitrate hoặc nitrite
Chuyên ngành Vi sinh vật học
12
Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Tuyền - Cao học K16

oxy hóa Fe(II) trong hemoglobin thành Fe(III) là nguyên nhân khiến hemoglobin
chuyển thành dạng methemoglobin, ở trạng thái này hồng cầu không thể liên kết và
vận chuyển oxy (Avery, 1999; Lundberg và cs, 2004). Thông thờng, khi
methemoglobin hình thành đợc khoảng 15% lợng hemoglobin lu thông thì bắt đầu
hình thành hội chứng xanh tím (Avery, 1999). Hội chứng này phổ biến ở trẻ dới 6
tháng tuổi bởi vì lợng enzyme khử methemoglobin (reductase NADH-cytochrome
b
5
) của chúng chỉ bằng một nửa của ngời lớn (Lundgerg và cs, 2004). Tác hại của
nitrate đối với sức khỏe con ngời không phải là do bản thân ion nitrate gây ra. Thực
tế là nitrate có độc tính rất thấp nhng khi nồng độ nitrate tăng lên thì nó sẽ chuyển
thành nitrite nhờ xúc tác của enzyme vi khuẩn và chính nitrite là nguyên nhân gây
độc (Lundberg và cs, 2004).
Ung thu dạ dày: Quá trình chuyển hóa giữa nitrate và nitrite có thể hình

thành N-nitrosamines là một chất gây ung th phổ biến (Tricker và Preussmann,
1991). N-nitrosamines có thể đợc hình thành từ chế độ ăn, môi trờng nghề nghiệp và
thông qua sử dụng thuốc lá. Bình thờng trong dạ dày có tính acid nên nitrite tạo
thành acid nitrous và không gây hại cho dạ dày. Nhng khi tính acid của dạ dày giảm
(do sử dụng thuốc hoặc bị bệnh) các vi khuẩn định c trong dạ dày có thể xúc tác cho
việc hình thành N-nitrosamines từ nitrite, và đây có thể là một trong những nguyên
nhân gây ung th dạ dày. Tuy nhiên cơ chế chi tiết của hiện tợng này vẫn cha đợc làm
rõ (Lundberg và cs, 2004).
Ung th bàng quang. Hầu hết nitrate nội sinh và thu nạp từ chế độ ăn đợc
thải ra ở dạng nớc tiểu. Vì nớc tiểu thờng là vô trùng nên không có quá trình khử
nitrate xảy ra. Tuy nhiên, trong trờng hợp nhiễm khuẩn đờng tiết niệu thì một số l-
ợng đáng kể nitrite có thể đợc tạo thành bởi vi khuẩn. Nhiễm Schistosoma
haematobium (sống ký sinh) là một tác nhân cực kỳ nguy hiểm đối với quá trình
phát triển ung th bàng quang, và N-nitrosamines đợc cho là đóng vai trò quan trọng
trong việc phát sinh dạng ung th này. Cơ chế giả thiết là do nhiễm kinh niên vi
khuẩn khử nitrate, làm tăng nồng độ nitrite trong nớc tiểu, do đó tăng cờng sinh N-
nitrosamines và có thể dẫn tới ung th bàng quang (Lundberg và cs, 2004).
Chuyên ngành Vi sinh vật học
13
Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Tuyền - Cao học K16

1.5.2. ảnh hởng của thừa sắt đến sức khỏe con ngời
Vai trò thiết yếu của sắt: Sắt là nguyên tố phổ biến trong tự nhiên, là một
thành phần quan trọng trong tổng hợp hemoglobin (chất vận chuyển oxy cho các tế
bào trong cơ thể) và myoglobin (chất dự trữ oxy cho cơ thể). Ngoài ra sắt còn tham
gia vào thành phần một số enzyme oxy hoá khử nh catalase, peroxydase và các
cytochrome (những chất xúc tác sinh học quan trọng trong cơ thể). Nó đóng vai trò
quan trọng trong việc sản xuất ra năng lợng oxy hoá, vận chuyển oxy, hô hấp của ty
lạp thể và bất hoạt các gốc oxy có hại. Tuy nhiên quá tải sắt trong cơ thể cũng gây ứ
đọng sắt tại các mô nh tim, gan, tuyến nội tiết..., dẫn đến rối loạn trầm trọng chức

