XÂY DỰNG QUY TRÌNH MULTIPLEX PCR CHẨN đoán ĐỒNG THỜI BỆNH đốm TRẮNG (WSSV), BỆNH còi (MBV) và BỆNH GAN tụy (HPV) TRÊN THỦY sản

1
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG
========***========





TRẦN THỊ DUNG



XÂY DỰNG QUY TRÌNH MULTIPLEX -PCR CHẨN ĐOÁN
ĐỒNG THỜI BỆNH ĐỐM TRẮNG (WSSV), BỆNH CÒI (MBV)
VÀ BỆNH GAN TỤY (HPV) TRÊN THỦY SẢN


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC







CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS. TS NGÔ ĐĂNG NGHĨA

CN. ĐẶNG HÒA THỌ






Nha Trang, tháng 08 năm 2010


2
ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, cùng với nhu cầu sử dụng thực phẩm từ thủy hải sản đang ngày một
tăng cao thì cũng đồng nghĩa với việc khai thác các nguồn lợi thủy hải sản biển
cũng gia tăng gây cạn kiệt nguồn tài nguyên quý giá này. Trước tình hình đó việc
phát triển tự phát nghề nuôi trồng thủy sản, đặc biệt là sự bùng phát nghề nuôi
tôm biển là một thực tế khách quan và là nhu cầu cần thi
ết. Ở nước ta, mặc dù
nghề nuôi tôm mới thực sự phát triển từ năm 1988 nhưng do lợi nhuận cao của
nghề và do được sự ưu đãi của thiên nhiên nên ngành nghề nuôi tôm phát triển
khá nhanh đặc biệt ở một số tỉnh ven biển miền Trung và các tỉnh đồng bằng
sông Cửu Long như : Long An, Tiền Giang, Bến Tre, Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc
Trăng,… Diện tích nuôi ngày càng được mở rộng hơn, hiện có hơn 260.000 ha
dùng để
nuôi tôm với nhiều hình thức nuôi khác nhau. Khoa học kĩ thuật đã được
áp dụng rộng rãi nhằm đáp ứng nhu cầu về con giống, thức ăn, thuốc,… với mục
tiêu đạt sản lượng cao nhất trong thời gian ngắn nhất.
Khi phát triển các hình thức nuôi tôm công nghiệp thì tôm được nuôi với mật
độ rất cao. Do đó nếu kĩ thuật nuôi chưa được đảm bảo, việc áp dụng khoa học kĩ
thu

ật trong các công đoạn nuôi chưa được đồng bộ thì vấn đề ô nhiễm môi
trường nước, phá vỡ môi trường sinh thái, bùng nổ và lây lan dịch bệnh… là một
thực tế không thể tránh khỏi và gây ra nhiều thiệt hại lớn cho người nuôi và cho
nền kinh tế. Theo tài liệu thống kê vào cuối năm 1993 đầu 1994 dịch bệnh lan
rộng khắp các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long, gây thiệt hại gần 294 tỷ đồng
(Nguyễn Vi
ệt Thắng, 1994 và Bùi Quang Tề, 1995) là một minh chứng cụ thể.
Trong đó, WSSV (White Spot Syndrome Virus) là virus gây bệnh đốm
trắng, một trong những bệnh quan trọng xảy ra trên rất nhiều các đối tượng tôm
nuôi. Đặc trưng của bệnh là tỷ lệ chết cao và chết hàng loạt trong một thời gian
rất ngắn tại các ao nuôi. MBV (Monodon baculovirus) và HPV
(Hepatopancreatic parvovirus) là hai loại virus tuy không gây chết ồ ạt nhưng lại
làm cho tôm chậm lớn. MBV gây thiệt hại và gây chết ở giai đ
oạn cuối của


3
postlavae (>90%) và giai đoạn juvenile (70%). Bên cạnh đó thì HPV lại chủ yếu
xâm nhiễm trên tôm trong giai đoạn mid –juvenile khiến cho gan teo lại, hoại tử
… nguy cơ chết có thể lên đến 100% (trong vòng 4 -8 tuần). Hiện nay, ba loại
virus này đang gây nhiều trở ngại lớn trong nuôi trồng thủy sản vì chưa có biện
pháp chữa trị đặc hiệu. Vì vậy, ngoài biện pháp kỹ thuật nuôi tốt còn phải có
phương pháp chẩn đoán nhanh và hiệu quả nhằm giám sát ba mầ
m bệnh này từ
lúc thả giống cho đến khi thu hoạch, phát hiện kịp thời tôm bị nhiễm bệnh để có
biện pháp xử lý thích hợp. Việc ứng dụng các phương pháp sinh học phân tử
trong đó có phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh trên tôm là nguồn công cụ rất
hữu ích và đem lại nhiều hiệu quả cao vì khả năng phát hiện nhanh nhạy và đặc
biệt là phương pháp Multiplex –PCR có thể đồng thời phát hiệ
n được nhiều virus

trên tôm giúp hạn chế đáng kể thiệt hại cho nghề nuôi.
Được sự phân công của Viện Công Nghệ Sinh Học - Môi Trường Trường
Đại Học Nha Trang tỉnh Khánh Hòa và được sự đồng ý hướng dẫn của Công Ty
Cổ Phần Công Nghệ Việt Á, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:
“ Xây dựng quy trình Multiplex -PCR chẩn đoán đồng thời bệnh đốm
trắng (WSSV), bệnh còi (MBV) và bệnh gan tụy (HPV) trên thủy sản”.

Đây là một phương pháp mới có khả năng phát hiện đặc hiệu đồng thời ba
loại bệnh trên tôm : bệnh đốm trắng (WSSV), bệnh còi (MBV), bệnh teo gan tụy
(HPV). Chỉ bằng một phản ứng duy nhất, mẫu tôm có thể được chẩn đoán chính
xác khả năng nhiễm ba loại bệnh nói trên. Điều này có ý nghĩa rất lớn vì nó giúp
tiết kiệm công sức lẫn chi phí xét nghiệm và quan trọng hơn hết đ
ó là giúp cho
nghề tôm có những phương pháp xử lý kịp thời khi thấy dấu hiệu có bệnh do tính
năng nhanh nhạy của phương pháp.




