Xây dựng quy trình multiplex PCR phát hiện đồng thời các gen độc tố của vi khuẩn vibrio parahaemolyticus gây bệnh

i
LỜI CẢM ƠN

Đề tài đƣợc thực hiện tại Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học,Trƣờng Đại
học Nha Trang. Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân
thành và sâu sắc tới TS. Phạm Thu Thủy đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ dạy, truyền đạt
kinh nghiệm và giúp đỡ tôi từng bƣớc tiếp cận và hoàn thành đề tài này.
Tôi xin chân thành cảm ơn đến:
 Quý thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học và Môi trƣờng đã truyền
đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong những năm qua.
 Quý thầy cô giáo và cán bộ Phòng thí nghiệm đã quan tâm, nhiệt tình
giúp đỡ tôi trong quá trình làm việc tại Phòng thí nghiệm.
 Bố mẹ, bạn bè đã luôn bên cạnh động viên, ủng hộ và dành cho tôi
những tình cảm yêu thƣơng nhất.
Một lần nữa, tôi xin đƣợc cảm ơn tất cả mọi ngƣời đã chia sẻ và giúp đỡ tôi
trong suốt quá trình thực hiện đề tài.


Nha Trang, tháng 07 năm 2012
Sinh viên thực hiện
NGUYỄN ANH THI

ii
MỤC LỤC


LỜI CẢM ƠN i
MỤC LỤC ii
DANH MỤC TỪ, KÍ TỰ VIẾT TẮT iv
DANH MỤC BẢNG v
DANH MỤC HÌNH vi
LỜI NÓI ĐẦU 1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN 2
1.1. Tình hình dịch bệnh do Vibrio parahaemolyticus gây ra 2
1.1.1. Trên thế giới 2
1.1.2. Ở Việt Nam 5
1.2. Tổng quan về vi khuẩn Vibrio và Vibrio parahaemolyticus 6
1.2.1. Tổng quan về vi khuẩn Vibrio 6
1.2.2. Tổng quan về vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 10
1.2.3. Gen độc tố của Vibrio parahaemolyticus 12
1.2.4. Khả năng gây bệnh của Vibrio parahaemolyticus 14
1.2.4.1. Nguồn lây nhiễm 14
1.2.4.2. Cơ chế gây bệnh 15
1.2.4.3. Đặc điểm của bệnh 16
1.2.5. Các phƣơng pháp kiểm tra sự có mặt của Vibrio parahaemolyticus 18
1.3. Tính cấp thiết và mục tiêu của đề tài 19
1.3.1. Tính cấp thiết của đề tài 19
1.3.2. Mục tiêu của đề tài 20

CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
2.1. Vật liệu 21
2.1.1. Mẫu 21
2.1.2. Thiết bị chuyên dụng 21
2.1.3. Hóa chất 22

iii
2.1.3.1. Hóa chất 22
2.1.3.2. Môi trƣờng và thuốc thử 22
2.2. Nội dung nghiên cứu 26
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 27
2.3.1. Phân lập vi khuẩn 27
2.3.2. Xác định đặc điểm hình thái của vi khuẩn Vibrio 30
2.3.3. Xác định một số đặc tính sinh hóa của các chủng Vibrio 31
2.3.4. Bảo quản chủng vi khuẩn. 33
2.3.5. Tách chiết DNA tổng số 33
2.3.6. Xác định gen độc tố bằng kỹ thuật PCR 35
2.3.7. Điện di gel agarose 40
2.3.8. Xây dựng quy trình Multiplex PCR phát hiện đồng thời 3 gen độc tố 41
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44
3.1. Phân lập và nuôi cấy vi khuẩn Vibrio từ hải sản 44
3.2. Đặc điểm hình thái tế bào của các chủng Vibrio 48
3.3. Một số đặc tính sinh hóa của Vibrio 49
3.4. Tách chiết DNA tổng số 53
3.5. Phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen toxR 54
3.6. Phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen tlh 55
3.7. Phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen tdh 56
3.8. Xây dựng quy trình Multiplex PCR phát hiện đồng thời 3 gen độc tố 56
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59
TÀI LIỆU THAM KHẢO

iv
DANH MỤC TỪ, KÍ TỰ VIẾT TẮT


FDA Food and Drug Administration
CDC Centers of Disease Control
bp Base pair
dNTPs Deoxynucleotide triphosphates
DNA Deoxyribonucleotide Acid
PCR Polymerase Chain Reaction
TCBS Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose
tdh (TDH) Thermostable direct hemolysin
trh (TRH) Tdh-related hemolysin
tlh (TLH) Thermolabile hemolysin
Vp-toxRS V. parahaemolyticus toxRS
RAPD Random Amplification of Polymorphic DNA
LAMP Loop mediated isothermal amplification
RT- PCR Reverse Transcription PCR
EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid
OD Optical Density
T3SS Type III Secretion System

v
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các nhóm thực phẩm Vibrio parahaemolyticus gây ngộ độc thực phẩm 4
Bảng 1.2. Ngộ độc thực phẩm gây ra bởi Vibrio parahaemolyticus do tiêu thụ thực
phẩm hải sản 1993 - 2000 ở Hồng Kông 5

Bảng 1.3. Đặc điểm của các loài Vibrio gây bệnh trên ngƣời liên quan đến việc tiêu
thụ hải sản 9
Bảng 1.4. Các kháng nguyên của Vibrio parahaemolyticus 11
Bảng 1.5. Các triệu chứng lâm sàng viêm dạ dày ruột gây ra bởi Vibrio
parahaemolyticus 18
Bảng 2.1. Các mẫu hải sản thu mua tại các chợ ở thành phố Nha Trang dùng để
phân lập vi khuẩn Vibrio 21
Bảng 2.2. Đặc điểm các mồi sử dụng cho phản ứng PCR 37
Bảng 2.3. Các thành phần sử dụng trong phản ứng PCR toxR 38
Bảng 2.4. Các thành phần sử dụng trong phản ứng PCR tlh, tdh 39
Bảng 2.5. Khảo sát tỉ lệ mồi 43
Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc 45
Bảng 3.2. Khả năng chịu muối của các chủng Vibrio 49
Bảng 3.3. Khả năng lên men đƣờng của các chủng vi khuẩn Vibrio 51
Bảng 3.4. Khả năng sử dụng lysin của các chủng vi khuẩn 52

vi
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu tạo Vibrio dƣới kính hiển vi điện tử 6
Hình 2.1. Sơ đồ cách tiếp cận các nội dung nghiên cứu 27
Hình 2.2. Quy trình phân lập Vibrio parahaemolyticus 29
Hình 3.1. Các chủng vi khuẩn sau 24 giờ nuôi cấy trên môi trƣờng LB 3%
NaCl ở điều kiện pH 7,2 và nhiệt độ 37
o
C 45
Hình 3.2. Các khuẩn lạc chủng T5, T11, T16, T20 sau 24 giờ nuôi cấy trên
môi trƣờng TCBS ở điều kiện pH 7,2 và nhiệt độ 37
o
C 48
Hình 3.3. Tế bào của chủng vi khuẩn Vibrio T11 sau khi nhuộm Gram 49

