Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật hữu ích phục vụ cho việc sản xuất các chế phẩm probiotic dùng trong chăn nuôi

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009
======================================================
MỞ ĐẦU
Trong dinh dưỡng động vật, việc tăng cường sức khoẻ hệ thống tiêu hoá của
vật nuôi thông qua những tác động tới hệ vi sinh vật đường ruột được coi là một giải
pháp rất hữu hiệu. Hệ vi sinh vật đường ruột của vật nuôi rất phong phú về chủng
loại và số lượng, những biến động về cơ cấu, số lượng các loài vi sinh vật đường ruột
là một trong những nguyên nhân chủ yếu dẫn đến những rối loạn trong tiêu hoá và
hấp thu. Bởi vậy, việc sử dụng các biện pháp kỹ thuật thông qua thức ăn và nuôi
dưỡng nhằm tạo nên một thế cân bằng tối ưu giữa các loài vi sinh vật đường ruột theo
hướng có lợi cho vật chủ đã và đang là hướng nghiên cứu được các nhà nghiên cứu
trong và ngoài nước quan tâm. Có nhiều biện pháp để cải thiện quan hệ cân bằng giữa
các nhóm vi khuẩn có lợi và có hại trong đường tiêu hoá của gia súc, gia cầm. Biện
pháp cổ điển được ứng dụng rộng rãi từ những năm 1950 của thế kỷ trước là sử dụng
kháng sinh liều thấp. Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi
ngày càng bị hạn chế (kể từ ngày 01 tháng 01 năm 2006, các nước thuộc EU cấm
hoàn toàn việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi -Hector Cervanter, 2006),
nên nhu cầu tìm ra các giải pháp thay thế kháng sinh ngày càng trở thành cấp bách.
Một trong những giải pháp hữu hiệu nhất hiện nay là probiotic. Probiotic - theo
Fuller (1992)- là chất bổ sung vi sinh vật sống hữu ích trong thức ăn nhằm cải thiện
sự cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột theo hướng có lợi cho vật chủ.
Các sản phẩm probiotic nhập khẩu dùng trong chăn nuôi có mặt trên thị
trường Việt Nam nhiều nhưng các đáp ứng tích cực cho vật nuôi chưa được rõ ràng.
Các nhà khoa học cho rằng có thể là các vi sinh vật đó không phù hợp với hệ vi sinh
vật đường ruột của vật chủ bản địa. Mặt khác, các nghiên cứu sản xuất các chế phẩm
probiotic dùng trong chăn nuôi ở nước ta còn rất hạn chế. Chúng tôi thực hiện đề tài:
“Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật hữu ích phục vụ cho việc sản xuất các
chế phẩm probiotic dùng trong chăn nuôi” với định hướng đưa ra được các giải pháp
công nghệ để sản xuất các chế phẩm nói trên bằng các nguyên liệu trong nước. Đề tài
này được thực hiện thành công sẽ mở ra triển vọng trong việc sản xuất các sản phẩm
sinh học chất lượng cao, đáp ứng với yêu cầu ngày càng cao của ngành chăn nuôi

===========================================================1
Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009
======================================================
hữu cơ (hoàn toàn dựa vào các nguyên liệu từ thiên nhiên) theo hướng công nghiệp ở
nước ta, hạn chế nhập khẩu.
Chương 1 – TỔNG QUAN
===========================================================2
Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009
======================================================
1.1. Lịch sử và định nghĩa probiotic
1.1.1. Lịch sử probiotic
Những nghiên cứu về probiotic mới chỉ bắt đầu vào thế kỷ 20, Henry Tisser
(1900), một bác sỹ người Pháp đã quan sát và thấy rằng phân của những đứa trẻ mắc
bệnh tiêu chảy có ít vi khuẩn lạ hình trứng hoặc hình chữ Y hơn những đứa trẻ khỏe
mạnh [53].
Sau đó năm 1907, Elie Metchnikoff - người Nga, đạt giải Nobel – đã chứng
minh được rằng việc tiêu thụ Lactobacillus sẽ hạn chế các nội độc tố của hệ vi sinh
vật đường ruột. Ông giải thích được điều bí ẩn về sức khỏe của những người Cô-dăc
ở Bulgary, họ sống rất khỏe mạnh và tuổi thọ có thể lên tới 115 tuổi hoặc hơn,
nguyên nhân có thể là do họ tiêu thụ rất lớn các sản phẩm sữa lên men, điều này được
ông báo cáo trong sách “sự kéo dài cuộc sống” – The Prolongation of life (1908)
[53].
Có thể nói Tisser và Metchnikoff là người đầu tiên đưa ra những đề xuất mang
tính khoa học về probiotic, làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về probiotic
[26].
Năm 1930, nhà khoa học người Nhật Minoru Shirota phân lập các vi khuẩn
lactic từ phân của các em thiếu nhi khỏe mạnh [27]. Cùng năm đó, các nhà nghiên
cứu Hoa Kỳ đã chứng minh là Lactobacillus acidophilus có khả năng làm giảm bệnh
táo bón thường xuyên. Các nhà khoa học đại học Havard phát hiện ra các vi khuẩn
đường ruột đóng một vai trò quyết định trong quá trình tiêu hóa, giúp tiêu hóa thức

ăn, cung cấp một số vitamin và các chất dinh dưỡng khác nhau mà cơ thể vật chủ
không tự sản xuất ra được [26]. Sau đó 5 năm, một trong các đồ uống lên men – đặt
tên là “Yakult” từ sữa được cho là hỗ trợ sức khỏe đường ruột (intestinal health)
được sản xuất. Khái niệm chung probiotics được chấp nhận ở Châu Á trong nhiều
năm khi các sản phẩm lên men từ sữa probiotic đầu tiên được giới thiệu ở Châu Âu
những năm của thập niên 80 [27].
===========================================================3
Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009
======================================================
Ngày nay, các sản phẩm probiotic có chứa Bifidobacteria hoặc Lactobacillus
được tiêu thụ rộng rãi và phổ biến trên khắp thế giới như những nguồn thực phẩm
chính giúp tăng cường sức khỏe cho con người cũng như vật nuôi.
1.1.2. Định nghĩa probiotic
Theo ngôn ngữ Hi Lạp, probiotic có nghĩa là “vì sự sống”. Thuật ngữ
probiotic được Parker đề nghị sử dụng lần đầu tiên vào năm 1974 để chỉ “những vi
sinh vật và những chất làm cân bằng hệ vi sinh vật ruột” (Fuller, 1989). Từ đó đến
nay thuật ngữ probiotic đã được cả thế giới sử dụng để chỉ những chế phẩm vi sinh
vật sống hữu ích khi được đưa vào cơ thể động vật thông qua thức ăn hoặc nước
uống tạo nên những ảnh hưởng có lợi cho vật chủ. Kể từ khi xuất hiện, khái niệm
probiotic vẫn chưa có một định nghĩa thống nhất. Tuy nhiên, hiện có hai định nghĩa
được cho là phản ánh khá đầy đủ bản chất của probiotic và được sử dụng nhiều trong
các ấn phẩm khoa học: (i) theo Fuller (1989), probiotic là “chất bổ sung vi sinh vật
sống vào thức ăn giúp cải thiện cân bằng của hệ vi sinh vật đường tiêu hóa theo
hướng có lợi cho vật chủ”; (ii) theo tổ chức Y tế thế giới (WHO, 2001), probiotic là
“các vi sinh vật sống khi đưa vào cơ thể theo đường tiêu hoá với một số lượng đủ sẽ
đem lại sức khoẻ tốt cho vật chủ”.
1.2. Hệ vi sinh vật đường ruột và tác động của hệ vi sinh vật đến sức khỏe của
vật nuôi
Bên cạnh sự hấp thụ các chất dinh dưỡng, đường tiêu hóa còn đóng vai trò
quan trọng như là cơ quan miễn dịch lớn nhất trong cơ thể. Do đó, nó là hệ thống bảo

