Tạo chủng và kiểm tra đặc tính sinh hóa chủng salmonella choleraesuissmith mang gen crp đột biến

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG






ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

TẠO CHỦNG VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC
TÍNH SINH HÓA CỦA CHỦNG
Salmonella choleraesuis Smith NHƯỢC
ĐỘC MANG GEN CRP BỊ ĐỘT BIẾN



GVHD : TS. VŨ KHẮC HÙNG
Th.S. LÊ ĐÌNH ĐỨC
SVTH : NGUYỄN HOÀNG OANH
Lớp : 50 CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Khoá : 50






Nha Trang, tháng 6 năm 2012

LỜI CẢM ƠN
Trước tiên tôi xin bày tỏ niềm tự hào vì đã được học tập và nghiên cứu tại
trường Đại học Nha Trang, một trong những trường có bề dày truyền thống trên 50
năm.
Xin được gửi lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tới Tiến sĩ Vũ Khắc
Hùng, Bộ môn Công nghệ Sinh học, Phân viện Thú Y miền Trung, và Thạc sĩ Lê
Đình Đức, Bộ môn Công nghệ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường,
đã định hướng, dìu dắt và tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện
và hoàn thành đồ án tốt nghiệp này.
Xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học và Môi
trường, trường Đại học Nha Trang đã giảng dạy, hướng dẫn tôi trong suốt thời gian
học tập tại trường.
Xin chân thành cảm ơn các anh, chị đang công tác tại Phân viện Thú Y miền
Trung, đặc biệt là anh Đỗ Văn Tấn và chị Đào Hoài Thu đã giúp đỡ tôi trong suốt
thời gian nghiên cứu.
Cuối cùng, xin gửi lòng biết ơn chân thành đến gia đình, bạn bè, những
người luôn quan tâm giúp đỡ, động viên, giúp tôi hoàn thành khóa học và đồ án tốt
nghiệp này.

Nha Trang, tháng 7 năm 2011
Sinh viên

NGUYỄN HOÀNG OANH


i


MỤC LỤC

MỤC LỤC i
DANH MỤC BẢNG iv
DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ, HÌNH VẼ v
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii
MỞ ĐẦU viii
Chương 1. Tổng quan 1
1.1 Bệnh phó thương hàn lợn 1
1.1.1 Cơ chế sinh bệnh 3
1.1.2 Phương thức lây truyền 3
1.1.3 Triệu chứng 4
1.1.4 Bệnh tích 4
1.1.5 Chẩn đoán bệnh 4
1.1.6 Phòng và trị bệnh 6
1.2 Đặc tính của vi khuẩn Salmonella choleraesuis Smith 7
1.2.1 Đặc điểm hình thái 8
1.2.2 Đặc điểm nuôi cấy 8
1.2.3 Đặc điểm sinh hóa 9
1.2.4 Cấu trúc kháng nguyên 10
1.2.5 Sức đề kháng 13
1.2.6 Tính gây bệnh 14
1.3 Gen CRP 15
1.4 Phương pháp tạo DNA tái tổ hợp 19
1.4.1 Nguyên tắc chung 19
1.4.2 Quy trình tạo DNA tái tổ hợp 20
1.5 Tình hình nghiên cứu gây đột biến trên một số gen gây bệnh của Salmonella
21
Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 24
2.1 Đối tượng nghiên cứu 24
ii

2.2 Vật liệu nghiên cứu 24
2.2.1 Vật liệu và môi trường 24
2.2.2 Dụng cụ và thiết bị 27
2.3 Phương pháp nghiên cứu 27
2.3.1 Tách chiết plasmid 27
2.3.2 Tách chiết genome 28
2.3.3 Chiết tách, tinh sạch DNA 27
2.3.4 Phản ứng PCR nhân đoạn gen crp 30
2.3.5 Phản ứng cắt với enzyme giới hạn 31
2.3.6 Phản ứng lai ghép 32
2.3.7 Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E.coli JM109 và E.coli χ7213 32
2.3.8 Tạo chủng E.coli χ7213 khả biến 33
2.3.9 Tiếp hợp E.coli χ7213 và Salmonella choleraesuis 34
2.3.10 Kiểm tra các đặc tính sinh hóa 35
Chương 3. Kết quả và thảo luận 37
3.1. Tạo chủng vector tái tổ hợp pBSIIK+/Δcrp 38
3.1.1. Khuếch đại đoạn gen Pr12, Pr34 với enzyme Pwo - polymerase 38
3.1.2. Tạo dòng vector tái tổ hợp pBSIIK+/Δcrp 39
3.2. Tạo dòng plasmid tái tổ hợpẠO pRE112/Δcrp 40
3.3. Tạo chủng S. choleraesuis Smith mang gen crp đột biến 41
3.3.1. Tiếp hợp E.coli χ7213/pRE112/Δcrp với S. choleraesuis 41
3.3.2. Sàng lọc dòng tế bào S. choleraesuis mang gen crp đột biến 42
3.4. Kết quả giám định đặc tính sinh hóa của chủng S. choleraesuis nhược độc
mang gen crp đã bị đột biến 44
3.4.1. Tốc độ sinh trưởng 44
3.4.2. Đặc tính sinh hóa 45
3.4.3. Tính ổn định của chủng đột biến 47
3.4.4. Giám định kháng nguyên H, O 48
3.4.5. So sánh trình tự gen của S. choleraesuis Smith và S. choleraesuis/Δcrp 48

