Tạo chủng và xác định đặc tính sinh hóa của salmonella choleraesuissmith đột biến gen asd

i

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn này, tôi đã được sự hướng
dẫn, giúp đỡ tận tình của quý thầy cô, các anh chị và các bạn. Với lòng kính trọng
và biết ơn sâu sắc, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới:
Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha
Trang. Ban lãnh đạo Phân Viện thú y Miền Trung đã tạo mọi điều kiện thuận lợi,
như liên hệ nơi thực tập, hỗ trợ cơ sở vật chất, trang thiết bị để tôi có thể hoàn thành
công việc tốt nhất.
Đặc biệt tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành tới TS. Vũ Khắc Hùng và TS.
Nguyễn Văn Duy, người đã trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện và hoàn thành luận
văn này.
Xin gởi lời cảm ơn tới BS. Đỗ Văn Tấn và CN. Đào Hoài Thu, cùng tất cả các
thầy cô giáo trong viện công nghệ sinh học. Các cô chú, anh chị tại Phân Viện thú y
Miền Trung đã hết lòng dạy bảo, giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình tìm tòi,
học hỏi để hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Xin gởi lời biết ơn tới bố mẹ, anh chị em và bạn bè tôi, đã luôn ở bên động viên
và giúp đỡ tôi rất nhiều trong học tập và cuộc sống.




Nha Trang, Ngày 2 tháng 7 năm 2012




SV. Đoàn Thị Thu Dung
ii

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i
MỤC LỤC ii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT v
DANH MỤC CÁC BẢNG vii
DANH MỤC CÁC HÌNH ix
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. Đại cương về vi khuẩn S. choleraesuis Smith 4
1.1.1. Phân loại khoa học của S. choleraesuis 4
1.1.2. Đặc điểm hình thái 4
1.1.3. Đặc tính nuôi cấy và sinh hóa 5
1.1.4. Sức đề kháng 7
1.1.5. Cấu trúc kháng nguyên 7
1.1.6. Tính gây bệnh 10
1.2. Bệnh Phó thương hàn 10
1.2.1. Đặc điểm và nguyên nhân gây bệnh 10
1.2.2. Cơ chế sinh bệnh 11
1.2.3. Triệu chứng 11
1.2.4. Bệnh tích 11
1.2.5. Phòng bệnh 12
1.2.6. Điều trị 13
1.3. Tình hình nghiên cứu về tạo chủng S. choleraesuis đột biến gen 13
iii

1.4. Gen asd 17
1.5. Vector 18

1.5.1. Khái niệm 18
1.5.2. Các đặc điểm chính của vector 19
1.5.3. Các bước trong tạo DNA tái tổ hợp 20
1.6. Plasmid dùng trong kỹ thuật tạo dòng 20
1.6.1. Plasmid pBluescript II SK(+) (pBSIIK+) 21
1.6.2. Plasmid pRE112 23
1.7. Tế bào chủ để khuếch đại gen 24
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 25
2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 25
2.2. Vật liệu dùng cho nghiên cứu 25
2.2.1. Các chủng vi sinh vật 25
2.2.2. Hóa chất và môi trường 25
2.2.3. Thiết bị chuyên dụng 28
2.3. Phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật sử dụng 28
2.3.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số 28
2.3.2. Phương pháp tách chiết DNA plasmid 29
2.3.3. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR sau điện di 30
2.3.4. Phương pháp PCR 31
2.3.5. Phương pháp biến nạp của Kang và cs 36
2.3.6. Phương pháp tạo tế bào E. coli χ7213 khả biến 37
2.3.7. Phương pháp tiếp hợp của Kang và cs 38
2.3.8. Phương pháp lên men các loại đường 39
2.3.9. Phương pháp kiểm tra tính ổn định của gen asd đột biến 39
2.3.10. Bố trí thí nghiệm 39
iv

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41
3.1. Khuếch đại đoạn gen Pa12, Pa34 41
3.2. Tạo dòng plasmid tái tổ hợp pBSIIK(+)/Δasd 42
3.3. Tạo dòng plasmid tái tổ hợp pRE112/Δasd 44

3.4. Tạo chủng S. choleraesuis mang gen asd đột biến 46
3.5. Sàng lọc dòng tế bào S. choleraesuis mang gen asd đột biến 48
3.6. Kiểm tra các đặc tính của chủng S. choleraesuis/Δasd 49
3.6.1. Tốc độ sinh trưởng của S. choleraesuis/Δasd 49
3.6.2. Khả năng lên men đường của S. choleraesuis /Δasd 50
3.6.3. Kết quả kiểm tra tính ổn định của chủng đột biến 51
3.6.4. Giải trình tự gen asd của S. choleraesuis/Δasd 52
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56
TÀI LIỆU THAM KHẢO 59




v


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT


STT Kí hiệu Tên đầy đủ
1
asd
Aspartate β-semialdehyde dehydrogenase

2
bp
Base pair
3
CIP
Calf alkaline phosphatase

4
Cm
Chloramphenicol

5

Cm
r

Gen kháng kháng sinh Chloramphenicol

6
CIRAD
Centre de coopération Iternationale en Recherche
agronomique pour le Dévelopment (French Agricultural
Research Centre for International Development)
7
DAP
DL-α, ε- Diaminopimelic acid

