Tìm hiểu lý thuyết về các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt lực enzym ACC oxydase trong bảo quản rau quả

Đặt vấn đề
Việt Nam là quốc gia nằm trong vùng có khí hậu nhiệt đới gió mùa nên
hệ thực vật rất đa dạng và phong phú. Trong đó, cây ăn quả chiếm tỷ lệ lớn và
đa dạng về chủng loại. Việc kéo dài thời gian bảo quản quả sau thu hoạch để
nâng cao giá trị kinh tế, đem lại lợi nhuận cao cho người nông dân, tạo thị
trường vững mạnh và lâu dài cho đất nước luôn được chú trọng trong thời
gian gần đây.
Để kéo dài thời gian bảo quản quả sau thu hoạch đã có nhiều công trình
nghiên cứu với những phương pháp khác nhau. Nhưng mục đích cuối cùng vẫn
là ngăn chặn sự tiếp xúc giữa ethylene với quả khi bảo quản, đồng thời kìm hãm
sự sinh tổng hợp ethylene trong quả sau thu hoạch.
Có nhiều phương pháp để kìm hãm quá trình sinh tổng hợp ethylene, trong
đó có phương pháp kìm hãm hoạt lực enzym 1-aminocyclopropane -1-
cacboxylate (ACC) oxydase để ngăn cản quá trình chuyển hóa ACC thành
ethylene.
Với mục đích như vậy, tôi thực hiện đề tài: “Tìm hiểu lý thuyết về các yếu
tố ảnh hưởng đến hoạt lực enzym ACC oxydase trong bảo quản rau quả”
mang tính tổng hợp lý thuyết các công trình nghiên cứu.
1. Giới thiệu chung về hợp chất etylene (C
2
H
4
) và Chu trình sinh tổng
hợp etylene.
1.1 Giới thiệu chung về hợp chất etylene (C
2
H
4
).
Ethylene là một khí hydrocacbon không no, có công thức hóa học là
C

2
H
4
, trong cấu trúc phân tử có một liên kết đôi. Đây là chất khí không màu,
không vị, không gây độc; có khả năng gây cháy nổ chỉ khi ở nồng độ cao hơn
2,7%
Hình 2.1. Công thức cấu tạo ethylene [23]
1
Ethylene có đặc tích kích thích sinh trưởng của các tế bào thực vật do
đó có tác dụng làm tăng trưởng về kích thước cây trồng, kích thích sự ra hoa ở
các loại cây ăn quả.
Một đặc tính quan trọng của khí ethylene là tác dụng kích thích quá
trình chín của các loại quả có hô hấp đột biến (climacteric) hay còn gọi là các
loại quả có quá trình chín sau thu hoạch, nghĩa là kể cả khi quả đã được thu
hoạch thì quá trình chín của chúng vẫn được duy trì như chuối, xoài, đu đủ,
hồng, cà chua
Etylene được tổng hợp trong tất cả các tế bào, các mô trong mọi giai
đoạn phát triển của cây nhưng nhiều nhất là các mô già và đặc biệt trong quả
đang chín. Etylene là chất khí nên được vận chuyển trong cây bằng phương
thức khuếch tán cho nên phạm vi phân tán của etylene trong mô là không xa,
chủ yếu được tổng hợp và gây tác động sinh lý tại chỗ.
Giai đoạn đầu, quả tạo ra ít ethylene, nhưng lượng ethylene tăng mạnh
khi quả bắt đầu già và vẫn tiếp tục tăng sau khi quả đã cắt lìa cành. Sự tạo
thành ethylen trong quá trình bảo quản là yếu tố bất lợi, làm giảm tuổi thọ bảo
quản của quả ngay cả khi ở nhiệt độ an toàn nhất.
GS.TS Nguyễn Quang Thạch, viện trưởng Viện Sinh học Nông nghiệp
cho biết, tùy vào mỗi loại cây và quả, lượng ethylene có nồng độ khác nhau
nhưng nhìn chung nồng độ này rất thấp.
1.2 Vai trò sinh lý của Ethylene trong quá trình chín quả.
Nó kích thích sự tổng hợp Enzyme gây biến đổi sinh hoá trong quá

trình chín của quả. Quá trình chín của nhiều loại quả, xảy ra hiện tượng hô
hấp đột biến, cường độ hô hấp tăng lên rất nhanh tạo nên một đỉnh hô hấp có
tính bột phát. Sau đó cường độ hô hấp giảm đi rất nhanh, sự sản sinh ra
Ethylene trong quả cũng tăng lên. Quá trình hô hấp bột phát được cảm ứng
bởi:
− Sự thuỷ phân các nguyên liệu dự trữ
− Sự mềm của thịt quả nhờ hoạt động của các Enzim phân giải
pectin.
− Sự biến đổi sắc tố
− Sự biến đổi các chất thơm
2
− Sự biến đổi các phản ứng sinh hoá khác.
3
Hình 2.2 Chu trình sinh tổng hợp Ethylen của Yang
1.3 Chu trình sinh tổng hợp etylen
Yang và cộng sự đã phát hiện ra chu trình sinh tổng hợp etylene thường
được gọi là chu trình Yang [8]. Quá trình sinh tổng hợp etylene bắt đầu từ
methionine (MET), dưới xúc tác của enzyme SAM synthetase thì methionine sẽ
được chuyển hóa thành S-adenosylmethionine (SAM) nhờ hoạt hóa của ATP.
Sau đó, SAM lại được chuyển hóa thành 1- aminocyclopropane -1- carboxylate
acid (ACC) dưới tác dụng của enzyme ACC synthase (ACS). Và 5’-
methylthioadenosine (MTA) cũng được tạo ra trong phản ứng này và trở lại
tổng hợp methionine theo chu trình Yang. Cho nên, ethylene luôn được tổng
hợp liên tục mà không cần bổ sung thành phần methionine từ bên ngoài. Đối
với các quả non thì quá trình tổng hợp lại methionine mạnh hơn so với sự
hình thành ACC và hiện tượng này xảy ra ngược lại khi quả chín dần. Với sự
có mặt của O
2
, ACC bị oxy hóa bởi ACC oxydase tạo thành ethylene, CO
2