iii


Kết luận và kiến nghị 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO 51


iv


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1 Đặc tính sinh hóa của một số loài Salmonella 9
Bảng 1.2 Định type huyết thanh học (serotyp) của vi khuẩn Salmonella (Theo
Kauffman (1972) ) 12
Bảng 1.3 Các gen bị mất và chức năng của chúng trong phát triển các chủng
Salmonella spp. đã giảm độc lực 22
Bảng 2.1 Các cặp mồi dùng cho phản ứng PCR 26
Bảng 2.2 Thành phần của bộ kit QIApre spin Miniprep Kit của QIAgen 28
Bảng 2.3 Thành phần của bộ kit Blood&Tissue Extraction của QIAgen 27
Bảng 2.4 Thành phần của bộ kit QIA Quick Gel Extraction của hãng QIAgen 30
Bảng 2.5 Thành phần cho một mẫu phản ứng PCR 30
Bảng 2.6 Thành phần của phản ứng cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn (RE) 31
Bảng 2.7 Thành phần của phản ứng cắt plasmid bằng enzyme RE 32
Bảng 2.8 Thành phần phản ứng lai ghép sử dụng T4 ligase 32
Bảng 3.1: Các đặc tính sinh hóa của chủng S. choleraesuis Smith và
S.choleraesuis/Δcrp 47

v


DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ, HÌNH VẼ
Hình 1.1 Lợn con 3 tháng tuổi chết do bị nhiễm S.choleraesuis 2
Hình 1.2: Hình thái vi khuẩn S. choleraesuis [31] 8
Hình 1.3 Khuẩn lạc S. choleraesuis trên thạch máu 24 giờ 9
Hình 1.4 Cấu trúc cAMP 15
Hình 1.5 Class I CAP-dependent promoter activation 16
Hình 1.6 Class II CAP-dependent promoter activation 16
Hình 1.7 Class III CAP-dependent promoter activation 16
Hình 1.8 Mối liên hệ giữa lượng đường và nồng độ cAMP.(Nguồn Scitable by
nature education) 18
Hình 1.9 Quy trình biến nạp DNA tái tổ hợp với vector là plasmid, tế bào nhận là
E.coli 20
Hình 1.10 Sàng lọc dòng vi khuẩn mang gen tái tổ hợp thành công dựa vào gen
kháng Ampicilin 21
Hình 3.1: Điện di kiểm tra sản phẩm PCR chạy từ khuôn là DNA tổng số của vi
khuẩn S. choleraesuis với cặp mồi Pr1F-Pr2R, và Pr3F-Pr4R trên gel agarose 1,2%.
38
Hình 3.2: Điện di kiểm tra tách chiết vector pBSIIK+ (A), sản phẩm cắt ADN
plasmid của 4 dòng vector tái tổ hợp pBSIIK+/Pr12 với BamHI/XbaI (B) và 3 dòng
pBSIIK(+)/Δcrp (C) với XhoI/KpnI 40
Hình 3.3: Điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân lên từ khuôn là plasmid tái tổ hợp
pBSIISK+/Pr12-1/Pr34-1 bằng cặp mồi Pr1F-Pr4R trên gel agarose 1,2%. 40
Hình 3.4: Điện di kiểm tra sản phẩm cắt của 5 dòng chọn lọc vector tái tổ hợp
pRE112/Δcrp bằng cặp enzyme XbaI và KpnI trên gel agarose 1,2%. 41

Hình 3.5 Các khuẩn lạc S. choleraesuis sau khi tiếp hợp với E.coli
χ7213/pRE112/Δcrp-4 mọc trên môi trường chọn lọc LB + Cm. 42
vi


Hình 3.6 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR từ genome của S. choleraesuis 539/Δcrp
(1), S. choleraesuis Smith (2), plasmid của χ7213/pRE112/Δcrp (3) với cặp mồi
Pr5F-Pr6R (ảnh trái), và Pr6R-Pr7F (ảnh phải) trên gel agarose 1,2%. 43
Hình 3.7 Hình ảnh khuẩn lạc của S.chorelasuis Smith và S. chorelasuis 539/Δcrp
sau 24h nuôi cấy 44
Hình 3.8 Biểu đồ tốc độ sinh trưởng của các chủng S. choleraesuis Δcrp và S.
choleraesuis Smith trong 10 giờ nuôi cấy 45
Hình 3.9 Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa của chủng S. choleraesuis Smith và
S.choleraesuis/Δcrp 46
Hình 3.10 Sản phẩm PCR từ genome của S. cholerasuis 539/Δcrp với cặp mồi
Pr5F-Pr6R, Pr6R-Pr7F ở các đời 1, 5, 10, 15, 20 47
Hình 3.11 Trình tự đoạn gen khuếch đại từ cặp mồi Pr5F- Pr6R của gen Δcrp với
đoạn 322 bp (545-867) (bôi đen) bị mất so với gen crp của Salmonella choleraesuis
nhược độc 49






vii


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
STT Kí hiệu Chữ viết tắt

1 CIP Calf alkaline phosphatase
2 Cm Chloramphenicol
3 Cm
r
Gen kháng kháng sinh Chloramphenicol
4 Crp cAMP receptor protein
5 Δcrp gen crp bị đột biến
6 CAP catabolite activator protein - Protein hoạt hóa dị hóa

