Luận văn : XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN VIRUS PMWaV-1 GÂY BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ (Mealybug wilt) TRÊN CÂY DỨA CAYENNE BẰNG PHƯƠNG PHÁP RT-PCR part 3 potx

21
Sether D.M. và Hu J.S., (2002) còn nghiên cứu thấy nếu không có sự hiện
diện của rệp thì dù cây có mang PMWaV cũng không xuất hiện triệu chứng bệnh.
Từ đó, các ông đặt giả thuyết rằng bệnh héo đỏ đầu lá khi phát sinh có liên quan đến
chất độc trong nước bọt của rệp - rệp sáp không chỉ là trung gian lây truyền bệnh mà
còn là nguyên nhân gây bệnh.
Bên cạnh rệp sáp, một loại côn trùng khác cũng ảnh hưởng đến sự lây lan và
phát tán của bệnh héo đỏ đầu lá là kiến. Kiến và rệp có thể sống cộng sinh với nhau.
Kiến ăn các chất mật do rệp tiết ra, đổi lại kiến làm tổ cho rệp và tha rệp đi phát tán
khắp nơi. Nhờ có các tổ do kiến tạo ra, rệp được bảo vệ khá chắc chắn trước sự ảnh
hưởng của thời tiết. Với sự cộng sinh này, kiến thúc đẩy sự phát tán rệp, từ đó làm
lây lan virus gây bệnh. Có 3 loại kiến chính trên những vùng trồng dứa sống cộng
sinh với rệp sáp:
Pheidole megacephala
(kiến đầu to), loài này chiếm ưu thế ở
những vùng có cao độ dưới 700 m;
Iridomyrmex humilis
(kiến Argentina), loài này
sống ở vùng có cao độ trên 600m và ở những vùng đất thấp, khô ráo thì
Solenopsis
germinata
(kiến lửa) là loài nổi trội nhất (Rohrbach K.G. và ctv, 1988)

Hình 2.6: Sự cộng sinh giữa kiến đầu to (
Pheidole megacephala
) và rệp sáp
(Nguồn: t-star/mealybug.htm)



Mealybug


22
* Biện pháp phòng trừ
Để phòng trừ bệnh héo đỏ đầu lá, theo Nguyễn Văn Kế (2002), cần áp dụng
các biện pháp phòng trừ tổng hợp như:
-

Chọn giống từ vùng ít bệnh.
-

Khử chồi bằng cách nhúng vào dung dịch thuốc trừ sâu như: Bi58,
Supracid trong 5 phút, dựng đứng chồi lên cho thuốc tác dụng vào tận nách lá.
-

Trước khi trồng, khử đất bằng Diazon để trừ kiến và các ổ rệp. Làm sạch
cỏ và các cây dứa của mùa trước còn sót lại để hạn chế chỗ ẩn nấp của rệp và
kiến.
-

Trong quá trình dứa phát triển cần theo dõi phun thuốc trừ rệp và kiến.
Tuy nhiên, những biện pháp này chỉ có tác dụng kiểm soát trung gian gây
bệnh, tránh bệnh lây lan, phát tán chứ không thể phòng trừ bệnh triệt để.

2.5 Một số nghiên cứu về bệnh héo đỏ đầu lá trên thế giới và ở Việt Nam
Tuy bệnh héo đỏ đầu lá đã xuất hiện từ rất lâu trên thế giới, nhưng mãi đến
gần đây, các nghiên cứu về bệnh mới đạt được những thành tựu mong muốn.
-

Năm 1989, German và Gunasinghe đã tìm thấy những thể tương tự như
Closterovirus ở những cây dứa bị héo đỏ đầu lá ở Hawaii và đặt tên là Pineapple
closterovirus (PCV).
-

Kháng thể đa dòng (Polyclonal Anti-body – PAb) sản xuất ở Hawaii
(Ullman D.E. và ctv, 1989) và Australia (Wakmen W. và ctv, 1995) được dùng để
phát hiện PCV. Tuy nhiên, PAb cũng tương tác với protein của dứa nên không đem
lại kết quả chính xác với kỹ thuật ELISA.
-

Năm 1996, Hu, Sether và Ullman đã thiết kế kháng thể đơn dòng
(Monoclonal Anti-body) cho PMWaV. Tuy nhiên, thí nghiệm thiếu độ nhạy cần
thiết nên phải dùng những mẫu rễ và lá giàu virus mới thu được kết quả.

