Tuyển chọn vi khuẩn bacillus sinh enzyme phytase

i

LỜI CẢM ƠN
Sau gần 3 tháng thực tập tại phòng vi sinh vật – Khoa Công nghệ thực phẩm,
trường Đại học Nha Trang, dưới sự hướng dẫn của TS.Nguyễn Minh Trí nên tôi đã
hoàn thành tốt cuốn luận văn này.
Qua đây tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Minh Trí
người đã quan tâm và tận tình chỉ bảo cho tôi trong suốt thời gian thực tập tốt
nghiệp, cùng các cán bộ nghiên cứu phòng vi sinh vật, những người đã tạo mọi điều
kiện thuận lợi để tôi hoàn thành tốt nhiệm vụ của mình.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo trường Đại học Nha Trang, cùng
toàn thể các thầy cô giáo trong Khoa Công nghệ thực phẩm đã tận tình chỉ bảo và
truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong những năm học vừa qua.
Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn tới gia đình cùng toàn thể bạn bè thân
thiết, những người đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.
Nha Trang,tháng 6-2012
Sinh viên

Nguyễn Thị Thư Thảo



ii

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN i
MỤC LỤC ii
DANH MỤC BẢNG v
DANH MỤC HÌNH vi
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vii
MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Phytase 3
1.1.1. Định nghĩa 3
1.1.2. Phân loại 3
1.1.2.1. Dựa trên vị trí của nhóm phospho đầu tiên bị tác động 3
1.1.2.2. Dựa trên sự khác biệt về cấu trúc và đặc trưng thủy phân của phytase 4
1.1.3. Các nguồn thu nhận enzyme phytase 5
1.1.3.1. Nguồn vi sinh vật 5
1.1.3.2. Nguồn thực vật 6
1.1.3.3. Nguồn động vật 6
1.1.4. Cơ chất đặc hiệu của phyase 8
1.1.4.1. Acid phytic và phytat 8
1.1.4.2. Các cơ chất khác 9
1.1.5. Các đặc tính lý hóa của phytase 10
1.1.5.1. Cấu tạo và trọng lượng phân tử 10
1.1.5.2. Nhiệt độ 10
1.1.5.3. pH 11
1.1.5.4. Ảnh hưởng của các ion kim loại và một số chất hóa học lên hoạt
độ phytase 11
1.1.6. Các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình sinh tổng hợp phytase ở vi sinh vật 12
1.1.7. Ứng dụng của enzyme phytase 13
iii

1.1.7.1. Ứng dụng phytase trong sản xuât thức ăn gia súc, gia cầm 13
1.1.7.2. Ứng dụng phytase trong sản xuất thực phẩm 14
1.1.7.3. Ứng dụng phytase trong sản xuât myo-inositol phosphat 14
1.1.7.4. Ứng dụng phytase trong sản xuất bột giấy và công nghiệp giấy 15
1.2. Đại cương về Bacillus sinh enzyme phytase 15
1.2.1. Vài nét về Bacillus 15
1.2.2. Phân loại phytase của Bacillus 16

1.2.3. Cơ chất đặc hiệu 17
1.3.Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trong sản xuất ở Việt Nam 17
CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18
2.1. Đối tượng và vật liệu 18
2.1.1. Đối tượng 18
2.1.2. Vật liệu 18
2.1.2.1. Hóa chất 18
2.1.2.2. Thuốc nhuộm 18
2.1.2.3. Thiết bị 18
2.1.3. Môi trường nuôi cấy 19
2.1.3.1. Môi trường phân lập, giữ giống và nuôi cấy 19
2.1.3.2. Môi trường tăng sinh: môi trường BHB (g/l) 19
2.1.3.3. Môi trường nuôi cấy xác định khả năng sinh phytase 19
2.3.3.4. Môi trường để xác định các yếu tố ảnh hưởng (Nhiệt độ, pH,
thời gian) 19
2.1.3.5. Cách chuẩn bị môi trường 20
2.2. Các phương pháp nghiên cứu 20
2.2.1. Phân lập chủng vi khuẩn Bacillus từ Natto 20
2.2.2. Phương pháp xác định khả năng sinh phytase 20
2.2.3. Phương pháp xác định hoạt độ phytase 21
2.2.3.1. Phương pháp định lượng phosphate (phương pháp Fiske và
Subbarow) 21
iv

2.2.3.2. Cách tính hoạt độ enzyme phytase 24
2.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến enzyme phytase
sinh ra 24
2.2.5. Khảo sát các ảnh hưởng của nhiệt độ, pH đến khả năng thủy phân
hytate của enzyme phytase 25
2.2.5.1. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ phytase 25

2.2.5.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên hoạt độ phytase 26
2.2.6. Sơ bộ đánh khả năng sinh enzyme phytase của vi khuẩn phân lập
được trên bã sắn 27
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 28
3.1. Phân lập chủng Bacillus 28
3.2. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc 28
3.3. Đặc điểm hình thái tế bào vi khuẩn 29
3.4. Nghiên cứu khả năng sinh enzyme phytase của các chủng Bacillus 31
3.5. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp phytase của Bacillus trên môi trường lỏng 32
3.5.1. Xây dựng đường chuẩn định lượng phospho 33
3.5.2. Khảo sát hoạt độ phytase của chủng Bacillus trên môi trường lỏng 34
3.5.3. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến enzyme phytase
sinh ra 35
3.6. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, pH đến khả năng thủy phân phytate
của enzyme phytase 36
3.6.1. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ phytase 36
3.6.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên hoạt độ phytase 37
3.7. Kết quả đánh giá sơ bộ khả năng thủy phân của enzyme phytase của vi
khuẩn ở trên bã sắn 38
CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO 40
PHỤ LỤC

v

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Phân loại một số phytase 5
Bảng 1.2: Các nguồn cung cấp phytase 7
Bảng 1.3: Hàm lượng phytat và phospho trong các sản phẩm cây trồng 9
Bảng 2.1: Bảng dung dịch đường chuẩn 23