7 Asd aspartate β–semialdehyde dehydrogenase
8 LB Luria – Bertani
9 ST Stable toxin –Độc tố chịu nhiệt
10 PBS Phosphate buffer saline – Đệm Phosphate.
11 LPS Lypopolysaccharide
12 Km Kanamycin
13 LT Labile toxin – Độc tố không bền nhiệt
14 RE Enzyme cắt giới hạn
15 KDO 2-keto-3 dexyoctonate

viii


MỞ ĐẦU
Salmonella choleraesuis là nguyên nhân gây ra hàng loạt dịch bệnh gây chết ở
lợn, đồng thời cũng là nguyên nhân dẫn đến nhiễm trùng máu và tử vong ở người
(Jean và cộng sự, 2006). Phòng bệnh do S. choleraesuis gây ra là ưu tiên hàng đầu
của nhà chăn nuôi. Việc sử dụng chủng Salmonella nhược độc làm vắc-xin đang
được quan tâm, chú ý trong những năm gần đây vì vắc-xin nhược độc hiệu quả hơn
nhiều so với vắc-xin chết hay vắc-xin tiểu phần trong việc kích thích hệ thống miễn
dịch ở lợn.

Hiện nay, trên thị trường có rất nhiều loại vắc-xin, trong đó hai loại vắc-xin vô
hoạt và vắc-xin nhược độc được sử dụng nhiều nhất. Vắc-xin vô hoạt ít hiệu quả
hơn so với các loại vắc-xin sống nhược độc [15]. Những năm gần đây có rất nhiều
nghiên cứu và số liệu liên quan đến quy trình sản xuất các loại vắc-xin sống nhược
độc. Tuy nhiên các loại vắc-xin sống nhược độc tạo ra bằng cách sử dụng các tác
nhân lý hóa hoặc bằng phương pháp tiếp truyền truyền thống chỉ giới hạn ở một số
loại mầm bệnh nhất định và nguy cơ các chủng vi khuẩn vắc-xin nhược độc quay
trở lại độc lực cao là rất lớn [18, 28]. Để khắc phục những mặt hạn chế trên, loại
vắc-xin thế hệ mới ra đời, một trong số đó là vắc-xin tái tổ hợp.
Kỹ thuật di truyền đã được sử dụng để tạo ra các sinh vật cải biến dùng làm
vắc-xin tái tổ hợp sống. Các vắc-xin này là sinh vật không gây bệnh được cải biến
để mang và biểu hiện quyết định kháng nguyên từ tác nhân gây bệnh đích hoặc
chủng cải biến của sinh vật gây bệnh trong đó gen độc đã được cải biến hoặc loại
bỏ. Trong trường hợp này, như là thành phần của vi khuẩn, các quyết định kháng
nguyên quan trọng có mặt trong hệ miễn dịch có thành phần rất giống với dạng
kháng nguyên ở sinh vật gây bệnh [1].
Gen crp mã hóa CAP-protein hoạt hóa trao đổi chất kết hợp với cAMP tạo
phức cAMP-CAP, phức này liên kết với promoter gây hoạt hóa sao mã các gen cấu
trúc. Thể đột biến gen crp không sao mã được mRNA của operon lac, dẫn đến
ix


không tham gia chuyển hóa năng lượng, gây kìm hãm sự sinh trưởng, phát triển của
S. choleraesuis.
Như vậy, việc tạo chủng S. choleraesuis mang gen crp bị đột biến phục vụ cho
việc sản xuất vắc-xin tái tổ hợp phòng hai bệnh phù đầu và phó thương hàn lợn là
việc cấp thiết. Do đó tôi tham gia thực hiện đề tài “Tạo chủng và kiểm tra đặc tính
sinh hóa chủng Salmonella choleraesuis Smith mang gen crp đột biến”.
Mục tiêu của đề tài
- Tạo chủng plasmid pRE112/Δcrp. Chuyển nạp plasmid pRE112/Δcrp vào

chủng S. cholerasuis Smith nhược độc gây đột biến gen crp.
- Kiểm tra đặc tính sinh hóa của chủng S. choleraesuis Smith mang gen crp
đột biến.
Nội dung nghiên cứu
- Tạo dòng plasmid pER112/Δcrp.
- Kiểm tra kết quả tạo dòng plasmid pER112/Δcrp.
-Chuyển nạp plasmid pER112/Δcrp vào chủng S. chorelasuis nhược độc gây
đột biến gen crp.
- Kiểm tra kết quả gây đột biến gen crp.
- Kiểm tra đặc tính sinh hóa của chủng S. choleraesuis nhược độc mang gen
crp bị đột biến.
Ý nghĩa của đề tài
Tạo chủng Salmonella cholerasuis Smith nhược độc mang gen crp đột biến
làm chủng biến nạp để từ đó có thể tiếp tục nghiên cứu sản xuất vắc-xin tái tổ hợp
phòng hai bệnh phù đầu và phó thương hàn lợn.