23
-

Năm 1997, Hu và cộng sự áp dụng phương pháp TBIA vào việc test PCV
cho thấy kể cả cây có triệu chứng bệnh lẫn cây không có triệu chứng bệnh đều mang
virus.

-

Năm 1998, Hu, Sether và Ullman tìm thấy PMWaV trên rệp sáp
Dysmicoccus brevipes
và
Dysmicoccus neobrevipes
. Xác định được rệp sáp là trung
gian lây truyền PMWaV.
-

Năm 2001, Sether và cộng sự xác định được PMWaV gồm 2 dòng:
PMWaV-1 và PMWaV-2. Bộ gene của chúng đã được giải trình tự và phân loại.
Cũng trong nghiên cứu này, các mẫu dứa thu thập từ 17 nước trên thế giới đã được
test PMWaV với kỹ thuật TBIA và RT-PCR với kết quả 100% các quốc gia trong thí
nghiệm đều có dứa nhiễm PMWaV.
-

Năm 2002, Sether và Hu chứng minh cây mang PMWaV nhưng không có
rệp sáp thì không xuất hiện bệnh. Tác giả đã đề ra giả thuyết độc tố trong nước bọt
của rệp sáp cũng là một tác nhân cần thiết để gây bệnh. Tiến hành xử lý nhiệt để khử
PMWaV trên các chồi dứa mang virus.
Ở Việt Nam, nhìn chung chưa có nhiều nghiên cứu về bệnh héo đỏ đầu lá.
Các thí nghiệm chỉ dừng lại ở bước xác định mối liên quan giữa mật độ rệp với mức
độ bệnh trên dứa và thống kê tình hình phân bố bệnh ở một số địa phương.
-

Theo nghiên cứu của Phan Gia Tân (1984), trên giống dứa Queen, nếu chỉ
có 6% số cây có rệp và mỗi cây có 1 – 10 con rệp thì cây chưa bị nhiễm bệnh hoặc
nhiễm rất nhẹ. Với 90 – 92% cây có rệp và lượng rệp lẫn ấu trùng trên mỗi cây là
51 – 200 con thì cây bị nhiễm bệnh ở mức độ trung bình. Với 92% cây có rệp và mật

độ ấu trùng trên 300 con/cây thì cây bị nhiễm bệnh nặng.
-

Một số thống kê về tình hình bệnh đỏ đầu lá của trường Đại học Nông
Lâm TP.HCM cho thấy bệnh héo đỏ đầu lá xuất hiện ở các vùng được nghiên cứu
với tỷ lệ bệnh cao: ở Bến Lức – Long An, Tân Phước – Tiền Giang và Đức Trọng –
Lâm Đồng, tỷ lệ bệnh lần lượt là 9.3%, 8.1% và 4.1%. Còn tỷ lệ bệnh ở các nông
trường: nông trường Phạm Văn Hai, nông trường Lê Minh Xuân – Tp.HCM và nông
trường Thọ Vực – Đồng Nai lần lượt là 6%, 7% và 12.1% (Phạm Văn Khánh, 2003,
Võ Thị Thúy Huệ, 2003, và Võ Thị Mỹ Hân, 2004).