8 DNA Deoxyribonucleic acid
9 E. coli Escherichia coli
10 F Forward
11 Kb Kilobase
12 Km Kanamycin
vi

13
LB

Luria Bertani
14
NA
Nutrient agar
15
NB
Nutrient broth
16
PBS
Phosphate buffer saline
17
PCR
Polymeration Chain Reaction
18
R
Reverse
19
S. choleraesuis
Salmonella choleraesuis
20
TBE
Tris- Borate- EDTA
21
Δasd

Gen asd bị đột biến

vii


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng thống kê tình hình nhiễm bệnh do Salmonella gây ra 2
Bảng 1.1. Các loại môi trường nuôi cấy vi khuẩn S. choleraesuis 5
Bảng 1.2. Tính trạng chủ yếu của các loài, loài phụ và đa dạng sinh học của
Salmonella 6
Bảng 1.3. Sức đề kháng của S. choleraesuis 7
Bảng 1.4. Các dạng huyết thanh chủ yếu và tính gây bệnh của Salmonella 9
Bảng 1.5. Các nhóm plasmid chính và đặc điểm 21
Bảng 2.6. Các plasmid dùng trong nghiên cứu 25
Bảng 2.7. Các bộ kit được dùng trong nghiên cứu 26
Bảng 2.8. Các cặp mồi dùng cho phản ứng PCR 26
Bảng 2.9. Các enzyme cắt giới hạn 27
Bảng 2.10. Thành phần các môi trường nuôi cấy 27
Bảng 2.11. Thành phần cho một mẫu phản ứng PCR (nhân gen asd) 31
Bảng 2.12. Bảng chu trình nhiệt (nhân gen asd) 31
Bảng 2.13. Thành phần cho một mẫu phản ứng PCR (kiểm tra tạo dòng plasmid).32
Bảng 2.14. Bảng chu trình nhiệt (kiểm tra tạo dòng plasmid) 32
Bảng 2.15. Thành phần cho một mẫu phản ứng PCR (kiểm tra gây đột biến) 33
Bảng 2.16. Bảng chu trình nhiệt (kiểm tra gây đột biến) 33
Bảng 2.17. Thành phần cho một mẫu phản ứng colony PCR 34
Bảng 2.18. Bảng chu trình nhiệt cho phản ứng Colony 34
viii

Bảng 2.19. Thành phần phản ứng cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn 35
Bảng 2.20. Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng enzyme giới hạn 35
Bảng 2.21. Thành phần phản ứng lai 36
Bảng 2.22. Nguyên vật liệu dùng trong phương pháp biến nạp của Kang và cs 36
Bảng 2.23. Nguyên vật liệu trong phương pháp tạo tế bào E. coli χ7213 khả biến .37
Bảng 2.24. Nguyên vật liệu của phương pháp tiếp hợp 38
Bảng 3.25. Tốc độ sinh trưởng của 2 chủng S. choleraesuis và 49
S. choleraesuis/Δasd 49
Bảng 3.26. Khả năng lên men đường của S. choleraesuis  S. cholersesuis/Δasd 51


ix


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Đặc điểm hình thái vi khuẩn S. choleraesuis chủng Smith 4
Hình 1.2. Hình ảnh khuẩn lạc vi khuẩn S. choleraesuis chủng Smith 57
Hình 1.3. Các kháng nguyên bề mặt của Salmonella 8
Hình 1.4. Sơ đồ con đường xâm nhập gây bệnh của S. choleraesuis 11
Hình 1.5. Vector nhân lên trong tế bào nhận 18
Hình 1.6. Cấu trúc của vector 19
Hình 1.7. Các bước tạo DNA tái tổ hợp 20
Hình 1.8. Plasmid pBluescrip II SK (+) 22
Hình 1.9. Plasmid pRE112 23
Hình 2.10. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 40
Hình 3.11. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen Pa12, Pa34 42
Hình 3.12. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt 2 dòng chọn lọc vector tái tổ hợp
pBSIIK(+)/Pa12 43

Hình 3.13. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt 6 dòng chọn lọc vector tái tổ hợp
pBSIIK(+)/Δasd 44
Hình 3.14. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt pBSIIK(+)/Δasd 45
Hình 3.15. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt của 3 dòng chọn lọc vector tái tổ
hợp pRE112/Δasd 46
Hình 3.16. Khuẩn lạc S. choleraesuis sau khi tiếp hợp với E. coli
χ7213/pRE112/Δasd 47
Hình 3.17. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR từ hệ gen của chủng
x