, và
xyanua. Trong điều kiện kị khí, quá trình tổng hợp ethylene không xảy ra
được. Như vậy, 1-aminocyclopropane-1-carboxylate acid (ACC) là chất tiền
thân trực tiếp của etylen. [5]
Theo Yang và cộng sự, sự có mặt enzym ACC-N-malonyltransferase sẽ
làm đổi hướng sinh tổng hợp từ ACC thành etylen mà tạo thành dẫn xuất
malonyl ACC (MACC). MACC là chất không hoạt động và chỉ có thể tái
chuyển hóa trở lại ACC trong những điều kiện phi sinh lý học [10]
1.4 Giới thiệu về ACC oxydase
1-Aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) oxidase (ACCO hoặc ACO)
là enzyme cuối cùng trong sinh tổng hợp hoóc môn thực vật ethylene đã được
xác định là một thành phần quan trọng trong điều khiển quá trình chín của trái
cây và làm mềm thịt quả [8]. Hoạt lực của enzym này đòi hỏi phải có sự xúc tác
Fe
+2
và trong một số hệ thống thì nó lại được hoạt hóa bởi CO
2
[21]
4
Trong phản ứng này cần có sự tham gia của axit ascorbic, đồng thời
nhận 2 electron và phải có Fe
2+
, ascorbat và CO
2
để hoạt hóa. Các sản phẩm
là etylene, hai phân tử nước và cyanoformat (chất này sau đó phân hủy thành
HCN và CO
2
) [22].
Các nghiên cứu cũng cho biết không chỉ có enzyme ACC oxydase mà các

enzyme khác như lypoxygenase và peroxidase cũng có tác dụng chuyển hóa
ACC thành etylen với sự hiện diện của các nhân tố phụ khác. Tuy nhiên, chỉ
enzym ACC oxydase là có tính đặc hiệu và đạt hiệu quả chuyển hóa cao [23].
Khi nghiên cứu sinh tổng hợp ethylene trên thực vật cho thấy ACC
oxydase là một cấu trúc bậc cao và định vị ở màng tế bào cho nên sự phá vỡ
của mô thực vật dẫn tới sự phá hủy màng và ức chế quá trình tổng hợp etylene
[23]. Và cũng cho biết thêm hoạt lực của ACC oxydase trên màng nguyên
sinh chất và màng không bào là như nhau [23]. Tuy nhiên, ACC oxydase trên
màng nguyên sinh chất sẽ chuyển đổi ACC thành etylene nhanh hơn và nhạy
hơn dẫn đến sự thẩm thấu cao hơn so với ACC oxydase trên màng không bào.
Trong một vài loại cây trồng thì hàm lượng của ACC oxydase trên cả hai
màng là như nhau trong khi đó ở các cây trồng khác có một loại cao hơn.
2. Các yếu tố ảnh hưởng đến ACC oxydase trong bảo quản rau quả.
ACC oxydase là enzyme có cấu trúc là protein nên cũng giống như các
enzyme khác, nó chịu tác động mạnh mẽ bởi các yếu tố như: nhiệt độ, pH môi
trường, nồng độ ion, nồng độ CO
2
, thế oxy hóa – khử của môi trường, nồng
độ cơ chất, sự có mặt các chất hoạt hóa hay chất ức chế trong môi trường.
Enzyme sẽ đạt hoạt độ cao nhất dưới những điều kiện tối ưu.
2.1 Ảnh hưởng của pH và CO
2
đến hoạt lực của ACC oxydase
Các enzyme đều được đặc trưng và phụ thuộc vào pH môi trường. Mỗi
enzyme đều có giá trị pH thích hợp nhất định đối với hoạt lực của chúng. Khi
pH tăng hoặc giảm ra ngoài giới hạn thích hợp thì hoạt lực của các enzyme sẽ
5
Hình 2.3 Phản ứng chuyển hóa ACC thành ethylen
bị giảm xuống. Cho nên, trong tất cả mọi nghiên cứu về enzyme, trị số pH cần
được duy trì bằng các dung dịch đệm thích hợp.