năng các cơ quan này (Trần Thị Kiều My và Nguyễn Hà Thanh, 2006).
Tác hại của thừa sắt trong cơ thể hiện nay vẫn còn đang gây nhiều tranh
cãi. Ngời ta cho rằng bộ não là mục tiêu chính của sự thừa sắt, sự tích lũy sắt trong
mô não hoặc gây ra hoặc đóng góp vào việc sinh ra bệnh về thần kinh nh Parkinson
và Alzheimer. Sắt còn đợc coi nh là một chất gây ung th rất mạnh. Và hiện nay ngời
ta đã có các bằng chứng chứng minh thừa sắt gây ra bệnh ung th gan. Sắt d thừa lắng
đọng trong tim và các động mạch có thể gây nên các bệnh về tim cũng nh là phá vỡ
động mạch. Sắt thừa lắng đọng trong lá lách sẽ phá vỡ sự bài tiết insuline và gây ra
bệnh đái tháo đờng nghiên trọng ở ngời lớn (ngời ta tìm thấy những lợp sắt lắng
đọng trong các tế bào tụy ở ngời có bệnh đái đờng tuýp 2) (Moon, 2008).
Để có thể hấp thu đợc, sắt phải chuyển từ dạng ferric (Fe(III)) sang dạng
ferrous (Fe(II)). Pepsin tách sắt khỏi các hợp chất hữu cơ và chuyển thành dạng gắn
với các acid amin hoặc đờng. Acid clohydric khử Fe(III) thành Fe(II) để hấp thu
(Trần Thị Kiều My và Nguyễn Hà Thanh, 2006). Vì vậy nên lợng sắt d thừa trong n-
ớc uống cho dù ở dạng Fe(II) hay Fe(III) đều gây nguy hiểm cho con ngời.
1.6. ý nghĩa của việc nghiên cứu tính đa dạng di truyền và tiềm năng ứng
dụng của các vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate
Với khả năng hô hấp kỵ khí bằng nitrate, vi khuẩn oxy hóa Fe(II) khử nitrate
có thể tham gia vào quá trình loại bỏ nitơ trong các nguồn nớc thải hay nớc sinh
Chuyên ngành Vi sinh vật học
14
Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Tuyền - Cao học K16

hoạt có nồng độ nitơ cao. Quá trình này diễn ra khi có mặt các hợp chất hữu cơ làm
nguồn điện tử thích hợp để khử nitrate, ví dụ nh lactate, acetate hay methanol là
những sản phẩm của quá trình phân giải chất hữu cơ cao phân tử. Bên cạnh đó, khả
năng sinh trởng vô cơ sử dụng Fe(II) làm nguồn điện tử để khử nitrate là một u thế
của nhóm vi khuẩn này so với các loài khử nitrate thông thờng. Do tác động của vi
khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate, cùng một lúc ion Fe(II) và nitrate d trong nguồn
nớc có thể đợc loại bỏ. Khả năng ứng dụng của nhóm vi khuẩn này có ý nghĩa đối