24
Như vậy, hiện nay bệnh héo đỏ đầu lá đã xuất hiện ở nước ta với mật độ rộng
và tỷ lệ cao, khi gặp điều kiện có thể lây lan thành dịch, gây thiệt hại lớn cho người
trồng. Bên cạnh đó chúng ta vẫn chưa có biện pháp phòng trừ bệnh hữu hiệu mà chỉ
có thể hạn chế bệnh bằng cách khống chế những nguồn trung gian gây bệnh. Tuy
nhiên với những vùng chuyên canh quy mô lớn hàng trăm, hàng ngàn hecta thì các
phương pháp như: trồng giãn cách xa giữa các luống, dùng thuốc trừ rệp, kiến không
có tính khả thi cao. Vì vậy với những dự án đầu tư lớn cho cây dứa hiện nay
(chương trình 3 cây, 3 con của thành phố Hồ Chí Minh) thì rất cần phải xây dựng
một quy trình phòng trừ bệnh thật sự hiệu quả.
Từ thành quả của những nghiên cứu đã được thực hiện trên thế giới, ta có thể
đề ra một mô hình phòng trừ bệnh héo đỏ đầu lá như sau:
1.

Xử lý nhiệt chồi dứa để khử PMWaV.
2.

Test các chồi đã xử lý nhiệt để xác định những mẫu sạch PMWaV.
3.

Nhân nhanh các mẫu sạch virus bằng phương pháp nuôi cấy mô để tạo
nguồn chồi giống sạch bệnh, cung cấp cho người trồng.
Với mô hình trên, các chồi giống sạch virus khi trồng sẽ không phát bệnh dù
có xuất hiện rệp sáp. Vậy nếu xử lý nhiệt tốt và có một phương pháp phát hiện
PMWaV thật chính xác thì ta sẽ phòng chống được bệnh héo đỏ đầu lá thật sự hữu
hiệu, nâng cao năng suất của cây dứa, đem lại hiệu quả kinh tế cao cho xã hội

2.6 Các phương pháp chẩn đoán PMWaV
Từ các nghiên cứu về bệnh héo đỏ đầu lá đã thực hiện trên thế giới cho thấy,
hiện nay có 3 phương pháp chính để chẩn đoán PMWaV-1 trên cây dứa.
-

Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay): năm
1978, Clark và Adam đã lần đầu tiên áp dụng thành công phương pháp này để chẩn
đoán bệnh virus hại khoai tây. Phương pháp này hoạt động dựa trên nguyên tắc
kháng nguyên – kháng thể. Hiện nay đây là phương pháp huyết thanh hiện đại và
nhanh chóng để chẩn đoán các bệnh virus.


25
-

Phương pháp TBIA (Tissue Bloting Immuno Assay): phương pháp này
được Lin và ctv sử dụng lần đầu tiên năm 1990 cũng hoạt động dựa trên nguyên tắc
kháng nguyên – kháng thể. Phương pháp này có nhiều ưu điểm hơn ELISA vì nó
không đòi hỏi phải chuẩn bị mẫu tỷ mỉ và có thể cung cấp thông tin về sự phân bố
virus trong mẫu bệnh.
-

Phương pháp RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain
Reaction): là phương pháp nhân nhanh mRNA, gồm 2 bước: mRNA của virus được
phiên mã ngược thành cDNA, sau đó cDNA này sẽ được khuếch đại. Kỹ thuật cho
phép phát hiện và phân biệt được nhiều dòng virus gần giống nhau.
Các phương pháp trên đều có những ưu điểm riêng. Với ELISA, TBIA tuy giá
thành cao, nhưng có thể thực hiện rất dễ dàng, nhanh chóng, rất thích hợp cho việc
test cây đang trồng trên đồng ruộng với qui mô lớn. TBIA còn có thể cung cấp thông
tin về sự phân bố của virus trong mẫu bệnh nên có thể ứng dụng tốt vào những
nghiên cứu về đặc điểm của bệnh. Còn với phương pháp RT-PCR, tuy cần nhiều
thời gian thực hiện nhưng giá thành thấp và chính xác hơn 2 phương pháp trên.
RT-PCR đòi hỏi lượng mẫu bệnh cần thiết cho phản ứng ít hơn ELISA rất nhiều,
nhưng lại có thể phát hiện được những mẫu có lượng virus ban đầu rất thấp. Như
vậy, với mô hình cung cấp giống sạch bệnh tập trung mà đề tài hướng tới, một mô
hình đòi hỏi một phương pháp chẩn đoán PMWaV-1 thật chính xác thì phương pháp
RT-PCR là phương pháp phù hợp nhất.