Fusao Mizutani và cộng sự khi nghiên cứu ảnh hưởng của pH và CO
2
đến hoạt động của enzyme ACC oxydase trong quả Táo cho thấy khi tăng
nồng độ CO
2
trong thí nghiệm kết quả là làm giảm mạnh pH của môi trường.
Hoạt động enzyme khi sử dụng đệm KH
2
PO
4
-NaOH (pH 5,8-8,0) và bộ đệm
Tris-HCl (pH 7,0-9,0) kết hợp với nồng độ CO
2
là khác nhau. Ví dụ, trong bộ
đệm phosphate, pH từ 7,0-8,0 giảm xuống khoảng 6,5-6,7 khi nồng độ CO
2
ở
20%. Trong môi trường xung quanh CO
2
, pH tối ưu cho hoạt động enzyme là
7,4. Tuy nhiên, khi nồng độ CO
2
tăng lên, pH tối ưu dần dần giảm và hoạt lực
của enzyme đạt cực đại tăng lên. PH tối ưu và hoạt lực cực đại của enzyme tại
nhiều nồng độ CO
2
trong đệm Phos-phate là ở pH 7,0, mức 1% CO
2
hoạt lực
thu được 190 nl/g-h; pH 6,9 ở 4% CO

2
hoạt lực là 270 nl/g-h và pH 6,7 ở 20%
CO
2
hoạt lực là 350 nl/g-h. Mô hình tương tự đã được thu được khi 0,1 M
đệm Tris-HC1 (pH 7,0-9,0), một bộ đệm có độ kiềm mạnh hơn [7].
6
Hình 3.1 Ảnh hưởng của pH và CO
2
đến
hoạt độ của enzyme ACC oxydase
Nồng độ cơ chất tham gia hoạt hóa ACO khác nhau cũng ảnh hưởng đến hoạt
độ ACO. Đối với CO
2
, hoạt độ ACO càng tăng khi CO
2
ở nồng độ cao và
giảm khi nồng độ CO
2
hạ thấp và cũng tùy thuộc vào đối tượng nghiên cứu.
CO
2
cần cho các hoạt động enzyme ACO trong thân quả Táo. Loại bỏ CO
2
từ
hỗn hợp phản ứng hoàn toàn ức chế các hoạt động của enzyme này, trong khi
0,5% CO
2
trong khí quyển (0,15 mM trong môi trường) thì giảm hoạt động
của ACO xuống một nửa [19].

Hoạt độ ACO đạt cực đại khi CO
2
đạt nồng độ 4%, giảm đi một nữa khi ở
0,5% CO
2
. Ở 0,03% CO
2
ACO hầu như không hoạt động (Hình 3.2) [19].
ACC oxidase cần CO
2
/ HCO
3
−

như là một hoạt hóa cần thiết cho hoạt
động của nó. Tận dụng có sự cân bằng nồng độ của CO
2
và HCO
3
−
thay đổi
theo độ pH và sự chuyển đổi giữa khí CO
2
và HCO
3
−

chậm lại ở nhiệt độ thấp,
ta xác định được CO
2

tốt hơn là HCO
3
−

sử dụng trong quá trình hoạt hóa
enzyme này. Enzyme với nồng độ bão hòa CO
2
cho kết quả hoạt hóa tăng khi
pH trước khi ủ được nâng lên, điều này cho thấy rằng CO
2
phản ứng với một
nhóm enzyme khi ở môi trường kiềm [20].
7
Hình 3.2 Hoạt độ ACO phụ thuộc vào nồng độ CO
2
2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt lực của ACC oxydase
Nhiệt độ là yếu tố thường xuyên ảnh hưởng đối với tốc độ phản ứng,
cường độ xúc tác các phản ứng. Trong sinh lý học, tốc độ phản ứng càng tăng
khi nhiệt độ môi trường phản ứng tăng. Nhưng nếu vượt ra khoảng giới hạn nào
đó, các phản ứng sẽ chậm lại và ngừng hẳn do sự biến tính của phân tử enzyme.
ACC oxidase cũng phụ thuộc vào nhiệt độ và có khoảng nhiệt đô tối thích nhất
định mà tại đó, tốc độ của phản ứng đạt cực đại. Nhiệt độ tối thích của enzyme
này tùy thuộc vào nguồn gốc, phụ thuộc loài rau quả được sử dụng….
Theo Frederick B. Abeles và cộng sự thì các enzyme ở ranh giới màng
như ACC oxydase thì có tính nhạy cảm với nhiệt độ cao. Khi mô cây đậu Ấn
Độ và mô táo được làm nóng tới 35
0
C thì ACC vẫn được được tích lũy. Điều
đó đưa đến kết luận rằng nhiệt độ cao chỉ làm bất hoạt ACC oxydase mà
không làm bất hoạt ACC synthase [23].