vệ và là hàng rào quan trọng chống lại các tác nhân gây bệnh xâm nhiễm. Thêm vào
các cơ chế bảo vệ nói chung, hệ thống miễn dịch, với các phản ứng đặc hiệu và
không đặc hiệu, giúp chống lại các vi sinh vật gây bệnh. Khu hệ vi sinh vật đường
ruột cũng được coi là một trong các yếu tố chống lại các tác nhân gây bệnh [36].
Khi còn ở trong bào thai, đường tiêu hoá của vật nuôi ở trạng thái vô trùng,
nhưng chỉ vài giờ sau khi sinh các vi sinh vật đã bắt đầu cư trú và trở thành những
“cư dân” bình thường trong đường tiêu hoá (WHO, 2001). Theo thời gian, do tiếp
===========================================================4
Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009
======================================================
xúc trực tiếp với môi trường, đặc biệt là qua thức ăn và nước uống, số lượng và tính
đa dạng sinh học của các vi sinh vật cộng sinh không ngừng tăng lên. Số lượng tế bào
vi sinh vật cư trú trong đường tiêu hóa của vật nuôi có thể cao gấp mười lần số lượng
tế bào cấu tạo nên cơ thể chúng (Fonty, 1995). Số lượng loài có thể lên tới từ 400-
500 (Tannock, 1999). Tuy nhiên, mật độ vi sinh vật ở các phân đoạn khác nhau của
đường tiêu hóa (dạ dày; tá tràng; ruột non và ruột già) ở loài động vật dạ dày đơn rất
khác nhau (khoảng 10
1
-10
3
; 10
1
-10
4
; 10
5
-10
8
và 10
9

-10
12
cfu/ml chất chứa tương ứng)
(Jans, 2005).
Sức khỏe của vật nuôi phụ thuộc vào 3 yếu tố chính: trạng thái sinh lý của vật
chủ, khẩu phần thức ăn và hệ vi sinh vật. Các yếu tố này chịu tác động của môi
trường, của các stress và tác động qua lại lẫn nhau. Trong số các nhân tố trên, hệ vi
sinh vật đường tiêu hóa đóng vai trò trung tâm, chỉ một biến động bất lợi của một
trong hai yếu tố còn lại cũng ảnh hưởng xấu tới hệ vi sinh vật (Conway, 1994). Sự
cộng sinh của các loài vi sinh vật trong đường tiêu hoá của vật nuôi (chủ yếu là trong
ruột) tạo nên một hệ sinh thái mở và mối cân bằng của quần thể vi sinh vật được xác
lập chỉ một thời gian rất ngắn sau khi sinh (Jans, 2005).
Có nhiều quan điểm khác nhau về mối tương quan cân bằng của hệ vi sinh vật
ruột. Theo Jans (2005), để đánh giá trạng thái cân bằng, các vi sinh vật ruột được chia
thành 3 nhóm (1) nhóm chủ yếu (main flora) gồm các loài vi khuẩn kị khí
(Clostridium; Lactobacillus; Bifidobacteria; Bacteroides, Eubacteria); (2) nhóm vệ
tinh (Satellite flora), gồm chủ yếu là Enterococcus và E. coli, và (3) nhóm còn lại
(Residual flora) gồm các vi sinh vật có hại như Proteus, Staphylococcus và
Pseudomonas… Một quần thể vi sinh vật được coi là cân bằng khi tỷ lệ của các nhóm
dao động trong khoảng 90; 1,0 và 0,01% tương ứng. Trạng thái mà các nhóm này
hình thành một tỷ lệ 90:1:0,01 được gọi là trạng thái “eubiosis” (tiếng Hy Lạp có
nghĩa là sự chung sống có lợi giữa các vi khuẩn với nhau và với vật chủ). Ở trạng thái
“eubiosis”, vật chủ cung cấp các điều kiện sống lý tưởng như nhiệt độ ổn định, pH
trung tính, dinh dưỡng và sự đào thải các chất chuyển hóa. Đổi lại, hệ vi sinh vật sẽ
mang lại lợi ích cho vật chủ thông qua tăng cường tiêu hóa các chất dinh dưỡng, giải
===========================================================5
Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009
======================================================
độc, tổng hợp các vitamin nhóm B và vitamin K, loại trừ các vi sinh vật có hại, tăng
cường đáp ứng miễn dịch của vật chủ. Sự cân bằng của hệ vi sinh vật trong đường

tiêu hóa bị tác động bởi một số nhân tố vô sinh và hữu sinh như: sinh lý vật chủ, khẩu
phần thức ăn và cơ cấu nội tại của bản thân hệ vi sinh vật. Thức ăn là nền dinh dưỡng
cơ bản của vi sinh vật, bởi vậy sự thay đổi thành phần khẩu phần, thức ăn không đảm
bảo vệ sinh, phương pháp cho ăn không hợp lý... đều làm tổn hại đến trạng thái cân
bằng hệ vi sinh vật ruột. Tương tự như vậy, các chất bài tiết của hệ tiêu hóa (dịch
mật, các enzym, chất đệm và chất nhầy...) cũng như kiểu và tần số nhu động ruột
cũng tác động trực tiếp đến hệ vi sinh vật. Kiểu và tần số nhu động ruột bị tác động
rất lớn bởi các stress (sinh đẻ, cai sữa, dồn chuồng, vận chuyển...). Khi quan hệ cân
bằng của hệ vi sinh vật ruột bị phá vỡ sẽ tạo nên trạng thái “dysbiosis” (trạng thái
“chung sống có hại”). Biểu hiện của trạng thái “dysbiosis” ở vật chủ thường là thể
tạng kém, sinh trưởng chậm và mắc các bệnh đường tiêu hóa như tiêu chảy, viêm
ruột hoại tử... (tóm tắt trạng thái eubiosis và dysbiosis có trong bảng 1). Để cải thiện
quan hệ cân bằng của hệ vi sinh vật ruột ở vật nuôi, một phương pháp thường được
áp dụng là bổ sung vào khẩu phần thức ăn một số loại kháng sinh liều thấp như
những chất kích thích sinh trưởng. Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn
chăn nuôi một cách không có kiểm soát đã và đang gây ra những hậu quả đáng lo
ngại về vệ sinh an toàn thực phẩm và đặc biệt là gây nên tình trạng kháng thuốc ngày
càng gia tăng của các vi khuẩn gây bệnh trên người và vật nuôi. Hiện nay, khối liên
minh châu Âu (EU) đã cấm sử dụng kháng sinh để bổ sung vào thức ăn như chất kích
thích sinh trưởng từ ngày 01 tháng 01 năm 2006. Việc cấm sử dụng kháng sinh trong
thức ăn chăn nuôi cũng đặt ra những thách thức lớn về kỹ thuật, đặc biệt đối với chăn
nuôi gia súc, gia cầm non hoặc trong điều kiện vệ sinh kém và vật nuôi chịu nhiều
stress. Để vượt qua những thách thức đó, đã có rất nhiều những nghiên cứu nhằm tìm
ra tác nhân để thay thế kháng sinh nhưng an toàn với vật nuôi. Một trong những tác
nhân tìm ra đó là probiotic.
===========================================================6
Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009
======================================================
Bảng 1: Tóm tắt trạng thái Eubiosis và Dysbiosis cùng các đặc điểm đặc trưng của
chúng

