Giáo án điện tử môn Sinh vật học : CÔNG NGHỆ GENE (GENETICS ENGENEERING) pps

CÔNG NGHỆ GENE
(GENETICS ENGENEERING)
Nguyễn Vũ Phong
Chương II
QUY TRÌNH TIẾN HÀNH
•
Bước 1: Nuôi tế bào chủ và tế
bào cho
•
Bước 2: Tách DNA plasmind và
DNA tế bào cho
•
Bước 3: Cắt DNA plasmid và
DNA mục tiêu
•
Bước 4: Nối 2 loại DNA bằng
enyme nối tạo DNA tái tổ hợp
hoàn chỉnh
•
Bước 5: Chuyển DNA tái tổ hợp
vào tế bào nhận (thường là vi
khuẩn E.coli)
•
Bước 6: Chọn lọc và nhân dòng
vi khuẩn mang gene tái tổ hợp
•
Bước 7: Nghiên cứu điều kiện để
gene biểu hiện ra sản phẩm
1. Enzyme
1.1. Restriction endonuclease enzyme (RE)
-

1962: hạn chế sự sinh sản của phage trong tế bào vi khuẩn
-
Hệ thống hạn chế - biến đổi (restriction – modification system) giúp bảo vệ
tế bào khỏi sự xâm nhập của DNA lạ.
-
Trình tự nhận biết: trình tự 4-6 cặp nu đối xứng đảo ngược (palindrom)
-
Cắt tạo thành đầu so le (sticky end) hay đầu bằng (cohesive end) .
1. Enzyme
1.1. Restriction
endonuclease
enzyme (RE)
-
Khoảng 3000 RE với
230 trình tự nhận biết
khác nhau.
-
Quy tắc đặt tên: EcoRI
Eco: Escherichia coli
R: dòng vi khuẩn
I: thứ tự RE được tìm
ra (I: đầu tiên)
1. Enzyme
1.2. Enzyme nối (Ligase)
- Nối : hình thành cầu phosphodiester
AATTC
G
G
CTTAA
Ligas

e
G
CTTAA
AATTC
G
EcoRI
EcoRI
GAATTC
CTTAAG
GAATTC
CTTAAG
G
CTTAA
AATTC
G
Ligation. (lige re = latin ‘to join’)
1. DNA Ligase reacts with an AMP donor in
an ATP (or NAD
+
dependent manner
depending on the source of ligase) 
activated enzyme.
2. Activated enzyme donates AMP to free
5’-PO
4
=
at the nick in the lower strand of
the DNA duplex, creating a high-energy
diphosphate group on one side of the
nick.

3. Cleavage of the di-phosphate bond
liberates energy to create a new
phosphodiester bond. Seals the nick in
the DNA.
N.B. Reaction can occur on Both Strands,
allowing joining of two independent
DNA molecules.
1. Enzyme
1.3. Enzyme phiên mã ngược
(reverse transcriptase)
•
Tổng hợp DNA một
mạch c-DNA
(complementary DNA) từ
một sợi mRNA hoặc từ
polyribonucleotide tổng
hợp
•
c-DNA có thể tổng hợp
thành c-DNA kép (c-DNA
duplex) nhờ DNA
polymerase. c-DNA kép
được dùng trong việc tạo
dòng c-DNA
1.4. Các enzyme khác
Enzyme Chức năng
DNaseI Endonuclease
Nuclase BAL31 Exon nuclease
S1 nuclease Cắt DNA mạch đơn
Đoạn Klenow DNA polymerase chỉ còn hoạt tính

exonuclease 3’-5’
Taq polymerase DNA polymerase chịu nhiệt
1. Enzyme
2. Các vector chuyển gene
Plasmid:
-
DNA vòng tròn
-
Sao chép độc lập trong tế bào
-
Có khả năng mang một số gene có khả năng biểu hiện thành protein
Vector:
-
Có khả năng tự tái bản
-
Tồn tại độc lập trong tế bào
-
Mang được gene mong muốn
Yêu cầu đối với vector chuyển gene.
-
Có trình tự khởi đầu sao chép (ori)
-
Trình tự nhận biết cho RE
-
Trình tự điều hòa (promoter)
-
Đảm bảo sự di truyền bền vững của
DNA tái tổ hợp
-
Có gene đánh dấu (marker) để dễ

dàng nhận biết.
2. Các vector chuyển gene
Ứng dụng của vector chuyển gene
-
Tạo dòng và khuyếch đại trình tự DNA
-
Nghiên cứu sự biểu hiện của đoạn trình
tự DNA
-
Chuyển gene
-
Sản xuất RNA
-
Sản xuất protein từ gene được tạo dòng.
2.1. Vector chuyển gene plasmid
-
Plasmid của vi khuẩn và bacteriophage.
-
pBR322
2. Các vector chuyển gene
2.2. Phage λ
-
Có hệ thống xâm nhập tự
động và sinh sản
-
Có dạng tròn hoặc dạng
thẳng, 2 đoạn cos (12 nu)
ở 2 đầu mút, dùng tạo
cosmid và phagemid
-