4



PHẦN I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU


5

1. TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH

1.1 Tình hình dịch bệnh tôm trên thế giới
Hiện nay nghề nuôi tôm đang trên đà phát triển mạnh và trở thành một
trong những ngành đem lại thu nhập lớn cho nền kinh tế quốc dân của rất nhiều
nước trên thế giới. Từ những năm cuối của thập kỷ 80, nghề nuôi tôm đã có
những bước phát triển nhanh chóng, các trại nuôi tôm được xây dựng ở gần 40
nước, đưa sản lượ
ng tôm nuôi từ tỷ lệ 2,1% năm 1981 lên 22% năm 1988 so với
tổng sản lượng tôm (Latscha, 1989). So với năm 1984, sản lượng tôm nuôi năm
1990 tăng 36,8% với gần 600.000 tấn (FAO, 1992). Năm 1995, sản lượng tôm
nuôi đạt 712.000 tấn, chiếm 27% tổng sản lượng nuôi trồng thủy sản trên thế
giới. Trong đó các nước Đông Bán Cầu chiếm 78% tổng sản lượng tôm nuôi, còn
lại là các nước Tây Bán Cầu (Rosenberry, 1995).
Hiện nay có khoảng 25 loài tôm đang được nuôi, nh
ưng chỉ có 5 loài đạt
sản lượng trên 10.000 tấn/năm và 3 loài đạt sản lượng 100.000 tấn/năm (Bộ Thủy
Sản,1994). Trong đó loài tôm sú Penaeus monodon chiếm tới 53% tổng sản
lượng tôm nuôi ở khu vực Châu Á – Thái Bình Dương. Vùng nuôi tôm sú tập
trung chủ yếu ở Châu Á (Fast, 1992) điển hình ở các quốc gia như Thái Lan,
Indonesia, Trung Quốc, Việt Nam, Đài Loan.
Trên thế giới có khá nhiều hình thức nuôi tôm: nuôi quảng canh; nuôi
quảng canh cải tiến; nuôi bán thâm canh; thâm canh và nuôi kết hợ
p với cua,
cá…(Liao, 1989). Và để chọn lựa hình thức nuôi nào phù hợp lại phụ thuộc vào
nhiều yếu tố như : kích thước ao, vốn đầu tư, kinh nghiệm quản lý, cơ sở vật chất
hiện có, thị trường tiêu thụ sản phẩm (Kungvankij và Kongkeo, 1988).
Lịch sử phát triển nghề nuôi tôm ở nhiều nước nhất là vùng Đông Nam Á
cho thấy vấn đề thiệt hại do dịch bệnh trong nghề nuôi tôm là đi
ều không thể
tránh khỏi, tùy theo mô hình nuôi, sau một thời gian khai thác thì nhất định bệnh
sẽ xuất hiện (Nguyễn Mạnh Hùng, 1994). Trung Quốc là nước có sản lượng tôm

cao nhất thế giới, năm 1992 là 150.000 tấn; năm 1993 do bệnh dịch thiệt hại 50%
tổng sản lượng. Đài Loan năm 1987 với đỉnh cao sản xuất 45.000 tấn tôm sú
nuôi, năm liền sau đó sản lượng giảm xuống còn 30.000 tấn do tôm bị dịch bệnh.
Indonesia cũng bị thiệt hại nặng nề do môi trường xấu và do dịch bệnh. Trong


6
quý 3 năm 1994, sản lượng tôm xuất khẩu của Indonesia sang Hoa Kỳ giảm 38%.
Thái lan năm 1990, thiệt hại hơn 20.000 ha nuôi thâm canh tôm sú vì nước bị ô
nhiễm bởi chất thải công nghiệp và bị bệnh. Năm 1994, tôm nuôi ở Thái Lan bị
chết gần 30.000 ha mức thiệt hại lên đến 40 triệu USD (Phan Lương Tâm, 1994).
1.2 Tình hình dịch bệnh tôm ở Việt Nam
Bờ biển Việt Nam trải dài 3.260 km từ Quảng Ninh đến Kiên Giang, là
tiềm năng to lớn cho nuôi tr
ồng thủy sản nước mặn và nước lợ. Nghề nuôi tôm ở
nước ta mà đặc biệt là ở đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) cũng chỉ mới phát
triển mạnh mẽ vào cuối những năm 1980 với sự phát triển của một số các hình
thức nuôi như quảng canh cải tiến và bán thâm canh. Năm 1997, mô hình nuôi
tôm công nghiệp ở quy mô nông hộ 700 – 1500 m
2
/ao (TS. Nguyễn Văn Hảo,
1998) được làm thí điểm tại Trà Vinh đạt năng suất 5 tấn/ha/vụ. Các mô hình
nuôi tôm công nghiệp đạt kết quả cao, tạo tiền đề cho chương trình phát triển
thâm canh hóa nghề nuôi tôm ở Việt Nam trong tương lai
Ngoài các hình thức nuôi tôm giống như trên thế giới: quảng canh, quảng
canh cải tiến, nuôi bán thâm canh và thâm canh thì nước ta cũng đã phát triển các
hình thức nuôi sinh thái : nuôi tôm – rừng, tôm – lúa … Trong đó, hình thức nuôi
quảng canh được áp dụng phổ bi
ến ở Việt Nam, đặc biệt là vùng ĐBSCL (Vũ Đỗ
Quỳnh, 1992).

Tại Việt Nam, từ cuối năm 1993 dịch bệnh tôm đã được báo động trên
toàn quốc, thiệt hại lớn nhất là ở các tỉnh ĐBSCL (Phan Lương Tâm, 1994). Tính
đến 30 – 9 -1994, tổng diện tích nuôi tôm bị chết là 84.850 ha với thiệt hại ước
tính 5.520 tấn trị giá 294 tỷ đồng (Bùi Quang Tề, 1995). Năm 1995, sản lượng
tôm nuôi của Việt Nam là 50.000 tấn gi
ảm còn 30.000 tấn năm 1997 (World
Shrimp Farming, 1997).
Theo TS. Nguyễn Văn Hảo và ctv năm 1997, tác nhân chính gây bệnh ở
tôm nuôi vùng ĐBSCL ngoài nhóm Vibrios còn có sự xuất hiện của hai tác nhân
Virus gây bệnh quan trọng là MBV ( Monodon baculovirus) và WSSV ( White
Spot Syndrome Virus).
Tác nhân gây bệnh Virus hiện nay được xem là một trong những tác nhân
gây bệnh nghiêm trọng nhất, việc chữa trị bệnh do virus không hiệu quả vì hiện


7
nay chưa có một loại thuốc hay hóa chất nào có thể chữa bệnh virus (TS. Nguyễn
Văn Hảo, 2000). Vì vậy cần phải có phương pháp chẩn đoán nhanh chóng, hiệu
quả và chính xác giúp khắc phục xử lý một cách triệt để làm giảm thiểu rủi ro lây
nhiễm và thiệt hại cho nghề tôm.
2 TỔNG QUAN VỀ CÁC BỆNH NHIỄM
2.1 Đặc điểm sinh học và biểu hiện bệnh lí
2.1.1 Bệnh đốm trắng (WSSV –White spot syndrome virus)
Phân bố: Bệnh đốm trắng WSSV xuất hiện đầu tiên tại Bắc Á vào năm
1992 – 1993, đồng thời nhanh chóng lan rộng khắp khu vực Châu Á và thế giới
nhất là các nước có hình thức nuôi tôm công nghiệp thâm canh. Bệnh đốm trắng
được thông báo đầu tiên ở Trung Quốc, trong các đầm nuôi tôm sú với tỷ lệ chết
cao (Chen, 1989). Năm 1992 -1993, bệnh đố
m trắng xuất hiện ở Thái Lan (Flegel
T.W, 1996). Năm 1993, Nhật Bản nhập tôm Trung Quốc về nuôi cũng đã xuất