Hình 3.4. Thí nghiệm lên men đƣờng của chủng vi khuẩn T5 51
Hình 3.5. Thí nghiệm sử dụng lysin của các chủng Vibrio 52
Hình 3.6. DNA tổng số của các chủng vi khuẩn đƣợc điện di và soi dƣới tia UV
53
Hình 3.7. Sản phẩm khuếch đại gen toxR đƣợc điện di và soi dƣới tia UV 54
Hình 3.8. Sản phẩm khuếch đại gen tlh đƣợc điện di và soi dƣới tia UV 55
Hình 3.9. Sản phẩm khuếch đại gen tdh đƣợc điện di và soi dƣới tia UV 56
Hình 3.10. Kết quả khảo sát nhiệt độ lai 57
Hình 3.11. Kết quả khảo sát tỉ lệ mồi 58

1
LỜI NÓI ĐẦU


Hải sản là một trong những thực phẩm giàu chất dinh dƣỡng và thƣờng
không thể thiếu đƣợc trong các khẩu phần ăn khoa học. Tuy nhiên, việc tiêu thụ hải
sản có thể dẫn đến những nguy cơ về sức khỏe, bị nhiễm các mầm bệnh sống tự
nhiên trong môi trƣờng nƣớc biển và trong hải sản.
Nguy cơ nhiễm bệnh càng tăng nếu hải sản đƣợc xử lý không đúng cách
trong quá trình chế biến, dẫn đến các mầm bệnh có thể phát triển nhanh chóng theo
cấp số nhân trong điều kiện thuận lợi.
Một trong những mầm bệnh quan trọng xâm nhiễm vào hải sản là các vi
khuẩn Vibrio, đặc biệt là vi khuẩn V. parahaemolyticus tác nhân gây ra nhiều vụ
ngộ độc thực phẩm do tiêu thụ hải sản trên thế giới. Ngoài các bệnh nhiễm trùng ở
ngƣời, một số loài Vibrio còn gây bệnh cho các động vật hải sản dƣới nƣớc, trong
đó có các loài cá và tôm có giá trị kinh tế cao.
Do đó, việc nghiên cứu các phƣơng pháp phát hiện nhanh vi khuẩn Vibrio
parahaemolyticus gây bệnh là một trong những hƣớng nghiên cứu cần quan tâm.
Đề tài “Xây dựng quy trình Multiplex PCR phát hiện đồng thời các gen
độc tố của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh” đƣợc tiến hành với các

mục tiêu sau:
Phân lập chủng vi khuẩn có đặc điểm hình thái và hóa sinh đặc trƣng cho
Vibrio parahaemolyticus.
Tách chiết DNA tổng số và khuếch đại các đoạn gen toxR, tlh, tdh bằng kỹ
thuật PCR.
Xây dựng quy trình phát hiện đồng thời 3 gen độc tố (toxR, tdh, tlh) của vi
khuẩn Vibrio parahaemolyticus bằng kỹ thuật Multiplex PCR.




2

CHƢƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. Tình hình dịch bệnh do Vibrio parahaemolyticus gây ra
1.1.1. Trên thế giới
Vibrio xâm nhiễm trực tiếp vào hải sản và coi chúng nhƣ một phần môi
trƣờng sống của mình. Nhiễm độc thực phẩm do tiêu thụ hải sản gây ra bởi Vibrio
xảy ra phổ biến mà nguyên nhân chính là do V. parahaemolyticus, chiếm khoảng
25% tổng số các vụ ngộ độc thực phẩm do Vibrio gây ra (Feldhusen, 2000).
V. parahaemolyticus sống trên các sinh vật nổi, lơ lửng, động vật phù du, cá
và động vật hai mảnh vỏ (Kaneko và Colwell, 1973). Vi khuẩn này đƣợc xác định là
tác nhân gây ra bệnh viêm dạ dày ruột trên toàn thế giới, đặc biệt là các vùng có
mức tiêu thụ hải sản cao nhƣ Đông Nam Á (Joseph và cộng sự, 1982). Năm 1997,
một ổ dịch lớn do V. parahaemolyticus gây ra do tiêu thụ hàu xảy ra dọc theo bờ
biển Thái Bình Dƣơng (CDC, 1998).
Một số nƣớc ở Châu Á cũng xảy ra nhiều ổ dịch nhƣ: ở Thái Lan các vụ ngộ
độc do V. parahaemolyticus chiếm hơn một nửa các vụ ngộ độc thực phẩm xảy ra
hàng năm (Leon và cộng sự, 2003), Trung Quốc (31,1% vụ ngộ độc thực phẩm đƣợc
báo cáo giữa năm 1991 và 2001), Nhật Bản (chiếm 20 - 30% các trƣờng hợp từ 1981

đến 1993) và Đài Loan (69% trƣờng hợp đƣợc báo cáo giữa năm 1981 và 2003).
Ngoài ra, dịch còn xảy ra ở các nƣớc châu Âu nhƣ Tây Ban Nha (1989, 1999, 2004),
Pháp (1997) và cả Châu Mỹ, điển hình là Hoa Kỳ (Norinaga và cộng sự, 2005).
Ở Đài Loan, từ năm 1983 đến 1993, có 786 chủng V. parahaemolyticus đã
đƣợc thu thập từ các dịch bệnh truyền qua thực phẩm và một số các trƣờng hợp tiêu
chảy ở miền bắc Đài Loan, gồm 42 kiểu huyết thanh. Năm kiểu huyết thanh thƣờng
gặp là K8 (36,8%), K15 (10,8%), K12 (8,7%), K56 (7,9%) và K63 (4,7%). Đa số
chủng gây ra bệnh có kiểu huyết thanh là O3:K6 (Wong và cộng sự, 2000).
Tại Hồng Kông, V. parahaemolyticus đang là tác nhân gây bệnh hàng đầu
trong số tất cả các vụ ngộ độc thực phẩm trong những năm gần đây. Theo số liệu