ACC oxidase gần như không hoạt động sau thu hoạch nhưng tăng khi
quả được xử lý bằng propylene ở nhiệt độ từ 30 đến 38°C. Hoạt động cao
nhất ở 30°C thấp dần ở 34, 38 và 40°C. Ở 30 và 34°C, hoạt động ACC
oxidase tăng cao nhất từ 48 và 96h và giảm đáng kể sau đó. Tại 38°C, có sự
gia tăng liên tục hoạt động của ACC oxidase trong quả, nhưng giá trị hoạt lực
thấp hơn đáng kể ở 34°C, ngoại trừ sau 120 h [9].
3. Các phương pháp xác định hoạt lực ACC oxydase.
3.1 Giới thiệu các phương pháp xác định hoạt lực enzyme [4]
Có thể phân chia thành hai loại phương pháp: liên tục và gián đoạn.
- Phương pháp liên tục: sử dụng máy móc, thiết bị đặc biệt tự động hoạt
động liên tục (chuẩn độ, so sánh, đo đạc) với cơ cấu tự động ghi lại liên tục sự
biến đổi của chất và các thông số phản ứng (hiển thị bảng biểu, đồ thị, biểu
đồ, enzym đồ ) trong suốt thời gian tác dụng của enzym. Phương pháp này
có nhiều ưu điểm, hoàn toàn tự động, có kết quả ngay, cùng một lúc có thể có
nhiều mẫu theo một chương trình định sẵn. Đây là xu hướng và thực tiễn hiện
nay với công nghệ cao (high-tech).
- Phương pháp gián đoạn: cho enzym tác dụng với cơ chất, sau những
khoảng thời gian nhất định thì lấy mẫu phản ứng để phân tích kết quả. Có thể
gọi phương pháp này là phương pháp cổ điển nhưng hiện nay vẫn còn được
8
sử dụng phổ biến trong nghiên cứu thăm dò sơ bộ, thí nghiệm đại cương, định
tính. Chỉ có một số ít thao tác với enzym tinh khiết được xem là hiện đại.
3.1.1 Phương pháp đo độ nhớt
Thường dùng cơ chất của enzym có độ nhớt lớn hơn (hoặc nhỏ hơn)
sản phẩm phân hủy của nó. Sự biến đổi độ nhớt này là thước đo hoạt lực của
enzym.Phương pháp này thường dùng để xác định hoạt lực enzym thủy phân
cho amylaza, proteinaza.
3.1.2 Phương pháp cực kế
Thường dùng khi cơ chất của enzym hoặc sản phẩm phân giải của nó
có khả năng làm quay mặt phẳng ánh sáng phân cực và góc quay riêng của

chnúg có khác nhau. Người ta thường dùng phương pháp này để xác định
hoạt lực của saccaraza. Cơ chất của enzym này là đường saccaroza có góc
quay riêng là + 66,5
0
(phía phải). Sản phẩm thuỷ phân của nó là glucoza (góc
quay riêng là +52,5
0
) và fructoza (góc quay riêng là -92,4
0
– phía trái). Khi
enzym tác dụng lên saccaroza theo mức độ thuỷ phân mà góc quay tổng cồng
giảm dần và chuyển từ phải sang trái. Đây là phản ứng nghịch đảo đường rất
kinh điển trong nghiên cứu động học phản ứng, đường tạo ra gọi là đường
nghịch đảo (từ phải sang trái mặt phẳng ánh sáng phân cực). Tác nhân xúc tác
thông thường (không phải enzym) là axit vô cơ (HCl, H
2
SO
4
).
3.1.3 Phương pháp áp kế
Được dùng khi phản ứng enzym tạo thành hay hấp thụ khí, chẳng hạn
các loại phản ứng oxy hóa có sự tham gia của phân tử oxy (oxy hóa hiếu khí),
decacboxy hóa, deamin hóa (loại CO
2
, NH
3
). Ngoài ra, có thể dùng phương
pháp này để xác định hoạt lực của enzym trong quá trình phản ứng không trực
tiếp làm biến đổi thể tích nhưng khó thông qua các phản ứng trung gian tiếp
theo (thể hiện gián tiếp hoạt lực của enzym và do đó thể hiện hoạt lực của nó)

lại tạo thành hoặc hấp thụ khí.
3.1.4 Phương pháp quang phổ kế
Thường dùng để xác định hoạt lực các enzym mà cơ chất coenzym
hoặc sản phẩm phản ứng có khả năng hấp thụ ánh sáng khác nhau ở những
bước sóng xác định. Sự biến đổi độ hấp thụ ở bước sóng ấy trong quá trình
9
phản ứng là đo hoạt lực enzym. Phương pháp này được sử dụng rộng rãi để
nghiên cứu các enzym thuộc nhóm oxy hoá khử oxydoreductaza, chẳng hạn:
- Các dehydrogenaza với coenzym NAD
+
hoặc NADP
+
. Tốc độ phản
ứng enzym được xác định theo mức độ khử hoặc oxy hóa coenzym của
chúng. Dạng khử NADH, NADPH và dạng oxy hóa của các enzym này khác
nhau rõ rệt về khả năng hấp thụ ở bước sóng 340nm, sự biến đổi này phản ánh
mức độ chuyển hóa giữa 2 dạng và cũng chính là tốc độ và hoạt lực phản ứng
enzym.
- Enzym tyrosunaza xúc tác sự oxy hóa các hợp chất phenol thành các
quinon. Phản ứng này làm tăng tốc độ hấp thụ ở bước sóng 280 nm. Đây là
phương pháp xác định hoạt lực tyrosinaza (gọi là phương pháp A hay phương
pháp tyrosin 280).
Phương pháp này chỉ cần lượng nguyên liệu nghiên cứu rất ít, lại có độ
nhạy cao, cho phép xác định nhanh chóng, chính xác hoạt lực của enzym. Vì
vậy đây là một trong những phương pháp được sử dụng phổ biến nhất để
nghiên cứu enzym học. Thậm chí có trường hợp phản ứng enzym không làm
biến đổi rõ rệt quang phổ hấp thụ thì một tác nhân khác (enzym hay một tác
nhân khác) tác dụng làm sản phẩm phản ứng để thay đổi sự hấp phụ.
3.1.5 Phương pháp chuẩn độ liên tục
Được dùng để nghiên cứu các phản ứng enzym mà kết quả của nó tạo