2.7 Gene HSP 70 của PMWaV
Heat shock protein 70 kD (HSP 70) là một nhóm protein đặc biệt của sinh vật.
Chức năng ban đầu của chúng là giúp tái đóng xoắn các protein bị biến tính vì nhiệt,
giúp sinh vật có thể tồn tại được ở những điều kiện khắc nghiệt bất thường. Cũng
chính vì thế mà chúng được đặt tên là heat shock protein. Ngoài ra, chúng còn có
một số chức năng khác như giúp các protein mới được tạo ra hình thành các cấu trúc
bậc cao, vận chuyển protein xuyên qua các màng tế bào và riêng ở Closterovirus,
HSP 70 là một thành phần của protein vỏ trong quá trình tạo virion của virus. (Dolja
V.V. và ctv, 1999)

26
Gene mã hóa HSP 70 là một gene có tính bảo tồn cao ở nhiều loài. Đặc biệt
với nhóm Closterovirus, đã có rất nhiều nghiên cứu dựa vào gene này để xây dựng
cây phân loài. Vì vậy, đối với PMWaV, HSP 70 là một gene rất quan trọng. Đây là

vùng gene chính cho các thí nghiệm khuếch đại gene để phát hiện PMWaV và cũng
dựa vào HSP 70 mà PMWaV được phân ra thành 2 loài: PMWaV-1 và PMWaV-2
(Sether D.M. và ctv, 2001).

2.8 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) là một công cụ khá mới
trong sinh học phân tử, do Karl Mullis và cộng sự phát minh 1985 và đã liên tục
được hoàn thiện và phát triển trong thời gian gần đây. Kỹ thuật PCR cho phép
khuyếch đại một đoạn DNA mong muốn lên nhiều lần để có thể phục vụ cho nhiều
mục đích khác nhau. Nguyên tắc cơ bản của phương pháp PCR chủ yếu dựa trên khả
năng tự nhân đôi, biến tính, và hồi tính của DNA.
2.8.1 Nguyên tắc của phương pháp PCR
Dựa trên khả năng biến tính và hồi tính của DNA cùng với sự tìm ra enzyme
Taq-polymerase (1 loại DNA polymerase chịu nhiệt), người ta đã thiết lập được
hàng loạt các chuỗi phản ứng nhân đôi DNA
in vitro
trong một thời gian ngắn. Khi
ta làm biến tính (đun nóng) để đoạn DNA tách ra thành 2 mạch đơn và cung cấp 2
mồi (primer) chuyên biệt gồm mồi xuôi và mồi ngược bắt cặp bổ sung với 2 đầu của
đoạn DNA cần nhân lên thì Taq-polymerase sẽ tổng hợp nên 2 sợi DNA mới. Như
vậy nếu phản ứng nhân đôi DNA trên được lặp lại liên tục nhiều lần thì ta sẽ thu
được 1 lượng khuyếch đại rất lớn của đoạn DNA cần nghiên cứu.
Phản ứng PCR gồm có nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ có 3 giai đoạn:
-

Giai đoạn 1: là giai đoạn biến tính (denaturation), nhiệt độ được nâng
lên 93 - 100
o
C. Ở nhiệt độ này tất cả các mạch xoắn kép của DNA đều được tách ra.
-

Giai đoạn 2: là giai đoạn bắt cặp (hybridization), nhiệt độ phản ứng
được hạ xuống thấp hơn nhiệt độ nóng chảy - Tm của các primer (là nhiệt độ mà tại
đó 2 mạch của một sợi đôi DNA tách ra hoàn toàn) cho phép các primer bắt cặp với

27
DNA khuôn mẫu. Mức nhiệt độ dao động khoảng 40 - 70
o
C, tuỳ thuộc vào Tm của
các primer và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút.
-

Giai đoạn 3: là giai đoạn kéo dài (extension), nhiệt độ được nâng lên
68 - 72
o
C. Ở nhiệt độ này Taq - polymerase hoạt động tốt nhất để kéo dài các mạch
DNA. Đoạn DNA nằm giữa 2 primer được tổng hợp.
Cứ sau 1 chu kỳ gồm 3 giai đoạn trên, từ 1 DNA khuôn mẫu sẽ tạo ra được 2
DNA mới. Và sau mỗi lần lặp lại sẽ làm tăng gấp đôi lượng DNA mẫu của lần trước
(tăng theo cấp số nhân).