Bảng 2.2: Bảng xác định lượng phosphat trong dịch enzyme 23
Bảng 3.1: Đo đường kính của vòng phân giải của enzyme trong môi trường thạch 32
Bảng 3.2: Tương quan giữa giá trị ∆OD với hàm lượng phospho giá trị
∆OD
700
với hàm lượng phospho 33


vi

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Phản ứng thủy giải phytase bởi enzyme phytase 3
Hình 1.2: Phản ứng thủy giải 3-phytase 4
Hình 1.3: Phản ứng thủy giải 6-phytase 4
Hình 1.4: Cấu trúc acid phytic 8
Hình 2.1: Sơ đồ của quá trình phân lập vi khuẩn Bacillus từ Natto 20
Hình 2.2: Sơ đồ xác định khả năng sinh enzyme phytase 21
Hình 2.3: Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến enzyme phytase 24
Hình 2.4: Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ phytase 25
Hình 2.5: Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt độ phytase 26
Hình 3.1: Phân lập khuẩn lạc chủng Bacillus 28
Hình 3.2: Các chủng Bacillus phân lập được 29
Hình 3.3: Hình thái tế bào của chủng Bacillus 30
Hình 3.4: Hình thái tế bào của chủng Bacillus (có sinh bào tử) 30
Hình 3.5: 3 chủng vi khuẩn không xuất hiện vòng phân giải 31
Hình 3.6: Hoạt tính phân giải enzyme phytase của 3 chủng Bacillus 32
Hình 3.7: Đường biểu diễn sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ phospho và
giá trị ∆OD
700
33

Hình 3.8: Hoạt độ chung của phytase của 3 chủng Bacillus nuôi cấy trong môi
trường lỏng, cơ chất cảm ứng là sodium phytase 34
Hình 3.9: Đường biến thiên hoạt độ phytase của B7 theo thời gian nuôi cấy 35
Hình 3.10: Đường biến thiên hoạt độ phytase của B7 theo nhiệt độ nuôi cấy 36
Hình 3.11: Đường biến thiên hoạt độ phytase của B7 theo pH nuôi cấy 37

vii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
HAPs : Histidin acid phosphat
BPP : β-propeller phytase

PAP : acid phosphatase
Ins : Inositol
OD : Độ hấp thụ của dung dịch (giá trị mật độ quang)
OD
o
: Giá trị mật độ quang của ống thử không
OD
t
: Giá trị mật độ quanh của ống thử thật
∆OD : Hiệu số mật độ quang (∆OD = OD
t
– OD
o
)
đvhđ : Đơn vị hoạt độ
TB : Trung bình
1

MỞ ĐẦU
Vi sinh vật trong tự nhiên rất là phong phú và đa dạng. Chúng ở khắp mọi
nơi xung quanh ta như: trong đất, trong nước, trong không khí thậm chí có cả trong
cơ thể của con người. Chúng có thể gây ra cho ta những bất lợi như bệnh lao, bệnh
dịch hạch, bệnh tả, đại dịch cúm ở con người và cả gia cầm, … Nhưng vi khuẩn
cũng đem lại cho chúng ta nguồn lợi vô cùng to lớn nếu ta biết, hiểu chúng và biết
cách sử dụng chúng vào mục đích có lợi sẽ giúp cho cuộc sống con người tốt đẹp hơn.
Từ xưa, con người đã biết ứng dụng những hoạt tính có lợi của vi sinh vật
phục vụ cho đời sống của mình như là tạo ra các loại rượu nhờ quá trình lên men
của vi sinh vật, tạo ra các loại thức ăn từ quá trình lên men như đậu tương lên men
(natto) của Nhật, tạo ra loại nước giải khát lên men, các chế phẩm enzyme lấy từ vi
sinh vật phục vụ cho trồng trọt, chăn nuôi.
Ngày nay khi chúng ta đang sống ở thế kỷ XXI, thế kỷ của khoa học và kỹ
thuật ngày càng phát triển thì công nghệ vi sinh càng ngày càng chứng tỏ được ưu
thế của mình
Hiện nay đã có rất nhiều chất có hoạt tính sinh học khác nhau đã được tổng
hợp từ vi sinh vật đã được đưa vào sản xuất ở mức độ công nghiệp để phục vụ cho
nghiên cứu, công – nông nghiệp, y học và cả đời sống của con người.
Các chủng vi khuẩn như: Bacillus, Lactobacillus … đã và đang được sử
dụng trong chế phẩm sinh học để phục vụ cho các ngành sản xuất như: bia, rượu, y
học, công nghiệp dệt, bổ sung vào thức ăn gia súc, thức ăn trong nuôi trồng thủy
sản, phân hủy thức ăn của vật nuôi
Xuất phát từ thực tiễn đó tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Tuyển chọn vi
khuẩn Bacillus sinh enzyme phytase” với các nội dung sau:
1. Tuyển lựa vi khuẩn Bacillus mẫu thực phẩm lên men (Natto) để chọn các
chủng Bacillus ở các mẫu khác nhau
2. Nghiên cứu các đặc điểm về hình thái tế bào khuẩn lạc, nghiên cứu một số
đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng đã được tuyển chon.
2

3. Xác định một số điều kiện ảnh hưởng đến khả năng thủy phân của enzyme
thu được.
4. Sơ bộ đánh giá khả năng thủy phân của enzyme thu nhận được trên bã sắn.
Để tài này được thực hiện tại phòng Vi sinh vật của Khoa công nghệ thực
phẩm thuộc trường Đại học Nha Trang.