thành axit hoặc bazơ. Lúc đó dùng thiết bị tự động thêm kiềm hoặc axit vào
để giữ pH môi trường phản ứng cố định, đồng thời tự động ghi đường biểu
diễn lượng kiềm hoặc axit đã tiêu tốn vào phản ứng trung hòa. Lưu lượng
kiềm hoặc axit này phản ánh tốc độ phản ứng enzym.
3.1.6 Phương pháp sắc kí
Đây là phương pháp hiện đại, hiện nay được sử dụng rất nhiều và trong
nhiều trường hợp được dùng để tinh chế enzym. Tất cả các phương pháp sắc
kí đều có thể áp dụng để xác định hoạt lực của enzym. Từ phương pháp lâu
đời nhất như sắc kí giấy, sắc kí trao đổi ion cho đến các phương pháp hiện đại
như sắc kí lỏng cao áp, sắc kí khí kết hợp với các phương phá phân tích hiện
đại (phân tích axit amin tự động, cộng hưởng từ hạt nhân, cực phổ). Lượng
10
enzym và cơ chất cũng như sản phẩm phản ánh rất ít cũng cho kết quả chính
xác, nhanh chóng.
3.1.7 Phương pháp hóa học
Dùng các phản ứng hóa học khác nhau để định lượng cơ chất bị hao
hụt hoặc sản phẩm phản ứng tạo thành dưới tác dụng của enzym. Các phản
ứng này thuộc loại tạo màu đặc trưng, tạo màu với thuốc thử đặc trưng, Nói
chung là một dấu hiệu để nói lên để nói lên mức độ hay thời điểm kết thúc
phản ứng.
Trong tất cả các phương pháp vừa nêu, tuỳ theo điều kiện, yêu cầu
nghiên cứu thực tế mà quyết định phương thức tiến hành (chẳng hạn tiến hành
trong điều kiên thời gian như nhau hay nồng độ enzym, nồng độ cơ chất
không đổi ) qui hoạch thực nghiệm để xác định các thông số tối ưu.
3.2 Các phương pháp xác định hoạt lực ACC oxydase.
Hoạt độ ACC oxidase được khảo sát hoạt động bằng cách đo khả năng
kiểm soát của mô để chuyển đổi ACC thành ethylene đã được nghiên cứu
thành công trước đây (Mathooko và cộng sự năm 1993). Sau đó, M.A. Moya-
León and P. John năm 1994 đã nghiên cứu phương pháp xác định hoạt độ
ACC oxidase trên thịt và vỏ quả chuối chín [11]. Nguyên tắc của phương

pháp này như sau: Cơ chất của phản ứng là ACC, enzym nội bào tham gia xúc
tác là ACC oxydase và sản phẩm tạo thành là etylen. Cho enzym nội bào
ACC oxydase xúc tác phản ứng xảy ra trong một khoảng thời gian nhất định.
Sau khi phản ứng kết thúc, tiến hành xác định hàm lượng cơ chất mất đi hay
lượng sản phẩm tạo thành sẽ xác định hoạt lực của enzym nội bào.
Phân tích hoạt lực của ACC oxydase trong tế bào sống bằng cách đo
lượng etylene sản sinh ra khi cho ACO ngấm lọc các mô với một lượng ACC
thừa. Mục đích của cách tiếp cận này là để bão hòa ACC oxydase với cơ chất.
Aminoethooxyvinylglycine (AVG) có thể được thêm vào để ức chế ACC
synthase. Cycloheximinde có thể được thêm vào để ngăn ngừa sự tạo thành
ACC synthase hoặc ACC oxydase mới [23].
11
4. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trên thế giới và Việt Nam
liên quan đến hoạt lực ACC oxydase trong bảo quản rau quả tươi.
4.1 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trên thế giới liên quan đến
hoạt lực ACC oxydase trong bảo quản rau quả tươi.
4.1.1 Sử dụng tropolone và hinokitiol trong bảo quản.
Theo Fusao Mizutani và cộng sự (1997), Tropolone và hinokitiol ảnh
hưởng đến sự sản sinh C
2
H
2
và hoạt động ACC oxydase đã được khảo sát trên
quả táo trong bao bì kín. Việc sử dụng dung dịch hòa tan tropolone và
hinikitiol kìm hãm sự sản sinh ethylene, nhưng thêm ion Fe
2+
trong dung dịch
sẽ làm giảm sự kìm hãm. Tropolone và hinikitiol ở dạng khí cũng có hiệu quả
đình chỉ nhưng việc đình chỉ đã giảm khi quả táo xuất hiện Fe
2+