hiện bệnh đốm trắng. Năm 1994, đã có các báo cáo từ Ấn Độ, Trung Quốc,
Indonesia, Nhật Bản và Thái Lan, tìm ra nguyên nhân gây bệnh đốm trắng.
Trong những năm gần đây bệnh đốm trắng thường xuyên xuất hiện trong
các khu vực nuôi tôm ven biển ở Việt Nam, hầu hết ở các tỉnh khi tôm bị nhiễ
m
bệnh đốm trắng thì tôm chết hàng loạt và gây tổn thất lớn cho nghề nuôi.
2.1.1.1 Phân loại
Trước năm 2002, có ba chủng Baculovirus gây bệnh đốm trắng hay còn
gọi là virus Trung Quốc. Tùy từng nước nghiên cứu mà chúng có tên gọi và kích
thước khác nhau (Theo Bùi Quang Tề, 2003).
Virus gây bệnh đốm trắng WSSV đầu tiên được phân loại thuộc họ
Baculovirdae (Francki và ctv, 1991). Tuy nhiên, trong những phân tích trình tự
hệ gen WSSV gần đây cho thấy chúng mã hóa một số loại protein không giống
protein của Baculovirus
nhờ protein ribonucleotide reductase (RR1 và RR2)
(Van Hulten và cvt, 2000). Protein capsid (VP26, VP28) (Van Hulten và ctv,
2000) của WSSV không giống bất kì một protein nào trong database. Ngoài ra,
trình tự nucleotide toàn bộ hệ gen WSSV cho thấy nhiều gen không giống gen
của virus nào khác (Van Hulten và ctv, 2001; Yang và ctv, 2001). Sự khác biệt


8
về genome và phổ kí chủ rộng của WSSV ( Flegel, 1997) chứng tỏ WSSV là đại
diện cho một họ virus mới (Van Hulten và ctv, 2000).
Trong hội nghị virus học quốc tế lần thứ 12 (Paris, 2002), các tác giả Just
M. Vlak, Jean-Robert Bonami, Tim W.Flegel, Guang-Hsiung Kou, Donald V.
Lightner, Chu-Fang Lo, Philip C. Loh và Peter J.Walker đã phân loại virus gây
hội chứng đốm trắng thành một giống mới Whispovirus thuộc họ Nimaviridae.
2.1.1.2 Hình thái
Là vi rút có kích thước lớn nhất trong các loại virus động vật. Các

virion có dạng khá đối xứng, hình dạng biến thiên t
ừ elip đến hình thoi.
Virus dạng hình trứng, kích thước 120 x 275 nm, có phần phụ ở một đầu
kích thước 70 x 300 nm (Woongteerasupaya C. Và ctv, 1995; Wang và ctv,
1995).

Hình 1: Hình thái WSSV
Virus đốm trắng tồn tại trong môi trường:
Độ mặn: 5- 40 ppt
pH: 4 -10
Nhiệt độ: 0 -79Oc




9
2.1.1.3 Cấu trúc protein và vật chất di truyền

Hình 2: Cấu trúc di truyền của WSSV
Hạt virus cấu trúc bao gồm 3 phần: bao màng (envelope), nucleocapside
và vật chất di truyền. Virion chứa 5 protein chính : VP28, VP26, VP24, VP29,
VP15 có trọng lượng phân tử tương ứng là 28, 26, 24, 19 và 15 kDa. Các
thử nghiệm trung hòa in –vivo sử dụng các kháng thể kháng các protein cấu trúc
khác nhau cho thấy có sự trì hoãn sự chết của tôm. Điều này chứng tỏ rằng VP28,
VP68, VP281, VP466 và VP24 có lẽ có vai trò quan trọng trong sự xâm nhập của
virus.
Hiện nay virus WSSV
đã được giải mã trình tự hoàn chỉnh (Yang và ctv,
2001).
2.1.1.4 Phổ ký chủ

Phổ ký chủ rộng, chủ yếu là các loại tôm: P. monodon, P. vannamei, P.
indicus, P. Japonicus, … các loại cua và các động vật thủy sinh khác (theo V.A.
Graindorge và T.W. Flegel, 1999).
2.1.1.5 Cơ chế xâm nhiễm
Khi xâm nhập vào tôm sẽ cư trú ở nhiều bộ phận của tôm như nội bì, mô,
dạ dày, mang, buồng trứng, tinh hoàn, hệ thống thần kinh, mắt, chân bơi và các
bộ phận khác. Sau khi xâm nhập vào tế bào chủ
, virus tiến hành tự nhân bản dựa
trên cơ sở vật chất và nguyên liệu của tế bào. Quá trình này làm cho số lượng
virus tăng lên rất nhanh, đồng thời làm thay đổi hoạt động bình thường của tế
bào. Virus tiếp tục phát triển đến giai đoạn làm vỡ nhân và giết chết tế bào, sau
đó virus được phóng thích ra môi trường nước, đi tìm ký chủ khác và tiếp tục
xâm nhập, tấn công. Nếu như virus không tìm được ký chủ mới thì nó ch
ỉ có thể
sống tự do trong nước khoảng 24 giờ.


10
Những nghiên cứu về nuôi cấy mô in-vitro và những nghiên cứu trên
hậu ấu trùng tôm (postlarva) cho thấy chu kỳ nhân lên của WSSV khoảng 20
giờ ở 25
o
C và có thể được chia thành 6 giai đoạn:
 Giai đoạn 1 :
Giai đoạn sớm của sự xâm nhiễm. Những tế bào đã bị
nhiễm virus có nhân phình to hơn bình thường. Một nucleosome virus xuất hiện
trước khi các phần tử của virus được hình thành. Nucleosome bao gồm những
protein của virus được tổ chức thành những mảnh hình sợi. Trong tế bào chất,
lưới nội chất phát triển to với một lượng lớn ribosome tự do.
 Giai đoạn 2 :