3

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Phytase
1.1.1. Định nghĩa [6][17]
Phytase (myo-inositol hexakisphosphat phosphohydrolase) là enzyme xúc tác
cho phản ứng thủy giải liên kết monophosphoester của acid phytic hoặc muối
phytat, giải phóng orthophosphat và các dẫn xuất myo-inositol chứa ít nhóm
phosphat hơn hay các myo-inositol tự do.
Phản ứng có thể khái quát như sau:
myo-inositol hexakisphosphat +H2O  D-myo-inositol 1,2,4,5,6-
pentakisphosphat + phosphat
Hình 1.1: Phản ứng thủy giải phytase bởi enzyme phytase
1.1.2. Phân loại [6][17]
1.1.2.1. Dựa trên vị trí của nhóm phospho đầu tiên bị tác động
Các tổ chức nghiên cứu về sinh hóa như IUBMB (International Union of
Biochemistry and Molecular Biology), IUPAC-IUB, JCBN (Joint Commission on
Biochemical Nomenclature) đã chia phytase thành 2 loại:
EC 3.1.3.8: tên thông thường là 3-phytase, tên hệ thống là myo-
inositolhexakisphosphat-3-phosphohydrolase. Enzyme loại này thủy giải liên kết
ester tại vị trí thứ 3 của myo-inositolhexakisphosphat, cho sản phẩm là D-myo-Ins-
1,2,4,5,6-pentakisphosphat và orthophosphat. Đây là dạng thường gặp đối với các
phytase có nguồn gốc vi sinh vật.

4



Myo-inositol
hexakisphosphat
+

H(2)O

=


1D-myo-inositol1,2,4,5,6-
pentakisphosphat
+


phosphat


Hình 1.2: Phản ứng thủy giải 3-phytase
EC 3.1.3.26: tên thông thường là 6-phytase, tên hệ thống là myo-
inositolhexakisphosphat-6-phosphohydrolase. Enzyme loại này thủy giải liên kết
ester tại vị trí thứ 6 của myo-inositolhexakisphosphat, cho sản phẩm là D-myo-Ins-
1,2,3,4,5-pentakisphosphat và orthophosphat. 6-phytase là dạng thường gặp đối với
phytase có nguồn gốc thực vật.


Myo-inositol

hexakisphosphat
+

H(2)O

=


1D-myo-inositol1,2,3,5,6-
pentakisphosphat
+


phosphat

Hình 1.3: Phản ứng thủy giải 6-phytase
1.1.2.2. Dựa trên sự khác biệt về cấu trúc và đặc trưng thủy phân của phytase
Một số tổ chức nghiên cứu và các nhà khoa học khác như Trung tâm thông
tin sinh học quốc gia Hoa Kỳ (NCBI) và các tác giả Mullaney, Ullah, đã phân chia
phytase thành 3 nhóm.
Nhóm thứ 1 (EC3.1.3.2): Bao gồm các acid phosphatase hoặc histidin acid
phosphat (HAPs). Đặc điểm chung có trung tâm hoạt động là RHGXRXP và quá
trình thủy giải phosphomonoester gồm các bước giống nhau.
5

Nhóm thứ 2 (EC3.1.3.8): Là các β-propeller phytase (BPP), chủ yếu là các
enzyme của Bacillis. Cho đến nay việc phân lập, xác định các gen điều khiển hoạt
động của phytase thuộc nhóm này chưa đầy đủ. Các nghiên cứu cho thấy, hiện có 2
loại phytase của Bacillus đã được xác định, đó là phyC do Kerovuo và các cộng sự
phát hiện vào năm 1998 và TS-phy do Kim và các cộng sự phát hiện vào năm 1998.

Nhóm thứ 3 (EC3.1.3.2): Bao gồm các purple acid phosphatase (PAP).
Gmphy được chiết tách từ lá mầm của đậu nành nảy mầm thuộc nhóm enzyme này.
Người ta đã xác định được cấu trúc không gian 3 chiều và cơ chế xúc tác của
Gmphy.
Bảng 1.1: Phân loại một số phytase [12]
STT Gen Nguồn cung cấp Nhóm phân loại
1 appA Escherichia coli Histidin acid phosphatase
2 MIPP Chuột Histidin acid phosphatase
3 phyA Aspergillus ficuum Histidin acid phosphatase
4 phyB Aspergillus niger Histidin acid phosphatase
5 phyS11 Bắp (zea mays) Histidin acid phosphatase
6 Gmphy Đậu nành (Glycine soja) Purple acid phosphatase
7 KBPAP Đậu trắng (Phaseolus vulgaris) Purple acid phosphatase
8 TRAP Động vật có vú Purple acid phosphatase
9 phyC Bacillus subtilis VTTE-68013 Beta-propeller phytase
10 TS-phy Bacillus amyloliquefaciens Beta-propeller phytase
11 phy-L Bacillus licheniformis Beta-propeller phytase
12 168phyA Bacillus subtilis 168 Beta-propeller phytase

1.1.3. Các nguồn thu nhận enzyme phytase [6][20]
1.1.3.1. Nguồn vi sinh vật
Năm 1968, Shieh và Ware đã tiến hành phân lập từ đất hơn 2.000 chủng vi
sinh vật có khả năng tạo phytase. Hầu hết các chủng được phân lập cho sản phẩm
enzyme nội bào. Chỉ có khoảng 30 chủng đã phân lập cho sản phẩm phytase ngoại
6

bào. Tất cả các phytase ngoại bào đều là sản phẩm của vi nấm, 28 chủng thuộc
giống Aspergillus, một thuộc giống Penicillium và một thuộc giống Mucor. Các
nghiên cứu khác đã khẳng định A.niger sinh tổng hợp phytase ngoại bào tốt nhất.
Các nghiên cứu của Powar và Jagannathan (1982), Shimizu (1992) cho thấy