. Tropolone và
hinikitiol kìm hãm hoạt lực ACC oxidase nhưng được phục hồi bằng cách
thêm Fe
2+
trong môi trường thí nghiệm. Bởi vậy, một phần kìm hãm sự sản
xuất ethylene bởi tropolone lại có thể kìm kẹp sự hoạt động của ion Fe
2+
[6].
4.1.2 Xử lý ethylene ngoại sinh đối với quả.
Quả Preclimacteric sản xuất ethylene rất ít vì cả hai enzyme ACC
synthase và ACC oxidase đều hoạt động thấp. Tuy nhiên, khi trái cây
được xử lý bằng ethylene ngoại sinh, trong một thời gian ngắn, sự gia
tăng mô có khả năng oxy hóa ACC thành ethylene đã được nghiên cứu
bởi Liu và cộng sự năm 1985 [18].
4.1.3 Xử lý CA trong 4 tháng bảo quản lạnh đối với Táo
Trong ống nghiệm hoạt lực ACO tăng lên đáng kể trong tất cả các
phương pháp xử lý CA trong 4 tháng bảo quản lạnh đối với Táo Golden
Delicious. Môi trường không khí và phương pháp xử lý không khí + 5%
CO
2
cho thấy sự tăng cao hoạt độ ACO và không có sự khác biệt đáng kể
giữa hai phương pháp xử lý trên. Các phương pháp xử lý với môi trường
gồm O
2
2% và O
2
2% + 5% CO
2
thể hiện sự hiệu quả hơn so với môi
trường chứa không khí và không khí + CO

2
5%, dù không hoàn toàn ức
chế sự tích tụ ACO nhưng hạn chế rất lớn sự sinh tổng hợp ethylene [13].
12
Hình 5.1 Tỷ lệ sinh tổng hợp ethylene của Táo "Golden
Delicious"được giữ trong các bầu khí quyển khác nhau.
4.1.4 Ngăn chặn sinh tổng hợp ethylene trong cà chua biến đổi gen
Trong nghiên cứu khi sử dụng gen ACC oxidase của chuối trong
định hướng antisense để ngăn chặn sinh tổng hợp ethylene trong cà chua
biến đổi gen. Có sự tăng đáng kể hoạt lực ACC oxidase sau 10 ngày bảo
quản của giai đoạn chín đỏ quả biến đổi gen. Không có sự khác biệt tổng
hàm lượng đường hòa tan và độ pH. Lượng ethylene được sản sinh bởi
cây chuyển gen luôn thấp hơn ở mọi giai đoạn của sự chín so với loại
hoang dã. Các hoạt động của men thủy phân vỏ tế bào của hydrolases và
ACC oxidase đã giảm tương ứng 40-60% và 30-40% trong các giai đoạn
chín đỏ của trái cây biến đổi gen. Đó cho phép kết luận rằng antisense ức
chế ACC oxidase trong cà chua bằng cách sử dụng gen phù hợp để kéo
dài thời gian trên cây và sau thu hái của cà chua trong đoạn chín đỏ
thành thục [14].
13
14
Hình 5.2. Quả cà chua hoang dã và quả cà chua biến đổi gen
Hình 5.3. Diễn biến sau thu hoạch quả hoang dã và quả cà chua biến đổi
gen (anti-MaACO1) sau khi xử lý với ethylene (50ppm, 12 h)
4.1.5 Ảnh hưởng của tinh dầu đến hoạt độ của ACS và ACO trên
thịt quả Bí
Khi nghiên cứu ảnh hưởng của tinh dầu đến hoạt độ của ACS và
ACO trên thịt quả Bí trưởng thành của Golam Rabbany và cộng sự năm
2011 có kết quả thu được là tất cả các loại tinh dầu đều ức chế hoạt động
của ACS. Ức chế đến 50% khi sử dụng 28µl/l limonene và 25µl/l

linalool. Ức chế cao hơn đã được tìm thấy với nhóm aldehyde của tinh
dầu. Citral, 1-octanal (Caprylaldehyd) , 1-nonanal (Pelargonaldehyd) và 1
decanal (Capraldehyd) ức chế hoạt động của ACC synthase 50 đến 78%
15
Hình 5.4 Ảnh hưởng của tinh dầu đến hoạt độ của ACO trên thịt quả Bí
và citronellal bằng 78-93% tại 3,6 đến 36 μl/l. Mặt khác, các loại tinh
dầu không ức chế hoạt động ACC oxidase. Tuy nhiên, aldehyt béo như
1-octanal, 1-nonanal và 1 decanal gây ra quá trình chuyển hóa không cần
enzyme từ ACC thành ethylene. Việc ủ enzym với hàm lượng khác nhau
của 1 -octanal, 1-nonanal và 1 decanal làm tăng hoạt độ của ACC và gia
tăng quá trình sản sinh ethylene [12].
4.1.6 Ảnh hưởng Salicylic và glutamine đến hoa sau thu hoạch
Trong nghiên cứu mới đây vào tháng 4 năm 2011 của S. Zamani, M.
Kazemi and M. Aran về ảnh hưởng của acid salicylic và glutamine đến hoa
Hồng sau thu hoạch cho thấy rằng 2mM acid salicylic làm giảm sự thoát
anthocyanin và hoạt độ của ACO. Khi thêm 3mM glutamine vào 2mM acid
salicylic thi càng làm giảm quá trình thoát anthocyanin và hoạt độ của ACO.
Hoạt độ ACO đạt cao nhất khi trong hoa hồng được xử lý 4mM acid salicylic
[16].
Bảng 5.1 Ảnh hưởng của Salicylic và glutamine đến hoa Hồng sau
thu hoạch
16
Hình 5.5 Sinh tổng hợp ethylene, hoạt độ của
ACC synthase và ACC oxydase [A]; phân tích
Western blot đối với protein ACC oxydase [B].
4.1.7 Ảnh hưởng của việc làm lạnh đến sản sinh ethylene, hoạt động
của ACC synthase và ACC oxidase [17].
Quả Lê Passe Crassane giữ đến 100 ngày tại 18
o
C trong không khí sau