Trong nhân, những vật liệu hình sợi kích thích sự hình
thành những màng tròn, những màng này sau đó bao bọc lõi virus và bắt đầu quá
trình đóng gói. Trong giai đoạn này, thể vùi loại Cowdry-A xuất hiện ở giữa
vùng virogenic stroma (nơi DNA của virus phân chia và hình thành virus mới) và
vùng marginated chromatin giàu điện tử (là vùng chứa mạng lưới phức tạp trong
nhân). Nhân phình to và tròn.
 Giai đoạn 3 :
Trong nhân, nucleocapsid xuất hiện với mật độ điện tử
thấp và phát triển dần từ một đầu đến đầu kia của nhân. Những thể vùi ở trung
tâm của nhân xuất hiện nhỏ hơn so với thể vùi trong tế bào ở giai đoạn 2 và giàu
điện tử hơn do sự hiện diện của một số lượng lớn phần tử virus. Sau đó, màng
nhân bị phá hủy. Đ
a số các bào quan của tế bào đều bất bình thường, bị phá vỡ
hoặc hình thành những cấu trúc có màng.
 Giai đoạn 4 :
Trong nhân, nucleocapsid được tạo thành hoàn chỉnh từ
12-14 vòng gồm những đơn vị protein hình cầu được sắp xếp chặc chẽ. Mỗi
nucleocapsid có một đầu tròn và một đầu vuông. Nucleocapsid sau đó được bao
bọc hoàn toàn bởi vỏ.
 Giai đoạn 5:
Giai đoạn muộn. Phần tử virus có hình trứng và hình
thành đuôi dài. Đuôi của virus gồm nucleocapsid bên trong được bao bọc bởi vỏ
ở ngoài. Sau đó, nucleocapsid trở nên ngắn hơn, dày hơn và nhiều điện tử hơn do
sự đóng gói của phức hợp DNA-VP15.
 Giai đoạn 6 :
Giai đoạn cuối. Virion trưởng thành có dạng hình
ellip với vỏ trơn bao bọc nucleocapsid giàu điện tử và một đuôi dài. Đôi khi, việc
đóng gói nucleocapsid diễn ra riêng biệt với vỏ bao và sau đó mới được bao bọc

11
bởi vỏ. Trong giai đoạn cuối, những tế bào bị nhiễm virus bị phá vỡ, do vậy sẽ
quan sát thấy một vùng trống trong mô bị tổn thương.
2.1.1.6 Dấu hiệu bệnh lý
Có thể chia bệnh virus đốm trắng thành hai dạng: Dạng 1 là bệnh cấp tính
gây tỷ lệ chết cao trong vòng 2 tuần. Bệnh thường gặp ở các loài tôm:
P.monodon, P. indicus và P. penicilatus. Dạng 2 là bệnh tiềm ẩn, virus đặc biệt
này tồ
n tại trong các loài tôm Macrobrachium sp, các loại cua tự nhiên, tôm hùm
tự nhiên thường không có dấu hiệu bệnh lý rõ rệt.
Tuy nhiên một số nhà khoa học khác đã chia bệnh virus đốm trắng xuất
hiện ở tôm he thành 3 dạng chính theo các dấu hiệu bệnh. Trong dạng I bệnh xuất
hiện (cấp tính và thứ cấp tính) mức độ phá huỷ nhiều ở các mô bị nhiễm virus,
tỷ lệ tôm chết có thể lên đến 90% -100% trong vòng 3 - 7 ngày (Feng Yang và
ctv, 2001) và dấu hiệu bệnh lý thể
hiện rõ nhất là có thể vùi màu hồng đến màu
nâu đỏ (Guang Hsiung và cvt, 1998). Bên trong vỏ giáp xác xuất hiện những đốm
trắng đường kính từ 0.5 – 2.0 mm. Các đốm trắng này xuất hiện đầu tiên ở vở
giáp xác (Carapace) và đốt bụng thứ V, VI. Gan tụy trương to có màu trắng hoặc
hơi vàng. Tỷ lệ tôm chết từ trung bình đến cao, tỷ lệ mẫu kiểm tra bị nhiễm từ
trung bình đến cao.
Dạng II tôm chết cấp tính, bệnh xuấ
t hiện tác động làm tôm chuyển màu
đỏ, mức độ phá huỷ rất mạnh ở các mô bị nhiễm virus, tỷ lệ tôm chết hầu hết
trong vòng từ 2 – 3 ngày, tỷ lệ mẫu kiểm tra bị nhiễm rất cao. Dạng III bệnh xuất
hiện mãn tính tổ chức mô phá huỷ thấp không có đốm trắng và không có màu đỏ,
tỷ lệ tôm chết kéo dài từ 15 - 28 ngày.

Hình 3: Tôm bệnh xuất hiện các đốm trắng đường kính 0.2 -0.5 mm

12
Bệnh đốm trắng xảy ra kèm theo sự tiêu thụ thức ăn giảm nhanh (Takahashi
và ctv, 1994) do tôm có biểu hiện bỏ ăn, lờ đờ kém hoạt động, thường có khuynh
hướng cặp mé bờ, sau đó chết và chìm xuống đáy (Y.G. Wang và ctv, 1998). Khi
nhiễm bệnh thì có dấu hiệu trương nhân trong tế bào cảm nhiễm ( Chou và ctv,
1995).
2.1.1.7 Phương thức lây nhiễm bệnh
Bệnh đốm trắng lây truyền chủ yếu theo chiều ngang. Virus lây từ giáp
xác khác nhiễ
m bệnh đốm trắng từ môi trường bên ngoài ao hoặc ngay trong ao
nuôi tôm. Bệnh đốm trắng không có khả năng lây lan theo đường thẳng đứng, vì
noãn bào (trứng) khi phát hiện chúng bị nhiễm virus đốm trắng thì chứng không
chín được (Bùi Quang Tề, 2003). Nhưng trong quá trình đẻ trứng của tôm mẹ có
thể thải ra các virus đốm trắng từ trong buồng trứng của chúng, do đó ấu trùng
tôm dễ dàng nhiễm virus ngay từ giai đoạn sớm.
2.1.2 Bệnh còi (MBV –Monodon Baculovirus)
Phân bố
: Bệnh MBV được phát hiện đầu tiên năm 1980 ở đàn tôm sú
(Penaeus monodon) đưa từ Đài Loan đến nuôi ở Mehico (Lightner và ctv, 1981 -
1983). Tiếp theo các nhà nghiên cứu đã phát hiện bệnh MBV có xuất phát từ Đài
Loan, Philippines, Malaysia, Polynesia thuộc Pháp, Singapore, indonesia, Thái
Lan, Trung Quốc… Ở Đài Loan bệnh MBV có liên quan đến thiệt hại nghiêm
trọng cho nghề nuôi tôm sú năm 1987 và 1988 ( Chen và ctv, 1989).
Theo các tài liệu nghiên cứu của Đỗ Thị Hòa và ctv, tại khu vực Châu Á-
Thái Bình Dương đã gặp virus này trên tôm sú nuôi ở Trung Quốc, Triều Tiên,
Đ
ài Loan, Malaysia, Philippine, Singapore, Thái Lan, Srilanka, Ấn Độ,
Indonesia, Australia và Việt Nam.
Tại khu vực Trung Đông đã gặp MBV trên tôm nuôi he ở: Kuwait, Oman,

Israel
Tại miền của miền Tây châu Phi đã tìm thấy trên tôm he nuôi ở: Gambia,
Kenya
Tại châu Mỹ: Hawaii, Mexico, Ecuador, Brazil và một số vịnh ở phía
Nam của nước Mỹ cũng đã phát hiện ra virus này.