Bacillus subtilis có khả năng sinh tổng hợp phytase và đây là enzyme ngoại bào.
Đến năm 1998, Kim và các cộng sự nghiên cứu và chứng minh Bacillus
amyloliquefaciens cũng có khả năng sinh tổng hợp phytase. Bên cạnh đó, các chủng
như Aerobacter aerogenes, Pseudomonas sp, Escherichia coli, Enterobacter sp
cũng có khả năng sinh tổng hợp phytase.
Một số nấm men cũng có khả năng sinh tổng hợp phytase, trong đó, các
chủng như Schwanniomyces castellii, Arxula adenivorans, Pichia spartinae và
Pichia rhodannesis cho sản phẩm phytase ngoại bào. Ngược lại, Saccharomyces
cerevisiae và Pichia anomala sinh tổng hợp enzyme phytase nội bào.
1.1.3.2. Nguồn thực vật
Phytase được tìm thấy ở nhiều thực vật. Ví dụ như phytase từ ngũ cốc: lúa
mì, bắp vàng, lúa mạch, lúa gạo và từ các loại đậu: đậu xanh, đậu lùn và đậu trắng
California loại nhỏ. Hoạt độ phytase cũng đã được xác định ở cải trắng, khoai tây,
củ cải, rau diếp, rau bina, cỏ và phấn hoa Lily. Một số tác giả đã tinh sạch và xác
định các đặc tính của phytase chiết tách từ hạt bắp vàng đang nảy mầm. Rễ cây của
một số thực vật có chứa phytase, tuy hàm lượng thấp nhưng cũng được nghiên cứu,
xác định.
1.1.3.3. Nguồn động vật
Phytase được tìm thấy ruột của một số động vật, đặc biệt là các động vật nhai
lại. Tuy nhiên, phytase trong ruột không đóng vai trò quan trọng trong việc tiêu hóa
các dẫn xuất phytat trong thức ăn. Năm 1997, Craxton và các cộng sự đã phân lập
và cho thấy biểu hiện hoạt động của phytase trên một nhánh gan của chuột. Một
enzyme có chức năng giống phytase cũng đã được tìm thấy ở động vật đơn bào
Paramecium.

7

Bảng 1.2: Các nguồn cung cấp phytase [6]

Nguồn Vị trí enzyme

Aspergillus niger NRRL 3135 EX
A.flavus EX
A.oryzae EX
A.terrus EX
A.carneus EX
A.fumigatus EX
Mucor sp EX
Penicillium spp EX
Penicillium caseoicolum EX
Nấm mốc
Rhizopus oligosporus IN và EX
Saccharomyces cerevisiae EX
Schwanniomyces castelii EX
Kluyveromyces fragilis EX
Candida tropicalis EX
Torulopsis candida EX
Nấm men
Debaryomyces castelii EX
Bacillus subtilis (Natto) EX
Bacillus amyloliquefaciens EX
Escherichia coli IN
1

Klebsiella aerogenes IN
K.terrigena IN
K.oxytoca IN
Pseudomonas sp EX
Enterobacter sp EX
Vi khuẩn
Citrobacter freundii IN

Bắp vàng (đã nảy mầm) IN
Hạt đậu nành IN
Thực vật
Hạt cây họ đậu IN
8


Nguồn Vị trí enzyme
Typha latifola ( phấn hóa) IN
Dịch nhờn trong ruột loài gặm nhấm IN
2

Gan của loài gặm nhấm IN
2

Động vật
Paramecium IN
2

EX: enzyme ngoại bào IN: enzyme nội bào

1
: trong tế bào chất
2
: trong lưới nội chất
1.1.4. Cơ chất đặc hiệu của phyase
1.1.4.1. Acid phytic và phytat [6][19]
Acid phytic (myo-inositol hexakisphosphat) là ester của rượu inositol và acid
phosphoric. Công thức tổng quát là C
6

H
18
O
24
P
6
. Cấu trúc hóa học của acid phytic
rất ổn định, hàm lượng phosphat cao, do đó nó có tích điện âm và có khả năng tồn
tại trong phổ pH rộng.








Hình 1.4: Cấu trúc acid phytic
Acid phytic chiếm từ 1-5% trọng lượng trong ngũ cốc, cây họ đậu, hạt
cho dầu và các loại quả hạch. Trong cỏ làm thức ăn cho động vật, 1/3 là các ion
phospho (P) có thể tiêu hóa được, trong khi đó 2/3 còn lại là các P vô cơ tồn tại
dưới dạng phytin, một dạng hỗn hợp của muối canxi, magie với acid inositol
hexaphosphoric được biết đến như là một dạng muối của acid phytic. Ngoài ra,
trong tự nhiên, acid phytic tồn tái chủ yếu dưới dạng muối phytat với các ion kim
loại như kẽm, sắt (II)… phytat là loại hợp chất phức tạp, khó tan, cơ thể người và
9

động vật không thể phân giải, do đó không thể hấp thụ được phospho và các nguyên
tố cần thiết cho cơ thẻ. Trong trường hợp này acid phytic là nguyên nhân gây nên
hiện tượng kháng dưỡng, hầu như không có enzyme nào có khả năng phân cắt các

liên kết phosphodiester trong phân tử acid phytic, ngoại trừ phytase.
Bảng 1.3: Hàm lượng phytat và phospho trong các sản phẩm cây trồng [9]
Nguồn Tỷ lệ phospho
tổng số (%)
Hàm lượng
phospho trong
muối phytat
(g/100g)
Tỷ lệ % phospho
trong phytat đối
với phospho tổng
số (%)
Đậu Hà Lan 0,48 0,24 50
Đậu nành 0,61-0,65 0,39 60-61
Hạt cải 1,18 0,70 59
Hạt hướng dương 1,16 0,89 77
Bắp vàng (dạng bột)

0,26-0,33 0,24 66-72
Lúa mạch 0,34-0,42 0,27 56-64
Lúa miến 0,36 0,24 66
Gạo 0,36 0,27 77
Lúa mì 0,30-0,35 0,27 67-77