S. choleraesuis với cặp mồi Pa5F-Pa6R (A) và Pa6R-Pa7F (B) 48
Hình 3.18. Khuẩn lạc vi khuuẩn S. choleraesuis Smith và S. choleraesuis/Δasd 57
Hình 3.19. Đường cong sinh trưởng của S. choleraesuis Smith và
S. choleraesuis/Δasd 50
Hình 3.20. Khả năng lên men đường của S. choleraesuis /Δasd 58
Hình 3.21. Khả năng lên men đường của S. choleraesuis Smith 59
Hình 3.22. Sản phẩm PCR từ hệ gen của S. choleraesuis Smith và
S.cholereasuis/Δasd các đời 1, 5, 10, 15, 20 với cặp mồi Pa5F - Pa6R (trắng)
và Pa7F - Pa6R (đỏ) 52
Hình 3.23. So sánh trình tự gen Δasd của S. choleraesuis với asd của
S. choleraesuis Smith 55

1

MỞ ĐẦU

Trong thời gian gần đây ngành chăn nuôi ở nước ta được khởi sắc và có sự
tăng trưởng khá cao, đạt 24% giá trị tổng sản lượng ngành nông nghiệp. Theo kết
quả điều tra tại thời điểm 01/4/2010, cả nước có 6 triệu con bò, 2,9 triệu con trâu,
27,3 triệu con lợn, 4 triệu con gia cầm [1]. Chiếm tỉ lệ lớn trong ngành chăn nuôi là

ngành chăn nuôi lợn. Mục tiêu của kế hoạch phát triển chăn nuôi lợn ở Việt Nam
theo chiến lược phát tiển chăn nuôi đến năm 2020: đàn lợn từ 27,3 triệu con năm
2010, lên 32,9 triệu con năm 2015 và lên 34,7 triệu con năm 2020. Sản lượng thịt
hơi từ 3,1 triệu tấn năm 2010 lên 3,9 triệu tấn năm 2015 và 4,8 triệu tấn năm 2020.
Sản lượng thịt xẻ từ 2191,3 ngàn tấn năm 2010 lên 2794,4 ngàn tấn năm 2015 và
3493,1 ngàn tấn năm 2020. Trong đó đàn lợn nuôi công nghiệp 5,8 triệu con (chiếm
19,3%) năm 2010 lên 8,9 triệu con (chiếm 27,0%) năm 2015 lên 12,9 triệu con (
chiếm 37,0%) năm 2020. Sản lượng thịt hơi nuôi công nghiệp từ 1135,2 ngàn tấn
(chiếm 36,5%) năm 2010 lên 1851,5 ngàn tấn (chiếm 47,2%) năm 2015 và 2866
ngàn tấn (chiếm 59%) năm 2020 [1].
Để đạt được những mục tiêu có tính chiến lược đó, việc đầu tư cho công tác
giống, quan tâm đến vấn đề thức ăn, các chương trình quản lý, đặc biệt nhiệm vụ
của ngành chăn nuôi - thú y càng nặng nề hơn, tăng cường áp dụng các biện pháp
khoa học, kỹ thuật cho công tác phòng, chống dịch bệnh ở vật nuôi có hiệu quả là
điều hết sức quan trọng.
Tuy nhiêm vấn đề đặt ra cho ngành chăn nuôi nói chung, và ngành nuôi lợn
nói riêng là tình hình dịch bệnh liên tục xảy ra và gây thiệt hại rất lớn. Một trong
những bệnh thường gặp phải kể đến là bệnh tiêu chảy do vi khuẩn Salmonella gây
ra ở lợn sau cai sữa, còn gọi là bệnh Phó thương hàn, tuy không nổ ra thành dịch lớn
nhưng với đặc điểm dịch tễ hết sức phức tạp, đã và đang gây nên những thiệt hại
đáng kể cho người chăn nuôi.
Bệnh do Salmonella xảy ra trên toàn cầu trong đó tập trung chủ yếu ở các
nước châu Âu, châu Mỹ điển hình là Anh, Pháp, Mỹ, Hà Lan, v.v
2

Bảng thống kê tình hình nhiễm bệnh do Salmonella gây ra
Năm Quốc gia Tình hình nhiễm bệnh
Pháp
Trong số 7449 bệnh nhân bị nhiễm độc thức ăn đã
có tới 3131 bệnh nhân do Salmonella gây ra.

1995

Đan Mạch
Có 2.911 trường hợp nhiễm Salmonella, trong đó
có 19 gây bệnh thương hàn do ăn thức ăn là trứng
và các sản phẩm của trứng bị nhiễm vi khuẩn này.
Hàn Quốc
Có 25,9% mẫu thịt gà tươi sống bị nhiễm
Salmonella.
1999
Hà Lan Có 23% thịt lợn nhiễm Salmonella spp.
Hàng
năm
Mỹ
Có khoảng 4000 trường hợp mắc bệnh do thực
phẩm bị nhiễm Salmonella spp.