3
đƣợc cung cấp bởi DH (Department of Health), từ năm 1999 đến năm 2003 đã bùng
phát 552 vụ ngộ độc thực phẩm trong đó chiếm đến 331 (56,7%) vụ là do tiêu thụ
hải sản.
Trƣớc năm 1994, ở Nhật bản tỷ lệ mắc bệnh do V. parahaemolyticus đƣợc
công bố còn ít. Thời kì 1994-1995 đã có 1280 vụ về nhiễm bệnh do V.
parahaemolyticus đƣợc báo cáo, còn nhiều hơn các vụ ngộ độc thực phẩm do
Salmonella. Phần lớn các trƣờng hợp ngộ độc xảy ra trong mùa hè, số lƣợng ca ngộ
độc xuất hiện nhiều nhất trong tháng tám. Từ 1996 - 1998, đã có 496 ổ dịch, với
24.373 trƣờng hợp do V. parahaemolyticus gây ra. Số lƣợng các trƣờng hợp ngộ độc
thực phẩm V. parahaemolyticus tăng gấp đôi vào năm 1998 so với năm 1997
(Yamazaki và cộng sự, 2000).
Ở Ấn Độ, từ năm 1994 - 1996, có 146 bệnh nhân bị ngộ độc do vi khuẩn V.
parahaemolyticus (Okuda và cộng sự, 1997). Tỷ lệ mắc tiêu chảy do chủng huyết
thanh O3: K6 chiếm 63% các chủng phân lập từ bệnh nhân ở Calcutta giữa tháng 9
năm 1996 và tháng 4 năm 1997.
Ở Hoa kỳ, trƣớc năm 1997 có rất ít báo cáo về các ngộ độc gây ra bởi V.
parahaemolyticu; tuy nhiên chỉ từ năm 1997 - 1998 đã có 4 ổ dịch liên quan đến
việc tiêu thụ hàu sống hoặc chƣa đƣợc nấu chín, ảnh hƣởng hơn 700 ngƣời. Sự gia

tăng đáng kể các vụ ngộ độc do V. parahaemolyticus gây ra ở Hoa Kỳ có liên quan
đến chủng huyết thanh O3:K6 mà trƣớc đây chỉ liên quan đến bệnh ở Châu Á
(Sakazaki và cộng sự, 2005).
Ở Mexico, trong tổng số 266 mẫu nƣớc biển, nhuyễn thể và cá thu thập từ
12 điểm khác nhau trong đầm phá Pueblo Viejo, Mexico vào các tháng khác nhau
trong năm cho thấy: V. parahaemolyticus đƣợc tìm thấy ở 11 trong 12 điểm trên.
Nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng nhân tố tác động đến sự phân bố của V.
parahaemolyticus trong môi trƣờng bao gồm nhiệt độ nƣớc, nồng độ muối và oxy,
sự tƣơng tác với thực vật nổi, sự có mặt của các trầm tích, chất hữu cơ trong huyền
phù, cá và hải sản cũng nhƣ sự lên xuống của thủy triều ở cửa sông (Maria và cộng
sự, 2004).

4
Ở Chile, tóm tắt dịch bệnh tiêu chảy liên quan đến tiêu thụ hải sản và V.
parahaemolyticus xảy ra trong mùa hè năm 2004 và 2005 ở các vùng quanh của
Puerto Montt, Chile. V. parahaemolyticus thu đƣợc từ động vật có vỏ và mẫu lâm
sàng trong thời gian dịch bệnh chủ yếu thuộc nhóm O3: K6 (Loreto và cộng sự,
2005).
Gần đây, bệnh tiêu chảy do V. parahaemolyticus đã đƣợc báo cáo từ Việt
Nam, Úc, Trung Mỹ và Anh. Tại châu Phi, V. parahaemolyticus lần đầu tiên đƣợc
xác định trong các dịch bệnh tại Togo. Do triệu chứng phát bệnh tƣơng tự với tả nên
ngƣời ta đẩy mạnh về công tác y tế công cộng (Bockemuhl và Triemer, 1974).
Bảng 1.1. Các nhóm thực phẩm Vibrio parahaemolyticus gây ngộ độc thực
phẩm
Nhóm thực phẩm
Số ca xác nhận
Số ngƣời mắc phải
Hải sản
313 (56,7%)
1465 (53,8%)

Món ăn hỗn hợp
68 (12,3%)
449 (16,5%)
Thịt, sản phẩm từ thịt và cá tạp
54 (9,8%)
314 (11,5%)
Ngũ cốc và sản phẩm từ ngũ cốc
39 (7,1%)
89 (3,3%)
Gia cầm và sản phẩm từ gia cầm
29 (5,3%)
187 (6,9%)
Trái cây, rau và sản phẩm từ chúng
25 (4,5%)
98 (3,6%)
Nhóm khác (chƣa rõ)
33 (4,3%)
123 (4,6%)
Tổng
552 (100%)
2725 (100%)
(Nguồn: Risk Assessment Studies, Report No.20, 2005 )







5

Bảng 1.2. Ngộ độc thực phẩm gây ra bởi Vibrio parahaemolyticus do tiêu thụ
thực phẩm hải sản 1993 - 2000 ở Hồng Kông
Nhóm thực phẩm
Loại thực phẩm
Số ca mắc bệnh
Số ngƣời mắc phải

Giáp xác

Cua
46 (14,7%)
180 (12,3%)
Tôm
43 (13,7%)
299 (20,4%)
Tôm Hùm
1 (0,3%)
2 (0,1%)
Tổng
90 (28,7%)
481 (32,8%)
Chân bụng
Mực
82 (26,2%)
371 (25,3%)
Thân mềm

Trai
15 (4,8%)
49 (3,3%)

Hàu
12 (3,8%)
41 (2,8%)
Hến
12 (3,8%)
45 (3,1%)
Sò , điệp
6 (1,9%)
24 (1,6%)
Các loại thân mềm khác
4 (1,3%)
29 (2,0%)
Tổng
49 (15,7%)
188 (12,8%)
Các sản phẩm khác từ
biển

49 (15,7%)
255 (17,4%)
Cá

43 (13,7%)
170 (11,6%)
Tổng

313 (100%)
1465 (100%)
(Nguồn: Risk Assessment Studies, Report No.20, 2005 )
1.1.2. Ở Việt Nam

Tại Việt Nam, từ năm 1999 đến 2008 đã có khoảng 1.000 vụ ngộ độc thực
phẩm đƣợc báo cáo với trên 25.000 ngƣời mắc, trong đó có 300 ngƣời tử vong.
Riêng tại tỉnh Khánh Hòa, tính từ năm 2001 đến 2008 có 215 ca ngộ độc thực phẩm
xảy ra, trong đó có 7 ca tử vong. Nguyên nhân của các vụ ngộ độc thực phẩm là do
cá nóc (25 ca), vi sinh vật (48 ca), nấm độc (46 ca). Thời điểm hay xảy ra ngộ độc
thực phẩm trong năm là từ tháng 7 đến tháng 12. Loại thực phẩm gây ngộ độc thực
phẩm thƣờng gặp là rau, thịt, nhƣng hải sản cũng chiếm 11,11% các ca ngộ độc.