Trạng thái Eubiosis
- Sự cùng tồn tại giữa vật chủ và hệ vi
sinh vật đường ruột – Sự cộng sinh
- Sự bảo vệ bề mặt của đường tiêu hóa
chống lại các vi sinh vật xâm nhiễm.
- Kích thích hệ miễn dịch của vật chủ.
- Tiêu hóa các chất dinh dưỡng.
- Tổng hợp protein.
- Tổng hợp các vitamin
Trạng thái Dysbiosis
- Sự không cùng tồn tại giữa vật chủ và
hệ vi sinh vật đường ruột.
- Sự phá hủy biểu mô đường ruột, làm
cho thành đường ruột mỏng đi dẫn đến
giảm sự hấp thụ các chất dinh dưỡng.
- Sinh ra các cơ chất gây độc (NH
3
, chất
độc…)
- Phân hủy, tăng sản sinh khí gas (CH
4
,
H
2
S, CO
2
).
- Làm yếu hệ thống miễn dịch
- Làm tăng chu trình tế bào, cần nhiều
năng lượng

1.3. Vai trò và cơ chế hoạt động của probiotic
1.3.1. Vai trò của probiotic
Từ khi kháng sinh bị cấm sử dụng như chất kích thích sinh trưởng trong thức
ăn chăn nuôi ở một số nước thuộc khối liên minh châu Âu (bắt đầu là Thụy Điển vào
năm 1986) thì probiotic được coi là một trong những nguồn thay thế có triển vọng
nhất vì có nhiều đặc tính ưu việt. Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu của nhiều tác
giả, Patterson (2003) đã tổng kết các ảnh hưởng có lợi của probiotic đối với đời sống
động vật thể hiện ở các khía cạnh sau:
- Thay đổi cấu trúc quần thể vi sinh vật đường ruột theo chiều hướng có lợi
cho vật chủ.
- Tăng cường khả năng miễn dịch.
- Giảm phản ứng viêm.
===========================================================7
Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009
======================================================
- Ngăn cản sự xâm nhập và ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh.
- Tăng sản xuất các axit béo bay hơi.
- Tăng cường quá trình sinh tổng hợp các vitamin nhóm B.
- Tăng hấp thu chất khoáng.
- Làm giảm cholesterol huyết thanh.
- Làm tăng năng suất vật nuôi.
- Giảm hàm lượng amoniac và urê trong chất thải.
Ngoài ra probiotic còn rất an toàn với động vật và thân thiện với môi trường.
Vì là chất bổ sung vi sinh vật sống hữu ích, việc sử dụng probiotic sẽ không tạo ra
các chất tồn dư trong các sản phẩm chăn nuôi có hại cho sức khỏe người tiêu dùng.
1.3.2. Cơ chế tác động
Có rất nhiều cách giải thích khác nhau về cơ chế tác động, nhưng phần lớn các
tài liệu về probiotic đề cập đến ba khía cạnh sau: (i) cạnh tranh loại trừ; (ii) đối kháng
vi khuẩn và (iii) điều chỉnh miễn dịch (Steiner, 2006). Minh họa cơ chế hoạt động
của probiotic thông qua hình 1.

Cạnh tranh loại trừ là đặc tính đấu tranh sinh tồn điển hình của các vi sinh vật.
Hình thức cạnh tranh loại trừ thường thấy ở các vi sinh vật ruột là cạnh tranh vị trí
bám dính. Các vi sinh vật probiotic cư ngụ và nhân lên trong ruột, khóa chặt các vị trí
thụ cảm và ngăn cản sự bám dính của các vi sinh vật khác như E. coli, Salmonella...
Một số nấm men probiotic (Saccharomyces cereviese; S.boulardii) không chỉ tranh vị
trí bám dính của các vi khuẩn khác mà còn gắn kết các vi khuẩn có roi (phần lớn là
những vi khuẩn có hại) thông qua các cơ quan thụ cảm mannose và đẩy chúng ra khỏi
vị trí bám dính ở niêm mạc ruột (Czerucka và Rampal, 2002). Tuy nhiên, cạnh tranh
dinh dưỡng là phương thức cạnh tranh khốc liệt nhất vì sự sinh sôi với số lượng lớn
của một loài vi sinh vật nào đó là một đe dọa nghiêm trọng đối với các loài khác về
nguồn cơ chất cho phát triển.
Đồng thời với cạnh tranh loại trừ, các vi sinh vật probiotic còn sản sinh các
chất kìm hãm vi khuẩn như lactoferrin, lysozym, hydrogen peroxide cũng như một số
===========================================================8
Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009
======================================================
axit hữu cơ khác. Các chất này gây tác động bất lợi lên vi khuẩn có hại chủ yếu là do
sự giảm thấp pH trong ruột (Conway, 1996).
Phản ứng miễn
dịch được kích
thích và hoạt tính
kháng thể của vật
chủ tăng lên
Cạnh tranh chất dinh dưỡng:
các sinh vật probiotic cạnh
tranh với các vi sinh vật gây
bệnh các chất dinh dưỡng quan
trọng.
Cạnh tranh loại trừ: các
sinh vật probiotic khóa chặt

các vị trí thụ cảm do đó loại
trừ được các vi sinh vật gây
bệnh
Màng chắn: nơi các sinh
vật probiotic chiếm giữ
các thụ cảm trên bề mặt
ruột, độc tố được loại trừ
Gây bệnh: các vi sinh vật
gây bệnh và chất độc của
chúng bám vào niêm mạc
và các thụ cảm trên ruột và
phá hủy chúng
Các vi sinh vật probiotic cư
ngụ và nhân lên trong ruột,
ngăn cản sự bám dính và
phát triển của các vi sinh vật
gây bệnh
Hình 1. Minh hoạ cơ chế tác động của probiotic
Ruột là cơ quan miễn dịch lớn nhất ở động vật có vú. Giữa hệ vi sinh vật ruột
và hệ thống miễn dịch có mối tương tác đặc thù. Năng lực miễn dịch thể dịch và
miễn dịch tế bào của hệ thống miễn dịch đường ruột bị ảnh hưởng rất lớn bởi sự cân
bằng của hệ vi sinh vật ruột (Cebra, 1999). Thông qua tương tác với hệ thống miễn
dịch ruột, các probiotic có thể điều chỉnh cả miễn dịch thụ động và chủ động hoặc cả
hai. Tác động điều chỉnh miễn dịch đặc hiệu của probiotic phụ thuộc vào chủng
giống hoặc các loài vi khuẩn probiotic (Dugas và ctv, 1999). Tuy nhiên, cơ chế tác
===========================================================9
Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009
======================================================
động của probiotic đối với việc nâng cao chức năng miễn dịch vẫn còn chưa được
hiểu biết đầy đủ.