Có thể nói rằng ở bất kỳ một cơ sở chăn nuôi nào dù quy mô lớn hay nhỏ đều
có thể xuất hiện bệnh này. Khi đời sống của nhân dân ngày càng được nâng cao,
vấn đề an toàn thực phẩm trong đó có lợn và thịt lợn sạch bệnh, không bị nhiễm
Salmonella là một yêu cầu cấp thiết.
Các đàn lợn bị nhiễm Salmonella không những gây thiệt hại kinh tế cho
người chăn nuôi mà còn là nguồn tàng trữ mầm bệnh gây hại đối với con người. Bởi
vậy mà mỗi biện pháp ngăn chặn có hiệu quả ở gia súc đều cần thiết và là điều kiện
tiên quyết góp phần giảm thiểu dịch bệnh, tăng thu nhập cho người chăn nuôi,
chống ô nhiễm môi trường và bảo vệ sức khoẻ cộng đồng.
Do đó, việc giảm tỷ lệ các trại bị nhiễm mầm bệnh Salmonella sẽ làm cho sự
an toàn thịt lợn tăng lên, và mục tiêu của các nhà khoa học, nhà sản xuất là xây
dựng các đàn gia súc sạch Salmonella. Chính vì thế mà việc nghiên cứu tạo ra các
chủng Salmonella nhược độc ứng dụng trong sản xuất vacxin phòng bệnh ở lợn,

phát hiện sớm và tìm ra hướng phòng, trị bệnh có hiệu quả luôn là những việc làm
cấp thiết.
3

Xuất phát từ thực tiễn nghiên cứu và yêu cầu của sản xuất, chúng tôi tiến
hành nghiên cứu "Tạo chủng và xác định đặc tính sinh hóa của Salmonella
choleraesuis Smith đột biến gen asd” đây là một nhánh nhỏ trong đề tài cấp nhà
nước.
Mục tiêu nghiên cứu
 Tạo chủng S. choleraesuis đột biến gen asd bằng cách gây đột biến mất
đoạn sử dụng công nghệ DNA tái tổ hợp.
 Kiểm tra các đặc tính sinh hóa của S. choleraesuis mang gen asd bị đột
biến.
 Mở rộng ứng dụng chủng vi khuẩn này làm chủng vacxin tái tổ hợp mang
plasmid đã được dòng hóa các kháng nguyên ngoại lai. (ví dụ kháng nguyên F18ab,
Stx2e của vi khuẩn E. coli).
Nội dung nghiên cứu
1. Tạo dòng plasmid pRE112/Δasd.
2. Kiểm tra kết quả tạo dòng plasmid pRE112/Δasd.
3. Chuyển nạp plasmid pRE112/Δasd vào chủng S. choleraesuis nhược độc gây
đột biến gen asd.
4. Kiểm tra kết quả gây đột biến gen asd bằng phản ứng PCR, giải trình tự.
5. Kiểm tra đặc tính sinh hóa của chủng S. choleraesuis nhược độc mang gen asd
bị đột biến.


4


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Đại cương về vi khuẩn S. choleraesuis Smith
Salmonella do Daniel E. Salmon (1850 - 1914) phát hiện ra vào năm
1885. Năm 1880, Grafhy mô tả hình ảnh vi khuẩn quan sát được trên tiêu bản và
là người đầu tiên phân lập được S. typhi vào năm 1884 [4].
S. choleraesuis là một trong những vi khuẩn gây bệnh Phó thương hàn lợn.
Lợn bị nhiễm S. choleraesuis có các biểu hiện bao gồm viêm dạ dày, ruột, viêm
phổi, viêm gan, viêm màng não [17].
1.1.1. Phân loại khoa học của S. choleraesuis
Giới (regnum): Bacteria
Ngành (phynum) : Proteobacteria
Lớp (class) : Gamaproteobacteria
Bộ (ordo) : Enterobacteriales
Họ (familia) : Enterobacteriaceae
Chi (genus) : Salmonella
Loài (species) : S. choleraesuis
1.1.2.Đặc điểm hình thái
S. choleraesuis là loại
trực khuẩn gram âm, hình gậy
ngắn, hai đầu tròn, kích thước
0,4 - 0,6 × 1 - 3 µm, không hình
thành giáp mô và nha bào. S.
choleraesuis có khả năng di
động mạnh do có từ 7 - 12 lông
quanh thân [3].


Hình 1.1. Đặc điểm hình thái vi
khuẩn S. choleraesuis chủng Smith.

