Đề tài “Tìm hiểu về Bromelain enzyme, chiết suất và ứng dụng” ppsx

Mục lục


Đề tài “Tìm hiểu về Bromelain enzyme, chiết
suất và ứng dụng”
i
Mục lục
MỤC LỤC
Mục lục
Danh mục bảng iii
Danh mục hình iv
Lời mở đầu 1
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU TỔNG QUAN 2
1.1 Đặc điểm nguồn nguyên liệu 2
1.2 Enzyme 3
1.2.1 Phân loại 3
1.3 Enzyme Bromelain 3
1.3.1 Cấu tạo hóa học 4
1.3.2 Cấu trúc không gian 4
1.3.3 Tính chất vật lý 5
1.3.4 Hoạt tính của Bromelain 5
a. Hoạt tính phân giải 5
b. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính Bromelain 6
CHƯƠNG 2: NHỮNG ỨNG DỤNG CỦA ENZYME BROMELAIN 8
2.1 Ứng dụng trong y dược 8
2.1.1 Bromelain giảm thiểu viêm xoang 8
2.1.2 Bromelain làm liền sẹo 9
2.1.3 Bromelain giảm đau nhức do hư khớp 9
2.1.4 Bromelain làm tăng hệ miễn dịch 9
2.1.5 Bromelain và bệnh hen suyễn 9
2.1.6 Bromelain và HIV 9

2.2 Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm 10
2.2.1 Bromelain làm mềm thịt 10
2.2.2 Bromelain sử dụng trong quá trình đông tụ sữa 10
2.2.3 Bromelain trong chế biến thủy sản 10
2.3 Ứng dụng trong công nghiệp dệt may 10
2.4 Ứng dụng trong công nghiệp thuộc da 10
2.5 Bromelain dùng để thu nhận các chất ức chế protease 10
2.6 Ứng dụng làm thực phẩm chức năng 11
CHƯƠNG 3: CÁC PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN VÀ TINH SẠCH ENZYME
BROMELAIN 13
3.1 Các phương pháp thu nhận enzyme Bromelain 13
3.1.1 Phương pháp siêu lọc 13
i
Mục lục
a. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình siêu lọc 13
b. Các kiểu siêu lọc 14
c. Những thuận lợi của phương pháp siêu lọc 15
3.1.2 Phương pháp kết tủa 15
3.1.3 Phương pháp hấp phụ 18
3.2 Các phương pháp tinh sạch enzyme Bromelain 18
i
Mục lục
3.2.1 Phương pháp thẫm tích 18
3.2.2 Phương pháp lọc Sephatex G-50 18
3.2.3 Phương pháp sắc kí 19
Kết luận 20
Tài liệu tham khảo 21

ii
Danh mục bảng

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1 Những tính chất vật lý của Bromelain thân 5
Bảng 1.2 Hoạt tính phân giải casein của Bromelain 6
Bảng 1.3 Hoạt tính phân giải Benzoyl – L – Arginine amide của Bromelain 6

iii
Danh mục hình
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Cấu trúc sợi hydrate carbon của Bromelain 4
Hình 2.1 Dược phẩm Bromelain có hoạt lực cao (1200 gdu/g hay 1800mcu/g) 12
Hình 2.2 Dược phẩm chức hàm lượng Bromelin cao 12
Hình 2.3 Thực phẩm chức năng gồm tinh chất Bromelain và Curcumin 12
Hình 2.4 Quercetin & Bromelain: Thuốc giúp bệnh Gút 12
Hình 2.5 Medizym: chống viêm, liền sẹo 12
Hình 2.6 Dứa enzyme: Complex – 800 GDU 12
Hình 3.1 Lọc cross - flow 13
Hình 3.2 Kiểu một bước 14
Hình 3.3 Kiểu lô 14
Hình 3.4 Kiểu thể tích không đổi 15
Hình 3.5 Quy trình thu nhận enzyme Bromelain 17
Hình 3.6 Cấu tạo của kaolin 18
iv
Lời mở đầu
LỜI MỞ ĐẦU
Ngày nay với sự tiến bộ và phát triển không ngừng của khoa học thì nhu cầu về sản
phẩm của Khoa học Công nghệ ngày càng cao, đặc biệt là công nghệ enzyme. Việc
sản xuất enzyme từ các nguồn động, thực vật và vi sinh vật có vai trò quan trọng vì
được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như công nghiệp và đời sống, đặc
biệt có thể giúp cải tiến được nhiều quy trình chế biến, nâng cao chất lượng, hạ giá
thành sản phẩm, rút ngắn thời gian sản xuất và đáp ứng được những nhu cầu như an