1.1.4.2. Các cơ chất khác
Phytase có khá nhiều cơ chất đặc trưng như ADP, ATP, p-nitrophenyl
phosphat, phenyl phosphat, fructose 1, 6-bisphosphat, glucose 6-phosphat, α-,β-
glycerophosphat và 3-phosphoglycerat. Các chất này không có cấu trúc tương tự
acid phytic nhưng tất cả đều được thủy giải bởi phytase. Chỉ có một số ít phytase
được nghiên cứu cho thấy có tính đặc hiệu cao với acid phytic, đó là phytase của

Bacillus và alkaline phytase được phân lập từ hạt phân hóa Lily.
Dựa trên cơ chất đặc trưng, phytase có thể được phân chia thành 2 loại là
phytase có lượng cơ chất đặc trưng khá rộng và phytase đặc hiệu cao với acid
phytic. Phytase phù hợp với nhiều cơ chất đặc hiệu thì lại có tính đặc hiệu thấp với
10

acid phytic (23 - 43U/mg). Ngược lại, phytase có lượng cơ chất đặc hiệu hẹp thì cho
hoạt độ cao hơn, từ 103 - 811U/mg.
1.1.5. Các đặc tính lý hóa của phytase
1.1.5.1. Cấu tạo và trọng lượng phân tử
Hầu hết các phytase đã được xác định là enzyme đơn phân tử. Ví dụ như
phytase của vi nấm, E.coli, Klebsiella terrigena, Bacillus subtilis. Tuy nhiên,
phytase của một số động thực vật được hình thành từ nhiều tiểu đơn vị. Phytase
được hình thành trong quá trình nảy mầm của hạt bắp được xác định là một enzyme
gồm 2 tiểu đơn vị có trọng lượng 38 kDa. Phytase được tinh sạch từ ruột của chuột,
qua kết quả điện di cho thấy có 2 loại protein với kích thước 70 và 90 kDa.
Phytase của Klebsiella aerogenes có 2 dạng khác nhau, một là dạng enzyme
tự nhiên, có kích thước khá lớn, 700kDa, dạng còn lại cũng có đầy đủ các phần đảm
bảo cho hoạt động của enzyme và có trọng lượng phân tử rất thấp, chỉ từ 10-13kDa.
Phytase của vi khuẩn hầu hết có trọng lượng phân tử nhỏ hơn phytase của nấm.
Theo tính toán lý thuyết, phytase của nấm có trọng lượng phân tử khoảng 50kDa,
kết quả nghiên cứu thực nghiệm cho kết quả trong khoảng 65-70 kDa, trong đó
phần nặng nhất là các gốc glycosy hóa.
Trọng lượng và kích thước phân tử tính toán theo lý thuyết của các protein
hoàn chỉnh và số lượng các tiểu đơn vị của phytase từ nhiều nguồn khác nhau.
1.1.5.2. Nhiệt độ
Nhiệt độ tối ưu của phytase từ các nguồn khác nhau sẽ khác nhau. Nhiệt độ
tối ưu của phytase dao động từ 45
o
C đến 77

o
C. Khi nghiên cứu khả năng chịu nhiệt
của Aspergillus fumigates, A.niger (phytase), các nhà khoa học đã xác định phytase
của A.niger không có khả năng chịu nhiệt, ngay cả khi có sự biến đổi cấu trúc sau
khi biến tính bởi nhiệt. Ở nhiệt độ khoảng 50 - 55
o
C, nó trải qua quá trình biến đổi
hình dáng cấu tạo không thuận nghịch và kết quả là làm giảm 70-80% hoạt độ
enzyme. Phytase của A.fumigatus cũng không có khả năng chịu nhiệt, nhưng có một
đặc tính đáng chú ý là có khả năng hồi tính, đảm bảo đầy đủ hoạt độ sau khi bị biến
tính ở 90
o
C.
11

Một vài nghiên cứu cho thấy có thể dùng kỹ thuật protein để tăng tính ổn
định nhiệt của phytase như thay thế prolin và tạo cầu disulfit hay dùng kỹ thuật sinh
học phân tử để tạo dòng phytase từ những nấm chịu nhiệt như M.thermophila,
T.thermophilus … Ngoài ra, cũng có thể sử dụng một số hóa chất đặc biệt như
polyol, dịch trích lúa miến…
1.1.5.3. pH
pH tối ưu của phytase từ các nguồn khác nhau sẽ khac nhau. pH tối ưu của
phytase dao động trong một biên độ khá lớn, từ 2,2 đến 8,0. Hầu hết phytase của vi
sinh vật, đặc biệt là ở các nấm, pH tối ưu trong khoảng 4,5 đến 5,6. Phytase của
A.fumigatus có phổ pH tối ưu khá rộng; ít nhất 80% hoạt độ cao nhất được xác định
ỏ trị số pH từ 4,0 đến 5,6. Hai phytase thực vật có tính kiềm (hạt đậu và phân hoa
Lily) có pH tối ưu là 8,0. Phytase từ động vật đa số hoạt động ở pH kiềm, từ 7,4 đến
8,7. Để tạo phytase có pH phù hợp với hệ thống tiêu hóa của động vật, Tomschy và
cộng sự đã tạo đột biến điểm định hướng bằng cách thay thế Gly-277 và tyr-282 của
phytase A.fumigatus bằng các gốc tương ứng Lys và His của phytase A.niger.

