Báo cáo y học: "Phát hiện virut EBV trên bệnh nhân ung thư vòm họng bằng phản ứng PCR" pdf

Phỏt hin virut EBV trờn bnh nhõn ung th vũm hng bng phn ng
PCR

Lờ Thanh H*; Nguyn Lnh Ton*
Nguyn ỡnh Phỳc**; Lờ Thanh Hũa***
Tóm tắt
T bnh phm l mụ sinh thit ca 3 bnh nhõn (BN) c chn oỏn ung th vũm hng
(UTVH), phỏt hin h gen EBV bng phn ng PCR. S dng k thut dũng húa v gii trỡnh t,
ton b chui ARN thụng tin on gen LMP-1 ca EBV c xỏc nh trong c 3 mu bnh phm
nghiờn cu.
* T khoỏ: Ung th vũm mi hng; EBV; LMP-1.

Detect Epsstein-Barr virus in patients with nasopharyngeal carcinoma by
polymerase chain reaction

Summary
Genomic DNA from biopsy tissue of 3 patients with nasopharyngeal carcinoma (NPC) was
extracted. Using PCR, cloning and sequencing, the entire mRNA of the LMP-1 gene of EBV was
detected. We detected EBV in biopsy tissue of these 3 patients.
* Key words: Nasopharyngeal carcinoma; EBV; LMP-1.

T VN đề
Ung th vũm mi hng l mt loi khi
u ỏc tớnh xut phỏt t lp biu mụ ph ca
vựng vũm mi hng. Loi ung th ny
c xp vo cỏc khi u biu mụ ca
ng tiờu hoỏ v hụ hp trờn, l mt
trong 5 loi ung th ph bin nht ngi
Vit Nam v hay gp nht trong ung th
vựng tai mi hng. Trờn th gii, cng hay
gp cỏc nc vựng ụng Nam v phớa

nam Trung Qu
c [6].
V nguyờn nhõn ca bnh, cú rt nhiu
gi thit, tp trung thnh ba nhúm ch yu
ú l do virut Epstein-Barr, do di truyn v
do cỏc yu t mụi trng, tp quỏn n
ung, hoỏ cht. Trong thi gian gn õy, cú
rt nhiu cụng trỡnh nghiờn cu ca cỏc tỏc
gi trong v ngoi nc v mi liờn quan
gia virut Epstein-Barr v ung th vũm mi
hng.
EBV l mt thnh viờn thuc nhúm herpesvirut
týp 4 gõy nhim bnh trờn ngi [3]. Cu trỳc

* Bệnh viện 103
** Học viện Quân y
*** Viện Công nghệ Sinh học
Phản biện khoa học: PGS. TS. Nguyễn Thái Sơn
h gen ca EBV l chui ADN xon kộp,
mch h, kớch thc khong 172 kb. H
gen ca EBV gm 6 t hp gen mó húa cho
cỏc loi protein khỏng nguyờn, ký hiu l
EBNA, ú l EBNA-1, EBNA-2, EBNA-3A,
EBNA-3B, EBNA-3C v EBNA-LP v 3 t
hp gen mó húa cho protein mng l LMP-
1, LMP-2A v LMP-2B [1, 5].
Nhiễm tiềm tàng EBV là khởi đầu sớm
cho quá trình tiến triển ung thư [8]. Trong
các protein có vai trò quan trọng đối với quá
trình tiến triển thành UTVH ở giai đoạn

sớm, LMP-1 là một loại đặc biệt do protein
này có khả năng gây ung thư thực nghiệm
trên chuột và LMP-1 cũng có khả năng gây
ra nhiều kiểu biến đổi kiểu hình tế bào
lympho B và tế bào biểu mô khác [2]. Một
bằng chứng quan trọng chứng minh vai trò
của LMP-1 trong quá trình tiến tri
ển UTVH
là protein LMP-1 biểu hiện và tìm thấy trong
78% số mẫu mô bệnh nhân UTVH. Sản
phẩm ARN thông tin của LMP-1 là kết quả
ghép-nối (splicing) của 3 chuỗi exon, chịu
trách nhiệm tổng hợp protein màng có phân
tử lượng là 63 kDa. LMP-1 có mức độ biến
đổi cấu trúc rất cao giữa các chủng, đặc
biệt ở vùng gen của exon 3 tại đầu 3’, trong
đó có những chủng EBV phân lập ở Việt
Nam [4, 7].
Trong nghiên cứu này sử dụng phản
ứng PCR, k
ỹ thuật dòng hóa và giải trình tự
để xác định sự tồn tại đoạn gen LMP-1 của
EBV trong mẫu mô sinh thiết của 3 BN được
chẩn đoán xác định là UTVH.
ĐèI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
nghiªn cøu
1. Đối tượng nghiên cứu.
Mẫu mô sinh thiết của BN UTVH tại
Bệnh viện Tai Mũi Họng TW được sử dụng
để tách ADN tổng số, bao gồm cả hệ gen