toàn sinh học, không gây bệnh đối với người. Một trong những enzyme quan trọng
trong cuộc sống đó là enzyme Bromelain nó được ứng dụng trong công nghiệp, thực
phẩm và quan trọng nhất là trong y dược.
Với những đặc điểm và tầm quan trọng của enzyme Bromelain Đề tài “Tìm
hiểu về Bromelain enzyme, chiết suất và ứng dụng” được thực hiện nhằm ly trích
và giúp hiểu được tầm quan trọng của enzyme Bromelain trong cuộc sống.
1
Chương 1: Giới thiệu tổng quan
CHƯƠNG 1
GIỚI THIỆU TỔNG QUAN
1.1 Đặc điểm nguồn nguyên liệu
Dứa là cây ăn quả nhiệt đới, có nguồn gốc ở
Nam Mỹ (Brazil, Argentina, Paraguay), hiện ở những
vùng này vẫn có thể tìm thấy nhiều giống dứa hoang
dại.
Hiện nay trên thế giới, cây dứa được trồng hầu
hết ở các nước trừ ở Châu Âu. Các nơi trồng nhiều như
là: Hawaii, Brazil, Philipines, Thailand…Ở nước ta,
dứa trồng từ Bắc đến Nam, diện tích trồng cả nước khoảng 40.000 ha với sản lượng
khoảng 500.000 tấn, trong đó 90% ở khu vực phía Nam. Các tỉnh trồng dứa nhiều ở
miền Nam là Kiên Giang, Tiền Giang, Cà Mau…miền Bắc có Thanh Hóa, Tuyên
Quang, Phú Thọ…miền Trung có Nghệ An, Quảng Nam…
Trên thế giới có khoảng 60-70 giống dứa và được chia thành 7 nhóm, trong đó
có 3 nhóm trồng phổ biến là nhóm Cayenne, nhóm Queen và nhóm Spanish.
- Nhóm Cayenne là nhóm dứa trồng phổ biến nhất trên thế giới, chiếm khoảng
80% diện tích. Ở nước ta mới trồng ở một số ít nơi như Vĩnh Phúc, Nghệ An, Lâm
Đồng. Dứa thuộc nhóm này có quả lớn nhất, mắt phẳng và nông. Thịt quả kém
vàng, nhiều nước, ít ngọt và kém thơm hơn dứa Queen.
- Nhóm Queen còn gọi là dứa Hoàng Hậu, dứa hoa, dứa tây. Đây là nhóm dứa
trồng phổ biến nhất ở nước ta hiện nay, với các giống dứa tây, giống dứa Na Hoa ở

phía Bắc, các giống Queen Long An, Kiên Giang ở các tỉnh Đồng bằng sông Cửu
Long (còn gọi là khóm hoặc thơm). Dứa thuộc nhóm này có quả tương đối nhỏ, mắt
lồi. Thịt quả vàng đậm, giòn, hương thơm, vị chua và ngọt lâu. Nhóm này có chất
lượng cao nhất, trên thế giới thường dùng để ăn tươi.
- Nhóm Spanish còn gọi là dứa Tây Ban Nha, dứa ta. Nhóm này được trồng ở
Thailand, Cuba… Quả dứa thuộc nhóm này lớn hơn dứa Queen, mắt sâu. Thịt quả
vàng nhạt, có chỗ trắng, vị chua ít thơm nhưng nhiều nước hơn dứa hoa. Dứa nhóm
này chịu bóng râm, ít dập nát khi vận chuyển và hàm lượng đường thấp nên không
được phát triển.
2
Chương 1: Giới thiệu tổng quan
1.2 Enzyme
- Trong cơ thể sống (các tế bào) luôn luôn xảy ra quá trình trao đổi chất. Sự
trao đổi chất mà ngừng lại thì sự sống sẽ không còn tồn tại. Quá trình trao đổi của
một chất là tập hợp của rất nhiều các phản ứng hóa học phức tạp. Enzyme là hợp
chất protein xúc tác cho các phản ứng hóa học đó. Chúng có khả năng xúc tác đặc
hiệu các phản ứng hóa học nhất định và đảm bảo cho các phản ứng xảy ra theo một
chiều hướng nhất định với tốc độ nhịp nhàng trong cơ thể sống.
- Enzyme có trong hầu hết các loại tế bào của cơ thể sống. Chính do những tác
nhân xúc tác có nguồn gốc sinh học nên enzyme còn được gọi là các chất xúc tác
sinh học (biocatalysators) nhằm phân biệt với các chất xúc tác hóa học.
- Chúng là chất xúc tác sinh học không chỉ có vai trò quan trọng trong quá
trình sinh trưởng, phát triển của mọi sinh vật mà nó còn giữ vai trò rất quan trọng
trong các lĩnh vực khác như: công nghệ chế biến thực phẩm, trong kỹ thuật phân
tích, trong công nghệ gen vào bảo vệ môi trường, đặc biệt là trong y học với ứng
dụng sản xuất dược phẩm.
1.2.1 Phân loại
- Ngày nay ngày càng nhiều enzyme mới được phát hiện, và để thống nhất tên
gọi enzyme người ta đã phân tất cả enzyme làm 6 loại:
Oxidoreductase: là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hoá khử.