1.1.5.4. Ảnh hưởng của các ion kim loại và một số chất hóa học lên hoạt độ
phytase
Các ion kim loại được xem là các tác nhân ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt độ
phytase. Tuy nhiên, rất khó để xác định rõ ảnh hưởng của các kim loại khác nhau vì
sự liên kết trực tiếp với enzyme hoặc các ion kim loại ở dạng hợp chất hòa tan với
acid phytic và do đó làm giảm mức độ hoạt động của cơ chất. Phytase của
Enterobacter sp.4 bi ức chế bởi các ion Zn
2+
, Ba
2+
,Cu
2+
và Al
2+
.
Theo nghiên cứu của Wyss và các động sự (1999), ion Cu
2+
được xác định
có khả năng làm giảm hoạt độ của enzyme phytase có nguồn gốc từ E.nidulans và
A.terrus. Phytase của A.fumigatus bị ức chế bởi một số ion kim loại thông thường.
Hoạt đô phytase của A.fumigatus bị giảm 50% dưới tác dụng của EDTA, ngược lại,
EDTA không phải là yếu tố chính tác động lên hoạt độ phytase có nguồn gốc từ
nấm như E.nidulans, A.niger, A.terrus. Những chất hóa học khác có khả năng kìm
hãm hoạt độ phytase là flor, molypdat, vanadat …
12

Vai trò của ion kim loại đối với hoạt độ phytase phải được xem xét trên từng
loại đối tượng cụ thể. Đối với phytase này, ion kim loại có thể là tác nhân làm giảm
hoạt độ nhưng đối với phytase khác, đó lại là yếu tố làm gia tăng hoạt độ của
enzyme. Ion Ca

2+
đóng một vai trò quan trọng đối với hoạt độ của phytase. Khi
thêm tác nhân Ca vào phytase của Bacillus, phytase có nguồn gốc phấn hoa Typha
latifolia và phytase của một số loại thực vật khác cũng có khả năng làm tăng hoạt
độ của enzyme, ví dụ như ion Zn
2+
, ở nồng độ 20-80µM, có thể làm tăng 40% hoạt
độ phytase ở chuột; ion Fe
2+
cũng có tác dụng làm tăng hoạt độ phytase.
1.1.6. Các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình sinh tổng hợp phytase ở vi sinh vật
Phytase là sản phẩm thứ cấp được vi sinh vật tổng hợp trong quá trình sinh
trưởng. Ở một số vi sinh vật (nấm mốc, vi khuẩn Bacillus) phytase được tiết vào
môi trường nuôi cấy, ở nhiều vi sinh vật khác, phytase chỉ được tích trữ trong thực
tế bào chúng.
Phytase thực chất là protein nên cơ chế tổng hợp của phytase tương tự như
những protein khác. Operon điều hòa phytase là operon cảm ứng. Gen mã hóa cho
enzyme phytase gọi là gen appA. Hoạt động của appA tùy thuộc vào nhân tố sigma
σ
s
– mã hóa bởi gen rpoS. Khi môi trường thiếu phospho và có nhiều phytat, rpoS
được kích thích hoạt động mạnh, theo sau đó là sự tổng hợp trong phase ổn định,
sau giai đoạn tăng trưởng lũy thừa.
Ngoài phytat là cơ chất cảm ứng cho sinh tổng hợp phytase, các yếu tố dinh
dưỡng khác như nguồn carbon, nitơ, khoáng cũng ảnh hưởng đến mức độ sinh tổng
hợp phytase. Vi khuẩn Raoultella terrigena tổng hợp nhiều phytase khi môi trường
thiếu nguồn carbon. Trong khi đó nồng độ giới hạn của carbon, nitơ không ảnh
hưởng đến sự tổng hợp phytase của E.coli. Sự tổng hợp phytase vô cơ ảnh hưởng
đến sự tổng hợp phytase của đa số nấm mốc, nấm men, vi khuẩn trừ Raoultella
terrigena và các vi khuẩn trong dạ dày cỏ của động vật nhai lại.

13

1.1.7. Ứng dụng của enzyme phytase [6][20]
1.1.7.1. Ứng dụng phytase trong sản xuât thức ăn gia súc, gia cầm
Động vật nhai lại tiêu hóa phytat thông qua hoạt động của các phytase được
tạo thành bởi các vi sinh vật trong dạ cỏ. Vi khuẩn và nấm sinh trưởng kị khí trong
ruột tham gia vào quá trình phân giải cơ bản thực vật trong dạ cỏ. Các ion phospho
được thủy giải từ phytat bởi phytase được sử dụng bởi cả hệ vi khuẩn trong dạ dày
và cơ thể chủ là động vật nhai lại. Tình trạng này khác hẳn so với các động vật khác
như heo, gia cầm và cá đều không có khả năng hấp thụ acid phytic, bởi chúng
không có enzyme phytase trong dạ dày và ruột. Vì thế, ion phospho được thêm vào
thức ăn của chúng để bổ sung nhu cầu phosphat. Theo nghiên cứu của
S.E.Scheldeler, khi bổ sung vào khẩu phần ăn của gà Broiler mái sẽ nâng cao tăng
trọng trong khoảng 7 tuần tuổi, cải thiện năng suất xương chân, không gây thiệt hại
năng suất thịt; đối với gà trống giúp tăng trọng nhanh, nâng cao khả năng chuyển
hóa thức ăn và sức sống.
Việc bổ sung vào thức ăn của động vật một hàm lượng phytase thích hợp sẽ
tạo khả năng đồng hóa phosphat trong quá trình tiêu hóa thức ăn và làm giảm bớt
hàm lượng phospho trong phân và điều đó có lợi cho môi trường. Tác động của
thức ăn có phytase đối với động vật trong vấn đề ô nhiễm môi trường đã được xác
định. Nếu sử dụng phytase trong thức ăn gia súc cho tất cả các động vật ở USD,
tương ứng với 8,23 x 10
4
tấn phosphat thải ra môi trường mỗi năm. Việc sử dụng
phytase như là một chất bổ sung vào thức ăn gia súc đã được áp dụng ở 22 nước. Tổ
chức FDA (The Food and Drug Administration) đã chấp thuận phytase đạt tiêu
chuẩn là chất không gây độc hại.
Bã sắn là phụ phẩm của quá trình tinh chế tinh bột sắn từ củ sắn tươi. Bã sắn
có độ ẩm trên 80% nên khi phơi dễ bị nhiễm khuẩn, sinh mùi khó chịu và ảnh
hưởng đến môi trường xung quang đặc biệt là nơi có dân cư sinh sống. Vậy nên vấn

