Báo cáo: "Công nghệ sản xuất insulin" pot

C¸n bé HDKH: TS. §µo Xu©n t©n
C¸n bé HDKH: TS. §µo Xu©n t©n
Häc viªn: §µo thÞ ngäc anh
Häc viªn: §µo thÞ ngäc anh
K11- Sinh häc thùc nghiÖm
K11- Sinh häc thùc nghiÖm







1.1 Cấu trúc phân tử insulin
1.1 Cấu trúc phân tử insulin
Insulin là một hoocmon protein do tế bào
Insulin là một hoocmon protein do tế bào
tuyến tụy sinh ra. Phân tử protein insulin có khối
tuyến tụy sinh ra. Phân tử protein insulin có khối
lượng khoảng 6000da. Cấu tạo bởi hai chuỗi
lượng khoảng 6000da. Cấu tạo bởi hai chuỗi
polypeptit A và B. Các chuỗi A và B liên kết với
polypeptit A và B. Các chuỗi A và B liên kết với
nhau bằng hai cầu nói đisulfua. Hầu hết các loài
nhau bằng hai cầu nói đisulfua. Hầu hết các loài
chuỗi A gồm 21aa; chuỗi B có 30aa
chuỗi A gồm 21aa; chuỗi B có 30aa

.
.


Hình 1:
Hình 1:
Cấu trúc phân tử insulin
Cấu trúc phân tử insulin


1.2 Vai trò sinh học của insulin
1.2 Vai trò sinh học của insulin
Insulin là một trong những hoocmon
Insulin là một trong những hoocmon
điều hoà nồng độ glucoz
điều hoà nồng độ glucoz


trong máu
trong máu
.
.
1.2.1. Insulin và trao đổi hydratcacbon
1.2.1. Insulin và trao đổi hydratcacbon
-
-
Insulin tuần hoàn trong máu, khi gắn với
Insulin tuần hoàn trong máu, khi gắn với
thụ thể trên màng tế bào tạo ra phức hợp
thụ thể trên màng tế bào tạo ra phức hợp

thụ thể - insulin làm phát tín hiệu truyền
thụ thể - insulin làm phát tín hiệu truyền
thông tin chuyển glucoz ra khỏi huyết
thông tin chuyển glucoz ra khỏi huyết
tương.
tương.


H
H
ình 2:
ình 2:
Insulin gắn với thụ thể trên màng tế bào v
Insulin gắn với thụ thể trên màng tế bào v
à
à
tuần hoàn trong máu
tuần hoàn trong máu


-
-


Insulin thúc đẩy gan dự trữ glucoz ở dạng
Insulin thúc đẩy gan dự trữ glucoz ở dạng
glycogen. Glucoz bị photphoryl hoá nhờ enzym
glycogen. Glucoz bị photphoryl hoá nhờ enzym
hexokinase nhờ đó glucoz bị bẫy vào trong tế
hexokinase nhờ đó glucoz bị bẫy vào trong tế

bào.
bào.
- Insulin ức chế hoạt động của glucoz - 6
- Insulin ức chế hoạt động của glucoz - 6
photphatase. Khi không có mặt insulin, quá trình
photphatase. Khi không có mặt insulin, quá trình
tổng hợp glycogen bị dừng lại và các enzym
tổng hợp glycogen bị dừng lại và các enzym
phân huỷ glycogen hoạt động.
phân huỷ glycogen hoạt động.


Insulin ngăn cản lượng đường
quá cao trong máu nên
không được có quá nhiều
insulin, do đó enzym
insulinase kiểm soát mức
độ insulin.
Khi lượng insulin quá cao
enzym insulinase sẽ phân
huỷ hoocmon này với thời
gian 6 phút.
Quá trình này đảm bảo cho
hàm lượng insulin được ổn
định trong máu và lượng
glucoz không bị giảm
xuống mức nguy hiểm.
Hình 3: insulin điều hoà glucoz trong máu


1.2.2. Insulin và trao đổi lipit
1.2.2. Insulin và trao đổi lipit
a- Insulin thúc đẩy sinh tổng hợp các axit béo trong gan.
a- Insulin thúc đẩy sinh tổng hợp các axit béo trong gan.
Khi lượng glycogen trong gan quá cao (> 5% lượng thô của
Khi lượng glycogen trong gan quá cao (> 5% lượng thô của
gan) thì quá trình tổng hợp bị ức chế. Lượng glucoz hấp thụ vào tế
gan) thì quá trình tổng hợp bị ức chế. Lượng glucoz hấp thụ vào tế
bào gan chuyển sang tổng hợp axit béo và chuyển khỏi gan ở
bào gan chuyển sang tổng hợp axit béo và chuyển khỏi gan ở
dạng lipoprotein.
dạng lipoprotein.