khi thu hoạch không thể sản xuất số lượng lớn ethylene. Hoạt độ ACC
synthase và oxidase ACC vẫn ở mức rất thấp so với các loại trái cây tươi sau
thu hoạch. Ngược lại, quả Lê Passe Crassane sản sinh ethylene khi bảo quản
trong 100 ngày tại 0
o
C vào
khoảng 30 pmol/kgs. Hoạt
động của ACC synthase và
ACC oxidase đều bị kích
thích mạnh khi giữ trong
môi trường lạnh 0
o
C, với
ACC oxidase hoạt độ tăng
từ 280 pmol/kgs lên 4600
pmol/kgs và ACC synthase
tăng từ 5 lên 43 pmol/kgs.
Khi quả Lê bảo quản 100
ngày ở -18
o
C thì lượng
ethylene sản sinh gấp 8 lần
song song với đó là sự kích
thích hoạt độ ACC synthase
lên gấp 3 lần. Đồng thời,
hoạt độ ACC oxydase chỉ
tăng gấp 1,5 lần. Phân tích
Western blot
chỉ ra rằng lạnh đã làm tăng
hoạt độ ACC oxidase là

mối tương quan với sự
tích tụ của protein 38
kDa tương ứng. Các
kháng nguyên ACC oxidase hầu như không phát hiện được trong quả không
chịu lạnh.
17
4.1.8 Hoạt độ ACO trong bảo quản quả Kiwi [20].
Quả Kiwi khi được xử lý 100 µg/ml ethylene ở 20
o
C trong 24h sau đó
theo dõi bảo quản trong 10 ngày tiếp theo. Kết quả cho thấy, trong hai ngày
đầu hoạt độ ACO tăng rất cao hơn so với quả không được xử lý, đến ngày thứ
4 thì bắt đầu giảm mạnh và xuống thấp hơn.

4.1.9 Ảnh hưởng của Fe2+ và NaHCO3 đến hoạt độ ACO
Theo nghiên cứu của Jian trên táo, hoạt lực của enzyme ACC
oxydase đạt cực đại khi trong môi trường có mặt của Fe
2+
10 µM và Natri
ascorbate 1 mM [26].
Kết quả nghiên cứu của Moya-León MA và John (1994) trên quả chuối
cho thấy khi enzyme ACC oxydase nhận được Fe
2+
20 µM, NaHCO
3
10 mM
và Natri ascorbate 20 mM thì hoạt lực đạt 50%, khi trong môi trường có mặt
của Fe
2+
0,2 mM, NaHCO

3
20 mM và Natri ascorbate 40 mM thì hoạt lực
enzyme ACC oxydase đạt cực đại nhưng nếu tiếp tục tăng nồng của các chất
này lên thì hoạt lực của này lại giảm đi [25].
18
Hình 5.6 Hoạt độ ACO chịu ảnh hưởng khi xử lý ethylene trên quả Kiwi
Đối với quả táo, khi trong môi trường có mặt của Fe2+ 10 µM và
NaHCO3 20 mM thì làm tăng hoạt lực của enzyme ACC oxydase nhưng khi
tăng nồng độ của Fe2+ > 50 µM và NaHCO3 > 50 mM thì hoạt lực của
enzyme ACC oxydase bị ức chế nhưng nó lại đạt cực đại khi trong môi
trường có mặt của Natri ascorbate 10 mM [24].
4.1.10 Ảnh hưởng của 1– MCP đến hoạt lực ACO
Pathak và cộng sự năm 2003 khi nghiên cứu “sự biểu hiện hoạt tính của
các enzyme sinh tổng hợp etylen trong quá trình chín của chuối và ảnh hưởng
của chất ức chế sinh trưởng 1 – MCP”. Kết quả cho thấy 1 – MCP không chỉ
có ảnh hưởng đến các cơ quan có khả năng hấp thụ etylen trong quả mà còn
có ảnh hưởng đến hoạt tính và sự tích lũy enzyme ACC - synthase và ACC -
oxydase trong quả [27].
4.2 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng tại Việt Nam liên quan đến
hoạt lực ACC oxydase trong bảo quản rau quả tươi.
Hiện nay ở Việt Nam, lĩnh vực nghiên cứu kéo dài thời gian bảo quản
các loại rau quả đã và đang được thúc đẩy và ngày càng mang tính cấp thiết.
Tuy các công trình nghiên cứu về lĩnh vực này còn rất khiêm tốn. Vào năm
2008, tác giả Lê Thị Phượng [1] đã nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Retain
– AVG đến hoạt lực enzyme ACC - oxydase trong bảo quản tươi chuối tiêu
sau thu hoạch, kết quả đã chỉ ra nồng độ Retain thích hợp để ức chế hoạt lực
enzyme ACC - oxydase trong quá trình sinh tổng hợp etylen kéo dài thời gian
bảo quản chuối là 0,9 g/l.
Năm 2009, Tống Thị Quỳnh Anh đã nghiên cứu: Khảo sát một số yếu tố
ảnh hưởng đến hoạt lực enzyme ACC - oxydase trong bảo quản tươi chuối tiêu