1.4. Tiêu chuẩn lựa chọn chủng vi sinh vật probiotic
1.4.1. Lựa chọn các chủng probiotic
Việc lựa chọn các chủng vi sinh vật với tiêu chuẩn đầu tiên là phải an toàn cho
quá trình sản xuất và ứng dụng, có khả năng sống sót và chiếm lĩnh (colonization)
trong đường tiêu hóa vật chủ. Các tiêu chuẩn lựa chọn này được hợp lý hóa thông
qua các thí nghiệm in vitro, từ đó sẽ tuyển chọn được các chủng có tiềm năng như là
nguồn probiotic [22].
Các chủng vi sinh vật probiotic được lựa chọn theo các tiêu chuẩn chủ yếu
sau:
• Tính bám dính trên bề mặt đường tiêu hóa hoặc các tế bào biểu mô: Các chủng
probiotic phải bám dính được vào thành ruột non, khu trú tốt trong đường tiêu hoá và
sinh sôi nảy nở. Khả năng bám dính được xem là một yêu cầu quan trọng để tăng khả
năng ức chế vi sinh vật gây bệnh, bảo vệ biểu mô và tăng khả năng miễn dịch của vật
chủ. Đặc tính này làm tăng khả năng cạnh tranh của các chủng probiotic với các vi
sinh vật bất lợi khác.
• Hoạt tính kháng khuẩn chống lại các vi khuẩn gây bệnh: Lựa chọn được các
chủng có khả năng sản sinh các chất kháng khuẩn là đặc tính quan trọng nhất trong
phát triển probiotic. Các chủng probiotic cần có hoạt tính ức chế vi khuẩn gây bệnh
như E. coli, Salmonella và Campylobacteria. Hoạt tính kháng khuẩn của chúng có thể
theo nhiều cơ chế khác nhau như:
+ Sản sinh ra các chất Bacteriocin.
+ Làm giảm độ pH bởi tạo ra axit lactic.
+ Tạo ra H
2
O
2
.
+ Làm giảm độc tố theo các cơ chế khác nhau.
+ Khả năng làm giảm sự bám dính của các vi khuẩn gây bệnh trên bề mặt.
+ Cạnh tranh dinh dưỡng với các vi khuẩn gây bệnh.

===========================================================10
Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009
======================================================
• Khả năng tồn tại trong môi trường axit dạ dày: Khoang miệng và dạ dày của
vật chủ là nơi có môi trường axit pH từ 2-3 và có mặt các enzym tiêu hoá (amylaza,
proteaza, lysozym…). Các chủng vi sinh vật được coi như là nguồn probiotic phải tồn
tại được trong điều kiện này. Hiện nay các công ty đã khuyến cáo dùng vỏ bọc
(microcapsute) với chế phẩm probiotic nhằm tăng khả năng sống của vi khuẩn
probiotic khi đi qua khoang miệng và dạ dày.
• Khả năng chịu muối mật: Thông thường, muối mật trong dịch tiêu hoá của động
vật dao động 1-3% [48]. Để tồn tại và phát triển, các chủng probiotic phải có khả
năng tồn tại và phát triển với nồng độ muối mật ≥ 2%, ngoài ra một số chủng
probiotic (Nấm men, Bacillus và Lactobacillus) có khả năng sinh enzym tiêu hoá
như: amylaza, xenlulaza và proteaza, lipaza và phytaza có vai trò làm tăng khả năng
tiêu hoá thức ăn và hấp thu chất dinh dưỡng của vật chủ.
1.4.2. Các chủng vi sinh vật dùng phổ biến trong probiotic
 Vi khuẩn lactic: gồm 2 chi vi khuẩn chủ yếu là Lactobacillus và
Bifidobacterium.
Các loài thuộc chi Lactobacillus: L. acidophilus, L. amylovorus, L. brevis, L. casei, L.
casei subsp. rhamnosus (Lactobacillus GG), L. caucasicus, L. crispatus, L.
delbrueckii subsp. bulgaricus (L. bulgaricus), L. fermentum (L. fermenti), L. gasseri,
L. helveticus, L. johnsonii, L. lactis, L. leichmannii, L. paracasei, L. plantarum, L.
reuteri, L. rhamnosus
Các loài thuộc chi Bifidobacterium: B. adolescentis, B. bifidum, B. breve, B. infantis,
B. lactis (B. animalis), B. licheniformis, B. longum
 Một số vi sinh vật probiotic khác không phải vi khuẩn lactic Lactobacillus và
Bifidobacterium: Bacillus subtilis, Enterococcus faecium, Saccharomyces boulardii,
Saccharomyces cerevisiae.
1.4.3. Công thức chế phẩm probiotic
===========================================================11

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009
======================================================
Như đã trình bày ở phần 1.4.2 có 3 đối tượng chủ yếu cho nghiên cứu phát
triển chế phẩm là vi khuẩn lactic, vi khuẩn Bacillus và nấm men. Vai trò cũng như cơ
chế tác động của chúng lên vật chủ rất khác nhau [36], cụ thể có trong bảng sau:
Bảng 2: Tóm tắt cơ chế tác động chủ yếu của các chủng probiotic lên vật chủ
Vi khuẩn lactic Vi khuẩn Bacillus Nấm men
- Sinh bacteriocin
- Cạnh tranh vị trí bám.
- Sinh các peptit, kích thích hệ
thống miễn dịch của vật chủ.
- Cạnh tranh dinh dưỡng và vị trí
bám vào biểu mô.
- Sinh các axit hữu cơ, tăng hiệu
quả hấp thu chất dinh dưỡng.
- Sinh enzym phân
giải các cơ chất như
tinh bột, xenluloza;
kích thích tiêu hoá.
- Sinh axit hữu cơ, kích
thích tiêu hoá
- Hấp thu chất độc và
cạnh tranh dinh dưỡng,
vị trí bám trên biểu mô
với vi sinh vật gây
bệnh.
Tuỳ thuộc vào từng loại sản phẩm mà có thành phần vi sinh vật khác nhau.
1.4.4. Yêu cầu an toàn đối với các chủng vi sinh vật probiotic
Việc nghiên cứu, phát triển chế phẩm probiotic và sử dụng trong chăn nuôi bắt
đầu từ khâu nghiên cứu sản xuất và tiêu thụ, sử dụng trên đàn gia súc, gia cầm [9].