Các lipoprotein đi vào vòng tuần hoàn, cung cấp các axit béo tự do
Các lipoprotein đi vào vòng tuần hoàn, cung cấp các axit béo tự do
cho các mô khác như mô mỡ để tổng hợp triglyxerit.
cho các mô khác như mô mỡ để tổng hợp triglyxerit.


b- Insulin ức chế phân huỷ chất béo trong mô mỡ: bằng cách ức chế
b- Insulin ức chế phân huỷ chất béo trong mô mỡ: bằng cách ức chế
quá trình thuỷ phân triglyxerit thành glixerol và axit béo tự do.
quá trình thuỷ phân triglyxerit thành glixerol và axit béo tự do.


Enzym nhạy cảm với hoocmon này trở nên hoạt động được khi
Enzym nhạy cảm với hoocmon này trở nên hoạt động được khi
photphoryl hoá. Insulin làm ngăn cản sự kết hợp với thụ thể trên màng tế
photphoryl hoá. Insulin làm ngăn cản sự kết hợp với thụ thể trên màng tế

bào. Do đó làm tăng sự tích tụ triglyxerit trong tế bào các mô mỡ.
bào. Do đó làm tăng sự tích tụ triglyxerit trong tế bào các mô mỡ.


1.2.3. Những tác động khác của insulin
1.2.3. Những tác động khác của insulin

- Insulin làm tăng tính
- Insulin làm tăng tính
hấp thụ của các axitamin.
hấp thụ của các axitamin.

- Insulin làm tăng tính
- Insulin làm tăng tính
thấm các ion kali, magie và
thấm các ion kali, magie và
photphat vô cơ tạo điều
photphat vô cơ tạo điều
kiện cho quá trình
kiện cho quá trình
photphoryl hoá và sử dụng
photphoryl hoá và sử dụng
glucoz.
glucoz.
H
H
ình 4: Insulin làm tăng tính thấm các ion kali,
ình 4: Insulin làm tăng tính thấm các ion kali,
magie và photphat vô cơ
magie và photphat vô cơ

1.3. Tổng hợp insulin trong cơ thể
1.3. Tổng hợp insulin trong cơ thể
Insulin được tổng hợp trong tế bào β của tuyến tụy.
Insulin được tổng hợp trong tế bào β của tuyến tụy.
Insulin được tạo ra từ một phần của một protein lớn hơn để
Insulin được tạo ra từ một phần của một protein lớn hơn để
đảm bảo sự gấp nếp đúng.
đảm bảo sự gấp nếp đúng.
mARN dịch mã protein preproinsulin. Preproinsulin
mARN dịch mã protein preproinsulin. Preproinsulin
gồm một trình tự đầu aa để tiền chất này đi qua lưới nội chất
gồm một trình tự đầu aa để tiền chất này đi qua lưới nội chất
tham gia vào quá trình sau dịch mã.
tham gia vào quá trình sau dịch mã.
Tại quá trình sau dịch mã preproinsulin bị thuỷ phân tạo
Tại quá trình sau dịch mã preproinsulin bị thuỷ phân tạo
thành dạng proinsulin. Sau khi hình thành 3 cầu đisulfua một
thành dạng proinsulin. Sau khi hình thành 3 cầu đisulfua một
số peptitdaza cắt proinsulin thành insulin hoàn chỉnh và hoạt
số peptitdaza cắt proinsulin thành insulin hoàn chỉnh và hoạt
động.
động.
Insulin được đóng gói và chứa trong các hạt tiết tích tụ
Insulin được đóng gói và chứa trong các hạt tiết tích tụ
trong tế bào chất đến khi được kích hoạt để giải phóng
trong tế bào chất đến khi được kích hoạt để giải phóng
.
.

Hình 5: Tổng hợp insulin trong cơ thể
Hình 5: Tổng hợp insulin trong cơ thể


Hình
Hình


6
6
: Các bước cải biến sau dịch mã của phân tử insulin
: Các bước cải biến sau dịch mã của phân tử insulin






Hiện nay công nghệ ADN tái tổ hợp
Hiện nay công nghệ ADN tái tổ hợp
được sử dụng
được sử dụng
để sản xuất.
để sản xuất.
2.1. Phương pháp 1
2.1. Phương pháp 1
T
T

ạo ra các chuỗi riêng biệt, kết hợp hoá học hoặc tạo một tiền
ạo ra các chuỗi riêng biệt, kết hợp hoá học hoặc tạo một tiền
chất chuỗi đơn proinsulin người, sau đó phân cắt để tạo thành
chất chuỗi đơn proinsulin người, sau đó phân cắt để tạo thành
insulin hoàn chỉnh.
insulin hoàn chỉnh.