đề ô nhiễm tại các nhà máy tinh bột sắn hiện nay là một trong những vấn đề cần
được giải quyết. Trong chăn nuôi thì bã sắn có chứa rất nhiều phytate chưa được
14

thủy phân nên việc bổ sung thêm phytase vào sẽ làm cho phytate trong bã sắn được
phân giải nhiều hơn.
1.1.7.2. Ứng dụng phytase trong sản xuất thực phẩm
Một chế độ ăn giàu ngũ cốc, đậu, đậu nành sẽ làm tăng lượng phytate vào cơ
thể. Người ăn kiêng và người lớn tuổi sẽ mất cân bằng trong tiêu hóa thức ăn nếu
tiêu thụ một lượng lớn ngũ cốc. Phytase không được tiêu hóa sẽ ảnh hưởng xấu đến
việc hấp thụ Zn
2+
, Ca
2+
, Mg
2+
, Fe
2+
, làm giảm khả năng chuyển hóa protein.
Simell và cộng sự (1989) đã ghi lại rằng nguồn dự trữ phytat tách từ protein
đậu nành tăng khả năng hòa tan tại pH thấp (pH = 3). Anno và cộng sự (1985) đã
tiến hành loại bỏ phytat từ sữa đậu nành bằng cách sử dụng phytase lúa mì. Tuy
nhiên, cần tiến hành nhiều nghiên cứu vè vấn đề này trước khi chấp nhận phytase
như là một chất phụ gia thực phẩm.
1.1.7.3. Ứng dụng phytase trong sản xuât myo-inositol phosphat
Myo-inositol phosphat và phospholipid đóng vai trò nòng cốt trong tín hiệu
vận chuyển qua màng và tăng sự tập trung ion Ca
2+
nội bào (Billington, 1993).
Đồng thời Ins(1,4,5)P

3
hoạt hóa các enzyme phụ thuộc ion Ca
2+
trong đó protein
kinase C, là yếu tố kích thích quá trình vận chuyển nhóm phosphat từ ATP đến
nhiều loại protein trong tế bào chất và làm thay đổi hoạt độ của chúng.
Bình thường inositol vận chuyển vào máu người một lượng là 30 µmol, tuy
hiện diện với một lượng nhỏ nhưng quan trọng do inositol có liên quan tới sự tuần
hoàn máu và có vai trò quan trọng trong sự sinh tinh trùng ở chuột.
Đặc biệt các inositol triphosphat đã chứng tỏ có khả năng ngăn chặn hoặc
giảm bớt bệnh trầm cảm hoặc làm giảm bớt các trường hợp liên quan đến sự khác
thường của neuopeptid Y (NPY). Trong số đó, bao gồm các bệnh như viêm khớp và
các bệnh về đường hô hấp như bệnh hen suyễn. Việc sử dụng inositol triphosphat
như thuốc giảm đau đã được nghiên cứu và đề nghị cho sử dụng. Đáng chú ý, ester
của inositol triphosphat được xem là tín hiệu biểu hiện sự ức chế ngược trở lại các
virus gây nhiễm trùng bao gồm cả HIV.
15

Các ứng dụng trong y học kể trên của myo-inositol phosphat đã góp phần
làm gia tăng sức hấp dẫn trong quá trình nghiên cứu, sản xuất hợp chất này. Cơ chế
tổng hợp hóa học của myo-inositol phosphat khá phức tạp, đòi hỏi nhiệt độ và áp
suất cao. Việc sản xuất myo-inositol phosphat bằng cách sử dụng phytase là một
phương pháp được lựa chọn thay cho việc tổng hợp hóa học. Việc cố định các
phytase được sử dụng để sản xuất các loại myo-inositol phosphat. Ngoài ra, myo-
inositol phosphat còn có thể được sử dụng cho việc nghiên cứu các đặc tính sinh
hóa và quá trình trao đổi chất.
1.1.7.4. Ứng dụng phytase trong sản xuất bột giấy và công nghiệp giấy
Acid phytic là thành phần quan trọng ở thực vật. Phytase chịu nhiệt được
xem là một tác nhân sinh học làm giảm hàm lượng acid phytic trong quá trình chế
biến giấy và bột giấy. Quá trình sử dụng enzyme làm giảm acid phytic sẽ không sản

sinh chất gây ung thư và các sản phẩm độc hại. Vì thế, việc khai thác phytase trong
quá trình chế biến giấy và bột giấy sẽ mang lại nhiều lợi ích cho môi trường và hỗ
trợ sự phát triển của các công nghệ sản xuất sạch trong tương lai.
1.2. Đại cương về Bacillus sinh enzyme phytase [1] [4] [6]
1.2.1. Vài nét về Bacillus
Vi khuẩn Bacillus là một nhóm vi khuẩn thuộc bộ eubacteriales của họ
bacillaceae.
Vi khuẩn Bacillus là trực khuẩn Gram dương (G
+
). Bacillus được phân biệt
với các loài vi khuẩn sinh bào tử khác bằng hình dạng tế tào hình que, sinh trưởng ở
trong điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc. Tế bào Bacillus có thể đơn
bào hoặc chuỗi và chuyển động bằng tiêm mao. Nhờ khả năng sinh bào tử nên vi
khuẩn bacillus có thể tồn tại trong thời gian rất dài dưới các điều kiện khác nhau và
rất phổ biến trong tự nhiên khác nhau như đất, nước, thức ăn, sữa, … nhưng chủ
yếu là đất.
Tất cả các loài thuộc chi Bacillus đều có khả năng dị dưỡng và hoại sinh nhờ
sử dụng các hợp chất hữu cơ đa dạng như đường, acid amin, acid hữu cơ,…Một vài
loài có thể lên men carbohydrate tạo thành glycerol và butanediol. Hầu hết đều là
16