1


Chương 1. Tổng quan
1.1 Bệnh phó thương hàn lợn
Nền kinh tế phát triển, cùng với hội nhập kinh tế toàn cầu, mức sống của
người dân được nâng cao, vai trò của ngành chăn nuôi trở lên quan trọng, đặc biệt là
ngành chăn nuôi lợn. Ngành chăn nuôi lợn đã góp phần đáp ứng nhu cầu thực phẩm
trong nước và một phần dành cho xuất khẩu thu ngoại tệ. Hiện nay, thịt lợn chiếm
77% tổng lượng các loại thịt tiêu dùng hàng ngày trên thị trường Việt Nam .
Mục tiêu của kế hoạch phát triển chăn nuôi lợn của Việt Nam theo quyết định
của Thủ tướng chính phủ số 10/2008/QĐ-TTg, (2008), chiến lược phát triển chăn
nuôi đến năm 2020: đàn lợn từ 29,9 triệu con năm 2010, lên 32,9 triệu con năm

2015 và lên 34.7 triệu con năm 2020. Sản lượng thịt hơi từ 3.1 triệu tấn năm 2010,
lên 3.9 triệu tấn năm 2015 và 4.8 triệu tấn năm 2020; sản lượng thịt xẻ từ 2191.3
ngàn tấn năm 2010; 2794.7 ngàn tấn năm 2015 và 3493.1 ngàn tấn năm 2020.
Trong đó đàn lợn nuôi công nghiệp 5.8 triệu con (chiếm 19.3%) năm 2010, lên 8.9
triệu con (chiếm 27.0%) năm 2015 và lên 12.9 triệu con (chiếm 37.0%) năm
2020. Sản phẩm thịt hơi nuôi công nghiệp từ 1135.2 ngàn tấn (chiếm 36.5%) năm
2010; 1851.5 ngàn tấn (chiếm 47.2%) năm 2015 và 2866 ngàn tấn (chiếm 59.2%)
năm 2020 .
Để đạt được những mục tiêu có tính chiến lược đó, việc đầu tư cho công tác
nghiên cứu, phát triển giống, thức ăn, xây dựng các chương trình quản lý; đặc biệt
nhiệm vụ của công tác chăn nuôi – thú y càng nặng nề hơn. Trong đó việc tăng
cường áp dụng các biện pháp khoa học kỹ thuật cho công tác phòng, chống dịch
bệnh ở lợn có hiệu quả là điều hết sức quan trọng.
Một thách thức không nhỏ đối với việc phát triển chăn nuôi lợn là dịch bệnh
vẫn thường xuyên xảy ra trên các đàn lợn ở mọi lứa tuổi, làm giảm năng suất, giảm
chất lượng con giống. Sản phẩm thịt lợn nhiễm bệnh làm tăng nguy cơ mất an toàn
vệ sinh thực phẩm. Một trong những bệnh thường gặp phải kể đến là bệnh phó
thương hàn do vi khuẩn Salmonella và phù đầu do vi khuẩn E.coli gây ra.
2


Bệnh phó thương hàn là bệnh truyền nhiễm xảy ra chủ yếu ở lợn 2- 4 tháng
tuổi. Bệnh do trực khuẩn Salmonella cholereasuis chủng Kunsendorf (thể cấp tính)
và Salmonella typhi suis chủng Vondagsen (thể mãn tính). Đây là vi khuẩn đường
ruột tác động chủ yếu trên đường tiêu hoá gây ra các triệu chứng và bệnh tích như
viêm ruột, dạ dày, lách sưng to . Các đàn lợn bị nhiễm Salmonella không những gây
thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi mà còn là nguồn tàng trữ mầm bệnh gây hại
đối với con người [22, 29].

Hình 1.1 Lợn con 3 tháng tuổi chết do bị nhiễm S.choleraesuis.
Bệnh xảy ra ở khắp nơi, tạo thành những ổ dịch lẻ tẻ, thường gặp ở những
vùng chăn nuôi có điều kiện vệ sinh kém đặc biệt là vùng sản xuất lợn giống. Ở
nước ta chứng viêm ruột tiêu chảy do Salmonella rất dễ xảy ra trên lợn, bệnh được
phát hiện ở tất cả các tỉnh trong cả nước và gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi.
Khi điều tra tình hình nhiễm vi khuẩn đường ruột ở một số trại chăn nuôi cho thấy:
82-100% số lợn nhiễm vi khuẩn Salmonella và trên lợn khoẻ cũng mang vi khuẩn
này với một tỷ lệ nhất định [6]. Phân lập vi khuẩn từ phân lợn tiêu chảy cũng cho
3


thấy: tỷ lệ xuất hiện vi khuẩn Salmonella trung bình là 80%, biến động trong
khoảng 73%-85% [9]. Điều tra tình hình nhiễm Salmonella của lợn vùng Tây
Nguyên cho thấy: bình thường, lợn 2-4 tháng tuổi nhiễm 32,66%; lợn 4-8 tháng tuổi
nhiễm 14,70% và lợn nái nhiễm 18,35%. Ở lợn bị tiêu chảy mật độ vi khuẩn
Salmonella trong cơ thể tăng rõ rệt ở ruột 80%, lách 20% [8]. Tình trạng nhiễm
Salmonella thay đổi theo sự tiến triển của bệnh, cụ thể tiêu chảy 1-3 ngày nhiễm
60%, 8-12 ngày nhiễm 100%. Trong trường hợp lợn con mắc bệnh phân trắng, tỷ lệ
nhiễm Salmonella có thể lên tới 25%. Tác giả nhận xét : vi khuẩn Salmonella có thể
tìm thấy ở mọi lứa tuổi lợn, xong chủ yếu là lợn 2-4 tháng tuổi. Trong cơ thể lợn, vi
khuẩn có nhiều nhất ở cơ quan tiêu hóa và đường bài xuất chính ra bên ngoài là
đường tiêu hóa. Cũng chính từ đó, Salmonella lại nhiễm vào thức ăn, nước uống để
nhiễm trở lại đường tiêu hóa.
1.1.1 Cơ chế sinh bệnh
Bệnh phó thương hàn do tác nhân là vi khuẩn Salmonella. Thời kì ủ bệnh từ 3-
6 ngày, có khi kéo dài đến tuần lễ hay một tháng tuỳ thuộc vào số lượng vi khuẩn
xâm nhập vào, độc lực của vi khuẩn và sức đề kháng của cơ thể. S. choleraesuis vào
cơ thể theo đường tiêu hoá vào hầu, ruột. Vi khuẩn sinh sản và chui qua niêm mạc
dạ dày, ruột, gây thuỷ thủng hoại tử cục bộ xuất huyết gây viêm ruột, viêm dạ dày
sau đó vi khuẩn xâm nhập vào các tổ chức lâm ba gây phản ứng hạch viêm, sưng