Bước 1
Bước 1
:
:
Bằng kỹ thuật tách gen sử dụng trong sinh học phân
Bằng kỹ thuật tách gen sử dụng trong sinh học phân
tử tách được gen mã hoá proinsulin người trên nhiễm sắc thể
tử tách được gen mã hoá proinsulin người trên nhiễm sắc thể
số 11.
số 11.

Tách mARN của gen tổng hợp proinsulin từ mẫu nghiền tuỵ
Tách mARN của gen tổng hợp proinsulin từ mẫu nghiền tuỵ
của người. Dùng phản ứng RT-PCR với mồi đặc hiệu để
của người. Dùng phản ứng RT-PCR với mồi đặc hiệu để
khuếch đại gen. Do hầu hết các mARN của người đều có đuôi
khuếch đại gen. Do hầu hết các mARN của người đều có đuôi
polyA nên sử dụng chuỗi polyT để bắt cặp với đuôi polyA đó.
polyA nên sử dụng chuỗi polyT để bắt cặp với đuôi polyA đó.

Sử dụng sắc kí ái lực với polyT giữ lại mARN cần thiết cho
Sử dụng sắc kí ái lực với polyT giữ lại mARN cần thiết cho
quá trình dịch mã; còn lại loại bỏ ADN và các ARN khác.

quá trình dịch mã; còn lại loại bỏ ADN và các ARN khác.

Cắt bỏ cầu nối A - T thu được mARN.
Cắt bỏ cầu nối A - T thu được mARN.


Hình 7: Tách mARN của gen tổng hợp proinsulin từ mẫu nghiền tuỵ của người
Hình 7: Tách mARN của gen tổng hợp proinsulin từ mẫu nghiền tuỵ của người




Bước 2
Bước 2
:
:


Tách và thiết kế plasmit tái tổ hợp.
Tách và thiết kế plasmit tái tổ hợp.
- Cắt gen mã hoá proinsulin và plasmit bằng một loại enzym giới hạn.
- Cắt gen mã hoá proinsulin và plasmit bằng một loại enzym giới hạn.
Nối bằng ADN ligase của phageT4.
Nối bằng ADN ligase của phageT4.
-Thiết kế các trình tự mã hoá cho các protein tín hiệu giúp vận chuyển
-Thiết kế các trình tự mã hoá cho các protein tín hiệu giúp vận chuyển
insulin ra ngoài tế bào chất.
insulin ra ngoài tế bào chất.
+Nếu sử dụng mARN tách được từ trên tiến hành như sau:
+Nếu sử dụng mARN tách được từ trên tiến hành như sau:

- Sao mARN tinh khiết thành cADN nhờ enzym phiên mã ngược và nhờ
- Sao mARN tinh khiết thành cADN nhờ enzym phiên mã ngược và nhờ
các dNTP (trong phản ứng RT - PCR)
các dNTP (trong phản ứng RT - PCR)
- Cài đoạn cADN mã hoá insulin hoàn chỉnh vào plasmit đứng sau một
- Cài đoạn cADN mã hoá insulin hoàn chỉnh vào plasmit đứng sau một
promoter mạnh. Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn
promoter mạnh. Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn
E.coli.
E.coli.
Bước 3:
Bước 3:
Biến nạp plasmit tái tổ hợp vào
Biến nạp plasmit tái tổ hợp vào
E.coli
E.coli
nhờ phương pháp trộn
nhờ phương pháp trộn
với dung dịch ion Ca hoặc tạo lỗ xung điện. Sau quá trình biến nạp, cần
với dung dịch ion Ca hoặc tạo lỗ xung điện. Sau quá trình biến nạp, cần
chọn lọc được những dòng vi khuẩn mang gen mong muốn.
chọn lọc được những dòng vi khuẩn mang gen mong muốn.


Hình 8: Tách và biến nạp plasmit tái tổ hợp vào
Hình 8: Tách và biến nạp plasmit tái tổ hợp vào
E.coli
E.coli

Bước 4:
Bước 4:
Các vi khuẩn chuyển gen sau đó được đưa vào lên
Các vi khuẩn chuyển gen sau đó được đưa vào lên
men.
men.


Nuôi chúng trong nồi lên men sử dụng phương pháp nuôi cấy liên tục,
Nuôi chúng trong nồi lên men sử dụng phương pháp nuôi cấy liên tục,
các chất dinh dưỡng được bổ xung thường xuyên để đảm bảo sự tăng
các chất dinh dưỡng được bổ xung thường xuyên để đảm bảo sự tăng
trưởng của vi khuẩn theo hàm số mũ.
trưởng của vi khuẩn theo hàm số mũ.
Sau 20 phút có hàng triệu vi khuẩn được nhân lên qua nguyên phân. Chỉ
Sau 20 phút có hàng triệu vi khuẩn được nhân lên qua nguyên phân. Chỉ
sau một thời gian ngắn, sinh khối tăng lên rất nhanh và gen insulin được
sau một thời gian ngắn, sinh khối tăng lên rất nhanh và gen insulin được
tổng hợp.
tổng hợp.
Hình 9:
Hình 9:
Đ
Đ
ưa các vi khuẩn chuyển gen
ưa các vi khuẩn chuyển gen


vào nồi lên men.
vào nồi lên men.