Hình 2.7: Phản ứng PCR.
Chú thích: (A): giai đoạn biến tính
(B): giai đoạn bắt cặp
(C): giai đoạn kéo dài

Tổng số DNA khuếch đại sau phản ứng PCR được tính theo công thức:
Tổng DNA khuếch đại = m
*
2
n

Với m là số bản sao ban đầu của DNA mẫu, n là số chu kỳ


28
2.8.2

Các yếu tố quan trọng trong phản ứng PCR
2.8.2.1

Dung dịch đệm (Buffer)
Dung dịch đệm có tác dụng cung cấp lực ion (ionic strength) cần thiết cho
phản ứng xảy ra. Nồng độ các chất, pH của dung dịch đệm tùy thuộc vào nguồn
enzyme DNA polymerase được dùng. Các thành phần của một dung dịch đệm điển
hình gồm: KCl, MgCl
2
, gelatin và Tris – HCl (pH 8,5 ở nhiệt độ phòng).
2.8.2.2

Mg

2+

Nồng độ Mg
2+
là yếu tố ảnh hưởng mạnh đến phản ứng PCR. Nó làm tăng
hoạt động của DNA polymerase, tăng Tm của DNA và sự tương tác giữa primer -
nhiệt độ. Nồng độ Mg
2+

trong hỗn hợp phản ứng cuối cùng thường biến thiên trong
khoảng từ 0,5 đến 5 mM. Nồng độ MgCl
2
từ 1,5 đến 2 mM thường được xem là tối
ưu, nhưng nồng độ tối ưu phải được xác định cho từng phản ứng qua nhiều thử
nghiệm (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998).
Nồng độ Mg
2+
cao sẽ làm phân tử dây đôi ổn định hơn, kềm hãm sự biến tính
hoàn toàn của các sợi đôi, làm cho kết quả PCR ít đi. Sự dư thừa Mg
2+
còn làm cho
hiện tượng bắt cặp giả xảy ra nhiều hơn. Hiện tượng này làm primer bắt cặp ở những
vị trí không chuyên biệt trên DNA khuôn tạo ra những sản phẩm không mong muốn
với số lượng khá lớn.
Ngược lại nếu nồng độ Mg
2+
quá thấp (< 0.5 mM), thì quá trình kéo dài sẽ
xảy ra không hoàn toàn, tạo ra những sản phẩm DNA ngắn hơn bình thường. Đó là
do trong phản ứng PCR, Mg
2+

đóng vai trò Co – factor của Taq polymerase nên nếu
lượng Mg
2+
quá thấp thì Taq polymerase sẽ không thể hoạt động bình thường trong
giai đoạn kéo dài (Bùi Chí Bửu, 1999).
2.8.2.3

Deoxyribonucleotide triphosphates (dNTPs)
Là nguyên liệu cần thiết cho phản ứng tổng hợp DNA. Hỗn hợp dNTPs gồm
4 loại: dATP, dTTP, dCTP, dGTP và thường được sử dụng ở nồng độ 20 - 200
µ
M
cho mỗi nucleotide. Điều quan trọng là chúng ta phải giữ cho nồng độ của cả 4
dNTPs bằng nhau vì sự mất cân bằng thành phần các nucleotide sẽ làm tăng lỗi sao
chép của DNA polymerase.