loài ưa nhiệt trung bình với nhiệt độ tối ưu là 30-45
o
C, nhưng cũng có nhiều loài ưa
nhiệt với nhiệt độ tối ưu là 65
o
C.
Vi khuẩn có ở mọi nơi trong tự nhiên và khi điều kiện sống gay go, chúng có
khả năng tạo ra bào tử gần như hình cầu, để tồn tại trong trạng thái "ngủ đông"
trong thời gian dài. Loại sinh vật này có cực kỳ nhiều loài khác nhau, trong đó đa số

là vô hại.
Đa số Bacillus sinh trưởng ở pH = 7, một số phù hợp với pH = 9 – 10 như
Bacillus alcalophillus, hay có loại phù hợp với pH = 2 – 6 như Bacillus
acidocaldrius.
Vi khuẩn Bacillus có khả năng sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease,
phytase …), do có chúng được ứng dụng nhiều trong công nghiệp, chăn nuôi, trong
bảo vệ môi trường…
Các chủng Bacillus được nghiên cứu khá nhiều, đặc biệt là trong việc sử
dụng để tổng hợp nhiều loại enzyme khác nhau: amylase, protease, phytase,… Một
vài nghiên cứu gần đây cho thấy một số chủng Bacillus như Bacillus subtilis,
Bacillus amyloliquefaciens đóng vai trò tích cực trong quá trình phát triển của thực
vật trong điều kiện môi trường đất có nhiều phytase. Sự hiện diện của các vi khuẩn
này trên bề mặt rễ của thực vật đã giúp ích cho sự phát triển của thực vật thông qua
việc tạo nên các điều kiện thuận lợi cho quá trình dinh dưỡng của thực vật. Một số
thực vật có khả năng tạo phytase tuy nhiên với một lượng rất ít, không đủ để phân
giải phytat trong đất, do đó sự xuất hiện của các chủng Bacillus có khả năng sinh
tổng hợp phytase có ý nghĩa quan trọng.
Vi khuẩn Bacillus có khả năng sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease,
phytase …), do có chúng được ứng dụng nhiều trong công nghiệp, chăn nuôi, trong
bảo vệ môi trường…
1.2.2. Phân loại phytase của Bacillus
Phytase sinh tổng hợp từ Bacillus có hai loại là phyC (Kerovuo, 1998) và
TS-phy (Kim, 1998). Cả hai loại này đều thuộc nhóm β-propeller phytase (BPP). Sự
17

phụ thuộc vào liên kết với ion Ca
2+
cho tính ổn định nhiệt và hoạt độ xúc tác của
enzyme để phân biệt phyC với các nhóm phụ khác của phytase.
BPP có hai vị trí gắn với phosphat, vị trí “bẻ gãy” và vị trí “ái lực”. Sự thủy

giải cơ chất xảy ra tại vị trí “bẻ gãy”, còn vị trí “ái lực” thì có thể làm tăng ái lực
liên kết với cơ chất. Ion Ca
2+
tạo liên kết dễ dàng với cơ chất bởi tạo ra một môi
trường tĩnh điện thích hợp.
1.2.3. Cơ chất đặc hiệu
PhyC đặc hiệu cao với cơ chất là acid phytic, hoạt độ đạt 100%, ngoài ra nó
còn đặc hiệu với ATP (hoạt độ đạt 50%) và ADP (hoạt độ đạt 75%). Tính đặc hiệu
của phytase ở Bacillus rất cao, tuy nhiên hiệu quả đặc hiệu thấp, so với phytase sinh
tổng hợp từ các nguồn khác. Hoạt độ đặc hiệu thấp làm cản trở việc sử dụng
phytase của Bacillus trong sản xuất công nghiêp.
1.3.Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trong sản xuất ở Việt Nam
Ở Việt Nam enzyme phytase được nghiên cứu ở nhiều trường đại học như
trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Đại học Thái Nguyên, trường
Cao đẳng Kinh tế - Kỹ thuật Hà Nội…Viện Chăn nuôi Quốc gia, Trung tâm Công
nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh, Viện Công nghệ sinh học Hà Nội và một
số trường đại học, viện nghiên cứu khác.
Có rất nhiều ứng dụng của phytase được ứng dụng trong các lĩnh vực, các
ngành nghề sản xuất khác nhau ở Việt Nam như: trong công nghiệp thực phẩm,
trong chăn nuôi, trong công nghiệp sản xuất bột giấy…
18

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng và vật liệu:
2.1.1. Đối tượng
Các chủng giống vi khuẩn Bacillus được phân lập mẫu thực phẩm lên men (natto).
2.1.2. Vật liệu
2.1.2.1. Hóa chất
NaOH 1N K

2
HPO
4

CaCl
2
FeSO
4

H
2
SO
4
(đậm đặc) HCl
TCA (acid trichloroacetic) Sodium phytate
Glucose NaCH
3
COO.3H
2
O
CH3COOH (đậm đặc) cồn
Ammonium molybdat [(NH
4
)
6
Mo
7
O
24
.4H

2
O]
2.1.2.2. Thuốc nhuộm
Violet
Lugon
Fushin
2.1.2.3. Thiết bị
+ Kính hiển vi + Tủ ấm
+ Tủ sấy + Nồi hấp thanh trùng
+ Cân điện tử + Tủ sấy
+ Tủ cấy vô trùng + Máy đo OD
+ Tủ lạnh + Bếp điện
+ Bình tam giác + Ống nghiệm
Dụng cụ khác: Đĩa petri, lame, pipet, đèn cồn, đũa thủy tinh, bóp cao su, …