6
Theo báo cáo của Tuyet và cộng sự (2002) từ giữa 1/1995 đến 9/2001 ở
Khánh Hòa đã có 548 ca nhiễm bệnh do Vibrio gây ra đƣợc xác định. Trong thời
gian này, các nhà nghiên cứu ghi nhận trong số này có 471 ngƣời lớn và có 57 trẻ
em. Đặc biệt, phân tích vi sinh cho thấy trong số 548 trƣờng hợp tiêu chảy, có 53%
dƣơng tính với vi khuẩn V. parahaemolyticus.
Nhiều địa phƣơng trên cả nƣớc hiện cũng đang phải đối mặt với tình trạng
ngộ độc thực phẩm ngày càng tăng do nhu cầu ăn hải sản ngày càng nhiều, có nơi
ngộ độc thực phẩm đã xảy ra hàng loạt. Ở Vĩnh Long, 10/2005 đã xảy ra dịch tiêu
chảy trên diện rộng. Khi xét nghiệm mẫu phân và mẫu nôn ói của bệnh nhân thì phát
hiện thấy sự hiện diện của vi khuẩn V. parahaemolyticus.
Tuy các phƣơng tiện truyền thông đƣa tin về ngộ độc thực phẩm do V,
parahaemolyticus gây ra rất nhiều do ăn các các loài hải sản nhƣ tôm, cá (Võ Văn
Nha và cộng sự, 2006) nhƣng ở nƣớc ta còn có ít nghiên cứu cơ bản về gen độc tố
của vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh. Đề tài đƣợc thực hiện để đáp ứng tình
hình thực tế, làm cơ sở cho nghiên cứu chẩn đoán và điều trị kịp thời.
1.2 . Tổng quan về vi khuẩn Vibrio và Vibrio parahaemolyticus
1.2.1. Tổng quan về vi khuẩn Vibrio

Hình 1.1. Cấu tạo Vibrio dƣới kính hiển vi điện tử


7
Vibrio lần đầu tiên đƣợc phân lập vào năm 1854 từ các bệnh nhân tả bởi
Filippo Pacini, đƣợc gọi là “vibrions”.
Chi Vibrio thuộc họ Vibrionaceae. Họ này gồm 5 chi, trong đó có 3 chi có
tầm quan trọng trong y học là Vibrio, Aeromonas, Plesiomonas. Chi Vibrio gồm 30
loài, trong đó có 13 loài gây bệnh cho ngƣời, bao gồm V. cholerae, V. metschnikovii,
V. minicus, V. fluvialis, V. funissii, V. anguillarum, V. alginolyticus, V.
parahaemolyticus, V. cincinnatiensis, V. damsela, V. carchariae, V. hollisae, V.
vulnificus.
Vibrio là những trực khuẩn hình que, hơi cong, còn đƣợc gọi là phẩy khuẩn,
Gram âm, thƣờng đƣợc tìm thấy trong nƣớc. Tế bào vi khuẩn có thể xếp liên tiếp
nhau thành hình chữ S hay hình xoắn. Chúng di động nhanh nhờ tiên mao đơn cực,
dinh dƣỡng theo phƣơng thức dị dƣỡng hữu cơ, không sinh nha bào, phản ứng
oxidase dƣơng tính, có thể tăng trƣởng trong điều kiện hiếu khí hoặc kị khí tùy tiện,
lên men đƣờng không sinh hơi, chuyển nitrat thành nitrit (Thompson và cộng sự,
2004).
Tất cả các loài thuộc chi Vibrio đều cần Na
+
cho sự sinh trƣởng nhƣng nồng
độ tối ƣu cho mỗi loài không giống nhau. Những loài cần NaCl thấp nhƣ V.
cholerae, V. metschnikovii, V. minicus và một số chủng của các loài V. fluvialis, V.
funissii, V. anguillarum. Ngƣợc lại, có những loài ở biển ƣa mặn nhƣ V.

alginolyticus và V. parahaemolyticus có thể phát triển ở nồng độ NaCl 6% - 8%.
Hầu hết các loài Vibrio sống ở 30
o
C nhƣng có một số loài ƣa mặn sinh trƣởng
ở 37
o
C. Các loài V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. cholerae có thể sinh
trƣởng ở 42
o
C. Tất cả các loài Vibrio đều nhạy cảm với nhiệt độ, đun nóng đến khi
nhiệt độ bên trong hải sản đạt đến 60
o
C trong vài phút thì có thể loại bỏ Vibrio. Làm
lạnh là biện pháp quan trọng giúp kiểm soát và ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn
này.
Vi khuẩn Vibrio nhạy cảm với môi trƣờng acid và phát triển tốt nhất ở giá trị
pH trên trung tính, tức là từ 7,5 – 8,5 nhƣng chúng cũng có khả năng chịu đƣợc môi
trƣờng kiềm. Chúng bị ức chế ở pH dƣới 6,8 và trên 10,2 (Rujiwat, 2007).

8
Các loài Vibrio chủ yếu sống ở nƣớc và mật độ phân bố tùy theo nhiệt độ,
nồng độ Na
+
, hàm lƣợng dinh dƣỡng có trong nƣớc và sự có mặt của các loài thực
vật và động vật (McCarter, 1999). Chúng thƣờng sống ở biển hoặc cửa sông, trên bề
mặt và trong ruột động vật biển. Ngƣời ta thƣờng phân lập chúng từ các cặn trầm
tích, nƣớc, thực vật và hải sản. Các loài hải sản là nơi an toàn cho các loài Vibrio
sinh sống, bao gồm các loài nhƣ trai, sò, cua, tôm, mực. Đối với các loài không ƣa
mặn, chúng có thể đƣợc phân lập từ mẫu nƣớc ngọt (Rujiwat, 2007).
Hầu hết các loài Vibrio phân lập từ các mẫu lâm sàng của ngƣời đều gây bệnh

ngoại trừ V. vurnissi. Vibrio spp thƣờng gây tiêu chảy hoặc nhiễm độc ngoài ruột,
riêng V. cholerae có thể gây ra cả hai hiện tƣợng. Gần đây các loài V. fluvialis, V.
hollisae, V. minicus cũng đƣợc xác định là tác nhân có liên quan nhƣng ít phổ biến.
Các loài khác thuộc họ Vibrionaceae, gồm V. vulnificus, AliiVibrio
salmonicida và V. harveyi, là tác nhân gây bệnh trên các loài hải sản và chúng gây ra
thiệt hại lớn về kinh tế. Photobacterium profundum, đại diện cho một chi khác trong
họ Vibrionaceae, cũng đƣợc kể đến trong danh sách các loài gây bệnh trên hải sản
(Rujiwat, 2007).