hạch và từ đó vào máu gây bại huyết. Ở những con vật qua khỏi bệnh vi khuẩn có
khuynh hướng khu trú ở một số phủ tạng như gan đặc biệt ở hạch lâm ba. Nội độc
tố của Salmonella đóng vai trò rất lớn trong quá trình gây bệnh. Nội độc tố ảnh
hưởng đến plasma, khả năng đông máu. Phản ứng viêm xảy ra đầu tiên, kích thích
tiểu cầu và tấn công bạch cầu. Sốt và trúng độc máu cũng là hai triệu chứng gây ra
trực tiếp do nội độc tố.
1.1.2 Phương thức lây truyền
Bệnh phó thương hàn lợn là bệnh ở đường tiêu hóa nên đường lây truyền chủ
yếu của bệnh là qua thức ăn, nước uống bị nhiễm khuẩn. Khi lợn ăn phải thức ăn,
nước uống có vi khuẩn thì sẽ nhiễm khuẩn và có khả năng phát bệnh.
4


Bệnh này chủ yếu gặp ở lợn con từ 2-4 tháng tuổi. Đặc biệt bệnh có thể lây
nhiễm sang người và các động vật nuôi khác như gia cầm, cừu,…
1.1.3 Triệu chứng
 Thể cấp tính
Khi lợn mắc bệnh thể cấp tính thì có triệu chứng như sốt cao từ 40–41
0
C, chót
tai lạnh, kém ăn, táo bón. Phân lợn có màu đen, màng nhày bao quanh phân. Lợn
con có thể có triệu chứng tiêu chảy phân có màu vàng, sệt lẫn máu và rất hôi thối.
Lợn nhiễm bệnh thường nằm co trên 4 chân, bụng nổi gai ốc, lông dựng. Ngoài ra
lợn cũng có các triệu chứng khác như thở khó và nhanh, tim đập yếu. Trên da xuất
huyết thành từng nốt đỏ ửng rồi chuyển sang tím xanh ở tai, bụng, mặt trong đùi.
Tốc độ lây lan trong chuồng chậm, tốc độ gây chết chậm, nhưng bệnh làm lợn
mất sức suy kiệt, còi cọc. Sau 1-2 tuần nhiễm bệnh, lợn bị suy kiệt dần, tiêu chảy
nặng và có thể chết. Lợn nái trong thời kỳ mang thai mắc bệnh có thể dẫn đến sẩy
thai.
 Thể mãn tính

Lúc đầu lợn nhiễm bệnh không có triệu chứng điển hình, sau đó biếng ăn, gầy
yếu, xanh xao; tới bữa chỉ liếm láp chứ không ăn, uống nước nhiều và trên da có
những mảng đỏ hoặc tím bầm. Lợn bị táo bón, đi phân thường phải rặn nhiều. Thể
mãn tính thường xảy ra ở lợn lớn. Lợn nái trong thời kỳ mang thai bị bệnh có thể
dẫn đến sẩy thai, hoặc nếu sinh ra lợn con cũng gầy yếu.
1.1.4 Bệnh tích
Khi mổ khám kiểm tra bệnh tích của lợn mắc bệnh phó thương hàn, chúng ta
thường thấy các biểu hiện bệnh tích đặc trưng ở đường tiêu hóa như: niêm mạc ruột
già hoại tử, bong từng mảng; van hồi manh tràng có các vết loét, có bờ và có hình
cúc áo.
1.1.5 Chẩn đoán bệnh
 Chẩn đoán lâm sàng
5


Ở thể cấp tính: lợn sốt cao, chết nhanh; viêm dạ dày ruột; lách sưng to, đàn
hồi, dai như cao su, có màu xanh sẫm; gan sưng, có ổ hoại tử; xuất huyết ở thận,
tương mạc.
Ở thể mãn tính: lợn bị tiêu chảy dai dẳng, gầy còm, suy nhược; chết do kiệt
sức, viêm ruột, gan, phổi.
 Chẩn đoán phân biệt
Phân biệt với bệnh bệnh dịch tả: bệnh xảy ra ở mọi lứa tuổi, lây lan mạnh, tỷ
lệ chết cao (>90%), tiêu chảy nặng, có máu tươi mùi thối khắm, chảy nước mũi đặc,
viêm kết mạc và giác mạc, nằm chùm nhum, bại liệt; bệnh tích: xuất huyết da, phổi
viêm tụ máu, gan hóa từng vùng, viêm loét hình cúc áo sâu có vòng fibrin đồng tâm
ở ruột già (ở bệnh phó thương hàn: mụn loét bằng phẳng nông, thành ruột già dày
và cứng lại, màu xám hoặc đen), lách nhồi huyết, vỏ thận xuất huyết đinh ghim.
 Chẩn đoán vi khuẩn học
- Soi kính bệnh phẩm: thấy trực khuẩn ngắn, gram âm.
- Nuôi cấy bệnh phẩm trong các môi trường phân lập vi khuẩn đường ruột.