của virut.
2. Phương pháp nghiên cứu.
* Phản
ứng PCR:
Phản ứng PCR được thực hiện dùng
cặp mồi do chúng tôi thiết kế như sau:
LMP1F (mồi xuôi):
5’-ATGGAACGCGACCTTGAGAG-3’
LMP1R (mồi ngược):
5’-TTAGTCATAGTAGCTTAGCTGAAC-3’
Sản phẩm của toàn bộ gen LMP-1 có kích
thước 1,3 - 1,35 kb, thay đổi tuỳ từng chủng.
Chu trình nhiệt của phản ứng như sau:

nhiÖt ®é thêi gian sè chu kú
94
0
C 5 phút 1
94
0
C 1 phút
55
0
C 1 phút
72
0
C 2 phút
35
72
0

C 10 phút 1
4
0
C Nhiệt độ bảo quản tạm thời sản phẩm

* Dòng hóa và giải trình trình tự:
Sản phẩm đoạn gen LMP-1 của EBV,
sau khi tinh sạch, dòng hoá vào plasmid
vector pCR2.1 (Invitrogen Inc.). Chọn lọc và
tách chiết ADN plasmid tái tổ hợp theo quy
trình của hãng Bioneer (Hàn Quốc). Trình
tự nucleotid ADN của plasmid tái tổ hợp
mang gen LMP-1 được giải trình trên máy
tự động ABI-3100 Genetic Analyzer. Phân
tích chuỗi nucleotid bằng các chương trình
SeqEd1.03, AssemblyLIGN1.9, MacVector
8.2 (Accelrys Inc.) và so sánh đối chiếu
bằng chương trình GENEDOC 2.6.002 (http://
www.nrbsc.org/gfx/genedoc/).
28

KÕT QUẢ nghiªn cøu
VÀ BµN LUẬN
1. Kết quả thực hiện PCR, dòng hoá
sản phẩm và tách dòng.
Bằng cặp mồi LMP1F-LMP1R, sản phẩm
PCR thu được có kích thước dự kiến
khoảng 1.300 bp. Kết quả điện di kiểm tra
sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8% trình
bày ở hình 1 cho thấy đoạn ADN của EBV

có độ dài khoảng 1.300 bp. Như vậy, hệ
gen của EBV đã được tách từ mô sinh thiết
của BN UTVH và sau khi thực hiện PCR đã
cho sản phẩm ADN có chất l
ượng và kích
thước phù hợp.










Hình 1: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm
PCR trên thạch agarose 0,8%. M: Thang
chuẩn ADN. Đường chạy 1 - 3: sản phẩm
PCR 3 mẫu ADN lần lượt của BN 1, 2, 3.
Kiểm tra sản phẩm dòng hóa bằng điện
di trên thạch agarose 0,8% (hình 2). Khi cắt
ADN plasmid tái tổ hợp có chứa sản phẩm
PCR (gen LMP-1) đã cho 2 băng ADN: 3,9
kb của vector và khoảng 1.300 bp của gen
LMP-1 đang nghiên cứu.

M 1 2 3

H×nh 2: Kết quả t¸ch dßng đoạn gen LMP-1
EBV trên thạch agarose 0,8%. M: Thang
chuẩn AND. Đường chạy 1 - 3: sản phẩm
tách dòng 3 mẫu ADN lần lượt của BN 1, 2,
3.

2. Kết quả giải trình tự gen LMP-1.
Đoạn ADN thu được gọi là khung gen
của LPM-1, kích thước khoảng 1,3 kb,
chính xác hơn sau khi phân tích là 1.268
bp, bao gồm 3 exon và 2 intron, có cấu trúc
giống như tất cả các khung gen LMP-1 của
các chủng trên thế giới [4].





30 60 90 120
A
TGGAACGCGACCTTGAGAGGGGCCCACCGGGCCCGCCACGGCCCCCTCTAGGACCCCCCCTCTCCTCTTCCATAGGCCTTGCTCTCCTTCTCCTGCTCTTGGCGCTACTGTTCTGGCTG

M E R D L E R G P P G P P R P P L G P P L S S S I G L A L L L L L L A L L F W L>
_
_________________________________________________EBVS7-VN-mRNA_________________________________________________________>