với việc xử lý các nguồn nớc ngầm dùng cho sinh hoạt bị nhiễm sắt và nitơ ngấm
xuống từ tầng nớc mặt.
Từ thực trạng ô nhiễm sắt và nitrate cũng nh ảnh hởng của chúng đến sức
khỏe con ngời cùng với vai trò của các vi khuẩn có khả năng làm giảm lợng sắt và
nitrate trong môi trờng, những nghiên cứu về tính đa dạng di truyền và tiềm năng
ứng dụng của nhóm vi khuẩn này trong các biện pháp xử lý các vùng ô nhiễm sắt và
nitrate là việc làm cần thiết. Nghiên cứu này không chỉ bổ sung kiến thức khoa học
về một nhóm vi khuẩn có khả năng oxy hóa Fe(II), khử nitrate mà còn đa ra những
gợi ý về hớng xử lý các nguồn nớc ô nhiễm kim loại nặng và chất hữu cơ. Cho đến
nay, nhóm vi khuẩn này chỉ mới đợc tập trung nghiên cứu ở một số nớc châu Âu với
điều kiện tự nhiên hoàn toàn khác biệt với nớc ta. Còn trong nớc thì cha có nghiên
cứu nào đề cập đến nhóm vi khuẩn tiềm năng này.
1.7. Các phơng pháp sinh học phân tử hiện đại đợc sử dụng trong các nghiên
cứu về tính đa dạng và cấu trúc di truyền của quần xã vi khuẩn
1.7.1. DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)
Một trong những kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại phổ biến đợc sử dụng để
đánh giá tính đa dạng di truyền của quần xã vi sinh vật không qua nuôi cấy hiện nay
là kỹ thuật PCR-DGGE (Giovannoni và cs, 1990; Ward và cs, 1990). PCR-DGGE
tiến hành với DNA của ribosome đợc Muyzer và cs công bố trong nghiên cứu về
sinh thái vi sinh vật năm 1993. Cho đến nay kỹ thuật này đợc biết đến phổ biến
trong nghiên cứu đa dạng di truyền vi sinh vật trong nhiều phòng thí nghiệm. Ngày
càng có nhiều công bố về ứng dụng PCR-DGGE trong nghiên cứu đa dạng di truyền
Chuyên ngành Vi sinh vật học
15
Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Tuyền - Cao học K16

vi sinh vật trong nhiều môi trờng sinh thái khác nhau nh trong đất (Norris và cs,
2002; Avrahami, 2002; Nicol và cs, 2003), biển (Bano and Hollibaugh, 2002), sông
(Sekiguchi và cs, 2002) và nớc hồ (Crump và cs, 2003). Ngoài ra sử dụng PCR-
DGGE còn xác định đợc nhóm vi sinh vật u thế trong các mẫu môi trờng nghiên cứu

(Bano và Hollibaugh, 2000).
Phơng pháp DGGE dựa trên việc di chuyển của các phân đoạn 16S rDNA đã
đợc khuếch đại trên gel polyacrylamide có chứa chất biến tính. Trong phơng phày
này, các phân đoạn DNA giống nhau về chiều dài nhng khác nhau về trình tự các
cặp bazơ có thể đợc phân tách (Fischer và Lerman, 1979). Trình tự giàu GC (còn gọi
là kẹp GC) có thể đợc gắn vào một trong hai mồi trong phản ứng PCR để ổn định
khả năng biến tính của các phân đoạn trên gel polyacrylamide để có thể xác định đ-
ợc 100% số trình tự có trong mẫu (Myers và cs, 1985; Sheffield và cs, 1989).
DGGE cho phép xác định cả những vi sinh vật không thể phân lập và nuôi cấy đợc
(Davies và cs, 2004).
1.7.2. FISH (Fluorescence In Situ Hybridization)
FISH là một trong số những phơng pháp cho phép xác định nhóm phân loại
của vi khuẩn trong mẫu mà không qua nuôi cấy bằng cách lai với các đầu dò gắn
huỳnh quang đặc hiệu cho rRNA và pháp hiện trên kính hiển vi huỳnh quang. FISH
ứng dụng cho vi khuẩn lần đầu tiên đợc mô tả hai mơi năm về trớc (Giovannoni và
cs, 1988; Delong và cs, 1989; Amann và cs, 1990), và đợc đợc đánh dấu nh một bớc
tiến vợt bậc trong lĩnh vực sinh thái vi sinh vật. Phơng pháp này chủ yếu dựa trên
trình tự của hệ tiểu đơn vị 16S rRNA, là trình tự đã đợc rất quan tâm trong nghiên
cứu hệ thống phân loại của vi sinh vật (Woese và cs, 1990; Ludwig và Schleifer,
1994). Đây là phơng pháp duy nhất cho phép quan sát tính đa dạng di truyền trực
tiếp trong môi trờng qua các tế bào bắt cặp với đầu dò đặc hiệu khác nhau (Amann
và cs, 1995).
1.7.3. ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis)
ARDRA là phơng pháp phân tích các đoạn cắt giới hạn của 16S DNA sau khi
đợc khuếch đại bằng phản ứng PCR. ARDRA đợc sử dụng để phân tích quần xã vi
Chuyên ngành Vi sinh vật học
16
Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Tuyền - Cao học K16