- Nếu số lượng vi khuẩn trong phân ít thì cấy vào môi trường tăng sinh, Mule
kofman, để tủ ấm 37
0
C trong 18 - 24 giờ, rồi mới cấy ria trên môi trường phân lập.
- Nếu trong máu có ít vi khuẩn thì cấy nhiều máu vào bình nước thịt 50ml có
1% glucose và nước mật bò, để tủ ấm 37
0
C trong 1 - 2 tuần lễ rồi mới cấy vào môi
trường phân lập.
- Giám định đặc tính sinh hoá của vi khuẩn đã phân lập.
- Tiêm động vật thí nghiệm (thỏ, chuột bạch, chuột lang). Bệnh phẩm sẽ làm
chết con vật sau 6 - 10 ngày.
 Chẩn đoán huyết thanh học
Dùng kháng nguyên vi khuẩn đã phân lập được làm phản ứng ngưng kết trên
phiến kính với kháng huyết thanh Salmonella đa giá A - E, kháng huyết thanh O và
H của nhóm C1 và cuối cùng với kháng huyết thanh S. choleraesuis, hiệu giá phải
trên 1/100 mới dương tính (hiệu giá ngưng kết tối thiểu).
6


Có thể phát hiện ngưng kết tố trong lợn bệnh, nhưng những kháng thể này chỉ
xuất hiện từ ngày thứ 7 sau khi mắc bệnh.
 Ngoài ra cũng có thể làm các phản ứng khác như PCR, ELISA,…để
tìm ra vi khuẩn gây bệnh.
1.1.6 Phòng và trị bệnh
1.1.6.1 Phòng bệnh và khống chế bệnh
 Vệ sinh và quản lý:
Vấn đề quan trọng là loại trừ các điều kiện có lợi cho mầm bệnh phát triển và
tiếp xúc với lợn bệnh và lợn mang trùng là nguồn lây lan bệnh nên các biện pháp vệ
sinh phòng dịch như cách ly, xử lý những đàn lợn mắc bệnh rất quan trọng. Xây

dựng chuồng trại đảm bảo vệ sinh và thuận tiện. Cụ thể:
- Thực hiện chặt chẽ quy trình vệ sinh chuồng trại, định kì tiêu độc khử
trùng…
- Loại trừ các yếu tố làm giảm sức đề kháng của lợn như thời tiết khí hậu, vận
chuyển
- Đảm bảo đúng mật độ nuôi ở từng lứa tuổi và giai đoạn sinh lí của vật nuôi.
- Tránh thay đổi thức ăn đột ngột, phải lựa chọn thức ăn đảm bảo dinh dưỡng.
Do nhiều yếu tố tác động nên những con bệnh tiềm ẩn phát bệnh và trở thành
nguồn lây lan cho đàn như nhốt qúa trật trội, stress do vận chuyển, loại thức ăn có
nhiều Salmonella (bột thịt) cho nên thường xuyên quan tâm vấn đề này.
 Tiêm phòng vắc-xin:
Tuân thủ quy trình tiêm vắc-xin phòng bệnh Phó thương hàn cho đàn lợn.
Hiện nay trên thị trường có các loại vắc-xin phòng bệnh Phó thương hàn như: vắc-
xin phó thương hàn nhược độc đông khô, vacxin phó thương hàn lợn vô hoạt keo
phèn .
 Ngoài ra cũng cần tăng cường khâu chăm sóc nuôi dưỡng nhằm tăng
cường sức đề kháng cho đàn lợn.
1.1.6.2 Trị bệnh
7


Chưa có biện pháp đìều trị có hiệu quả cao. Thông thường chỉ nên điều trị
những trường hợp nhẹ, tiến triển chậm.
Có thể dùng huyết thanh phó thương hàn lợn, tiêm liều 30 - 50ml/lợn >1.5
tháng.
Chloramphenicol 10%, chlotetrasone, oxycaf, biocortyl O.P.C, T.P.C, tylo
P.C, tylo D.C liều: 1 – 1.5ml/10 kg thể trọng (20 mg/ kg).
Gentamycine: 250 mg, 2 lần/ngày
Các loại sulfamid: Sulfadiazin, sulmet, Sulfaprim, Septotryl 24% dùng 1 ml/5,
10 kg thể trọng.

Nếu dùng cho cả đàn thì dùng nitrofurazone hay phối hợp chlortetracyclin với
sulfamethiazine (75 mg của mỗi thứ cho 1 lít nước). Liệu trình: 3 - 5 ngày.
Kết hợp đìều trị triệu chứng tiêu chảy như: Atropin, Kaolin
Ngoài ra phải dùng các loại thuốc bù các chất điện giải và mất nước như dung
dịch Sodium Bicarbonate 5%, nước muối sinh lý (0,9%)
1.2 Đặc tính của vi khuẩn Salmonella choleraesuis Smith
S. choleraesuis là một trong những vi khuẩn gây bệnh phó thương hàn lợn.
Lợn bị nhiễm S. choleraesuis không chỉ bị viêm dạ dày, ruột mà gây chết biểu hiện
bao gồm viêm phổi, viêm gan, viêm màng não [22].
Vi khuẩn được phân lập lần đầu tiên trên lợn vào năm 1885 do Salmon và
Smith [20].
Phân loại khoa học của S.choleraesuis :
Giới (regnum) : Bacteria
Ngành (phynum : Proteobacteria
Lớp (class) : Gamaproteobacteria
Bộ (ordo) : Enterobacteriales
Họ (familia) : Enterobacteriaceae
Chi (genus) : Salmonella
Loài (species) : S.choleraesuis