Mang được đoạn DNA
(15-23Kb)
-
Dùng trong thành lập
ngân hàng gene
2. Các vector chuyển gene
2.3. Cosmid :
-
Plasmid gắn thêm đoạn cos của
phage,
-
Có thể chứa đoạn gene dài đến
45kb
-
Dùng lập thư viện gen
2. Các vector chuyển gene
2.4. Phagemid
2.5. Phage M13:
-
DNA mạch đơn
-
Dùng xác định trình tự
nucleotide của gene
-
Sản xuất mẫu dò
(probe)
-
Gây đột biến điểm định
hướng (site-directed
mutagenesis)

2. Các vector chuyển gene
2.5. Plasmid Ti
-
Agrobacterium tumefaciens
-
Chuyển gen ở thực vật
-
200Kb
-
Chuyển và gắn ngẫu nhiên vào bộ gene
của tế bào
2. Các vector chuyển gene
2.6. Nhiễm sắc thể nhân tạo
của nấm men (YAC-yeast
artificial chromosome)
- Plasmid vòng tròn 2µm
-
Chứa đoạn DNA lạ dài đến
2000Kb
2. Các vector chuyển gene
2.7. Các nhiễm sắc thể nhân
tạo khác
-
BAC (Bacterial artificial
chromosome)
-
MAC (Mammalian artificial
chromosome)
-
P1AC (P1 bacteriophage

derived artificial
chromosome)
3. Hệ thống tế bào chủ (Host)
Mục đích:
-
Nhân nuôi tạo số lượng lớn dùng cho thí nghiệm tạo dòng.
-
Biểu hiện gene
-
Sản xuất protein tái tổ hợp.
3.1. Escherichia coli (E.coli)
-
Dễ nuôi cấy và nhân dòng
-
Dễ chấp nhận các loại vector khác nhau.
-
Vi khuẩn Gram-, hình que,
-
Bộ gene khoảng 4,6x10(6) cặp base
3. Hệ thống tế bào chủ (Host)
3.2. Saccharomyces cerevisiae
-
Đối tượng nghiên cứu của vi sinh vật Eukaryote
-
Phân lập được nhiều promotor hoạt động mạnh
-
Thực hiện biến đổi sau dịch mã tạo protein có
đủ hoạt tính sinh học.
-
Sản xuất protein tái tổ hợp

-
Sinh vật an toàn
3.3. Hệ thống tế bào thực vật
3.4. Hệ thống tế bào động vật
-
Tế bào thận khỉ xanh châu Phi (COS- African green monkey kidney)
-
Tế bào thận chuột đồng con (BHK- Baby hamster kidney)
-
Tế bào thận phôi người (HEK-239- Human embryonic kidney
-
Tế bào tử cung chuột bạch (CHO-Chinese hamster ovary)
- Tế bào côn trùng nuôi baculovirus biều hiện protein người
-
Tế bào tuyến trùng Caenorhabditis elegans
3. Hệ thống tế bào chủ (Host)
1. Lai nucleic acid
-
Tách chiết và tinh sạch DNA và RNA
-
Điện di trên gel
+
-
Wells
Small
Large
Kỹ thuật và
phương pháp căn bản
1. Lai nucleic acid
-

Lai trên pha rắn
Southern blot, Northern blot, Western blot, Dot và slot blot
Kỹ thuật và
phương pháp căn bản
1. Lai nucleic acid
-
Lai trên pha rắn
Kỹ thuật và
phương pháp căn bản
Dot và slot blot
dùng cho RNA và DNA
1. Lai nucleic acid
-
Lai trên pha rắn
-
Lai tại chổ
(in situ hybridisation):
nghiên cứu nucleic acid tại
chổ không cần phải tách
chiết ra ngoài
Kỹ thuật và
phương pháp căn bản
2. Thu nhận gene
-
Thu nhận DNA từ bộ gene
* Shotgun
* Ngân hàng/thư viện DNA bộ gene (Bank/Library of genomic DNA)
-
Tổng hợp gene bằng phương pháp hóa học
-

Lập ngân hàng c-DNA
* Chứa trình tự mã hóa liên tục của một gene (no intron)
* Xác định đúng dòng gene muốn nghiên cứu : EX: hemoglobine
Kỹ thuật và
phương pháp căn bản
2. Thu nhận gene
-
Thu nhận DNA từ bộ gene
-
Tổng hợp gene bằng phương pháp hóa học
-
Lập ngân hàng c-DNA
* Chứa trình tự mã hóa liên tục của một gene (no intron)
* Xác định đúng dòng gene muốn nghiên cứu : EX: hemoglobine
Kỹ thuật và
phương pháp căn bản