Transferase: là nhóm enzyme xúc tác phản ứng chuyển vị một nhóm (gốc) nào
đó từ chất này sang chất khác.
Hydrolase: là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân (phản ứng cắt có
sự tham gia của nước).
Lyase: là nhóm các enzyme xúc tác quá trình phân cắt một nhóm nào đó ra
khỏi hợp chất mà không có sự tham gia của nước.
Izomerase: là nhóm enzyme xúc tác sự đồng phân hoá, chuyển dạng đồng
phân này sang dạng đồng phân khác.
Ligase: là nhóm enzyme xúc tác sự tổng hợp chất hữu cơ nhờ năng lượng
ATP và các chất tương tự.
1.3 Enzyme Bromelain
- Bromelain là protein-enzyme có nhiều trong quả dứa và có một ít trong quả
chuối, enzyme này được phát hiện từ giữa thế kỉ 19 nhưng mới được nghiên cứu từ
giữa thế kỷ 20. Ở nước ta nghiên cứu về bromelain được bắt đầu từ những năm 1968
-1970.
3
Chương 1: Giới thiệu tổng quan
- Bromelain là nhóm protease thực vật có mã số EC-3.4.22.33 được thu nhận
từ họ bromeliaceae, đặc biệt là từ thân và trái dứa. Ở mỗi bộ phận khác nhau thì
bromelain có pH tối ưu khác nhau và cấu tạo cũng có sự khác nhau.
- Bromelain có trong toàn bộ cây dứa, nhưng nhiều nhất là trong quả.
Bromelain là nhóm endoprotease có khả năng phân cắt các liên kết peptide nội phân
tử protein để chuyển phân tử protein thành các đoạn nhỏ gọi là các peptide
[5]
.
- Thành phần chủ yếu của bromelain có chứa nhóm sulfurhydryl thủy giải
protein. Khi chiết tách và tinh sạch phân đoạn có chứa nhóm sulfurhydryl của
bromelain thì thu được một enzyme thủy phân protein hiệu quả in vitro
[1]
.

1.3.1 Cấu tạo hoá học
- Bromelain thân là một protease nhưng nó khác với các protease thực vật khác
như papain, ficin ở chỗ nó là một glycoprotein, mỗi phân tử có glycan gồm 3
manose, 2 glucosamine, 1 xylose, và 1 fructose
[1]
.
- Các nghiên cứu ghi nhận, polypeptide của bromelain thân có acid amin đầu –
NH
2
là valine và đầu carboxyl là glycine; còn đối với bromelain quả, acid amin đầu
–NH
2
là alanine
[1]
.
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
CH OH
2
CH OH
2

CH OH
2
OH
OH
NHCONH
3
NHCONH
3
NHCOCH
2
C
N
CH
CH
2
Fructose
Maltose
Maltose
Maltose
Xylose
Glucofamine
Hình 1.1: Cấu trúc sợi hydrate carbon của bromelain
1.3.2 Cấu trúc không gian
- Murachi và Busan phân tích cấu trúc bậc 1 của bromelain và nhận thấy cách
sắp xếp amino acid trong phân tử bromelain như sau:
- Ser – Val – Lys – Asn – Gln – Asn – Pro – Cys – Gly – Ala – Cys – Tryp -
- Gly – Cys – Lys -
4
Chương 1: Giới thiệu tổng quan
- Bromelain là một protease trong tâm hoạt động có chứa cysteine và hai sợi

polypeptide liên kết với nhau bằng cầu nối - S – S Phân tử có dạng hình cầu do có
cách sắp xếp phức tạp.
- Trong phân tử bromelain thân có chứa nhóm sulfurhydryl có vai trò chủ yếu
trong hoạt tính xúc tác và trong mỗi phân tử có tất cả 5 cầu nối disulfite. Ngoài ra,
trong phân tử còn có các ion Zn
2+
có lẽ có vai trò trong duy trì cấu trúc không gian
của enzyme.
1.3.3 Tính chất vật lí
- Murachi và cộng sự năm 1964 đã nghiên cứu về tính chất vật lý của enzyme
bromelain trích từ thân cây dứa và thấy như sau:
Bảng 1.1 Những tính chất vật lý của bromelain thân
Tính chất Ký hiệu Số liệu
Hằng số sa lắng S (s) 2.73
Hằng số khuếch tán D (cm
2
/ s) 7.77 x 10
-7
Thể tích riêng phần V (ml/g) 0.743
Độ nhớt bên trong [ I ] (dl/g) 0.039
Tỷ số ma sát f / f
o
1.26
Điểm đẳng điện pI 9.55
Sự hấp thu A
1%
cm
ở 280nm 20.1
Trọng lượng phân tử
32.000

*
32.100
**
35.500
***
*
: Tính bằng phương pháp sa lắng - khuếch tán
**
: Tính từ hằng số sa lắng và độ nhớt bên trong
***
: Tính bằng phương pháp Archibald
1.3.4 Hoạt tính của bromelain
a. Hoạt tính phân giải
- Bromelain có 3 hoạt tính: peptidase, amidase và esterase, hoạt tính esterase ở
bromelain hơn papain trong đu đủ và ficin trong cây thuộc họ Sung
[1]
.
- Khả năng phân giải các cơ chất tự nhiên của bromelain.
Bảng 1.2: Hoạt tính phân giải casein của bromelain
Cơ chất
Hoạt tính phân giải casein ( UI/mg)
Bromelain thân Bromelain quả xanh Bromelain quả chín
5
Chương 1: Giới thiệu tổng quan
Casein 7.4 4.0 3.0

- Đối với cơ chất là casein, hoạt tính phân giải của bromelain thân cao hơn
trong quả xanh và quả chín.
- Khả năng phân giải các cơ chất nhân tạo của bromelain.
Bảng 1.3 Hoạt tính phân giải Benzoyl-L-Arginine amide (BAA) của bromelain