8


1.2.1 Đặc điểm hình thái
S. choleraesuis là một loại vi khuẩn hình que ngắn, hai đầu tròn, kích thước
0,4–0,6µm x 1–3µm, không có khả năng hình thành giáp mô và nha bào. Có khả
năng di động mạnh do có từ 8 -12 tiêm mao xung quanh thân. Vi khuẩn dễ bắt màu
thuốc nhuộm, Gram âm, khi nhuộm vi khuẩn bắt màu đều toàn thân hoặc hơi đậm ở
hai đầu [7].

Hình 1.2: Hình thái vi khuẩn S. choleraesuis [31].
1.2.2 Đặc điểm nuôi cấy
Trên thạch: sau khi nuôi cấy 24 giờ, để ở nhiệt độ phòng thí nghiệm (25–
30
o
C) từ 1 đến 2 ngày sau, hình thành một bờ chất dính lầy nhầy ở xung quanh.
Trên mặt thạch thỉnh thoảng xuất hiện khuẩn lạc R nhám, mặt không bóng, không
đều, mờ [7].

9



Hình 1.3 Khuẩn lạc S. choleraesuis trên thạch máu 24 giờ [32].
1.2.3 Đặc điểm sinh hóa
S. choleraesuis có khả năng chuyển hoá các loại đường như : glucose,
levulose, galactose, mannitol, xyclose, rhamnose, lactose, maltose, arabinose,
dextrin; sinh hơi [7]. Một số đặc tính sinh hóa thể hiện ở Bảng 1.1.
Bảng 1.1 Đặc tính sinh hóa của một số loài Salmonella
Loài vi khuẩn Xylose

Arabinose

Trehalose

Inositol Mantose

Sinh
H
2

S
S.paratyphi - +H +H - +H -
S.echotmuelleri +H +H +H +H +H +
S.híchfeldii +H +H +H - +H +
S.typhosa ± ± + - + +
S.typhimurium +H +H +H +H +H +
S.abortus equi +H +H - - +H ±
S.abortus ovis +H +H - - +H ±
S.cholerae suis +H - - - +H ±
S.typhi suis +H +H +H - +H -
10


S.enteritidis +H +H +H - +H +
S.pullorum +H +H +H - ± +
S.gallinarum + + + - + ±
S.anatis +H +H + - +H +
Chú thích: + : sinh axit, dương tính; H : sinh hơi
- : âm tính; ± : không xác định
Các phản ứng sinh hoá khác:
Indon -
H
2
S +
VP -
MR -
Khử nitrat thành nitrit +
1.2.4 Cấu trúc kháng nguyên
S. choleraesuis thuộc nhóm C trong bảng phân loại Salmonella của Kauffman
có công thức kháng nguyên như sau:S . VI, VII : c–1,5 [7].

 Kháng nguyên O
 Cấu tạo :
Kháng nguyên thân O nằm ở lớp màng ngoài của tế bào vi khuẩn. Tính chất
đặc thù của kháng nguyên này được xác định bởi thành phần cấu trúc
Lypopolysaccharide (LPS) bao gồm hai nhóm:
- Nhóm LPS nằm bên trong không mang tính đặc trưng của kháng nguyên mà
có vai trò tạo ra sự khác biệt về hình thái khuẩn lạc từ dạng S (Smooth) sang dạng R
(Rough)
- Nhóm LPS nằm ngoài quyết định tính kháng nguyên và đặc trưng cho từng
chủng vi khuẩn.
Khi thủy phân phân tử Lypopolysaccharide người ta thu được 5 loại đường
là: heptose, 2-keto-3 dexyoctonate (KDO), glucose, galactose và glucosamine. Qua
nghiên cứu người ta xác định kháng nguyên O có bản chất là các chuỗi đường nằm
11


trên phân tử Lypopolysaccharide mà đơn vị cơ bản của nó là Oligosaccharide, đây
là những đường đa (một phân tử Oligosaccharide được cấu tạo từ 2-10 phân tử
đường đơn mongosaccharide).
Trong quá trình nghiên cứu, các nhà khoa học đã tìm thấy kháng nguyên O
của Salmonella có 65 thành phần khác nhau. Một loài Salmonella có thể có một
hoặc nhiều yếu tố đó. Mỗi thành phần được đánh dấu bằng chữ số La mã hay số Ả
Rập.
Dựa vào sự khác nhau về cấu trúc kháng nguyên O của các Salmonella mà người
ta chia chúng thành 34 nhóm khác nhau:A, B; C
1
; C
2
; C
3