13
Ở Việt Nam tháng 10-11/1994 Bùi Quang Tề lần đầu tiên đã nghiên cứu
về mức độ nhiễm bệnh MBV trên tôm sú nuôi các tỉnh ven biển phía Nam : tôm
sú nuôi nhiễm virus MBV khá cao; tôm thịt ở Minh Hải: 50%-85,7%; ở Sóc
Trăng 92,8%; tôm giống ở Bà Rịa -Vũng Tàu 5,5% -31,6%; tôm giống Nha
Trang 70%-100%. Bệnh MBV là một trong những nguyên nhân gây chết tôm ở
các tỉnh phía Nam năm 1993-1994. Tiếp theo Đỗ Thị Hoà từ tháng 11/1994-
7/1995 cũng đã nghiên cứu bệnh MBV trên tôm sú nuôi ở các tỉnh Nam Trung
Bộ, kết quả cho thấy: tỷ
lệ nhiễm virus MBV ở ấu trùng tôm sú là 33,8%, tôm
giống là 52,5%, tôm thịt là 66,5%. Năm 1995 sơ bộ điều tra bệnh tôm sú nuôi ở
các tỉnh phía Bắc đã nhiễm mầm bệnh MBV ở các tỉnh : Nghệ An, Thanh Hoá,
Hải Phòng. Vì những tỉnh này đều lấy tôm giống từ Nha Trang ra nuôi (Bùi
Quang Tề và ctv, 1997).
2.1.2.1 Phân loại
 Tên khoa học: Penaeus monodon nucleopolyhedro virus.
 Họ: Baculoviridae
 Loài: Monodon baculovirus
Theo tài liệu của Đỗ Thị Hòa, hiện nay đã có 2 chủng virus này
được
nghiên cứu và mô tả: MBV ( Monodon baculovirus ) từ tôm P. monodon vùng
Thái Bình Dương, một chủng khác có tên PmSNPV (Singly enveloped nuclear
polyhedrosis virus in Penaeus monodon) được phân lập từ P.monodon, P.

plebelus, P. merguiensis ở Úc.
2.1.2.2 Hình thái
Tác nhân Baculovirus monodon, cấu trúc nhân ( acid nucleoic ) là ds
ADN, có lớp vỏ bao, hình que tồn tại dưới dạng thể vùi. Theo J.Mari và ctv, 1993
thì chủng MBV của tôm sú từ Ấn Độ Thái Bình Dương có kích thước nhân 42 ±
3 x 246 ± 15 nm, kích thước vỏ bao 75 ± 4 x 324 ± 33 nm. Chủng PMV của tôm
( P. plebejus, P. monodon, P. merguiensis) từ Úc có kích thước nhân 45 – 52 x
260 – 300 nm, kích thước vỏ bao 60 x 420 nm.



14


Hình 4: Hình thái thể vùi của MBV
2.1.2.3 Cấu trúc protein và vật chất di truyền
Hiện nay trình tự bộ gen của MBV vẫn còn đang được nghiên cứu. Tuy
nhiên người ta đã nghiên cứu được đoạn polyhedrin gen của MBV với kích thước
khoảng 1588 bp (GenBank, EU 251062) chứa 1359 nucleotide mã hóa cho 452
amino acid và có trọng lượng phân tử ước khoảng 50.6 kDa







Hình 5 : Cấu trúc di truyền của MBV
Virus được bao bọc trong lớp thể vùi kích thước 5µm và được b
ảo

vệ trong lớp polyhedin để tránh các tác hại của tia UV.
2.1.2.4 Phổ ký chủ
Chủ yếu gây xâm nhiễm trên tôm sú (P. monodon) ngoài ra một số
tôm khác cũng có khả năng nhiễm bệnh như: P. merguiensis, P. semisulcatus,
P. kerathurus, P. plebejus, P. indicus, P. penicillatus, P. esculentus, P.
vannamei.


15
MBV có thể nhiễm ở hầu hết các giai đoạn khác nhau của tôm, bắt đầu từ
giai đoạn Zoea 2, riêng giai đoạn Nauplius có tính trơ với virus (Lightner, 1996).
Liao,1999 đã thông báo rằng, quần đàn tôm mẹ bắt từ biển của Đài Loan 1987
nhiễm MBV 33%, đến năm 1989 nhiễm 100%, thường gặp nhiễm 85%.
Natividad 1992 cho biết, ở Philippine đến năm 1992 rất khó tìm được một đàn
Postlarvae của tôm sú không nhiễm MBV.
Kết quả nghiên cứu
ở Việt Nam cho thấy, tại các tỉnh miền Trung có
khoảng 70% bể Post có MBV(+). Khi đưa Post xuống ao đất để ương thành tôm
giống, tỷ lệ nhiễm MBV trên đàn giống tăng cao, gần 90% ao ương nhiễm MBV.
Tôm bố mẹ dùng trong các trại sản xuất tôm sú giống ở Miền Trung bị nhiễm
MBV từ 60% - 70% ( Đỗ Thị Hòa, 2000).
2.1.2.5 Cơ chế xâm nhiễm
Ký sinh ở tế bào biểu bì mô hình ống của gan tụy và tế bào bi
ểu bì phía
trước ruột giữa (Lightner và Redman, 1981). Virus tái sản xuất bên trong nhân tế
bào bao gồm các giai đoạn :
 Giai đoạn 0 (tiềm ẩn) : Sau khi tế bào nhiễm MBV là giai đoạn sớm
của tế bào chất biến đổi.
 Giai đoạn 1 : Nhân tế bào sưng nhẹ, các nhiễm sắc thể tan ra và di
chuyển ra sát màng nhân. Tế bào chất mất dần chức năng của chúng và hình

thành giọt mỡ. Virus bắt đầu gây ảnh h
ưởng.
 Giai đoạn 2: Nhân sưng nhanh, số lượng virus tăng nhanh, xuất hiện
thể ẩn (Occlusion bodies) trong nhân.
 Giai đoạn 3: Tế bào bị bệnh, nhân tăng lên gấp 2 lần, đường kính bình
thường và tăng 6 lần về thể tích. Bên trong nhân có 1 đến nhiều thể ẩn, trong
thể ẩn chứa đầy các virus. Các virus phá huỷ các tế bào ký chủ, tiếp tục di chuyển
sang tế bào khác hoặc theo chất bài tiết ra ngoài môi trường, tạo thành virus tự
do
tồn tại trong bùn và nước.



16


Hình 6 : Sự xâm nhiễm của virus MBV trong nhân tế bào gan tụy khi quan sát
bằng H&E (Trích từ T.W. Flegel, 2006)
2.1.2.6 Dấu hiệu bệnh lý
Tôm có màu tái hay xanh tái, xanh xẫm, tôm giảm ăn, hoạt động yếu và
sinh trưởng chậm. Phần phụ và vỏ kitin có hiện tượng hoại tử, có nhiều sinh vật
bám như ký sinh trùng đơn bào, tảo và các vi khuẩn dạng sợi. Gan tụy teo, có màu
trắng hơi vàng thối rất nhanh. Tôm yếu dần, dạt vào bờ, bơi trên tầng m
ặt chết rải
rác 3-7 ngày, tỉ lệ tôm chết cao đến 70-100% .