Như vậy các chủng vi sinh vật đã qua nhiều khâu tiếp xúc với con người, môi trường
trước khi vào cơ thể động vật. Điều này cho thấy là yêu cầu an toàn đối với chủng vi
sinh vật là vấn đề quan trọng nhất đối với vật nuôi, con người và môi trường. Đối với
động vật cần có thời gian thử nghiệm từ 1-3 tháng, kiểm tra các chỉ tiêu tăng trọng,
phản ứng cơ thể, theo dõi các bệnh tiêu hoá, bệnh nhiếm khuẩn và các phản ứng phụ.
Ngoài ra cần có những thông số phân tích sinh hoá về máu và đánh giá chỉ số
coliform trong phân. Đối với con người không cần thiết phải thử nghiệm như trên
động vật nhưng cần chú ý các phản ứng phụ như dị ứng với da, mũi, mắt (Arturo et
al, 2006). Với môi trường cần đảm bảo là vi sinh vật không có hại đối với con người
và động vật, không mang gen lạ. Nói chung các chủng vi sinh vật probiotic có nguồn
gốc tự nhiên (từ hệ vi sinh vật đường ruột vật nuôi) là các chủng được khuyến cáo sử
===========================================================12
Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009
======================================================
dụng. Tổ chức FAO (2002) đưa ra hướng dẫn với việc tuyển chọn các chủng
probiotic, ngoài các đặc tính probiotic và đảm bảo an toàn thì các chủng này phải
được cụ thể hoá các thông tin về nguồn gốc chủng, tên phân loại đến chi và loài. Đối
với vấn đề an toàn probiotic, cộng đồng Châu Âu đã lập một Uỷ ban khoa học về
dinh dưỡng động vật (SCAN: scientific committee for animal nutrition) đưa ra những
quy định đánh giá an toàn đối với sản phẩm và những khuyến cáo cho vấn đề này qua
các điều luật và kỹ thuật online ((SCAN, 2000).
Tổ chức FAO (2002) khuyến cáo các chủng probiotic không những cần được
phân loại chính xác mà còn phải được cung cấp và lưu giữ tại các bảo tàng vi sinh vật
đạt tiêu chuẩn quốc tế. Quy trình sản xuất phải theo tiêu chuẩn GMP (Good
Manufacturing Practices).
1.4.5. Phân loại vi sinh vật
Yêu cầu tiên quyết là các chủng vi sinh vật probiotic phải được định danh
chính xác đến chi (genus) và loài (species) (FAO, 2002). Hiện nay, trên thị trường có
nhiều loại KIT định danh vi sinh vật khác nhau như API 50CH, API-20E... Tuy nhiên
các KIT này được phát triển dựa trên các đặc tính sinh lý và sinh hoá của các vi sinh

vật đã biết, vì vậy với yêu cầu định danh chính xác cần kết hợp các đặc tính phân loại
về hình thái, sinh lý sinh hoá và sinh học phân tử. Phương pháp định danh dựa theo
sinh học phân tử hiện nay chủ yếu vẫn là dựa theo kỹ thuật giải trình tự đoạn gen mã
hoá cho ARN riboxom 16S (đối với vi khuẩn) và đoạn D1D2 của gen mã hoá cho
ARN riboxom 28S hoặc vùng ITS (đối với nấm men). Trong những điều kiện cho
phép thì người ta tiến hành kỹ thuật lai ADN với các chủng chuẩn để khẳng định vị
trí phân loại của chủng nghiên cứu tới loài.
1.5. Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic trên thế giới và Việt nam
1.5.1. Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm probiotic trên
thế giới
Việc sử dụng thực phẩm có probiotic (hoặc như 1 thành phần tự nhiên của
thực phẩm hoặc thực phẩm đã lên men) đã được biết đến từ lâu, nhưng việc nghiên
===========================================================13
Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009
======================================================
cứu hệ vi sinh vật đường ruột và sử dụng probiotic mới thực sự phát triển từ những
năm 80 của thể kỷ 20 (Patterson và ctv, 2003). Những nghiên cứu phân loại và đặc
điểm của quần thể vi sinh vật đường ruột ở người và động vật được tiến hành bởi
Savage (1987); Vahjen và ctv (1998); Apajalahti và ctv (1998); Vander Wielen và ctv
(2000) đã cho thấy nếu như trong ruột non của người Bacteroides và Bifidobacterium
chiếm ưu thế thì ở gà là Ruminococcus và Streptococcus. Bằng kỹ thuật phân tử, các
nhà nghiên cứu đã chỉ ra rằng chỉ có khoảng 20 đến 50% số loài vi sinh vật đường
ruột ở động vật được phân lập, nuôi cấy như nguồn probiotic (Patterson và ctv,
2003). Apajialahti và ctv (1998); Netherwood và ctv (1999); Gong và ctv (2002); Zhu
và ctv (2002) đã sử dụng kỹ thuật phân tử để nghiên cứu sự thay đổi cấu trúc quần
thể và đặc điểm sinh học của hệ vi sinh vật đường ruột ở động vật dưới tác động của
probiotic. Tuy nhiên, cho đến nay những nhân tố nào góp phần tạo nên 1 hệ vi sinh
vật cân bằng hoặc làm rối loạn sự cân bằng của hệ vi sinh vật đường ruột cũng chưa
được hiểu biết đầy đủ (Patterson và ctv, 2003). Đã có rất nhiều nghiên cứu về vai trò
của probiotic đối với đời sống động vật như tác động của probiotic đối với hệ thống

miễn dịch ở niêm mạc ruột (Schat và Myer, 1991; Hersbberg và Mayer, 2000); đối
với sự thay đổi của niêm mạc ruột non ở vật nuôi (Glick, 1995; Fontaine và ctv,
1996; Dai và ctv, 2000; McCracken và Lorenz, 2001).
Những ảnh hưởng có lợi của probiotic thể hiện ở nhiều khía cạnh khác nhau
nhưng những hiểu biết của con người về cơ chế tác động của probiotic còn rất hạn
chế. Có một số tác giả cho rằng hiệu quả của probiotic trong việc ức chế sự phát triển
của các vi khuẩn gây bệnh trong đường tiêu hóa của động vật có ý nghĩa rất quan
trọng. Sự kìm hãm được thực hiện theo những cách sau: cạnh tranh chất dinh dưỡng,
sản xuất độc tố và các sản phẩm trao đổi (các axit béo bay hơi, các chất giống kháng
sinh...), cạnh tranh vị trí bám dính ở niêm mạc ruột và kích thích hệ thống miễn dịch
ruột (Fuller, 1989; Gibson và Fuller, 2000; Rolfe, 2000; S.C. Knight và cs, 2009).
Trong khoảng 20 năm trở lại đây, nhờ ứng dụng những tiến bộ kỹ thuật trong
lĩnh vực sinh học phân tử, đặc biệt là kỹ thuật giải trình tự axit nucleic trong nghiên
cứu phân loại và định danh các chủng vi sinh vật, công nghệ sản xuất các sản phẩm
===========================================================14
Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009
======================================================
probiotic phục vụ chăn nuôi ngày càng trở nên dễ dàng và phổ biến hơn ở nhiều nước
trên thế giới. Tuy nhiên, các kết quả nghiên cứu về sử dụng các sản phẩm probiotic
trong chăn nuôi rất khác nhau, đôi khi trái ngược nhau. Nhiều nghiên cứu bổ sung
chế phẩm probiotic trên lợn và gà cho thấy có đáp ứng tích cực (Henrich và ctv,
2006): tăng cường khả năng miễn dịch ở lợn con; tăng tỷ lệ tiêu hóa các chất dinh
dưỡng; tăng hiệu quả sử dụng thức ăn...). Bên cạnh đó cũng có nhiều nghiên cứu đã
chứng tỏ hiệu quả không rõ rệt của việc bổ sung các chế phẩm probiotic trên lợn
(Breston và ctv, 1995): không quan sát thấy ảnh hưởng tích cực của probiotic
(Lactobacillus) bổ sung trong khẩu phần cho lợn cái và đực thiến ở giai đoạn lợn
choai và vỗ béo; Navas-Sanchez và ctv (1995): khuyến cáo rằng đối với lợn con sau
cai sữa không nên sử dụng các chế phẩm probiotic; Galassi và ctv (2001): không thấy
có sự khác nhau về tỷ lệ tiêu hóa thức ăn và hiệu quả sử dụng năng lượng ở các nhóm
lợn thí nghiệm và đối chứng được ăn thức ăn có và không có bổ sung probiotic...