29

2.8.2.4

Primer (đoạn mồi)
Primer là một trong những yếu tố quan trọng nhất, ảnh hưởng trực tiếp đến
hiệu quả cũng như độ chuyên biệt của phản ứng PCR. Chọn primer là giai đoạn
quyết định của phản ứng PCR và cần tuân theo một số nguyên tắc sau:
-

Primer cho 1 phản ứng PCR gồm có 1 primer xuôi (forward) và 1
primer ngược (reverse). Xuôi và ngược là so với chiều sao mã. Trong hầu hết các
ứng dụng phản ứng PCR, 2 primer xuôi và ngược đều phải có nồng độ bằng nhau.
-

Trình tự của primer được chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung
giữa 2 primer hay giữa 1 primer với chính nó (trình tự của chúng không được bổ
sung nhau).
-

Tm của 2 primer không cách xa nhau.
-

Trình tự của primer phải đặc trưng cho trình tự của DNA được
khuyếch đại, không trùng với các trình tự lặp lại trên gen. Trình tự giữa 2 primer
không nên quá lớn, phản ứng PCR thường tối ưu với những đoạn trình tự nhỏ hơn
1kb (Phan Cự Nhân, 2001).

2.8.2.5

Taq – polymerase
Là một DNA polymerase chịu nhiệt, được tách chiết từ một vi khuẩn suối
nước nóng có tên là
Thermus aquaticus
. Taq - polymerase không bị phá hủy ở nhiệt
độ biến tính của phản ứng PCR và hoạt động tối ưu ở 68 – 72
o
C .
Nồng độ enzyme Taq polymerase được sử dụng thông thường là 0.5 – 5 đơn
vị trên 100
µ
l dung dịch phản ứng. Nếu nồng độ Taq quá cao có thể tạo ra những sản
phẩm không chuyên biệt làm sai lệch kết quả. Nếu nồng độ Taq quá thấp, phản ứng
sẽ không có đủ lượng enzyme cần thiết để tạo ra sản phẩm PCR theo mong muốn

(Bùi Chí Bửu, 1999).



30
2.8.2.6

Số lượng chu kỳ trong phản ứng PCR
Số chu kỳ cho 1 phản ứng tùy thuộc vào số lượng bản sao ban đầu của mẫu.
Ví dụ nếu lượng bản mẫu ban đầu là 10
5
thì cần 25 – 30 chu kỳ, nếu lượng bản mẫu
là 10
2
– 10
3
thì số lượng chu kỳ là 35 – 40 .
Trong thực tế không nên thiết lập số chu kỳ quá lớn cho 1 phản ứng PCR. Sở
dĩ như vậy là vì phản ứng PCR diễn tiến qua 2 giai đoạn, ở giai đoạn đầu số lượng
bản sao tăng theo cấp số nhân của lượng mẫu, sau đó hiệu quả khuyếch đại giảm hẳn
vì những nguyên nhân sau:
-

Sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng
-

Sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng
-

Các bản sao vừa được tổng hợp không kết hợp với mồi mà bắt cặp với

nhau (Phan Cự Nhân, 2001).

2.9

Phương pháp RT-PCR (Reverse Transcription PCR)
RT-PCR là một kỹ thuật cho phép ta khuếch đại các đoạn mRNA (RNA
thông tin) để làm cơ sở cho việc nghiên cứu về sự biểu hiện gene (sự sao mã tạo ra
các mRNA của các gen) hay nghiên cứu các retrovirus (các loại virus mang thông tin
di truyền là mRNA).
RT-PCR hoạt động dựa trên cơ sở của kỹ thuật PCR nhưng trước khi thực
hiện phản ứng khuếch đại, có thêm giai đoạn tổng hợp cDNA (complementary
DNA) từ sợi mRNA khuôn. Giai đoạn này được thực hiện nhờ enzyme reverse
transcriptase, enzyme phiên mã ngược được phân lập từ retrovirus. Nếu cung cấp
một primer bắt cặp với mRNA, enzyme reverse transcriptase sẽ thực hiện phản ứng
phiên mã ngược, tổng hợp nên một sợi DNA bổ sung với sợi mRNA khuôn, gọi là
sợi cDNA. Sau khi được tạo ra, sợi cDNA sẽ được dùng làm khuôn mẫu cho phản
ứng khuếch đại DNA thông thường. (Bùi Trang Việt, 2002)