9
Bảng 1.3. Đặc điểm của các loài Vibrio gây bệnh trên ngƣời liên quan đến việc
tiêu thụ hải sản

**
**
TCBS agar
V
V
V
V
Km
V
X
X
X
V
X
mCPC agar
Km
Ti
Km
Km
Km
Km
Km
Km
V
Km

Km
CC agar
Km
Ti
Km
Km
Km
Km
Km
Km
V
Km
Km
AGS
KA
Ka
KK
KK
Ka
KK
KA
KA
KA
KK
0
Oxidase
+
+
+
+

+
−
+
+
+
+
+
Arginine dihydrolase
−
−
+
+
−
+
−
−
−
+
+
Ornithine
decarboxylase
+
+
−
−
−
−
+
+
+

−
+
Lysine decarboxylase
+
+
−
−
−
+
+
+
+
T
+
Khả
năng
chịu
muối
0% NaCl
−
+
−
−
−
−
+
−
−
+
+

3% NaCl
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
6% NaCl
+
−
+
+
+
+
−
+
+
+
−
8% NaCl
+
−
T
+
−

T
−
−
−
−
−
10% NaCl
+
−
−
−
−
−
−
−
−
−
−
Phát triển ở 42°C
+
+
T
−
0
T
+
+
+
T
+

Khả
năng
lên men
Sucrose
+
+
+
+
−
+
−
−
T
T
−
D-
cellobiose
−
−
+
−
−
−
−
T
+
+
−
Lactose
−

−
−
−
−
−
−
−
+
T
−
Arabinose
−
−
+
+
+
−
−
+
−
T
−
D-Mannose
+
+
+
+
+
+
+

+
+
T
−
D-Mannitol
+
+
+
+
−
+
+
+
T
+
−
ONPG
−
+
+
+
−
+
+
−
+
+
−
Voges-
+

T
−
−
−
+
−
−
−
+
−

10
Proskauer
Nhạy
với
10 µg
O/129
K
N
K
K
0
N
N
K
N
K
N
150 µg
O/129

N
N
N
N
0
N
N
N
N
K
N
Gelatinase
+
+
+
+
−
+
+
+
+
+
−
Urease
−
−
−
−
−
−

−
T
−
−
−
** Aeromonas hydrophila, Plesiomonas shigelloides
Chú thích: V = vàng; Km = không mọc hoặc mọc rất ít; N = nhạy cảm; 0 = không làm;
X = màu xanh; T = tùy chủng; K= kháng; Ti = màu tía; AGS = Arginine glucose slant;
mCPC = Modified cellobiose polymyxin; KK = thạch nghiêng có kiềm; Ka = thạch
nghiêng có tính kiềm hoặc acid nhẹ; KA = thạch nghiêng có acid
Nguồn: www.fda.gov
1.2.2. Tổng quan về vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
Phân loại khoa học của Vibrio parahaemolyticus:
Giới: Vi khuẩn
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Gamma Proteobacteria
Bộ: Vibrionales
Họ: Vibrionaceae
Chi: Vibrio
Loài: V. parahaemolyticus
Theo khóa phân loại của Bergey, V. parahaemolyticus là vi khuẩn Gram âm,
hình dấu phẩy, có tiên mao ở một đầu, di động, kỵ khí tùy tiện và ƣa môi trƣờng
kiềm mặn. Tiên mao đơn cực hoạt động nhanh hơn dƣới động lực Na và giúp cho vi
khuẩn chuyển động dễ dàng trong môi trƣờng lỏng. Chúng có thời gian thế hệ 8-9
phút (Daniels và cộng sự, 2000), thƣờng phân bố ở các cửa sông và ven biển của hầu
hết các vùng trên thế giới. Vi khuẩn này có thể đƣợc phân lập từ cát, bùn và nƣớc
biển, cũng nhƣ ở hải sản (Maria và cộng sự, 2004).

11
Các yếu tố ảnh hƣởng đến sự hiện diện và mật độ của V. parahaemolyticus

trong môi trƣờng nƣớc bao gồm nhiệt độ nƣớc, nồng độ muối và oxy, sự tƣơng tác
của các sinh vật phù du, các chất hữu cơ lơ lửng, cá và hải sản và cƣờng độ thủy
triều.
Các đặc tính sinh hóa đặc trƣng cho V. parahaemolyticus bao gồm: phản ứng
oxydase (+), khả năng sử dụng lysin (+), ornithin (+), arginine (+), khả năng lên men
đƣờng arabinose (+), lactose (-), sucrose (-), mannitol (+), mannose (+), phát triển
đƣợc trong phạm vi nồng độ muối từ 3-8%, không mọc ở môi trƣờng không có muối
(0%) hoặc nồng độ muối quá cao (10%).
Các chủng V. parahaemolyticus phân lập có thể phân biệt nhau bằng kiểu
huyết thanh (serotype). Hệ thống để xác định các kiểu huyết thanh của V.
parahaemolyticus dựa trên các cấu trúc kháng nguyên khác nhau của vỏ
lipopolysaccharides (kháng nguyên O) và nang (kháng nguyên K) (Joseph và cộng
sự, 1983). Theo FDA, có 12 kiểu kháng nguyên O và hơn 70 kiểu kháng nguyên K
đã đƣợc xác định (Bảng 1.4).
Bảng 1.4. Các kháng nguyên của Vibrio parahaemolyticus (1986)
Kháng nguyên O
Kháng nguyên K
1
1,25,26,32,38,41,56,58,64,69
2
3,28
3
4,5,6,7,27,30,31,33,37,43,45,48,54,57,58,59,65
4
4,8,9,10,11,12,13,34,42,49,53,55,63,67
5
5,15,17,30,47,60,61,68
6
6,18,46
7

7,19
8
8,20,21,22,39,70
9
9,23,44
10
l9,24,52,66,71
11
36,40,50,51,61
12
52

12
1.2.3. Gen độc tố của Vibrio parahaemolyticus
Một yếu tố độc tính từ lâu đã đƣợc xác định là có liên quan chặt chẽ đến khả
năng gây bệnh của vi khuẩn Vibrio là hemolysin. Vì lí do này, hemolysin đã đƣợc
nghiên cứu rộng rãi trên thế giới.
Chi Vibrio có 4 họ hemolysin chính là TDH, HlyA, TLH và -VPH, trong đó
TDH của V. haemolyticus và HlyA của V. cholera là các tác nhân chính trong tiến
trình gây bệnh đã đƣợc nghiên cứu rộng rãi.
V. parahaemolyticus có thể là nhân tố gây viêm dạ dày ruột do tiêu thụ hải
sản nhiễm mầm bệnh, nhƣng không phải chủng nào của loài này cũng gây bệnh.
Phần lớn các chủng V. parahaemolyticus phân lập từ các trƣờng hợp viêm dạ dày
ruột ở ngƣời đều sản xuất beta-hemolysin trên môi trƣờng thạch máu Wagatsuma
(Wagatsuma, 1968). Khả năng gây tan máu trên môi trƣờng đƣợc gọi là hiện tƣợng
Kanagawa (KP). Chỉ có 1 - 5% các chủng có nguồn gốc từ môi trƣờng dƣơng tính
KP. Do vậy, hemolysin đƣợc xem là yếu tố độc tố quan trọng và phản ứng KP đƣợc
dùng để đánh dấu nhận biết cho các chủng độc hại.
Hiện tƣợng KP gây ra bởi một loại hemolysin chịu nhiệt do gen tdh mã hóa.
Hemolysin này có tên là TDH (thermostable direct hemolysin), là yếu tố độc lực