Có rất nhiều ý kiến khác nhau khi giải thích sự khác biệt của các kết quả
nghiên cứu, nhưng ý kiến được nhiều nhà khoa học thống nhất là các chế phẩm
probiotic tạo nên các đáp ứng tích cực ở gia súc và gia cầm chỉ khi nó có đầy đủ các
đặc tính probiotic, sự thiếu một hoặc nhiều các đặc tính của probiotic có thể là
nguyên nhân chủ yếu của các đáp ứng âm tính.
1.5.2. Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm probiotic ở Việt
nam
Ở nước ta hiện nay, việc nghiên cứu sản xuất probiotic phục vụ cho đời sống
dân sinh nói chung và chăn nuôi nói riêng còn rất mới mẻ và bắt đầu được quan tâm
trong khoảng một thập kỷ gần đây. Lê Thanh Bình và ctv (1999) đã sản xuất chế
phẩm PRO99 gồm hai chủng vi khuẩn lactic và nuôi thử nghiệm trên gà Broiler cho
thấy quần thể vi sinh vật đường ruột thay đổi theo chiều hướng tích cực, các vi khuẩn
lactic tăng, E.coli giảm rõ rệt ở nhóm gà được ăn thức ăn có thức ăn bổ sung PRO99.
Khối lượng cơ thể lúc 50 ngày tuổi của gà ở nhóm được ăn thức ăn có bổ sung
PRO99 cao hơn so với đối chứng 10,6%. Phạm Ngọc Lan và ctv (2003) đã phân lập
===========================================================15
Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009
======================================================
được hai trong số 789 chủng vi khuẩn lactic trong ruột gà. Bằng các phương pháp
nghiên cứu sinh học phân tử, nhóm tác giả đã xác định được các chủng CH123 và
CH156 có những tính chất probiotic gần với Lactobacillus agillis và Lactobacillus
salivarius (có khả năng đề kháng được với 40% axit mật; sinh trưởng được ở môi
trường pH = 4,0 và nồng độ NaCl = 6%, có hoạt tính kháng với Salmonella, E.coli)
có khả năng sử dụng như nguồn probiotic ứng dụng trong chăn nuôi. Nguyễn Thị
Hồng Hà và ctv (2003) đã sử dụng hai chủng Bifidobacterium bifidum và
Lactobacillus acidophilus để sản xuất chế phẩm probiotic, bước đầu đã nghiên cứu
được công nghệ sản xuất bằng phương pháp sấy phun. Chế phẩm sau 6 tháng vẫn có
số tế bào vi khuẩn sống ở mức 10
6
CFU/g và có khả năng ức chế vi khuẩn

Salmonella. Nguyễn Thùy Châu (2003) thông báo đã lựa chọn được chủng nấm men
Candida ultilis CM 125 cho sinh khối cao trên môi trường rỉ mật, bước đầu đã đưa ra
quy trình công nghệ sản xuất sinh khối loại nấm men này. Nguyễn La Anh và ctv
(2003) đã phân lập được chủng vi khuẩn lactic BC 5.1 từ nước bắp cải muối chua và
đã xác định được rằng chủng vi khuẩn này có tính chất probiotic và có thể sử dụng
trong chế biến thực phẩm Biochie dạng dung dịch (từ vi khuẩn Bacillus và
Lactobacillus) với mật độ 10
8
CFU/ml có tác dụng cải thiện môi trường nước nuôi
tôm, cá. Lê Tấn Hưng, Võ Thị Hồng Hạnh và ctv (2003) đã nghiên cứu sản xuất hai
chế phẩm probiotic BIO I và BIO II. Chế phẩm BIO II gồm các nhóm vi khuẩn
Lactobacillus, Bacillus và nấm men Sacharomyces phối hợp với các enzym α-
amylaza và proteaza dùng trong xử lý môi trường nước nuôi tôm, cá và chế phẩm
BIO I dùng trong chăn nuôi. Hiện nay chế phẩm BIO II đã được ứng dụng rộng rãi
nhưng chế phẩm BIO I hiệu quả sử dụng chưa cao.
Sau đây là thông tin một số sản phẩm probiotic có mặt trên thị trường:
Bảng 3: Tóm tắt một số thông tin của một vài sản phẩm probiotic có mặt trên thị
trường
Vi sinh vật sử dụng và mật độ (CFU/g)
===========================================================16
Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009
======================================================
Vi khuẩn Lactic Bacillus Nấm men
BioGuard Việt Nam 10
7
E.lac Hàn Quốc 2 x 10
7
4 x 10
7
BioSix Việt Nam 10

5
10
5
Lactacids Việt Nam 10
7
Adepro Việt Nam 10
7
Lactizym Việt Nam 6 x 10
5
Ferment Trung Quốc 10
9
Lacto-Sacc Mỹ 2,5 x 10
8
4,6 x 10
6
Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu
2.1.1. Nguồn vi sinh vật
- Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật hữu ích từ các nguồn khác nhau: chất
chứa trong đường tiêu hóa của lợn, gà; các nguồn khác nhau trong tự nhiên (đất, các
thực phẩm lên men…)
===========================================================17
Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009
======================================================
- Các vi sinh vật kiểm định: E.coli, Shigella sp., Salmonella sp… từ Bảo tàng giống
Vi sinh vật (VTCC) - Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học- Đại học Quốc gia Hà
Nội
2.1.2. Hóa chất và thiết bị sử dụng
2.1.2.1. Hóa chất
Glucoza; MgSO

4
.7H
2
O; NaCl; K
2
HPO
4
; CaCO
3
; FeCl
3
.6H
2
O; Pepton; cao nấm
men; cao malt; Tween 80; cao thịt; KI; I
2
và các hóa chất khác của hãng Merck,
Sigma…
2.1.2.2. Máy móc và dụng cụ
Các máy móc, dụng cụ được sử dụng có tại Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh vật
(VTCC) – Viện Vi Vinh Vật – Đại học Quốc gia Hà Nội. Bao gồm:
Kính hiển vi quang học (Olympus, Nhật Bản)
Nồi lên men (Hanil R&D- Hàn Quốc)
Máy sấy phun (Changzou SPD-5, Trung quốc)
Máy ly tâm lạnh C30P (Sigma, Đức)
Máy điện di ADN, máy phát hiện ADN trên gel (Biorad, Mỹ)
Máy đo pH (Horiba, Nhật Bản)
Máy lắc ổn nhiệt (Metler, Thụy Sĩ)
Máy PCR Mastercycler gradient (Eppendorf, Đức)
Máy đo quang phổ Ultrospec 3000 pro (Anh)

Tủ cấy vô trùng (Nuaire, Mỹ)
Cân điện tử (Precisa, Thụy Sĩ)
2.1.3. Môi trường nghiên cứu
2.1.3.1. Môi trường MRS (g/l):
Đường glucoza 20,0 K
2
HPO
4
2,0
CaCO
3
5,0 CH
3
COONa 5,0
Cao thịt 10,0 Triamoni xitrat 2,0
Pepton 10,0 MgSO
4
.7H
2
O 0,58
Cao nấm men 5,0 MnSO
4
.4H
2
O 0,28
===========================================================18
Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009
======================================================
Tween 80 1 ml Nước cất vừa đủ 1000 ml
pH= 7,0; khử trùng ở 121

o
C/15 phút Thạch 15,0
Môi trường dịch thể bỏ thạch và CaCO
3
2.1.3.2. Môi trường LB (g/l):
Bacto-Tryptone 10 NaCl 10
Cao nấm men 5 Nước cất vừa đủ 1000 ml
pH= 7,0; khử trùng ở 121
o
C/15 phút
2.1.3.3. Môi trường thạch thường (g/l):
Thạch 15,0 NaCl 1,0
Pepton 5,0 Nước cất vừa đủ 1000ml
Cao thịt 2,0
pH= 7,0; khử trùng ở 121
o
C/15 phút
2.1.3.4. Môi trường YM (g/l):
Glucoza 10,0 Cao nấm men 3,0
Pepton 5,0 Thạch 15,0
Cao malt 3,0 Nước cất vừa đủ 1000 ml
pH= 7,0; khử trùng ở 121
o
C/15 phút
2.1.3.5. Môi trường Mueller Hinton (g/l):
Cao thịt 2,0 Tinh bột 1,5
Axit casein Hydrolysate 17,5 Thạch 15,0
Nước cất vừa đủ 1000 ml
pH= 7,3; khử trùng ở 121
o