5

1.1.3.Đặc tính nuôi cấy và sinh hóa
S. choleraesuis là vi khuẩn yếm khí tùy tiện, có khả năng chuyển hóa
đường, khử nitrat thành nitrit [4].
Bảng 1.1. Các loại môi trường nuôi cấy vi khuẩn S. choleraesuis
Môi trường Đặc điểm
Nước thịt
Nuôi cấy 24h sau môi trường đục đều, để lâu thì
dưới đáy có cặn, trên mặt môi trường có màng mỏng.
Thạch thường
Khuẩn lạc có dạng S tròn, gọn, trong sáng, ẩm ướt
nhẵn bóng, xung quanh khuẩn lạc có một bờ chất dính
lầy nhầy (Hình 1.2).
Thạch Istrati Khuẩn lạc có màu xanh
Thạch máu Không dung huyết
Lên men và sinh hơi các loại đường chính:
glucoza, galactoza, mantoza, levuloza, mannit, v.v
Môi trường đường
Không lên men và không sinh hơi: lactoza,
saccaroza, arabinoza.
H2S : +
Indol : -
MR (methyl rouge) : -
Các phản ứng khác
VP (voges prosskauer) : -

6

Bảng 1.2. Tính trạng chủ yếu của các loài, loài phụ và đa dạng sinh học của

Salmonella [3]

7


1.1.4. Sức đề kháng
S. choleraesuis có khả năng chịu nhiệt kém. Các chất sát trùng thông
thường cũng dễ dàng phá hủy vi khuẩn này hoàn toàn, ví dụ như: phenol 5%, HgCl
2

1/500, formol 1/500 diệt vi khuẩn này trong 15 - 20 phút. Nhưng đối với một số hóa
chất như: cristal violet, lục malachite, natri hyposunfit, muối mật với nồng độ vừa
đủ gây độc cho E. coli thì không ảnh hưởng tới sự phát triển của Salmonella. Dựa
vào tính chất này, người ta chế tạo ra những môi trường chọn lọc để kiềm hãm sự
phát triển của E. coli và giúp cho Salmonella phát triển được dễ dàng [5].
Bảng 1.3. Sức đề kháng của S. choleraesuis
1.1.5. Cấu trúc kháng nguyên
Hiện nay có khoảng 2500 kiểu huyết thanh (Serotype) của Salmonella được
phát hiện, các kiểu huyết thanh của Salmonella được phân biệt dựa trên phản ứng
miễn dịch của hai kháng nguyên bề mặt chính: kháng nguyên O và kháng nguyên
H.
Kháng nguyên O có bản chất là cacbohydrate (hay polysaccharide) và là
thành phần nằm ngoài cùng của màng lipopolysaccharide. Kháng nguyên O là
Điều kiện Thời gian S. choleraesuis tồn tại được
Trong nước 1 tuần
Trong nước đá
Xác động vật chết chôn ở bùn, cát
2-3 tháng
Ở 50
0
C Sau 1 giờ
Ở 70

0
C 20 phút
Nước sôi 5 phút
Ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp
trong nước trong
5 phút
Ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp
trong nước đục
9 phút
8

polymer của các tiểu phần O, mỗi tiểu phần O sẽ gồm 4 - 6 nhóm đường tùy từng
nhóm kháng nguyên O. Các kháng nguyên O khác nhau do chứa các nhóm đường
khác nhau, hay khác nhau do bản chất cộng hóa trị giữa các nhóm đường trong cùng
một tiểu phần hoặc khác nhau về liên kết cộng hóa trị giữa các tiểu phần. Kháng
nguyên O được kí hiệu bằng số và được chia thành từng nhóm khác nhau, một số
nhóm còn được kí hiệu bằng chữ cái latin.
Kháng nguyên H là protein tiểu phần cấu tạo nên phần sợi của lông roi, đây
là phần cấu trúc chính của lông roi, do đó kháng nguyên H còn được gọi là kháng
nguyên lông roi (hay kháng nguyên flagellin). Flagellin chia làm 8 vùng :
Vùng I, II, và VIII là vùng bảo tồn cho chi Salmonella và họ vi khuẩn
đường rột, có vai trò liên kết các flagellin tiểu phần.
Vùng IV, V, VI là vùng biến đổi, nằm trên bề mặt sợ roi, có tính miễn
dịch kháng nguyên cao, kích thích tạo kháng thể chuyên biệt với các kiểu huyết
thanh của Salmonella.
Theo bảng phân loại Salmonella của Kauffman S. choleraesuis có công thức
kháng nguyên: O 6, 7 và H 1, 5 [5].