chính của vi khuẩn V. parahaemolyticus (Kaper và cộng sư, 1984). Protein TDH có
trọng lƣợng phân tử đƣợc xác định là 42 kDa bằng sử dụng sắc kí lọc gel (Takeda và
cộng sự, 1978). Cấu trúc của nó không có lipit hay cacbohydrat mà là một dimer,
bao gồm hai tiểu đơn vị và mỗi tiểu đơn vị có khối lƣợng 21 kDa. Protein này rất
bền nhiệt, khi đun nóng ở 100
o
C trong 10 phút thì protein bị biến tính còn lại 165
amino axit với một cầu nối disulfua ở gần đầu carboxyl (–COOH) (Tsunasawa và
cộng sự, 1987).
Năm 1988, Honda và các đồng nghiệp phát hiện ra một hemolysin mới trong
khi phân lập các chủng lâm sàng KP dƣơng tính (Honda và cộng sựz1988).
Hemolysin này đƣợc gọi là TRH (TDH-related haemolysin), có tính chất hóa lý,
miễn dịch và sinh học tƣơng tự nhƣ TDH. Hai protein TDH và TRH đƣợc coi là yếu
tố độc tính quan trọng trong khả năng gây bệnh của V. parahaemolyticus. Chúng

13
đƣợc mã hóa bởi các gen tƣơng ứng là tdh và trh có kích thƣớc lần lƣợt là 269 bp và
250 bp (Nishibuchi và cộng sự, 1992; Honda và Iida, 1993; Xu và cộng sự, 1994).
Giữa các chủng V. parahaemolyticus khác nhau chứa các gen độc tố khác nhau. Hầu
nhƣ tất cả các mẫu lâm sàng đều dƣơng tính với gen tdh hoặc trh, hoặc cả hai, trong
khi gần nhƣ tất cả các mẫu từ môi trƣờng không có hoặc có với tỉ lệ thấp 1 - 5%
(Nishibuchi và Kaper, 1995, Robert và cộng sự, 2004).
Các chủng V. parahaemolyticus gây bệnh là các chủng KP dƣơng tính, có
chứa gen tdh và gen trh mã hóa các protein độc tố TDH, TRH nằm trong operon độc
tố Vp-toxRS và đƣợc điều hòa bởi gen toxR. Operon Vp-toxRS có tên này là do cấu
trúc và chức năng tƣơng tự với operon toxRS của V. cholerae mã hóa cho các gen
nội độc tố tả. Tƣơng tự operon toxRS của V. cholerae, operon Vp-toxRS của V.
parahaemolyticus không chỉ điều khiển sự phiên mã của gen độc tố ruột tdh mà còn
các gen khác nữa. Trình tự của operon Vp-toxRS đƣợc phát hiện có tất cả các chủng
V. parahaemolyticus (Nishibuchi và cộng sự, 1995).

Do các gen độc tố tdh, trh ở các loài V. cholerae, V. mimicus, V. hollisae có
mức độ tƣơng đồng cao so với V. parahaemolyticus nên việc xác định gen toxR có
thể giúp chỉ ra chính xác loài V. parahaemolyticus (Nishibuchi và Kaper, 1995). Gen
toxR có kích thƣớc 368 bp, là gen điều hòa cho operon Vp-toxRS (Zulkifli và cộng
sự, 2009), tồn tại ở tất cả các chủng V. parahaemolyticus, kiểm soát sự biểu hiện của
các gen mã hóa cho các nhân tố độc lực ngoại bào quan trọng nhƣ TDH, TRH, và
ngoài ra là các gen liên quan đến các độc tố khác.
Gen toxR là gen điều hòa có mặt ở nhiều loài trong chi Vibrio (Jun và cộng
sự, 2001). Ở V. cholerae, gen toxR đóng vai trò chủ chốt trong điều hòa gen ctx và
nhiều gen khác, bao gồm gen tcp mã hóa độc tố lông mao (toxin-coregulated pili),
các gen ompU, ompT mã hóa các protein màng ngoài (OMPs) ở V. cholerae. Mức
độ tƣơng đồng trong trình tự nucleotide của gen toxR ở ba loài V. cholerae, V.
parahaemolyticus và V. vulnificus đƣợc xác định là từ 52 – 63%. %. Trong đó, giữa
hai operon của hai loài V. parahaemolyticus và V. cholerae có lần lƣợt là 52% trình
tự tƣơng đồng (Zulkifli và cộng sự, 2009).

14

Vật liệu di truyền của V. parahaemolyticus là hai nhiễm sắc thể dạng vòng I
và II có kích thƣớc lần lƣợt là 3,2 và 1,9 Mb. Việc giải trình tự gen hoàn toàn vi
khuẩn này đã đƣợc hoàn thành vào ngày 10 tháng 3 năm 2003 (Kozo và cộng sự,
2003). Các gen độc tố tdh, trh nằm trên nhiễm sắc thể II.
T3SS (Type III Secretion System) là một trong những hệ thống bài tiết các
protein của vi khuẩn vào môi trƣờng ngoại bào hoặc giúp vi khuẩn tiêm các protein
độc tố vào tế bào vật chủ eucaryote của chúng. Ở. V. cholerae không có hệ thống
protein này trong khi V. parahaemolyticus có hai hệ thống T3SS là T3SS1 và
T3SS2, đóng vai trò quan trọng trong quá trình bệnh của vi khuẩn này (Thomson và
cộng sự, 2004, Honda và cộng sự, 2006). Jun và cộng sự (2001) đã phát hiện một dải
gen gây bệnh Vp-PAI dài 80 kp trên nhiễm sắc thể II bảo tồn trong các chủng KP (+)
và không có trong KP (-) (Kodama và cộng sự, 2010). Vp-PAI không chỉ chứa gen

tdh mà còn chứa cụm gen T3SS2, do vậy, liên quan đến khả năng gây bệnh của V.
parahaemolyticus.
Cùng với TDH và TRH, một hemolysin khác đã đƣợc phát hiện trên V.
parahaemolyticus là TLH (thermolabile haemolysin). TLH là một protein không bền
nhiệt và có hoạt tính phospholipase / lysophospholipase (Shinoda và cộng sự, 1991).
Cấu trúc của gen tlh có chứa một ORF dài 1254 bp. Dạng tiền protein và protein
trƣởng thành của TLH gồm có 418 và 398 amino acids với trọng lƣợng phân tử
tƣơng ứng là 47,5 và 45,3 kDa (Shinoda và cộng sự, 1991). Hàm lƣợng G + C của
tlh là 47,6% (Taniguchi và cộng sự, 1986). Nghiên cứu cho thấy không có sự tƣơng
đồng về trình tự của hai gen tdh và tlh. Gen tlh đã đƣợc tìm thấy ở genome của tất cả
các chủng V. parahaemolyticus đƣợc phân lập từ các mẫu lâm sàng hay môi trƣờng.
Tuy nhiên, vai trò của haemolysin này đối với việc gây bệnh dạ dày ruột của V.
parahaemolyticus vẫn chƣa đƣợc biết đến.
1.2.4. Khả năng gây bệnh của Vibrio parahaemolyticus
1.2.4.1. Nguồn lây nhiễm