Hình 7: Tôm bệnh còi cọc, chậm lớn và có nhiều sinh vật bám kí sinh
2.1.2.7 Phương thức lây nhiễm bệnh
Khi nghiên cứu về đặc điểm lan truyền của MBV, Paynter và nhiều tác giả
khác đã khẳng định rằng : Virus này có thể lây nhiễm theo 2 trục, trục dọc và trục

ngang. Tôm mẹ mang virus, khi tham gia sinh sản, MBV theo phân tôm mẹ vào
môi trường bể đẻ, bể ấp, chúng sẽ xâm nhập vào cơ thể ấu trùng tôm qua con
đường thức ăn, bắ
t đầu từ giai đoạn Zoea, khi ấu trùng sử dụng thức ăn từ bên


17
ngoài. Ngoài ra, MBV cũng lây nhiễm theo trục ngang rất mạnh. Liao và ctv
thông báo rằng, MBV có thể nằm trong các thể ẩn (occlusion bodies), theo phân
tôm bị nhiễm, ra ngoài môi trường, nằm ở đáy ao trong nhiều năm và là nguồn
lây nhiễm cho tôm khỏe theo trục ngang.
2.1.3. Bệnh teo gan tụy (HPV –Hepatopancreatic Parvovirus)
Phân bố: Theo các nghiên cứu của TS. Đỗ Thị Hòa và ctv cho thấy bệnh
HPV đã được quan sát thấy trên tôm he nuôi và tôm he tự nhiên ở Australia, trên
tôm nuôi ở 1 số vùng ven biển như : Trung Quốc, Nam Triều Tiên, Đài Loan,
Philippines, Malaysia, Indonesia, Singapore, Kenya, Kuwait, Israel và Việt Nam.
HPV được xem là một virus đặc thù của tôm he châu Á, Phi và Úc, bởi nó
được phát hiện ở châu Á và tất cả những thông báo về tôm nhiễm HPV đều xuất
phát từ khu vực châu Á– Thái Bình Dương. Tuy vậy, năm 1997 người ta đã phát
hiện HPV trên tôm he nuôi ở Mỹ do nguồn giống nhập từ châu Á. Đặc biệt là P.
vannamei, một loài tôm he đặc thù châu Mỹ cũng đã bị nhiễm bệnh virus này.
Hiện nay, người ta cho rằng HPV có sự phân bố địa lý mang tính quốc tế.
Trên tôm sú nuôi ở Việt Nam, khi kiểm tra mức độ cảm nhiễm MBV bằng
phương pháp mô học với thuốc nhuộm Hematoxylin và Eosin, cũng phát hiện
được một số thể vùi rất đặc thù của HPV. Đặc biệt, trong vài năm gần đây tại
Việt Nam, xuất hiện hội chứng teo gan xảy ra ở tôm sú thương phẩm vào mùa có
nhiệt độ cao, có một vài mẫu trong số nhiều mẫu tôm bị bệnh teo gan đã thu
được, cho thấ
y sự nhiễm HPV ở cường độ cao. Đây là vấn đề đang được nghiên
cứu tiếp theo.

2.1.3.1 Phân loại
Theo OIE
¾ Tên khoa học: Penaeus monodon hepatopancreatic parvovirus
¾ Họ: Parvoviridae
¾ Chi: Parvovirinae
¾ Loài: Parvovirus
¾ Chiều dài gene: 3.9 -5.9 kb




18
2.1.3.2 Hình thái
Theo báo cáo của Bùi Quang Tề và ctv, HPV là virus có cấu trúc hình
khối 20 mặt, không có màng bao với kích thước nhỏ khoảng 22 – 24 nm.
Genome là ssDNA thẳng với kích thước gene từ 4 -6 kb.
2.1.3.3 Cấu trúc protein và vật chất di truyền
Genome có thể bao gồm các gen chồng lấp (overlapping genes) mã hóa
cho ít nhất 2 polypeptides. Khi nhuộm mô gan tụy bằng H&E cho thấy xuất hiện
các thể vùi nội nhân ưa base (basophilic intranuclear inclusion bodies) thường ở
dạng đơn có đường kính khoảng 5-11µm. Các thể vùi này bao gồm các hạt virion
được sắp xếp ngẫu nhiên hay trong trạng thái kết tinh (para-crystalline). Dấu hiệu
này thường được tìm thấy trong tất cả các loại HPV được báo cáo trên tôm.
Một công bố hiện tại mô tả
trình tự genome hoàn chỉnh (HPV-Thai) với
kích thước khoảng 6.3kb có chứa 3 vùng ORF. ORF1 và ORF2 mã hóa cho
protein không cấu trúc giả định NS-1 (chủ yếu) và protein cấu trúc giả định NS-2
(thứ yếu), còn ORF3 mã hóa cho một protein capsid (VP) (Sukhumsirichart W. et
al., 2006).

Hình 8: Cấu trúc bộ gene của HPV với 3 khung đọc mở
2.1.3.4 Phổ ký chủ
Theo OEI virus này cảm nhiễm tự nhiên và gây bệnh ở một số tôm:
Penaeus monodon, P. esculentus, P. chinensis, P. semisulcatus, P. indicus, P.
penicillatus, P. schmitti, P. vannamei, P. stylirostris. Ngoài ra còn tìm thấy ở tôm
càng xanh Macrobrachium rosenbergii.
Những chủng được cảm nhiễm nhân tạo: P. monodon




19
2.1.3.5 Cơ chế xâm nhiễm
Dấu hiệu mô học đặc thù của virus này cho thấy HPV cảm nhiễm trong
nhân tế bào gan tụy, hiện dưới dạng một thể vùi (inclusion body) trong nhân tế
bào đã phình to . Sau khi xâm nhập vào tế bào chủ, virus tiến hành tự nhân bản
dựa trên cơ sở vật chất và nguyên liệu của tế bào. Quá trình này làm cho số lượng
virus tăng lên rất nhanh, đồng thời làm thay đổi hoạt động bình thường của tế
bào. Thể vùi này có d
ạng hình cầu, hoặc hơi bầu dục, nhưng không chiếm hết thể
tích của của nhân đã phình to, thường tạo nên 1 vòng sáng xung quanh. Trong
các tế bào bị cảm nhiễm virus, hạch nhân cũng phình to hơn các tế bào bình
thường và bị thể vùi đẩy vào 1 góc, giáp với màng nhân và dính liền với thể vùi.