Bước 5
Bước 5
:
:
Tiền tinh sạch
Tiền tinh sạch
Sau khi lên men cần
Sau khi lên men cần
tách tế bào và khử trùng
tách tế bào và khử trùng
nhiệt.
nhiệt.

Dùng enzym lizozyme
Dùng enzym lizozyme
phá vỡ màng tế bào, sau
phá vỡ màng tế bào, sau
đó dùng hỗn hợp chất
đó dùng hỗn hợp chất
tẩy rửa để tách lớp
tẩy rửa để tách lớp
màng lipit.
màng lipit.



Bằng phương pháp ly

Bằng phương pháp ly
tâm và lọc tách được
tâm và lọc tách được
proinsulin
proinsulin
.
.
Hình 10: Proinsulin được lọc tách
Hình 10: Proinsulin được lọc tách


Bước 6: Hoạt hoá.
Do hệ thống E.coli có khả năng biểu hiện gen insulin
nhưng không có khả năng hoạt hoá insulin.
Hoạt hoá proinsulin invitro bằng cách xử lý dung dịch
đệm, giúp nó đạt cấu trúc bậc 4, sau đó dùng enzym đặc
hiệu trypsin để phân cắt proinsulin. Khi đó sản phẩm thu
được mới có hoạt tính cần thiết.


Hình 11:Hoạt hoá proinsulin thành insulin hoàn chỉnh



Bước 7
Bước 7
:
:

Hỗn hợp tinh
Hỗn hợp tinh
sạch chỉ còn có insulin.
sạch chỉ còn có insulin.
Bằng phương pháp sắc
Bằng phương pháp sắc
ký, tách và phương pháp
ký, tách và phương pháp
miễn dịch gắn enzym.
miễn dịch gắn enzym.



Độ tinh sạch của insulin
Độ tinh sạch của insulin
được đánh giá qua mỗi
được đánh giá qua mỗi
giai đoạn trung gian của
giai đoạn trung gian của
quá trình sản xuất nhờ
quá trình sản xuất nhờ
phòng thí nghiệm chuyên
phòng thí nghiệm chuyên
hoá. Cuối cùng insulin
hoá. Cuối cùng insulin
được tinh thể hoá
được tinh thể hoá
.
.
Hình 12: Các tinh thể insulin

Hình 12: Các tinh thể insulin


2.2. Phương pháp 2
2.2. Phương pháp 2
-
-
Tổng hợp riêng rẽ hai chuỗi A và B.
Tổng hợp riêng rẽ hai chuỗi A và B.
- Xác định trình tự ADN để sản xuất chuỗi A và B. Qua đó
- Xác định trình tự ADN để sản xuất chuỗi A và B. Qua đó
tổng hợp và tách hai dòng gen này.
tổng hợp và tách hai dòng gen này.


- Mỗi ADN được chèn vào plasmit. Sau đó sản xuất tương tự
- Mỗi ADN được chèn vào plasmit. Sau đó sản xuất tương tự
như sản xuất proinsulin.
như sản xuất proinsulin.
- Cuối cùng hai chuỗi A và B được trộn với nhau và hình
- Cuối cùng hai chuỗi A và B được trộn với nhau và hình
thành cầu nối đisulfua qua phản ứng tái oxi hoá khử nhờ một
thành cầu nối đisulfua qua phản ứng tái oxi hoá khử nhờ một
chất oxi hoá nhất định.
chất oxi hoá nhất định.


Ngày nay, nấm men cũng được sử dụng để sản xuất insulin.
Ngày nay, nấm men cũng được sử dụng để sản xuất insulin.
Có nhiều ưu điểm: tế bào nấm men tạo phân tử insulin người

Có nhiều ưu điểm: tế bào nấm men tạo phân tử insulin người
gần như hoàn chỉnh với cấu trúc không gian hoàn hảo.
gần như hoàn chỉnh với cấu trúc không gian hoàn hảo.
Điều đó làm giảm tối đa tính phức tạp và giá thành của các
Điều đó làm giảm tối đa tính phức tạp và giá thành của các
giai đoạn tinh sạch.
giai đoạn tinh sạch.




Hình 13: Sản xuất insulin bằng cách tổng hợp riêng rẽ hai chuỗi A và B.
Hình 13: Sản xuất insulin bằng cách tổng hợp riêng rẽ hai chuỗi A và B.