150 180 210 240
TATATCATTATGAGTGACTGGGCTGGAGGAGCGCTCCTTGTCCTCTATGCCTTTGCTCTAATGCTTATTATTATCATTCTGATCATCTTTATCTTCAGAAGAGACCTTCTCTGTCCACTT
Y I I M S D W A G G A L L V L Y A F A L M L I I I I L I I F I F R R D L L C P L>
_
_________________________________________________EBVS7-VN-mRNA_________________________________________________________>

270 300 330 360
GGAGGTTTTGGTCTACTCCTACTGATGATCACCCTCCTGCTCATCGCTCTTTGGAATTTGCACGGACAGGCATTGTACCTTGGAATTGTGCTGCTCATCTTCGGCTGCTTACTTGTCTTA
G G F G L L L L M I T L L L I A L W N L H G Q A L Y L G I V L L I F G C L L V L>
_
_________________________________________________EBVS7-VN-mRNA_________________________________________________________>

390 420 450 480
GGTCTCTGGATCTACTTCTTGGAGATTCTCTGGCGGCTTGGTGCCACCATCTGGCAGCTTTTGGCCTTCATCCTAGCCTTCTTCCTAGACATCATCCTGCTTATTATTACTCTCTATCTA
G L W I Y F L E I L W R L G A T I W Q L L A F I L A F F L D I I L L I I T L Y L>
_
______________________________________________
_
__EBVS7-VN-mRNA_________________________________________________________>

510 540 570 600
CAACAAAACTGGTGGACTCTATTGGTTGATCTCCTTTGGCTCCTCCTGTTTCTGGCCATTTTAATCTGGATGTATTACCATGGACAACGACACACTGATGAACACCACCACGATGACTCC
Q Q N W W T L L V D L L W L L L F L A I L I W M Y Y H G Q R H T D E H H H D D S>
_
_________________________________________________EBVS7-VN-mRNA_________________________________________________________>

630 660 690 720
CTCCCGCACCCTCAACAAGCTACCGACGATTCTAGCCATGAATCTGACTCTAACTCCAACGAGGGCAGACACCACCTGCTCGTAACTGGAGGCGCCGACGGACCCCCACTCTGCTCTCAA
L P H P Q Q A T D D S S H E S D S N S N E G R H H L L V T G G A D G P P L C S Q>
_
_________________________________________________EBVS7-VN-mRNA_________________________________________________________>

750 780 810 840
A
ACCTACGCGCACCTGGATGTGGTCCTGACAATGGCCCACAGGACCCTGACAACACTGATGCCAATGGCCCACAGGACCCTGACAACACTGATGACAATGGCCCACAGGACCCTGACACC
N L R A P G C G P D N G P Q D P D N T D A N G P Q D P D N T D D N G P Q D P D T>
EBVS7-
V
N-mRNA
>
30 60 90 120
A
TGGAACGCGACCTTGAGAGGGGCCCACCGGGCCCGCCACGGCCCCCTCTAGGACCCCCCCTCTCCTCTTCCATAGGCCTTGCTCTCCTTCTCCTGCTCTTGGCGCTACTGTTCTGGCTG
M E R D L E R G P P G P P R P P L G P P L S S S I G L A L L L L L L A L L F W L>
_
_________________________________________________EBVS7-VN-mRNA_________________________________________________________>

150 180 210 240
TATATCATTATGAGTGACTGGGCTGGAGGAGCGCTCCTTGTCCTCTATGCCTTTGCTCTAATGCTTATTATTATCATTCTGATCATCTTTATCTTCAGAAGAGACCTTCTCTGTCCACTT
Y I I M S D W A G G A L L V L Y A F A L M L I I I I L I I F I F R R D L L C P L>
_
_________________________________________________EBVS7-VN-mRNA_________________________________________________________>

270 300 330 360
GGAGGTTTTGGTCTACTCCTACTGATGATCACCCTCCTGCTCATCGCTCTTTGGAATTTGCACGGACAGGCATTGTACCTTGGAATTGTGCTGCTCATCTTCGGCTGCTTACTTGTCTTA
G G F G L L L L M I T L L L I A L W N L H G Q A L Y L G I V L L I F G C L L V L>

_
_________________________________________________EBVS7-VN-mRNA_________________________________________________________>

390 420 450 480
GGTCTCTGGATCTACTTCTTGGAGATTCTCTGGCGGCTTGGTGCCACCATCTGGCAGCTTTTGGCCTTCATCCTAGCCTTCTTCCTAGACATCATCCTGCTTATTATTACTCTCTATCTA
G L W I Y F L E I L W R L G A T I W Q L L A F I L A F F L D I I L L I I T L Y L>
_
______________________________________________
_
__EBVS7-VN-mRNA_________________________________________________________>