Hình 9: Tế bào gan tụy dưới kính hiển vi điện tử sau khi được nhuộm H & E

2.1.3.6 Biểu hiện bệnh lý
Tôm có màu sẫm, mang đỏ hay đen, vỏ có nhiều sinh vật đơn bào và vi
sinh vật bám. Gan tụy teo lại chỉ bằng 1/3 thể tích gan bình thường, nếu dùng tay
bóp mạnh thì thấy gan tôm rất cứng và chai. Khi nhiễm bệnh tôm có màu vàng

hoặc trắng nhợt, rất tanh, sinh trưởng chậm, kém ăn, giảm hoạt động, làm đục cơ
tôm chết dần 3 - 7 ngày từ 70% - 100%. Tuy nhiên tỷ lệ chết đã thông báo có thể
cao ở giai đoạn
đầu của thời kỳ ấu niên (Juvenile) với tỷ lệ chết tích lũy 50% –
100% trong 4 tuần ( Bùi Thị Hòa và ctv, 2004).





20








Hình 10: Tôm bệnh có màu trắng nhạt hoặc xẫm, còi cọc.

2.1.3.7 Phương thức lây nhiễm bệnh
Theo Donald V. Lightner 1996, khi nghiên cứu mức độ nhiễm HPV của 4
trại giống của Singapore, mức độ nhiễm rất cao (>50%), gặp ở 2 trại sản xuất
Postlarvae bằng cách cho tôm mẹ sinh sản trong điều kiện nhân tạo. Ngược lại,
mức độ nhiễm rất thấp ở 2 trại ương tôm vớt giống từ tự nhiên theo thủy triều (<
15%). Điều đó cho thấ
y, HPV lây truyền chủ yếu theo trục dọc từ tôm bố mẹ
sang đàn con, có lây nhiễm theo trục ngang, từ con này sang con khác, nhưng
không phải là chủ yếu.

3 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BỆNH
3.1 Phương pháp mô bệnh học
Phương pháp mô học giúp chẩn đoán bệnh dựa trên những biến đổi bất
thường của cấu trúc tế bào, mô cơ quan. Phương pháp mô học được tăng cường
độ nhạy phát hiện bằng cách cố định mẫu, làm tiêu bản mô học, nhuộm với
Hematoxylin và Eosin, sau đó quan sát thể vùi (inclusion body) bên trong nhân tế
bào. Ngoài ra, phương pháp mô học còn được thực hiện bằng cách tạo mẫu ép
mỏng, cố đị
nh trong methanol, nhuộm với Giemsa và tìm sự xuất hiện của thể
vùi trong nhân. Hiện tượng nhân phồng to là một chỉ thị của sự nhân bản và tích
lũy virion bên trong nhân và là dấu hiệu đặc trưng của bệnh.
Ở hội chứng bệnh đốm trắng, các thể ẩn ưa kiềm hiện diện trong nhân của
các tế bào biểu bì, ruột trước, mang và hệ bạch huyết, còn ở bệnh còi và bệnh teo
gan tụy các thể
ẩn lại hiện diện trong nhân của các tế bào biểu bì mô hình ống
của gan tụy và tế bào biểu bì phía trước ruột giữa.


21
Cần lưu ý rằng phương pháp mô học không có tính đặc hiệu. Sự hình
thành thể vùi là chỉ thị của sự hiện diện số lượng lớn của virion, không phân biệt
được loại vi rút. Để khẳng định thể vùi là từ các virion của WSSV, MBV và HPV
cần phải khảo sát và xác định các đặc tính hình thái, cấu trúc của virus bằng kính
hiển vi điện tử. Mặt khác, sự hình thành thể vùi là hệ quả của sự nhân bản củ
a vi
rút tạo các virion mới bên trong nhân. Như vậy, phương pháp này chỉ áp dụng
được cho trường hợp đã phát bệnh, không áp dụng được khi vi rút còn ở dạng
tiềm ẩn trong bộ gen của tế bào chủ.
3.2. Phương pháp lai
Các phương pháp lai như Dot blot, Southern blot, lai tại chỗ (in situ)

có thể được sử dụng để phát hiện chuyên biệt cho sự hiện diện của WSSV, MBV,
HPV. Các phương pháp này đều dựa trên nguyên tắc chung là dùng mẫu dò
chuyên biệt của virus để dò tìm s
ự hiện diện của virus trên mẫu tôm nghi nhiễm.
Sự bắt cặp của mẫu dò với DNA của virus trên mẫu tôm cho phép kết luận mẫu
tôm bị nhiễm bệnh.
3.3. Phương pháp miễn dịch
Dựa trên phản ứng đáp ứng miễn dịch giữa kháng nguyên và kháng thể để
xác định bệnh do virus. Thông thường các kháng thể này được sản xuất từ chuột
hoặc thỏ đã được tiêm kháng nguyên là vi rút cần xác
định hoặc một loại protein
vỏ của vi rút. Kháng thể thu được từ huyết thanh chuột là kháng thể đa dòng.
Hiện nay trên thế giới đã có những báo cáo về kháng thể đa dòng
và đơn dòng của virus, tuy nhiên các phương pháp huyết thanh học vẫn còn giới
hạn trong các phòng thí nghiệm để chẩn đoán bệnh vì giá rất đắt và hạn chế về
thời gian. Hướng giải quyết là phải tìm cách cho kháng thể có thể phản ứ
ng với
virus ở dạng nguyên thể để phát hiện nhanh virus trên các mẫu bị nghi ngờ là
nhiễm.
3.4. Phương pháp PCR
Phương pháp PCR (Polymer Chain Reaction) do Kary B. Mulis cùng các
cộng sự phát minh năm 1985. Đây là một kĩ thuật tạo dòng invitro cho phép
khuếch đại đặc trưng một đoạn ADN nằm giữa hai trình tự oligonucleotide đã
biết trước mà không cần sự hiện diện của tế bào. Hai trình tự oligonucleotide này


22
được gọi là mồi xuôi ( forward primer) và mồi ngược (reverse primer). Bằng
cách lặp lại 30 - 40 chu kỳ PCR, số lượng bản sao DNA mục tiêu ban đầu có thể
được tăng lên hàng triệu lần và trở nên có thể phát hiện thành vạch DNA khi điện