Cơ chất
Hoạt tính phân giải BAA ( UI/mg)
Bromelain thân Bromelain quả xanh Bromelian quả chín
BAA 3.7 9.1 7.2
- Qua bảng trên ta thấy bromelain quả xanh có hoạt tính phân giải BAA cao
hơn bromelain thân và quả chín.
b. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính bromelain
- Giống như các loại chất sinh học khác, bromelain cũng bị ảnh hưởng bởi các
yếu tố như: cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, ion kim loại,
một số nhóm chức, phương pháp ly trích, phương pháp tinh sạch, phương pháp tinh
khiết
- Các yếu tố như nhiệt độ, pH thích hợp cho hoạt động của các phản ứng xúc
tác của bromelain không ổn định mà phụ thuộc lẫn nhau và phụ thuộc vào các yếu tố
khác như: bản chất cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, sự có mặt của các
chất hoạt hóa…
 Ảnh hưởng của pH: pH là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính xúc
tác của enzyme, pH tối thích của bromelain không ổn định mà tuỳ thuộc vào nhiệt
độ, thời gian phản ứng, bản chất và nồng độ cơ chất, độ tinh sạch enzyme…Ví dụ:
Khi thu thập bromelain thân, nếu dùng tác nhân kết tủa là (NH
4
)
2
SO
4
thì enzyme có
hoạt tính cao nhất ở pH = 4.8, ổn định ở pH = 4.6 - 5.4. Bromelain đã được tinh sạch
một phần có hoạt tính cao nhất ở pH = 6.0 và pH = 8.0, ổn định ở pH = 3.5 – 5.6
với nhiệt độ 63
º
C. Bromelain có biên độ pH rộng (3 -10), tốt nhất là pH = 5 – 8 tuỳ

thuộc vào cơ chất.
 Ảnh hưởng bởi cơ chất: trên những loại cơ chất khác nhau, bromelain có hoạt
tính khác nhau. Nếu cơ chất là hemoglobin thì khả năng phân giải của bromelain
mạnh hơn papain gấp 4 lần, nếu cơ chất là casein thì hoạt tính của bromelain tương
tự như papain. Đối với các cơ chất tổng hợp như BAA (Benzoyl-L-Arginine amide),
BAEE (Benzoyl-L-Arginine ethyl ester) thì khả năng thuỷ giải của bromelain yếu
hơn papain.
6
Chương 1: Giới thiệu tổng quan
 Ảnh hưởng bởi nhiệt độ: nhiệt độ của phản ứng xúc tác chịu ảnh hưởng bởi
nhiều yếu tố: thời gian tác dụng càng dài thì nhiệt độ sẽ ít nhiều ảnh hưởng đến hoạt
tính của enzyme, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của enzyme. Ví dụ: Ở dịch chiết quả
dứa (pH = 3.5) khi tăng nhiệt độ lên đến 60
º
C thì bromelain vẫn còn hoạt tính nhưng
nếu tăng cao quá thì bromelain sẽ mất hoạt tính. Ở 5
º
C, pH = 4 - 10 thì enzyme giữ
hoạt tính tối đa trên casein trong 24h. Ở 55
º
C, pH = 6.1 thì enzyme mất 50% hoạt
tính trong vòng 20 phút.
 Ảnh hưởng bởi các ion kim loại: các ion kim loại có ảnh hưởng đến hoạt tính của
enzyme do chúng gắn vào các trung tâm hoạt động của enzyme. Chẳng hạn muối
thuỷ ngân có ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme bromelain và mức độ kìm hãm
tuỳ thuộc vào nồng độ của muối.
7
Chương 2: Những ứng dụng của enzyme Bromelain
CHƯƠNG 2
NHỮNG ỨNG DỤNG CỦA ENZYME BROMELAIN

- Hiện nay, việc sản xuất chế phẩm enzyme các loại đã và đang phát triển
mạnh mẽ trên qui mô công nghiệp. Thực tế đã có hàng ngàn chế phẩm enzyme bán
trên thị trường thế giới, các chế phẩm này đã được khai thác và tinh chế có mức độ
tinh khiết theo tiêu chuẩn công nghiệp và ứng dụng. Các chế phẩm enzyme phổ biến
như amylase, protease, catalase, cellulase, lipase, glucoseoxydase…
- Chế phẩm enzyme không chỉ được ứng dụng trong y học mà còn được ứng
dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, như trong công nghiệp thực phẩm, dệt may,
thuộc da…
2.1 Ứng dụng trong y dược
- Enzyme có một vị trí quan trọng trong y học. Đặc biệt là các phương pháp
định lượng và định tính enzyme trong hóa học lâm sàng và phòng thí nghiệm chẩn
đoán. Do đó, hiện nay trong y học đã xuất hiện lĩnh vực mới gọi là chẩn đoán
enzyme, có nhiệm vụ:
 Phân tích xác định nồng độ cơ chất như glucose, ure, cholesterol… với sự hỗ
trợ của enzyme.
 Xác định hoạt tính xúc tác của enzyme trong mẫu sinh vật.
 Xác định nồng độ cơ chất với sự hỗ trợ của thuốc thử enzyme đánh dấu.
- Ngoài ra còn dùng enzyme làm thuốc, ví dụ protease làm thuốc tắc nghẽn tim
mạch, tiêu mủ vết thương, làm thông đường hô hấp, chống viêm, làm thuốc tăng
tiêu hóa protein, thành phần của các loại thuốc dùng trong da liễu và mỹ phẩm…
- Trong y học các protease cũng được dùng để sản xuất môi trường dinh dưỡng
để nuôi cấy vi sinh vật sản xuất ra kháng sinh, chất kháng độc… Ngoài ra người ta
còn dùng enzyme protease để cô đặc và tinh chế các huyết thanh kháng độc để chữa
bệnh.
2.1.1 Bromelain giảm thiểu viêm xoang
- Ở Đức, trẻ em bị viêm xoang thường được chữa trị bằng bromelain chiết xuất
từ dứa, và thấy cho kết quả tốt, nó làm giảm thời gian trị bệnh (từ 8 ngày xuống còn
6 ngày)
- Bromelain còn được dùng làm thuốc tấy giun, một loại giun nhỏ thường gặp ở
trẻ em. Qua nghiên cứu của Hordegen.P thì bromelain cũng cho kết quả tốt như