Hình 1.3. Các kháng nguyên bề mặt của Salmonella. (Nguồn: Diffchamb, 1997)


9


Bảng 1.4. Các dạng huyết thanh chủ yếu và tính gây bệnh của Salmonella [5]
10

1.1.6. Tính gây bệnh
Trong tự nhiên vi khuẩn có thể theo thức ăn, nước uống vào đường tiêu hóa
của lợn. Bình thường, chúng có thể sống trong đường tiêu hóa mà không gây bệnh,
khi sức đề kháng của con vật giảm sút, vi khuẩn xâm nhập vào máu, nội tạng và gây
bệnh. Sự giảm sút sức đề kháng có thể do thời tiết, do cách chăm sóc nuôi dưỡng,
lợn con sau cai sữa, tách đàn, vận chuyển đi xa. Hoặc do con vật mắc các bệnh
truyền nhiễm khác, thường là các bệnh: tụ huyết trùng, đóng dấu lợn và đặc biệt là
Phó thương hàn.
Vi khuẩn gây ra bệnh Phó thương hàn cho lợn con từ 2 - 4 tháng tuổi với tỷ
lệ tử vong trên 50% có khi lên đến 95%, bệnh có thể gây ra ở lợn lớn với thể mãn
tính và ít gây chết [5].
1.2. Bệnh Phó thương hàn
1.2.1. Đặc điểm và nguyên nhân gây bệnh
Bệnh Phó thương hàn là một bệnh truyền nhiễm, do vi khuẩn S.

choleraesuis (vi khuẩn Phó thương hàn lợn) gây ra. Lợn ở mọi lứa tuổi đều có thể
mắc bệnh, phổ biến là lợn con từ cai sữa đến 4 tháng tuổi, ít khi xảy ra ở lợn trên 6
tháng tuổi (nếu có chỉ thấy mắc bệnh ở thể mãn tính).
Vi khuẩn gây bệnh có khả năng tồn tại ngoài môi trường, nếu lợn gặp phải
điều kiện bất lợi do stress như: thời tiết thay đổi, giao mùa, cai sữa, vận chuyển lợn
đi xa, nhập đàn, thay đổi thức ăn một cách đột ngột. Ngoài ra còn do thức ăn bị nấm
mốc, do ký sinh trùng, v.v lúc này vi khuẩn sẽ xâm nhập vào cơ thể lợn lây qua
đường tiêu hóa (gây bệnh cấp tính trên lợn con). Ngoài ra, lợn nái mang thai có thể
truyền bệnh cho bào thai.



11


1.2.2. Cơ chế sinh bệnh











Hình 1.4. Sơ đồ con đường xâm nhập gây bệnh của S. choleraesuis ở lợn
1.2.3. Triệu chứng
 Thể cấp tính

Lợn sốt cao từ 41 - 41,5
0
C. Giai đoạn đầu, lợn kém ăn hoặc không ăn,
không bú. Sau đó có các triệu chứng như là: táo bón, bí đại tiện, nôn mửa, tiêu chảy
phân lỏng, màu vàng có mùi rất thối, đôi khi có lẫn máu. Con vật kêu la đau đớn do
viêm dạ dày, viêm ruột nặng. Lợn thở gấp, ho, suy nhược do bị mất nước. Cuối thời
kỳ bệnh, da tụ máu thành từng nốt, đỏ ửng rồi chuyển thành màu tím xanh ở tai,
bụng, mặt trong đùi, ngực. Bệnh tiến triển trong 2 - 4 ngày, lợn gầy còm, còi cọc,
tiêu chảy nhiều rồi chết, với biểu hiện ở bụng và chân có vết tím bầm.
 Thể mãn tính
Lợn gầy yếu dần, ăn uống giảm sút, chậm lớn, thiếu máu, da xanh, có khi
trên da có những mảng đỏ hoặc bầm tím. Lợn tiêu chảy phân lỏng, vàng rất hôi thối,
thở khó, ho, sau khi vận động con vật thường mệt nhọc, đi lại khó khăn. Bệnh kéo
dài trong vài tuần, một số có thể khỏi bệnh nhưng chậm lớn.
1.2.4. Bệnh tích
Niêm mạc
ruột,
d
ạ
dày