khuẩn trong các môi trờng khác nhau (Moyer và cs, 1994; Martínez-Murcia và cs,

1995; Lagacé và cs, 2004). Phơng pháp này còn đợc sử dụng để đánh giá nhanh sự
biến đổi về mặt di truyền trong quần xã qua thời gian hoặc là so sánh các quần xã
trong các điều kiện môi trờng khác nhau (Frederic và cs, 2000; Lagacé và cs, 2004)
hay nghiên cứu đa dạng di truyền các chủng đơn trong quần xã vi sinh vật (Moyer
và cs, 1994).
1.7.4. Giải trình tự tự động
Các máy đọc trình tự tự động hiện nay hoạt động dựa trên phơng pháp xác
định trình tự DNA (phơng pháp Dideoxy - hay còn gọi là phơng pháp gián đoạn
chuỗi (chain-determination method)) đợc Sanger phát triển năm 1977. Nguyên tắc
của phơng pháp là sử dụng 1% ddNTP (dideoxynucleotide, không có nhóm 3'-OH)
để làm ngừng phản ứng tổng hợp DNA một cách ngẫu nhiên. Các đoạn nucleotide
có kích thớc dài ngắn khác nhau sẽ đợc tổng hợp. A, T, G, C đợc đánh dấu huỳnh
quang khác nhau sẽ đợc pháp hiện bằng detector tín hiệu huỳnh quang khi điện di
mao quản 8 đến 16 kênh.
Chơng 2 - Nguyên vật liệu và phơng pháp nghiên cứu
2.1. Nguyên vật liệu
2.1.1. Đối tợng nghiên cứu
Mẫu bùn và trầm tích đợc thu thập ở ba môi trờng sinh thái đại diện khác
nhau: mẫu bùn đáy ao nớc ngọt và chân ruộng ngập nớc đợc thu ở ngoại thành Hà
Chuyên ngành Vi sinh vật học
17
Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Tuyền - Cao học K16

Nội, mẫu trầm tích nớc lợ đợc thu ở ven biển Vân Đồn - Quảng Ninh. Mẫu chân
ruộng và trầm tích ven biển đợc thu thập trong các ống nhựa mica có nút cao su ở
hai đầu cho phép khoan sâu tới 60 cm dới bề mặt trầm tích (hình 5). Mẫu đáy ao đợc
thu thập trong bình thuỷ tinh, sau đó bổ sung nớc vào toàn bộ thể tích để giảm thiểu
sự ảnh hởng của oxy không khí. Mẫu đợc bảo quản ở nhiệt độ 4C cho đến khi tiến
hành các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 5. Mẫu bùn và trầm

tích thu thập ngoài môi trờng
tự nhiên, đợc đảm bảo kỵ khí
nghiêm ngặt.
2.1.2. Hóa chất
Các hóa chất đợc sử dụng trong nghiên cứu vi sinh vật đều là những hóa chất
có tiêu chuẩn chất lợng cao của các hãng cung cấp lớn nh Merck, Sigma. Hoá chất
và một số kit dùng cho phân tích sinh học phân tử do các hãng Bioneer-Hàn Quốc,
Fermentas-Đức, Qiagen-Mỹ, ABI-Mỹ, BioRad-Mỹ cung cấp.
- Hóa chất sử dụng nuôi cấy vi khuẩn: Các chất khoáng (bảng 1), vi lợng (bảng 2),
vitamine (bảng 2), chất cho điện tử (FeSO
4
và MnSO
4
), chất nhận điện tử (NaNO
3
),
khí N
2
và CO
2
.
- Hóa chất sử dụng trong phơng pháp quang phổ xác định hàm lợng sắt II, mangan II
và nitrate: hydroxylamine hydrochloride, formaldehyde, ammonia, phenanthroline,
ammonium acetate, disulfofemic...
- Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm sinh học phân tử: Hóa chất cần thiết để tách
DNA, PCR, tinh sạch sản phẩm PCR, điện di biến tính, giải trình tự.
2.1.3. Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu
Chuyên ngành Vi sinh vật học
18