C/15 phút
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Các phương pháp định tính và định lượng
2.2.1.1. Định tính axit lactic
Đánh giá khả năng sinh axit của các chủng vi sinh vật bằng phương pháp đục
lỗ. Phương pháp như sau: lấy phần dịch nuôi cấy các chủng phân lập được ly tâm
lạnh 12000 vòng/phút lấy dịch trong. Nhỏ phần dịch trong vào các giếng trên đĩa
thạch đã có CaCO
3
, để ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Khả năng sinh axit của các
===========================================================19
Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009
======================================================
chủng vi khuẩn được tính đánh giá thông qua đường kính vòng trong phân giải
CaCO
3
.
∆D = D-d (mm) với D: đường kính vòng trong phân giải CaCO
3
(mm).
d: đường kính lỗ thạch (mm).
2.2.1.2. Định lượng axit lactic theo Therner [61]:
Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng hấp phụ màu của dịch axit lactic mà vi khuẩn sinh ra
với phenolphtalein. Ta xác định được hàm lượng axit lactic của mẫu.
Tiến hành: Lấy 10ml dịch lên men đã li tâm bỏ sinh khối, bổ sung 20ml nước cất và
thêm 2 giọt phenolphtalein (nồng độ 1% trong cồn 90
0
). Sau đó chuẩn độ bằng NaOH
0,1N đến khi xuất hiện màu hồng nhạt bền trong 30 giây thì dừng lại. Ghi lại thể tích
NaOH (ml) đã dùng. Độ axit được tính như sau:

% axit lactic = V
NaOH
tiêu tốn x 0,009 (g/l)
2.2.1.3. Xác định hoạt tính kháng khuẩn
Hoạt tính kháng khuẩn được xác định bằng phương pháp đục lỗ. Phương pháp
như sau: môi trường thử hoạt tính kháng khuẩn được đổ trên đĩa Petri (đã chứa vi
khuẩn kiểm định), sau khi môi trường đã đông cứng tiến hành đục lỗ thạch. Nhỏ phần
dịch trong (dịch nuôi cấy đã li tâm) vào các lỗ đã đục, để ở 4
0
C trong 6 giờ, sau đó
mang các đĩa thạch để 37
0
C. Sau 24 giờ quan sát vòng kháng khuẩn tạo thành. Hoạt
tính kháng khuẩn của các chủng vi sinh vật tuyển chọn được tính bằng đường kính
vòng kháng khuẩn ∆D.
∆D = D-d (mm) với D: đường kính vòng vô khuẩn (mm).
d: đường kính lỗ thạch (mm).
Khả năng sinh bacteriocin: dịch trong thu được sau li tâm được trung hòa bằng
NaOH 0,1N (mục đích trung hòa axit tạo thành), sau đó làm tiếp tục các bước như
===========================================================20
Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009
======================================================
trên để xác định hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn lactic được tuyển
chọn.
2.2.1.4. Xác định hoạt tính enzym
Hoạt tính enzym được xác định bằng phương pháp đục lỗ. Phương pháp như
sau: Bản thạch thử hoạt tính enzym (cơ chất tinh bột, xenluloza) được đổ trên đĩa
Petri, sau khi môi trường đã đông cứng tiến hành đục lỗ thạch. Nhỏ dịch enzym vào
các lỗ đã đục, để ở 37
0

C trong 24 giờ, sau đó nhuộm bằng thuốc thử Lugol để vòng
phân giải cơ chất hiện rõ. Đo vòng phân giải D-d (mm), D là đường kính vòng ngoài,
d là đường kính lỗ nhỏ dịch.
2.2.2. Phương pháp phân lập
2.2.2.1.Vi khuẩn lactic
Để phân lập vi khuẩn lactic từ các mẫu chất chứa trong đường tiêu hóa, các
nguồn khác nhau trong tự nhiên, sử dụng phương pháp pha loãng mẫu bằng nước vô
trùng, cấy gạt dịch pha loãng ở nồng độ 10
-3
và 10
-5
trên đĩa Petri chứa môi trường
MRS, sau đó phủ tiếp 1 lớp thạch mỏng để tạo điều kiện kị khí. Nuôi ở 37
0
C trong 48
giờ. Kiểm tra sự xuất hiện các khuẩn lạc trên đĩa Petri, tách và thuần khiết các khuẩn
lạc có vùng trong suốt xung quanh (axit phân giải CaCO
3
tạo vòng trong). Bảo quản
giống trong ống nghiệm môi trường MRS thạch nghiêng. Mỗi mẫu phân lập chọn các
khuẩn lạc có hình thái khác nhau và quan sát tế bào dưới kính hiển vi.
2.2.2.2. Vi khuẩn Bacillus
Mẫu trước khi pha loãng ở nồng độ tương tự như phân lập vi khuẩn lactic
được xử lý ở nhiệt độ 80
0
C/30 phút, sau khi pha loãng, dịch mẫu được gạt trên đĩa
Petri chứa môi trường thạch thường. Nuôi ở 37
0
C trong 48 giờ. Tách và thuần khiết
các khuẩn lạc tạo thành.

2.2.2.3. Nấm men
===========================================================21
Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009
======================================================
Phương pháp làm tương tự như trên, nhưng thay bằng môi trường YM có bổ
sung kháng sinh cloramphenicol. Nuôi cấy các đĩa Petri đã gạt mẫu ở 30
0
C. Sau 48
giờ chọn các khuẩn lạc tạo thành và soi dưới kính hiển vi quang học.
2.2.3. Phương pháp tuyển chọn
2.2.3.1. Vi khuẩn lactic
Sau khi thuần khiết các chủng vi khuẩn lactic phân lập được, tiến hành tuyển
chọn các chủng có khả năng sinh axit lactic cao (định tính) và khả năng sinh
bacteriocin kháng vi khuẩn kiểm định.
2.2.3.2. Vi khuẩn Bacillus
Sau khi thuần khiết các chủng vi khuẩn phân lập được, tiến hành tuyển chọn
các chủng có khả năng sinh enzym amylaza và xenlulaza cao và khả năng kháng vi
khuẩn kiểm định.
2.2.3.3. Nấm men
Tuyển chọn các chủng nấm men phân lập được thông qua đánh giá khả năng
kháng các vi khuẩn kiểm định.
2.2.4. Phương pháp phân loại
2.2.4.1. Phân loại vi khuẩn
 Phương pháp sinh lý, sinh hóa
Nhuộm gram
Nguyên tắc: Nhuộm Gram (phản ứng Gram) có vai trò đặc biệt trong việc phân loại
vi khuẩn. Trong quá trình nhuộm Gram, tế bào bước đầu được xử lý với tím kết tinh
và iot nên có sự tạo thành phức chất tím kết tinh iot bên trong tế bào. Khi vi khuẩn
Gram âm bị tẩy cồn, lipit của lớp màng ngoài bị hoà tan làm tăng tính thấm của màng
dẫn đến sự rửa trôi phức chất tím – iot và làm cho vi khuẩn mất màu. Khi nhuộm bổ