pyratel.
8
Chương 2: Những ứng dụng của enzyme Bromelain
2.1.2 Bromelain làm liền sẹo
Enzyme Bromelain có tác dụng làm mau lành các vết thương ở da hay các vết
phỏng. Một số thí nghiệm cho thấy, ở chuột bị phỏng, chất chiết xuất bromelain từ
dứa giúp tiến trình làm sạch một vết thương chỉ sau 4h, lấy đi các vật lạ và mô chết
để không còn trở ngại nào cho quá trình làm lành vết thương.
2.1.3 Bromelain giảm đau nhức do hư khớp
- Ở Đức, trên thị trường có một sản phẩm chứa 90mg bromelain, 48mg trysin
(enzyme nguồn động vật) và 100mg rutin (một flavonoid bảo vệ mao mạch)
- Thử nghiệm nhằm so sánh sản phẩm này trong 6 tuần trên 90 người bị hư
khớp háng với diclofenac (100mg/ngày). Và kết quả điều trị tốt như diclofenac về
đau nhức do hư khớp, không có tác dụng phụ.
2.1.4 Bromelain làm tăng hệ miễn dịch
Bromelain làm tăng hệ miễn dịch giúp cho người bị ung thư (phổi, bàng
quang, vú, buồng trứng…) giảm được hiện tượng di căn. Đồng thời bromelain còn
ức chế quá trình viêm, làm giảm hiện tượng phù nề và tụ huyết, cũng như giảm đau
nhức. Do đó, các chuyên gia y tế đề nghị sử dụng bromelain như chất làm giảm đau,
kháng viêm và kháng sưng. Hiệu quả của bromelain là làm giảm lượng
prostaglandin trong cơ thể gây ra đau, viêm và ngăn cản sự thấm các chất dinh
dưỡng qua mô bằng cách ngăn cản những tiền chất gây viêm.
2.1.5 Bromelain và bệnh hen suyễn
Bromelain phối hợp với các thuốc kháng sinh trong điều trị một số bệnh nhiễm
khuẩn sẽ làm tăng hiệu quả kháng sinh, phối hợp với một số thuốc điều trị hen
(theophyllin, ephedrin ) làm tăng tác dụng chống hen. Mới đây, một số nghiên cứu
đăng trên tạp chí y học Anh cho biết, qua thử nghiệm trên chuột, các nhà khoa học
đã nhận thấy bromelain làm giảm hơn 50% dấu hiệu viêm phổi đối với bệnh hen.
2.1.6 Bromelain và HIV
Trong quá trình sinh sản trong tế bào người bệnh, virus gây hội chứng suy

giảm miễn dịch (HIV) cần một enzyme hoạt hóa protease (protein-digesting
enzymes) để sao chép ngược để cô đọng nhân protein để nhân bội virus. Thuốc điều
trị HIV/AIDS theo cơ chế ức chế protein-digesting enzymes này gọi là protease
inhibitor hay anti-protease khá hữu hiệu nhưng rất đắc tiền và cũng gây nhiều phản
ứng phụ. Các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên có khả
năng ức chế protease HIV và đã tìm thấy 19 hợp chất thiên nhiên có tác dụng tương
tự thuốc anti protease, trong đó bromelain trong dứa được coi là có giá trị nhất và có
thể ăn, uống để điều trị HIV/AIDS.
9
Chương 2: Những ứng dụng của enzyme Bromelain
2.2 Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm
2.2.1 Bromelain làm mềm thịt
Enzyme Bromelain: có tác dụng thủy phân chất đạm, nghĩa là nó phân cắt
protein thành các acid amin dễ tiêu hóa. Để cho thịt bò, thịt trâu… trở nên mềm
thường phải nấu sôi hàng giờ. Nhưng nếu trước khi nấu ta ướp (trộn) thịt với thơm
bằm (hay đu đủ bằm) độ 20-30 phút thì chỉ cần nấu lửa riu riu cho đến sôi lên là thịt
mềm ngay rất dễ tiêu hóa hấp thu
2.2.2 Bromelain sử dụng trong quá trình đông tụ sữa
Để chế biến các sản phẩm từ sữa người ta thường dùng renin. Renin là enzyme
làm đông tụ sữa truyền thống. Tuy nhiên, lượng renin sản xuất chưa đáp ứng đủ nhu
cầu trong sản xuất sữa. Gần đây người ta sử dụng enzyme thực vật vào trong chế
biến sữa và đang được nghiên cứu. Trong đó, enzyme Bromelain đang được quan
tâm với mục đích này.
2.2.3 Bromelain trong chế biến thủy sản
Trong sản xuất nước mắm thì thời gian chế biến thường dài và hiệu suất thủy
phân độ đạm không cao nên hiện nay người ta chú ý đến qui trình sản xuất nước
mắm ngắn ngày có enzyme Bromelain sẽ giúp thời gian sản xuất nước mắm được
giảm bớt và cải thiện được hương vị của nước mắm.
2.3 Ứng dụng trong công nghiệp dệt may
Trong sản xuất tơ tằm, người ta dùng protease để làm sạch sợi tơ. Với công