Vào tổ chức
Lâm Ba
Vào máu
S. choleraesuis
Hầu

Ruột
Gây bại huyết
12

 Thể cấp tính
 Lách sưng to, đặc biệt là 1/3 phần ở giữa sưng to hơn, dai như cao su, màu
xanh thẫm.
 Hạch lâm ba sưng, tụ máu, xuất huyết.
 Gan tụ máu có nốt hoại tử bằng hạt kê.
 Thận có những điểm hoại tử ở vỏ thận.
 Phổi tụ máu và có các ổ viêm, ruột sưng nhiều nước.
 Niêm mạc dạ dày và ruột viêm đỏ, có điểm xuất huyết, đôi khi có vết loét
như hạt đậu.
 Thể mãn tính
 Bệnh tích chủ yếu ở dạ dày và ruột.
 Niêm mạc dạ dày và ruột viêm đỏ từng đám. Ở ruột già và ruột non có
nhiều đám loét bờ cạn, những đám loét này phủ fibrin.
 Lách không sưng, đôi khi có những nốt hoại tử to bằng quả mận.
 Gan có nốt viêm hoại tử màu xám, to bằng hạt đậu.
 Phổi viêm sưng có ổ hoại tử màu vàng xám.
1.2.5. Phòng bệnh
Mua lợn từ nơi không có bệnh, cách ly và theo dõi lợn ít nhất 2 tuần rồi mới
nhập đàn.
 Vệ sinh phòng bệnh
 Định kỳ sát trùng chuồng trại, máng ăn, máng uống, đảm bảo cung cấp đủ
thức ăn và nước uống sạch, không cho lợn ăn thức ăn hôi thiu, ẩm mốc.
 Nên áp dụng biện pháp cùng vào - cùng ra, chuồng trại nên được để trống
khoảng 5 - 7 ngày.
 Phải sát trùng chuồng trại và dụng cụ thật kỹ sau mỗi lứa lợn.
 Phòng bệnh bằng vacxin
Hiện nay, tại Việt Nam có hai loại vacxin phòng bệnh Phó thương hàn lợn:
đó là vacxin chết và vacxin nhược độc. Vacxin chết phòng bệnh Phó thương hàn
13

được sản xuất dưới dạng nước, có bổ sung các chất bổ trợ làm tăng cường và kéo
dài khả năng miễn dịch. Vacxin nhược độc được sản xuất dạng đông khô kết hợp
với vi khuẩn Pasteurella mutocida nhược độc phòng hai bệnh Phó thương hàn và
Tụ huyết trùng lợn. Ưu điểm của vacxin kép nhược độc dạng đông khô là an toàn,
hiệu lực cao, giá thành thấp.
Phòng bệnh bằng vacxin thì định kỳ tiêm phòng vacxin Phó thương hàn cho
lợn con và lợn thịt theo quy trình tiêm phòng vacxin tại địa phương. Riêng đối với
lợn nái, nên tiêm trước khi phối giống 10 - 15 ngày là tốt nhất, để lợn con sinh ra có
khả năng miễn dịch do sữa mẹ truyền sang chống bệnh trong thời gian đầu.
1.2.6. Điều trị
Hiện nay chưa có biện pháp điều trị hiệu quả cao, chỉ nên điều trị những
trường hợp bệnh nhẹ, tiến triển chậm. Hoặc có thể dùng các loại thuốc kháng sinh
như: chloramphenicol 10%, chlotetrasone, oxycaf, biocortyl O.P.C, T.P.C, tylo P.C,
tylo D.C, v.v liều: 1 - 1,5 ml/10 kg thể trọng (20mg/ kg); gentamycine: 250mg, 2
lần/ ngày. Các loại kháng sinh thuộc nhóm sulfamid như: sunfadiazin, sulmet,
sulfaprim, sptotry 24% dùng 1ml/5 - 10 kg thể trọng [5].
1.3. Tình hình nghiên cứu về tạo chủng S. choleraesuis đột biến gen
Ngày nay, việc sử dụng vi khuẩn nhược độc làm vi khuẩn biến nạp mang
kháng nguyên vacxin tái tổ hợp là hướng nghiên cứu mang nhiều triển vọng, vì
khắc phục được nhược điểm của các loại vacxin truyền thống, vacxin tiểu phần.
Các loại vacxin này có giá thành sản xuất cao, đòi hỏi phải có chất bổ trợ và
phải tiêm chủng nhiều lần mới tạo được miễn dịch tốt, hơn nữa các loại vacxin này
có thể ảnh hưởng đến việc tạo kháng thể trên gia súc mẹ dẫn tới khả năng bảo hộ
thấp hoặc không có khả năng bảo hộ đối với gia súc non (Chappuis, 1998; Pastoret,
1999).
Các loại vacxin độc tố có thể tạo miễn dịch dịch thể tốt, tuy nhiên không có
tác dụng hoặc tác dụng ít trong việc tạo miễn dịch qua trung gian tế bào. Các loại
vacxin vô hoạt toàn khuẩn thường chứa cơ chất kháng nguyên và không kháng
14