15
V. parahaemolyticus đƣợc tìm thấy chủ yếu trong các loại thực phẩm có
nguồn gốc từ biển nhƣ cua, hàu, sò…, chúng thƣờng hiện diện khoảng 10 CFU/g –
10
3
CFU/g trong những ngày hè ấm áp. Loài này có thế hệ thời gian ngắn (8-9 phút).
Chúng chỉ cần một thời gian ngắn có nhiệt độ tăng (khoảng từ 30 - 42
o
C, tối ƣu là
37
o
C) là đủ để phát triển đến mức độ lây nhiễm (10
6
tế bào/ml) (Daniels và cộng sự,

2000).
Khi gây bệnh trên ngƣời, sự lây nhiễm có thể qua đƣờng ăn uống, lây nhiễm
từ ngƣời sang ngƣời do tiếp xúc với mầm bệnh (chất nôn, phân, dụng cụ, ), ngƣời
bệnh không rửa tay kỹ, ăn thực phẩm tƣơi sống hay chƣa nấu chín. Đây là nguyên
nhân chủ yếu gây ra viêm dạ dày ruột (gastroenteritis) cấp tính. Sự lây nhiễm qua
vết thƣơng cũng có, nhƣng ít phổ biến hơn ngộ độc do ăn hải sản và thực phẩm bị
nhiễm chéo với các loại thực phẩm hải sản khác, lây nhiễm trong quá trình chế biến
hoặc nguồn nƣớc sử dụng bị nhiễm và xử lý không đúng cách. Ngoài ra, bơi lội hoặc
làm việc ở vùng bị ảnh hƣởng có thể dẫn đến nhiễm trùng mắt hoặc tai và các vết
thƣơng hở. Loài vi khuẩn này gây bệnh không chỉ trên ngƣời mà còn là các đối
tƣợng hải sản nhƣ tôm, cá, (Đỗ Thị Hòa và cộng sự, 2004).
1.2.4.2. Cơ chế gây bệnh
Nhiều loài Vibrio gây bệnh cho ngƣời, và/hoặc cho động vật biển có xƣơng
sống và không có xƣơng sống. Các loài gây bệnh sản xuất nhiều yếu tố độc lực khác
nhau bao gồm enterotoxin, hemolysin, cytotoxin, protease, lipase, photpholipase,
siderophore, các nhân tố đính bám và/hoặc haemagglutinin.
Đối với V. parahaemplyticus các yếu tố độc lực đƣợc xem là có vai trò quan
trọng liên quan tới khả năng gây bệnh bao gồm β-hemolysin, các nhân tố đính bám,
các enzyme, protein độc tố TDH, TRH.
Hemolysin đƣợc gọi tên do khả năng làm tan màng tế bào hồng cầu và giải
phóng hemoglobin, là protein ngoại độc tố có mặt ở nhiều loài Vibrio gây bệnh và
đóng nhiều vai trò khác nhau trong quá trính lây nhiễm (Iida và Honda, 1997). Sắt là
một ion thiết yếu cho sự phát triển và sao chép của vi khuẩn, đóng vai trò quan trọng
trong quá trình gây bệnh của Vibrio. Hemolysin tấn công màng tế bào hồng cầu và

16
làm tan bào, dẫn tới giải phóng các protein liên kết với sắt (Fe
3+
) nhƣ hemoglobin,
transferrin, lactoferrin thành dạng tự do. Còn các ion sắt (Fe

3+
) sẽ đƣợc liên kết với
các thể mang sắt của vi khuẩn có khả năng cạnh tranh với các protein gắn sắt của vật
chủ. Phức hợp này sau đó sẽ liên kết với các thụ thể trên màng tế bào và đƣợc vận
chuyển vào trong tế bào (Zhang và Austin, 1998). Hoạt tính hemolysin của vi khuẩn
Vibrio phụ thuộc vào nồng độ ion sắt của vật chủ trong quá trình xâm nhiễm
(Stoebner và Payne, 1988). Trong nhiều trƣờng hợp, hoạt tính tạo lỗ màng của
hemolysin không chỉ giới hạn ở các tế bào hồng cầu mà còn ở một số loại tế bào
khác nhƣ tế bào mast, các bạch cầu trung tính và các tế bào nhân đa hình
(polymorphonuclear) làm tăng cƣờng độc tính và dẫn tới phá hủy các mô (Iida và
Honda, 1997).
Hemolysin có vai trò gây độc chính trong V. parahaemolyticus là một
hemolysin chịu nhiệt do gen tdh mã hóa. Hemolysin này có tên là TDH. TDH là
ngoại độc tố có khả năng làm tan máu, gây tiết dịch ruột, gây độc cho một vài loại tế
bào và hoạt động của tim (Iida và Honda, 1997). Theo Honda và cộng sự (1992)
TDH phá vỡ tế bào eukaryote theo ba bƣớc. Đầu tiên chúng liên kết với màng tế bào
sau đó chúng tham gia tạo ra các kênh lỗ màng (porin channel) ở tế bào biểu mô
thành ruột có đƣờng kính khoảng 2 nm, các kênh này cho phép nhiều loại ion tràn
vào nhƣ Na
+
, Mg
2+
, Ca
2+
. Khi lƣợng TDH tăng lên thì cũng tăng lên các kênh này
làm cho các ion tràn vào tự do và tế bào căng lên hết mức và bị phá vỡ do mất cân
bằng thẩm thấu.
1.2.4.3. Đặc điểm của bệnh
Vào những năm 1950, V. parahaemolyticus lần đầu tiên đƣợc xác định là tác
nhân gây bệnh do thực phẩm ở Nhật Bản. Đến cuối những năm 1960 và đầu những

năm 1970, V. parahaemolyticus đã đƣợc công nhận là một căn nguyên gây ra bệnh
tiêu chảy trên toàn thế giới.
V. parahaemolyticus là một loại vi khuẩn ƣa mặn, có khả năng gây ngộ độc
thực phẩm và viêm dạ dày ruột, nhiễm trùng vết thƣơng, và nhiễm trùng huyết ở
ngƣời. Trong đó, nhiễm trùng huyết là mối đe dọa nghiêm trọng do vi khuẩn lây lan