đoạn xử lý bằng enzyme sau khi xử lý bằng dung dịch xà phòng sẽ giúp lụa có tính
đàn hồi tốt, bắt màu đồng đều và dễ trang trí trên lụa.
2.4 Ứng dụng trong công nghiệp thuộc da
Trong công nghiệp da, enzyme được dùng để làm mềm da, làm sạch da, rút
ngắn thời gian, tránh ô nhiễm môi trường. Việc xử lý đã được tiến hành bằng cách
ngâm da trong dung dịch enzyme, hay phết dịch enzyme lên bề mặt da. Enzyme sẽ
tách các chất nhờn và làm đứt một số liên kết trong phân tử collagen làm cho da
mềm hơn. Thực tế cho thấy khi xử lý da bằng chế phẩm protease từ vi sinh vật có
thể rút ngắn thời gian làm mềm và tách lông xuống nhiều lần. Điều quan trọng là
chất lượng lông tốt hơn khi cắt.
2.5 Bromelain dùng để thu nhận các chất ức chế protease
Bromelain dùng để thu nhận các chất ức chế protein có chứa nhóm –SH. Các
chất ức chế này được sử dụng nhiều trong công nghiệp và y tế.
10
Chương 2: Những ứng dụng của enzyme Bromelain
2.6 Ứng dụng làm thực phẩm chức năng
Bromelain kết hợp với Curcumin (chiết suất từ củ nghệ vàng) điều chế thành
thực phẩm chức năng an toàn Brocurma C-B có tác dụng tăng cường miễn dịch và
khảng năng đề kháng của cơ thể, tăng khả năng phòng một số bệnh đồng thời hỗ trợ
trong điều trị các bệnh nan y, hiểm nghèo nhờ hoạt tính sinh học cộng hưởng của
Curcumin-Bromelain. Sản phẩm rất đặc hiệu đối với bệnh viêm dạ dày, đại tràng.
Có chứng nhận tiêu chuẩn sản phẩm số: 919/2006/YT-CNTC do Cục An Toàn vệ
sinh thực phẩm – Bộ Y Tế cấp ngày 05/4/2006.
Một số Enzyme Bromelain thương mại
11
Chương 2: Những ứng dụng của enzyme Bromelain

Hình 2.1 Dược phẩm Bromelain có hoạt
lực cao (1200 gdu/g hay 1800 mcu/g)
Hình 2.2 Dược phẩm chứa hàm

lượng Bromelin cao
Hình 2.4 Quercetin & Bromelain:
Thuốc trị bệnh Gút
Hình 2.3 Thực phẩm chức năng gồm
tinh chất Bromelain và Curcumin
Hình 2.5 Medizym:
chống viêm, liền sẹo
Hình 2.6 Dứa Enzyme
Complex - 800 GDU
12
Chương 3: Các phương pháp thu nhận và tinh sạch enzyme Bromelain
CHƯƠNG 3
CÁC PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN VÀ TINH SẠCH
ENZYME BROMELAIN
3.1 Các phương pháp thu nhận enzyme Bromelain
3.1.1 Phương pháp siêu lọc
- Siêu lọc là quá trình dung dịch lỏng chảy qua một màng lọc dưới một áp suất
để tách phân đoạn các thành phẩm trong chất lỏng đó. Sự phân chia các phân đoạn
phụ thuộc vào kích thước lỗ trên màng và tùy theo trọng lượng phân tử của chất
thấm qua. Tùy theo kích thước của lỗ trên màng mà sau khi thực hiện quá trình siêu
lọc sẽ thu được nước và những chất có phân tử nhỏ còn những chất có phân tử lớn
sẽ bị giữ lại trên màng.
- Dung dịch enzyme thu được từ nguyên liệu thực vật sẽ có chứa những tạp
chất có trọng lượng phân tử khác nhau. Đầu tiên sẽ sử dụng phương pháp lọc để loại
trừ các chất bẩn. Sau đó chuyển sang phương pháp siêu lọc thì sẽ loại được các chất
có trọng lượng phân tử thấp hơn các protein, enzyme và đồng thời cô đặc được
enzyme.
- Màng siêu lọc được cấu tạo bởi các sợi rỗng. Trong mỗi sợi rỗng lại có nhiều
lỗ rỗng xếp song song và gắn chặt với lớp ngoài tạo thành những lỗ để các chất
thấm qua. Các sợi này được chế tạo từ các lọai polime bền như fluoropolime (FS:

Fluorosurfactant), Cenlulose acetate (CA), polysulphone (GR)… Tùy theo mục đích
cụ thể mà người ta sử dụng lọai màng thích hợp. Ví dụ: cô đặc protein (dùng màng
FS, GR); Cô đặc enzyme (dùng màng GR).
Hình 3.1: Lọc cross - flow
a. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình siêu lọc
- Nhiệt độ: Nhiệt độ phải thích hợp với sản phẩm và loại màng sử dụng. Khi chọn
nhiệt độ sử dụng cần lưu y đến khả năng kết tủa của protein và sự tăng nhiệt độ
trong quá tình siêu lọc vì quá trình này có thể làm kín màng.
Dịch học
Vật liệu học
Chất rắn
13
Chương 3: Các phương pháp thu nhận và tinh sạch enzyme Bromelain
- Áp suất: Thường tốc độ của dòng chảy (số lít chất lỏng qua 1m
2
màng trong 1h) sẽ
tăng cùng với sự gia tăng áp suất cho đến khi đạt đến giá trị (tốc độ) cực đại. Nếu áp
suất tăng lên cao hơn nữa thì dòng chảy sẽ giảm. Người ta đề nghị tốc độ dòng chảy
nên được điều chỉnh từ 4 - 5 lít/phút, tương ứng với hiệu suất PI
1
- PI
2
ở trong
khoảng 0.5 - 3bar. Áp suất dòng vào lớn nhất (PI
1
max) là 7bar (tương đương
102Psi), áp suất dòng ra nhỏ nhất (PI
2
min) là 0.5bar (tương đương 7.25Psi).
b. Các kiểu siêu lọc : có ba kiểu hệ thống siêu lọc

- Kiểu một bước (single pas operation)
Hình 3.2: Kiểu một bước
- Kiểu lô (batch operation): Chất lỏng được tuần hoàn qua màng đến nồng độ của
dịch cô đặc ở trong chậu chứa đạt được như yêu cầu .
Hình 3.3: Kiểu lô
- Kiểu thể tích không đổi (constant volume operation): Dòng chất lỏng được cung
cấp liên tục để thể tích ở trong chậu chứa không thay đổi và chất lỏng được tuần
hoàn qua màng đến nồng độ dung dịch cô đặc ở trong chậu chứa đạt được như yêu
cầu.
14
Chương 3: Các phương pháp thu nhận và tinh sạch enzyme Bromelain
Hình 3.4: Kiểu thể tích không đổi
c. Những thuận lợi của phương pháp siêu lọc
- Có thể lựa chọn màng thích hợp với từng mục đích cụ thể.
- Đối với enzyme: enzyme có thể cô đặc 25 lần mà không bị mất hoạt tính.
- Quá trình siêu lọc vừa làm cô đặc, vừa tinh sạch được enzyme. Trong quá
trình thực hiện nếu thêm nước vào thì độ tinh sạch của enzyme càng cao.
- Trong quá trình siêu lọc, nhiệt độ cao có thể làm mất hoạt tính của enzyme,
do đó nhiệt độ 10 - 20
º
C được xem là khoảng nhiệt độ thích hợp nhất cho năng suất
cao mà không làm mất hoạt tính enzyme. Quá trình siêu lọc có thể thực hiện tốt ở
nhiệt độ thấp (5
º
C).
3.1.2 Phương pháp kết tủa
- Nguyên tắc: Dựa trên tính hoà tan. Điểm đẳng điện của đa số protein thấp
hơn pH = 7 do đó trong điều kiện sinh lý, các phân tử protein có thừa điện tích âm
đã kết hợp với các đầu mang điện tích dương của phân tử nước lưỡng cực, cũng như
các ion dương khác có trong dung dịch. Sự kết hợp với nước tạo ra một lớp nước

bao quanh phân tử protein và cản trở sự kết tủa của chúng và để có thể kết tủa được
các enzyme thì ta nhất thiết phải phá vỡ lớp nước liên kết xung quanh phân tử này
bằng cách bổ sung vào dung dịch các dung môi hoặc các hoá chất ưa nước có ái lực
mạnh hơn protein để lôi kéo nước ra khỏi phân tử protein đó, giúp cho protein tủa
xuống.
- Heinicker và Gortner đã dùng acetone để kết tủa bromelain. Bromelain trong
dung dịch nước rất nhạy cảm với các dung môi hữu cơ, do đó để sự kết tủa đạt hiệu
quả cao thường tiến hành trong điều kiện lạnh. Như vậy dịch dứa phải được làm
lạnh ở 0
º
C đến 4
º
C và acetone tinh khiết ở - 20
º
C. Ethanol cũng được sử dụng để làm
kết tủa bromelain và cũng phải giữ ở nhiệt độ thấp. Sau khi thu được kết tủa, tủa
bromelain phải rửa bằng acetone và làm khô thật nhanh để bromelain không bị biến
tính.
15
Chương 3: Các phương pháp thu nhận và tinh sạch enzyme Bromelain
- Thông thường những yếu tố chính có thể ảnh hưởng đến hiệu suất và chất
lượng của chế phẩm enzyme đó là:
 Nồng độ của tác nhân kết tủa
 pH của dịch chiết
 Nhiệt độ kết tủa
 Thời gian tiếp xúc của tác nhân và dịch chiết
Ngoài ra, ta còn sử dụng ammonium sulfate. Sự kết tủa với tác nhân này là
một quá trình thuận nghịch và có thể thực hiện ở nhiệt độ thường. Do có những ưu
điểm như vậy nên tác nhân ammonium sulfate thường được dùng để kết tủa
bromelain thu về chế phẩm enzyme thô.