nguyên. Các đáp ứng miễn dịch chống lại cơ chất không kháng nguyên, hoàn toàn
trái ngược với sự ngăn chặn nhiễm trùng và có thể làm ảnh hưởng hoặc làm giảm
đáp ứng miễn dịch đối với cơ chất kháng nguyên. Chúng có thể tạo ra các phản ứng
phụ có hại do các cơ chất ngoài mong muốn như các loại nội độc tố (Wegenr và
cộng sự, 1998).
Các loại vacxin sống nhược độc có khả năng tạo ra hai loại miễn dịch là
miễn dịch dịch thể và miễn dịch qua trung gian tế bào. Mặt khác, khi sử dụng vi
khuẩn nhược độc làm tế bào chủ mang các kháng nguyên vacxin protein tái tổ hợp
làm kéo dài sự hiện diện của kháng nguyên với hệ thống miễn dịch của động vật
được tiêm vacxin. Khi sử dụng vi khuẩn nhược độc làm tế bào chủ mang kháng
nguyên vacxin tái tổ hợp, những gen mã hóa các kháng nguyên vacxin được dòng
hóa trên các plasmid bên trong các tế bào vi khuẩn nhược độc.
Những năm gần đây, có rất nhiều nghiên cứu và số liệu liên quan đến quy
trình sản xuất các loại vacxin sống nhược độc. Tuy nhiên, các loại vacxin sống
nhược độc này chỉ giới hạn ở một số loại mầm bệnh nhất định và nguy cơ các chủng
vi khuẩn vacxin nhược độc quay trở lại độc lực cao là rất lớn (Moos, 1995; Terpstra
and Kroese, 1996a,b).
Các chủng vi khuẩn Salmonella nhược độc là chủng đầu tiên được sử dụng
làm vacxin phòng các bệnh do vi khuẩn Salmonella gây trên người và động vật
(Germanier và cộng sự, 1971; 1975). Sau này các chủng Salmonella nhược độc
được biến đổi một số gen để sử dụng làm vi khuẩn biến nạp mang các plasmid tái tổ
hợp đã được dòng hóa các kháng nguyên ngoại lai. Những vacxin tái tổ hợp này tạo
miễn dịch do các kháng nguyên ngoại lai đồng thời tạo miễn dịch do các kháng
nguyên của vi khuẩn Salmonella.
Một hệ thống tế bào chủ - vector biểu hiện cân bằng gây chết (a balanced-
lethal host-vector system) dựa trên gen asd (aspartate β-semialdehyde
dehydrogenase) đã được sử dụng cho những kháng nguyên tái tổ hợp đặc hiệu từ
các plasmid asd
+

bên trong các chủng vacxin Salmonella đã bị loại bỏ gen asd (Gán
lan và cộng sự, 1990; Nakayama và cộng sự 1988).
15

Gần đây, có rất nhiều nghiên cứu sử dụng các chủng vacxin Salmonella
nhược độc làm vi khuẩn biến nạp mang các plasmid tái tổ hợp đã dòng hóa các
kháng nguyên ngoại lai phòng các bệnh do Salmonella cũng như các bệnh do các
kháng nguyên ngoại lai gây ra cho người và động vật.
Bucley và cộng sự (2009) sử dụng chủng S. typhimurium DeltaaroA nhược
độc làm tế bào chủ mang plasmid tái tổ hợp đã dòng hóa các kháng nguyên của
Campylobacter làm vacxin phòng bệnh do Campylobacter jejuni gây ra trên gia
cầm. Zekarias và cộng sự (2008) đã dùng chủng S. typhimurium nhược độc làm vi
khuẩn biến nạp mang plasmid tái tổ hợp đã dòng hóa gen α tốc-xin của Clostridium
perfingens làm vacxin phòng bệnh viêm ruột hoại tử trên gà. Gà tiêm vacxin được
bảo hộ tốt khi công cường độc với chủng Clostridium perfringens cường độc.
Tương tự, Xin và cộng sự (2009) cũng sử dụng S. typhimurium làm vi khuẩn
biến nạp mang plasmid tái tổ hợp đã dòng hóa gen của kháng nguyên protein bề mặt
A của Streptococcus pneumoniae gây bệnh viêm phổi, viêm màng não trên người,
khi thử nghiệm trên chuột, vacxin có tác dụng tạo miễn dịch tốt.
Branger và cộng sự (2009) khi nghiên cứu vacxin tái tổ hợp phòng bệnh do
Yersinia gây ra trên người, chủng vi khuẩn vacxin nhược độc S. typhimurium được
sử dụng làm tế bào chủ mang plasmid tái tổ hợp đã dòng hóa các gen kháng nguyên
Lcrv và Lcrv196. Zhao và cộng sự (2009) khi nghiên cứu thử nghiệm vacxin phòng
bệnh sảy thai truyền nhiễm, các tác giả này đã dòng hóa các gen kháng nguyên
protein L7/L12 của vi khuẩn Brucella trên plasmid vector và biến nạp vào chủng
vacxin nhược độc Salmonella typhirmurium, vacxin có hiệu lực cao khi thử nghiệm
trên chuột. Các chủng vacxin Salmonella nhược độc không những là tế bào chủ
mang các plasmid tái tổ hợp đã dòng hóa các kháng nguyên vi khuẩn mà còn là vật
mang cho các plasmid tái tổ hợp dòng hóa các kháng nguyên vi rút và ký sinh trùng.
Benitez và cộng sự (2009) đã sử dụng chủng vacxin S. typhimurium nhược độc

SL3261 làm vi khuẩn biến nạp mang plasmid tái tổ hợp đã dòng hóa các kháng
nguyên của Cryptosporidium parvum.