17
nhanh, do sự hiện diện và tồn tại lâu dài của các độc tố do chúng sản xuất ra tuần
hoàn trong máu. Dấu hiệu đặc trƣng là sốt hoặc hạ huyết áp và khả năng phát tán các
vi sinh vật từ máu. Trong trƣờng hợp nhiễm trùng huyết, các triệu chứng có thể bao
gồm sƣng, đau đớn tứ chi với xuất huyết (Hlady, 1997; Klontz, 1990). Tử vong cũng
có thể xảy ra tiếp theo sau nhiễm trùng huyết (Barker và Gangarosa, 1974).
Các triệu chứng đặc trƣng do V. parahaemolyticus gây ra là tiêu chảy đôi khi
còn kèm theo đau đầu, nôn mửa, sốt, ớn lạnh. Thời kỳ ủ bệnh thƣờng từ 12 giờ – 24
giờ và bệnh thƣờng tự khỏi sau 3 ngày. Thông thƣờng bệnh nhẹ và ít nguy hiểm,
song nếu phát hiện chậm và không đƣợc điều trị kịp thời cũng có thể gây tử vong. V.
parahaemolyticus gây ra hai hội chứng lâm sàng khác biệt nhau:
o Ca bệnh lâm sàng:
+ Dạng tả nhẹ: nôn và tiêu chảy dạng tả, phân lỏng, tóe nƣớc, màu xanh hoặc
xanh vàng, mùi hơi tanh. Nôn và tiêu chảy nhiều có thể dẫn đến mất nƣớc cấp, hầu
nhƣ không sốt, không đau bụng.
+ Dạng lỵ trực khuẩn: tiêu chảy phân lỏng lờ lờ máu cá, mùi thối kèm theo đau
bụng và sốt, kiểu lỵ trực khuẩn.
o Ca bệnh xác định: là ca bệnh tiêu chảy cấp khi lấy phân hoặc chất nôn nuôi
cấy bắt đƣợc V. parahaemolyticus.

18
Bảng 1.5. Các triệu chứng lâm sàng viêm dạ dày ruột gây ra bởi Vibrio
parahaemolyticus
Triệu chứng
Tỷ lệ của triệu chứng
Trung bình
Phạm vi (khoảng)
Tiêu chảy
98%
80 - 100%
Đau thắt bụng
82%
68 - 100%
Nôn
71%
40 - 100%
Buồn nôn
52%
17 - 79%
Đau đầu
42%
13 - 56%
Sốt
27%

21 - 33%
Ớn lạnh
24%
4 - 56%
(Nguồn Barker và Gangarosa, 1974; Levine và cộng sự, 1993)
1.2.5. Các phƣơng pháp kiểm tra sự có mặt của Vibrio parahaemolyticus
Có nhiều phƣơng pháp đƣợc sử dụng để phát hiện V. parahaemolyticus nhƣ:
quan sát hình thái dƣới kính hiển vi, dựa vào các đặc tính sinh hóa và các kĩ thuật
sinh học phân tử nhƣ PCR, RAPD, miễn dịch phân tử.
Khi quan sát dƣới kính hiển vi, V. parahaemolyticus có hình dấu phẩy, di
động nhờ tiên mao đơn cực, kích cỡ tùy thuộc vào chủng. Khi nhuộm Gram, chúng
đƣợc xác định là vi khuẩn Gram âm.
Các loài V. parahaemolyticus khi nuôi cấy trên môi trƣờng chọn lọc TCBS
(Thiosulfate Citrate Bile Salt Sucrose) có màu xanh lá cây hoặc màu xanh đậm
(Kudo và cộng sự, 2003). V. parahaemolyticus còn phát triển trên môi trƣờng chọn
lọc khác là CHROMagar
TM
, khuẩn lạc có màu tía hoặc tím. Ngoài ra V.
parahaemolyticus còn có thể đƣợc phát hiện bằng cách nuôi cấy vi khuẩn trên môi
trƣờng thạch Wagatsuma (một loại môi trƣờng thạch máu đặc biệt) để kiểm tra khả
năng sản xuất β – hemolysin xung quanh khuẩn lạc bởi TDH của V.
parahaemolyticus (Miyamoto và cộng sự, 1969) hoặc bằng kĩ thuật ELISA (Enzyme

19
– linked immunosorbent assay) để phát hiện chủng sản xuất TDH (Honda và cộng
sự, 1989).
Cuối cùng, V. parahaemolyticus có thể đƣợc phát hiện bằng các kĩ thuật sinh
học phân tử dựa trên nguyên lý PCR nhƣ Multiplex PCR, RT- PCR, RAPD, LAMP.
Kỹ thuật PCR đƣợc sử dụng để phát hiện V. parahaemolyticus trong các mẫu khác
nhau bao gồm thủy hải sản hoặc mẫu nƣớc. Phƣơng pháp này thực hiện nhanh, dễ

dàng và đáng tin cậy do vậy thƣờng đƣợc sử dụng để phân tích. Các gen thƣờng
đƣợc sử dụng để xác định loài V. parahaemolyticus bằng kỹ thuật PCR là toxR và
gyrB. Gen toxR là gen điều hòa operon độc tố, bảo thủ đối với V. parahaemolyticus
(Kim và cộng sự, 1999). Ngoài toxR, gen gyrB cũng là gen bảo thủ ở V.
parahaemolyticus nên cũng có thể đƣợc sử dụng để xác định loài V.
parahaemolyticus (Zulkifli và cộng sự, 2009). Trong khi phản ứng khuếch đại các
gen độc tố nhƣ tdh, tlh, trh lại đƣợc sử dụng để kiểm tra khả năng gây bệnh của vi
khuẩn (Zulkifli và cộng sự, 2009).
1.3. Tính cấp thiết và mục tiêu của đề tài
1.3.1. Tính cấp thiết của đề tài
Ở Việt Nam, việc phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm hầu hết chỉ dựa trên
phƣơng pháp truyền thống: nuôi cấy kết hợp với các thử nghiệm sinh hóa, miễn
dịch. Các quy trình này rất phức tạp, tiêu tốn thời gian ít nhất từ 2 đến 6 ngày. Đó
cũng là lý do vì sao một vụ ngộ độc phải mất cả tuần mới tìm đƣợc nguyên nhân
gây bệnh. Mặt khác, phƣơng pháp nuôi cấy kết hợp hoàn toàn không đáp ứng đƣợc
yêu cầu kiểm tra, giám sát và kiểm dịch của các cơ quan quản lý. Vì vậy, việc
nghiên cứu phƣơng pháp chẩn đoán nhanh chóng để kiểm soát bệnh và để sản xuất
ra thuốc điều trị kịp thời, tiện dụng là vô cùng cần thiết.
Trong năm 2010, đề tài nghiên cứu khoa học sinh viên “Phân lập và xác định
gen độc tố của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus trong hải sản tƣơi sống tại các chợ
của thành phố Nha Trang” của sinh viên Nguyễn Thị Cẩm Ly đã xây dựng đƣợc
quy trình PCR đơn phát hiện hai gen độc tố toxR, tlh là gen phổ biến ở tất cả các