- Hiện nay người ta kết tủa enzyme bromelain bằng CMC (carboxyl methyl
cellulose) do enzyme thu được có độ tinh khiết cao, thời gian đợi kết tủa ngắn và
tiến hành thuận lợi hơn.
- Quá trình tạo ra CMC
[4]
:
Vải màn Alkalicellulose
ClCH
2
COOH
NaOH
Carboxylmethylcellulose
(CMC)
16
Xay nhuyễn Rửa sạch

Bã

Dịch ép

Ly tâm
Ly tâm lạnh
Kết tủa
Bromelain

Sấy đông khô

Lọc
Dịch ly tâm
Tác nhân kết tủa

Enzyme
Bromelain

Dứa
Chương 3: Các phương pháp thu nhận và tinh sạch enzyme Bromelain
- Quy trình thu nhận enzyme Bromelain.
Hình 3.5: Quy trình thu nhận enzyme Bromelain
17
Chương 3: Các phương pháp thu nhận và tinh sạch enzyme Bromelain
Mô tả sơ đồ :
Thân, chồi và quả của trái dứa sẽ được rửa sạch sau đó tiến hành đem xay
nhuyễn những phần đó thu được hệ huyền phù. Đem lọc sẽ thu được dịch ép, sau đó
ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút sẽ thu được dịch ly tâm, khi đó sẽ
cho tác nhân kết tủa (acetone tinh khiết -20°C, ethanol -4°C hoặc ammonium sulfate
70% bão hòa) vào dung dịch trên để làm kết tủa enzyme Bromelain với thời gian 30
phút rồi tiến hành ly tâm lạnh 6000 vòng/phút trong 20 phút thu được kết tủa
enzyme này cuối cùng đem sấy đông khô sẽ được enzyme Bromelain thô.
3.1.3 Phương pháp hấp phụ
Có nhiều chất được sử dụng để làm chất hấp phụ enzyme như kaolin hay
bentonite để hấp phụ bromelain. Kaolin là một chất có tính hấp phụ tốt, kích thước
hạt nhỏ hơn 1µm do đó diện tích tiếp xúc giữa hạt kaolin và chất bị hấp phụ tăng lên
rất nhiều. Một lí do khác dẫn đến khả năng hấp phụ vật chất của kaolin cao là do
trên bề mặt kaolin có rất nhiều ion OH
-
và O
2-
, những ion này có khả năng liên kết
tương đối bền vững với chất bị hấp phụ.
Hình 3.6: Cấu tạo của kaolin
3.2 Các phương pháp tinh sạch enzyme Bromelain

3.2.1 Phương pháp thẩm tích
Tiến hành:
- Cân 1g enzyme thô.
- Dung dịch đệm sử dụng là 10ml dung dịch Na
3
PO
4
0,03M có pH = 7.2.
- Cho protein vào túi cellophane rồi tiến hành thẩm tích trong 6h và cứ sau 2h
thay thế dung dịch đệm bên ngoài 1 lần. Dung dịch đệm phía ngoài túi được khuấy
liên tục bằng 1 máy khuấy từ, cuối cùng thu được enzyme trong túi.
3.2.2 Phương pháp lọc Sephadex G-50
Ta đem cân 100mg enzyme thô hòa tan vào 1ml dung dịch đệm Na
3
PO
4
0,03M, pH = 7.2. Khi enzyme đã hoà tan hoàn toàn thì cho hỗn hợp enzyme từ từ
vào cột. Cho dung môi phân ly enzyme qua cột và điều chỉnh tốc độ chảy khoảng
2ml trong 7 phút. Loại bỏ 5ml đầu tiên rồi mới bắt đầu thu dịch enzyme. Dịch
enzyme được thu đến khi dùng Ba(NO
3
)
2
để thử (NH
4
)
2
SO
4
và thấy có xuất hiện kết

18
Chương 3: Các phương pháp thu nhận và tinh sạch enzyme Bromelain
tủa trắng thì ngừng quá trình thu dịch enzyme. Dịch enzyme thu nhận được làm
đông khô. Quá trình lọc enzyme qua sephadex G-50 nên tiến hành trong điều kiện
nhiệt độ thấp để giảm thiểu sự biến tính protein, thời gian tiến hành lọc khoảng 1h.
3.2.3 Phương pháp sắc ký
- Bromelain thân cho chạy sắc ký trên Duolite CS101 ở pH= 6.05 cho hai phân
đoạn khác nhau về điện tích với hoạt tính xúc tác phân giải BAEE, casein và
glucagons.
- Sắc ký bromelain thân trên Bio Rex ở pH = 6.1 sẽ thu được 5 phân đoạn khác
nhau về thành phần amino axit. Khi sắc ký trên Sephadex G-75 ở pH= 7 cũng nhận
được 5 thành phần có hoạt tính enzyme.
- Bromelain thân và bromelain quả thô được cho chạy sắc ký gel trên sephadex
G-75 tiếp theo sử dụng phương pháp sắc ký trao đổi ion trên sulfoethyl sephadex chỉ
cho phân đoạn đơn có hoạt tính phân giải protein. Nếu sắc ký hoán vị gel ở pH =7
rồi sau đó sắc ký trên sulfoethyl sephadex cho thấy có sự hiện diện của hai protease
riêng biệt được đặt tên là bromelain II và bromelain III, hai protease này có tốc độ di
chuyển khác nhau khi điện di trên polyacrylamide ở pH=9.5.
- Bromelain thân khi dùng sắc kí gel trên sephadex G-50 và sắc kí trao đổi ion
trên DEAE-cellulose thì thấy có 1 thành phần chính và 5 thành phần phụ.
- Bromelain quả dùng sắc kí trên DEAE-cellulose và sulfoethyl sephadex thì
thấy có 1 thành phần chính và 2 thành phần phụ.
19