; D
1
, D
2
, E
1
, E
2
, E
3
, E
4
, F, G
1
,
G
2
, H. I, J, L, M, N, O, P, Q, R, S, T, U, V, W, X, Y, Z, 49, 50.
 Đặc tính :
Kháng nguyên O là yếu tố giúp vi khuẩn chống lại khả năng phòng vệ của vật
chủ, giúp vi khuẩn phát triển trong tế bào tổ chức, chống lại sự thực bào của đại
thực bào (Morris và cộng sự, 1976) [19].
Kháng nguyên O của vi khuẩn Salmonella là kháng nguyên chịu nhiệt. Ở nhiệt
độ 100
0
C, kháng nguyên bị hủy sau 24 giờ. Kháng nguyên O có thể chịu được cồn
50
0
và axit HCL 1N trong 24 giờ, nhưng bị phá hủy bởi focmon nồng độ 5% [5].
Kháng nguyên có tính độc. Chuỗi polysaccarit khi mất dần phân tử đường hay

có sự thay đổi vị trí làm cho độc lực của vi khuẩn bị thay đổi. Kháng nguyên O liên
hệ trực tiếp với hệ thống miễn dịch của cơ thể.
Khi kháng nguyên O gặp kháng thể tương ứng sẽ xảy ra phản ứng ngưng kết,
gọi là hiện tượng ngưng kết O. Thân vi khuẩn ngưng kết với nhau thành những hạt
nhỏ, lắc khó tan.
 Kháng nguyên H
 Cấu tạo :
Có ở trên lông vi khuẩn, bản chất protein cấu trúc gần giống miozin của cơ.
Kháng nguyên H chia làm 2 pha [4]:
- Pha 1 có tính chất đặc hiệu, gồm 28 kháng nguyên lông được biểu thị
bằng chữ mẫu Latin thường: a, b, c, d…z
12


- Pha 2 không có tính chất đặc hiệu, loại này có thể ngưng kết với loại
khác. Pha 2 gồm có 6 loại được biểu thị bằng chữ số Ả Rập 1, 2, 3, 4,
5, 6. hay chữ Latin thường e, n, x…
 Đặc tính :
Là kháng nguyên kém chịu nhiệt (60
o
C/1h), dễ bị tác động bởi cồn 50
0
(bị phá
huỷ). Đề kháng với focmon 5%o vẫn tồn tại. Khi kháng nguyên H gặp kháng thể H
làm cho vi khuẩn ngưng kết lại: lông- kháng thể- lông biểu hiện như cụm bông nhỏ.
Ngưng kết không bền, dễ tan khi lắc ở vi khuẩn đường ruột. Kháng nguyên H
không liên quan đến yếu tố độc lực, không có ý nghĩa tạo miễn dịch, chỉ có ý nghĩa
trong quá trình phân loại.
Bảng 1.2 Định type huyết thanh học (serotyp) của vi khuẩn Salmonella (Theo
Kauffman (1972) ).

Kháng nguyên H Nhóm huyết
thanh
Serotyp
Kháng
nguyên O
Pha 1 Pha 2
Nhóm A S.paratyphi A 1, 2, 12 A /1, 5/
S.paratyphi B 1, 4, /5/, 12 B 1,2
S.abortus ovis 1, 4, 5, 12 C 1,6
S.saintpaul 1, 4, 12 E, h 1,2
S.agona 1, 4, 12 F, g, s -
S.typhimurium 1, 4, /5/, 12 I 1,2
S.heidelberg 1, 4, /5/, 12 R 1,2
Nhóm B
S.abortus equi 4, 12 - E,n,x
S.paratyphi C 6, 7, /Vi/ C 1,5
S.cholerae suis 6, 7 C 1,5
S.cholerae suis var
Kunzendorf
6, 7 - 1,5
S.typhisuis 6, 7 C 1,5
Nhóm C1
S.montervideo 6, 7, 14 G,m/p/, s /1,2,7/
13


S.thomson 6, 7, 14 K 1,5
S.virchow 6, 7 R 1,2
S.infantis 6, 7, 14 R 1,5
S.typhi 9, 12, /Vi/ D -

S.enteritidis 1, 9, 12 G,m/p/, s /1,7/
S.dublin 1, 9, 12 G, p -
S.panama 1, 9, 12 i, v 1,5
S.gallinarum 1, 9, 12
1
, 13
3
- -
Nhóm D1
S.pullorum 9, 12 - -

1.2.5 Sức đề kháng
Vi khuẩn Salmonella rất mẫn cảm với nhiệt độ và các chất sát trùng, các chất
sát trùng thông thường cũng dễ phá hủy vi khuẩn hoàn toàn như: Phenol 5%, HgCl
1/500, Focmon 1/500 diệt vi khuẩn trong 15–20 phút. Nhưng đối với một số hóa
chất như Cristal Violet, xanh Malachit, NatriHhyposulfit,Ddixitrat, muối mật với
những nồng độ vừa đủ gây độc cho E.coli thì không ảnh hưởng tới sự phát triển của
Salmonella. Dựa vào tính chất này người ta chế tạo những môi trường chọn lọc để
kìm hãm sự phát triển của E.coli và giúp cho Salmonella có thể phát triển dễ dàng.
Vi khuẩn có sức đề kháng yếu với nhiệt độ, bị tiêu diệt sau 60
0
C trong 1giờ
hay 75
0
C trong 5 phút. Nếu chiếu ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp diệt vi khuẩn sau
5 giờ [9].
Salmonella có thể tồn tại vài năm trong môi trường thích hợp. Vi khuẩn có thể
tồn tại trong chất độn chuồng 30 tuần, trong phân vịt 28 tuần, trong máy ấp ở nhiệt
độ phòng tới 5 năm. Vi khuẩn có thể sống trong đất ở độ sâu 5m trong vòng 2 tháng
và có thể tồn tại trong máng gỗ 108 ngày[2]. Salmonella có thể sống trong thịt ướp

muối (nồng độ khoảng 29%) được 4-8 tháng ở nhiệt độ từ 6–12
o
C [2].