510 540 570 600
CAACAAAACTGGTGGACTCTATTGGTTGATCTCCTTTGGCTCCTCCTGTTTCTGGCCATTTTAATCTGGATGTATTACCATGGACAACGACACACTGATGAACACCACCACGATGACTCC
Q Q N W W T L L V D L L W L L L F L A I L I W M Y Y H G Q R H T D E H H H D D S>
_
_________________________________________________EBVS7-VN-mRNA_________________________________________________________>

630 660 690 720
CTCCCGCACCCTCAACAAGCTACCGACGATTCTAGCCATGAATCTGACTCTAACTCCAACGAGGGCAGACACCACCTGCTCGTAACTGGAGGCGCCGACGGACCCCCACTCTGCTCTCAA
L P H P Q Q A T D D S S H E S D S N S N E G R H H L L V T G G A D G P P L C S Q>
_
_________________________________________________EBVS7-VN-mRNA_________________________________________________________>

750 780 810 840
A
ACCTACGCGCACCTGGATGTGGTCCTGACAATGGCCCACAGGACCCTGACAACACTGATGCCAATGGCCCACAGGACCCTGACAACACTGATGACAATGGCCCACAGGACCCTGACACC
N L R A P G C G P D N G P Q D P D N T D A N G P Q D P D N T D D N G P Q D P D T>
EBVS7-
V
N-mRNA

>
0.5kb
2.3kb
9.4kb
23.0kb
4.3kb
6.5kb
2.0kb
M 1 2 3
0.5k
2.3k
2.0k
4.3k
6.5k
9.4k
23.0k













Hình 3: Trình tự mARN gen LMP-1 của EBV (1.116 bp).

Mũi tên chỉ dẫn vị trí ghép nối giữa exon 1 và 2,
giữa exon 2 và 3 để tạo nên mARN hoàn chỉnh.


Sau khi bỏ 2 intron, chúng tôi thu được chuỗi nucleotid ARN thông tin của 1 chuỗi gen có
độ dài 1.113 bp. Kết quả giải trình tự và sắp xếp nulceotid và acid amin của gen LMP-1 của
một chuỗi (hình 3).

KÕT LUẬN
Sử dụng cặp mồi LMP1F-LMP1R, chúng tôi đã thực hiện thành công phản ứng PCR 3
mẫu ADN tách chiết từ mô sinh thiết của 3 BN được chẩn đoán UTVH. Sản phẩm thu được
đã dòng hóa và giải trình tự gen, phân tích kết quả cho thấy đây chính là đoạn gen LMP-1
của EBV. Kết quả cuối cùng cho thấy trong cả 3 mẫu sinh thiết của 3 BN UTVH đều có tồn
tại EBV. Như vậy, có thể sử dụng quy trình trong nghiên cứu này
để phát hiện EBV ở BN
UTVH.
30
TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Nguyễn Đình Phúc và Lê Thanh Hòa. Virut Epstein-Barr gây ung thư vòm mũi họng và một số
phương pháp hiện đại ứng dụng trong chẩn đoán. Tổng quan. Tạp chí Công nghệ Sinh học. 2008, 6
(2), tr.1-18.
2. Cohen JI. Virology and molecular biology of Epstein-Barr virus. In Epstein-Barr virus. Edited by
Tselis A and Jenson HB. Taylor and Francis Group LLC, New York NY.2006, pp.21-37.
3. Kaye KM, Izumi KM, Kieff E. Epstein-Barr virus latent membrane protein 1 is essential for B-
lymphocyte growth transformation. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 1993, 90 (19),
pp.9150-9154.
4. Middeldorp JM, Brink AA, van den Brule AJ, Meijer CJ. Pathogenic roles for Epstein-Barr virus
(EBV) gene products in EBV-associated proliferative disorders. Crit Rev Oncol Hematol. 2003, 4 (1),
pp.1-36.

5. Miller WE, Edwards RH, Walling DM and Raab-Traub N. Sequence variation in the Epstein-Barr
virus latent membrane protein 1. J Gen Virol. 1994, 75 (10), pp.2729-2740.
6. Murray PG and Young LS. Epstein-Barr virus infection: basis of malignancy and potential for
therapy. Expert Rev Mol Med. 2001, 3 (28), pp.1-20.
7. Nguyen-Van D, Ernberg I, Phan-Thi Phi P, Tran-Thi C, Hu L. Epstein-Barr virus genetic variation
in Vietnamese patients with nasopharyngeal carcinoma: full-length analysis of LMP1. Virus Genes. 2008,
37 (2), pp.273-281.
8. Pathmanathan R, Prasad U, Sadler R, Flynn K, Raab-Traub N. Clonal proliferations of cells
infected with Epstein-Barr virus in preinvasive lesions related to nasopharyngeal carcinoma. The New
England Journal of Medicine. 1995, 333, pp.693-698.