di trên gel agarose (AGE).
Phương pháp này có tính đặc hiệu tương tự như phương pháp lai phân tử
nhưng có độ nhạy cao hơn. Do phương pháp này được dựa trên sự nhân bản sao
của gen virus nên có thể được dùng để chẩn đoán s
ự hiện diện của mầm vi rút
(chưa hoạt động, chưa nhân bản) trong tôm. Vì vậy phương pháp này rất thích
hợp cho việc chẩn đoán mầm bệnh ở tôm bố mẹ hoặc tôm giống (PL15).
Phương pháp PCR được sử dụng phát hiện WSSV, MBV, HPV bằng cách
sử dụng DNA tách chiết từ mẫu tôm nghi bệnh làm khuôn cho phản ứng PCR và
cặp mồi được thiết kế ở hai đầu của một đo
ạn DNA chuyên biệt trên từng virus.
Điện di trên gel agarose để phát hiện vạch PCR dựa trên kích thước của đoạn
DNA được khuếch đại.
Ngày nay, dựa trên kỹ thuật PCR cổ điển, người ta đã phát triển nhiều
kỹ thuật chẩn đoán nhanh và chính xác hơn đang được nhiều phòng thí nghiệm
trên thế giới sử dụng, cụ thể:
3.4.1 Phương pháp MULTIPLEX –PCR
Phản ứng multiplex PCR là một dạng thay đổ
i của phản ứng PCR thông
thường, ở đó hai hoặc hơn hai locus được nhân lên đồng thời trong cùng một
phản ứng hay nói cách khác Multiplex –PCR là phản ứng PCR mà chỉ cần trong
một phản ứng ta có thể xác định đồng thời được nhiều tác nhân vi sinh vật dựa
trên nguyên lí sử dụng nhiều cặp mồi đặc hiệu cho các đoạn DNA đích của
chúng. Từ các mô tả đầu tiên về nó năm 1988, thì cho đến nay phương pháp này
đ
ã từng được áp dụng thành công trong rất nhiều lĩnh vực thí nghiệm DNA gồm
có phân tích mất đoạn, đột biến, đa hình hoặc trong các phương pháp định lượng
và kỹ thuật PCR sao chép ngược (RT-PCR).
3.4.2 Kỹ thuật nested PCR.

23

Hình 11: Kĩ thuật Nested PCR
Là phản ứng PCR có hai giai đoạn : giai đoạn đầu là PCR dùng một
cặp mồi ngoài (gọi là PCR vòng ngoài) để khuếch đại một đoạn DNA trong đó
có chứa các trình tự đặc hiệu muốn tìm, sau đó dùng sản phẩm PCR vòng ngoài
này làm khuôn cho vào ống PCR có cặp mồi trong (gọi là PCR vòng trong) để
khuếch đại trình tự muốn tìm này. Ngoài nested PCR, còn có semi-nested PCR
hay hemi-nested PCR là biến thể của nested PCR với một mồi vòng ngoài được
dùng làm một trong hai mồi c
ủa cặp mồi vòng trong. Ưu điểm của nested PCR
(và cả semi-nested PCR hay hemi-nested PCR) là làm tăng độ nhạy của PCR khi
mà mồi cho trình tự đặc hiệu muốn tìm có độ nhạy thấp (như trong các trường
hợp phải dùng mồi có degenerative base). Tuy nhiên nhược điểm lớn nhất của
phương pháp này là nguy cơ ngoại nhiễm cao do phải mở tube PCR vòng trong
để cho sản phẩm vòng ngoài vào.
Kỹ thuật này sẽ có nhiều đoạn sản phẩ
m DNA hơn là kỹ thuật PCR cổ
điển, số đoạn DNA được phát hiện sẽ nói lên tính định lượng tương đối của phản
ứng. Kỹ thuật này được Lo et al công bố vào năm 1996.
3.4.3 Kỹ thuật real-time PCR
Kỹ thuật này không phân tích sản phẩm PCR trên bản thạch: agarose
hay polyacrylamid nên không cần sử dụng Ethidium bromide (là chất độc
có thể gây đột biến). Kỹ thuật này làm giảm thời gian đổ bảng thạch và th
ời gian
chạy điện di. Thay vì dùng kỹ thuật điện di để phát hiện ADN người ta thiết kế
một hệ thống quang học ngay trên máy PCR để đo cường độ ánh sáng sinh ra
tương ứng với lượng sản phẩm PCR được khuếch đại. Có nhiều cách phát hiện
lượng ánh sáng (màu) sinh ra.

24

3.4.3.1 Sử dụng SYBR GREEN

Hình 12: Real time PCR sử dụng SYBR GREEN

Đặc tính của chất SYBR GREEN là phát huỳnh quang khi nằm chen
vào sợi DNA đôi. Số lượng sản phẩm DNA sinh ra càng nhiều thì cường độ
huỳnh quang càng cao. Tuy nhiên phương pháp dùng SYBR GREEN gặp trở
ngại vì sau phản ứng có nhiều đoạn mồi bắt cặp với nhau thành những sợi ngắn
DNA đôi dài 20-40 bp. Do đó khi thiết kế phản ứng chúng ta phải tính toán
lượng DNA vừa đủ cho các đoạn mồi không tự bắt cặp v
ới nhau.
3.4.3.2 Dùng đoạn dò TaqMan (TaqMan probe)

Hình 13: Real time dùng đoạn dò TaqMan probe

Đoạn dò TaqMan Probe là đoạn oligonucleotide có trình tự bổ xung
với trình tự của một đoạn DNA trên mạch khuôn, giới hạn bởi 2 trình tự bổ sung
với trình tự của hai 2 đoạn mồi, trong phản ứng PCR. Hai đầu của đoạn dò được
gắn hai chất gọi là reporter và quencher, khi reporter và quencher ở gần nhau thì
quencher làm mất màu của reporter, khi reporter và quencher ở xa nhau thì
reporter phát huỳnh quang. Ở mỗi chu kỳ PCR, trước hết là sự gắn vào mạ
ch


25
khuôn của đoạn dò và hai đoạn mồi. Sau đó, Taq DNA polymerase sẽ tổng hợp

mạch DNA mới dựa trên khuôn và đoạn mồi, đồng thời nó cũng phân cắt đoạn
dò ra khỏi mạch khuôn khi nó tiến đến vị trí của đoạn dò, trong quá trình này
quencher sẽ tách ra khỏi reporter nên làm reporter phát quang. Do đó lượng phát
quang sẽ tỉ lệ thuận với lượng DNA khuếch đại lên. Kỹ thuật Real time PCR
dùng đoạn dò TaqMan cho kết qu
ả chính xác và có thể phát hiện nhanh các virus
trên tôm (Kathy và Lightner,1996).
3.5 Phương pháp giải trình tự
Phương pháp này dựa vào sự tổng hợp nhờ enzyme DNA polymerase
mạch bổ sung cho trình tự DNA mạch đơn cần xác định. Đặc trưng của phương
pháp là ngoài 4 loại nucleotide thông thường còn sử dụng thêm bốn loại
dideoxynucleotide là những deoxynucleotide trong đó có nhóm 3’OH được thay
thế bằng H. Điều này khiến các dideoxynucleotide không còn khả năng hình
thành các nối phosphodieste và do đó sẽ làm ngưng quá trình tổng hợp.
M
ỗi loại dideoxynucleotide được đánh dấu bằng một fluorchrome có màu
khác nhau. Như vậy sau quá trình tổng hợp sẽ được phân tách trên gel
polyacrylamide, kết quả sẽ được đọc qua một hệ thống vi tính.
Việc xác định trình tự các virus WSSV, MBV, HPV cũng dựa vào các
nguyên tắc trên.
Phương pháp giải trình tự được báo cáo đầu tiên bởi Frederick Sanger vào
đầu những năm 1970.