sung chúng sẽ bắt màu với thuốc này (Đỏ vàng với Safranin hay đỏ tía với Fuchsin).
===========================================================22
Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009
======================================================
Ở vi khuẩn Gram dương, cồn làm cho các lỗ trong peptidoglycan co lại do đó phức
chất tím – iot bị giữ lại bên trong tế bào.
Tiến hành: Dùng que cấy vô trùng lấy dịch huyền phù tế bào vi khuẩn đặt lên phiến
kính. Cố định tiêu bản bằng ngọn lửa rồi nhuộm thuốc đầu bằng dung dịch tím kết
tinh (crystal violet) trong khoảng 1 phút. Rửa bằng nước. Nhuộm tiếp bằng dung dịch
Lugol trong 1 phút. Rửa bằng nước. Phủ lên vết bôi dung dịch etanol 95% : axeton
(1:1) trong khoảng 1 phút. Lại rửa bằng nước. Sau đó nhuộm tiếp bằng thuốc nhuộm
màu đỏ (như Safranin hay Fuchsin Ziehl) trong 30 giây - Rửa qua nước, để khô, soi
kính.
Xác định khả năng đồng hóa các loại đường
1% các loại đường sử dụng thay cho glucoza trong môi trường MRS (vi khuẩn
lactic), LB (vi khuẩn Bacillus): L-arabinoza, D-riboza, D-Xyloza, D-fructoza, D-
mannoza, D-mannitol, D-sorbitol, lactoza, trehaloza, raffinoza, Na-gluconat.
Môi trường được chia vào các ống nhỏ. Cấy vi sinh vật, để 2 -3 ngày.
Đối chứng dương được cấy trên môi trường chứa glucoza, đối chứng âm được cấy
trên các môi trường không chứa nguồn đường nào.
Thử khả năng lên men nguồn đường glucoza (chỉ với vi khuẩn lactic)
Nguyên tắc: Việc phát triển trên môi trường với các hợp chất này có thể làm dẫn đến
việc tích luỹ các axit hữu cơ, các sản phẩm trung hoà, các loại khí.
Cách tiến hành: Sử dụng môi trường dịch thể (Glucoza - 2%). Cho vào mỗi ống
nghiệm 2ml môi trường cơ sở và 1 ống Durham để ngược. Khử trùng ở 121
o
C/15
phút. Bổ sung 100µl dịch vi khuẩn vào mỗi ống, nuôi cấy trong 1-2 ngày. Quan sát
khả năng sinh khí CO
2,

nếu sinh khí là lên men dị hình và ngược lại là lên men đồng
hình.
Phản ứng catalaza (chỉ với vi khuẩn lactic)
===========================================================23
Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009
======================================================
Phần lớn các chủng vi khuẩn lactic có phản ứng catalaza âm tính nhưng đặc biệt có
một số loài thuộc chi Pedioccocus lại có phản ứng catalaza dương tính gọi là
“Catalaza giả” như P. pentosaceus do chúng không nhảy cảm với cyanide và azide
và không chứa một nhóm giả của Haem (C
34
H
32
0
4
N
2
Fe).
Tiến hành: Nhỏ trực tiếp vài giọt H
2
O
2
3% lên bề mặt khuẩn lạc vi khuẩn, quan sát sự
xuất hiện bọt khí bằng mắt thường.
 Phương pháp sinh học phân tử
Xác định trình tự rARN 16S của các chủng vi khuẩn theo phương pháp của Sakiyama
và cs (2009).
Tách chiết ADN
- Ly tâm 1.5ml dịch nuôi vi khuẩn lấy sinh khối tế bào.
- Hoà sinh khối tế bào trong 100 µl TE ( TE buffer: 15 mM Tris-HCl +1 mM EDTA

(pH 7,5)).
- Thêm 0,4 mg lysozym. Trộn đều, ủ 37
0
C/1 giờ. Trộn đều 3 phút.
- Thêm 100 µl SDS 10% (w/v), trộn đều 2-3 phút trộn thật kỹ, ủ 37
0
C/30 phút.
- Thêm một thể tích tương đương phenol: chloroform: isoamyl alcohol (PCI), trộn
đều. Ly tâm 15000v/p, 15phút. Chuyển lớp dịch phía trên sang ống eppendoft khác.
- Thêm 8 µl ARNaza 3 mg/ml, trộn đều, ủ ở 37
o
C trong 30 phút.
- Thêm 12 µl proteinaza K (5 mg/ml), trộn đều, ủ 15 phút ở 56
0
C.
- Thêm một thể tích tương đương phenol: chloroform: isoamyl alcohol (PCI), trộn
đều. Ly tâm 15000v/p, 15phút. Chuyển lớp dịch phía trên sang ống eppendoft khác.
- Thêm 1 thể tích tương đương chloroform: isoamyl alcohol, trộn đều, ly tâm
15000v/p, 15phút. Chuyển lớp dịch phía trên sang ống eppendoft khác.
- Thêm 1/ 10 V Natri axetat 3M và 1ml Etanol 100%, đảo trộn. Đặt trong đá 30 phút.
Ly tâm 15000v/p trong 15 phút. Bỏ lớp dịch trên.
- Rửa tủa bằng Etanol 70%.
- Làm khô ADN bằng máy cô quay chân không.
- Hoà tan ADN trong 50-100µl nước hoặc TE.
===========================================================24
Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009
======================================================
- Kiểm tra các sản phẩm của PCR bằng điện di:
Đun tan 1% agaroza (dung dịch 50X TAE: 2ml, nước cất: 98 ml, agaroza: 1g)
để ấm, đổ vào khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngập trong

300ml dung dịch 1 X TAE. Trộn 2 µl dung dịch 6X loading buffer với 5 µl mẫu trộn
đều, nhỏ vào giếng. Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế 100V, cưòng
độ dòng điện 80 mA trong 30 phút, bỏ ra ngâm trong dung dịch EtBr (nồng độ 0,5
µl/ml) 20 phút vớt ra. Quan sát trên máy soi gel
Phản ứng khuếch đại ADN.
Thành phần phản ứng:
Thành phần
Thể tích (µl)
10X buffer 10
MgCl
2
8
dNTP 2.0 mM 10
Primer xuôi (10 pmol/µl)
2
Primer ngược (10 pmol/µl)
2
Taq polymerase 2
Template 1-2
H
2
O cho đủ 100
Chu trình nhiệt:
95
0
C - 3 phút
95
0
C - 30giây
56

0
C - 15 giây 30 chu kỳ
72
0
C - 1 phút
72
0
C - 5 phút
4
0
C - ∞
Primer:
Primer xuôi : 27F 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'.
Primer ngược: 1525R 5'-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3'
- Kiểm tra các sản phẩm của PCR bằng điện di
Đun tan 1% agaroza (dung dịch 50X TAE: 2ml, nước cất: 98 ml, agaroza: 1g)
để ấm, đổ vào khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngập trong
===========================================================25