(Musa AAA Cavendish) cho thấy rằng Với nồng độ 0,8 g/l, Retain – AVG
phun cận thu hoạch tại thời điểm chuối sau khi cắt hoa 78 ngày cho giá trị hoạt
lực ACC oxydase đạt cực đại chậm nhất vào ngày bảo quản thứ 40, so với
trường hợp không sử dụng Retain – AVG 28 ngày, ở cùng điều kiện (t
0
= 13
0
C,
bao bì LDPE 25 µm). Và đã xác định được loại bao bì LDPE 25 µm có khả
năng ức chế hoạt lực enzyme ACC oxydase tốt nhất trong quá trình bảo quản
tươi chuối tiêu ở cùng điều kiện (t
0
= 13
0
C, Retain – AVG nồng độ 0,9 g/l).
Nguyễn Văn Toản (2011) khi nghiên cứu “Điều tiết quá trình sinh tổng
19
hợp etylen nhằm kéo dài thời gian chín sau thu hoạch của quả chuối tiêu” thì
hiệu quả sinh tổng hợp etylen nhằm kéo dài thời gian bảo quản tươi chuối tiêu
sau thu hoạch đạt giá trị (nồng độ AVG 0,8 g/l, thời điểm phun 78 ngày, 28
ngày bảo quản) là hoạt lực ACC oxydase: 0,44 (nmol C2H4.g-1.h-1)/2,18
(nmol C2H4.g-1.h-1) khi có/ không sử dụng AVG. Điều này cho thấy, cường
độ sản sinh etylen bị kìm hãm sau khi tiến hành điều tiết bằng AVG ở giai
đoạn cận thu hoạch và rất quan trọng trong việc đảm bảo chín sinh học tự
nhiên của chuối tiêu sau khi thực hiện giải pháp công nghệ điều tiết nội
enzym ACC oxydase.
20
KẾT LUẬN
Trong quá trình tìm hiểu về enzyme ACC oxydase tôi nhận thấy rằng
enzyme này có tác động rất lớn đến quá trình sản sinh ethylene trong rau quả.

Nó chuyển hóa ACC (chất tiền ethylene) thành ethylene, phản ứng chuyển
hóa này chịu tác động của rất nhiều yếu tố. Nếu chúng ta làm bất hoạt enzyme
này thì quá trình tạo thành ethylene bị ngừng lại, khi đó sẽ kéo dài được thời
gian bảo quản rau quả sau thu hoạch. Tuy nhiên, để gây bất hoạt hoàn toàn
enzyme này rất khó vì nó chịu tác động của các chất hoạt hóa như Fe
2
, HCO
3
−
,
đồng thời phải giữ trong môi trường chứa nồng độ O
2
và CO
2
thích hợp, phải
sử dụng các chất ức chế như 1-MCP, AVG (ức chế sự tạo thành ACC – cơ
chất chính của ACO).
Hiện nay, trên thế giới có rất nhiều công trình nghiên cứu về ACC
oxydase để ứng dụng kéo dài thời gian bảo quản trên nhiều loại rau quả.
Nhưng theo tôi tìm hiểu thì các nghiên cứu này đi sâu vào phân tích gen và sử
dụng phương pháp sinh học phân tử để tác động trực tiếp đến gen quy định
enzyme này. Các nghiên cứu này cho hiệu quả trên cây trồng cao hơn nhiều
so với các phương pháp trước được sử dụng.
21
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Lê Thị Phượng. Khóa luận tốt nghiệp Ảnh hưởng của nồng độ Retain –
AVG đến hoạt lực enzyme ACC – oxydase trong bảo quản tươi chuối tiêu
sau thu hoạch. Đại học Nông Lâm Huế, 2008.
[2] Tống Thị Quỳnh Anh, Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt lực
enzyme ACC - oxydase trong bảo quản tươi chuối tiêu (Musa AAA

Cavendish), Đại học Nông Lâm Huế, 2009
[3] Nguyễn Văn Toản, Điều tiết quá trình sinh tổng hợp etylen nhằm kéo
dài thời gian chín sau thu hoạch của quả chuối tiêu. Đại học Nông Lâm
Huế, 2011
[4] Trần Xuân Ngạch; “Công nghệ enzym”; Trường Đại Học Bách Khoa
Đà Nẵng; 2005
[5] Adams D.O, Yang S.F. (1979), “Ethylene biosynthesis; Identification of
1- aminocyclopropane-1-carboxylic acid as an intermediate in the conversion of
methionine to ethylene”, Proc Natl Acad Sci, 76, pp. 170-174.
[6] Fusao Mizutani,* A. B. M. Golam Rabbany and Hiroaki Akiyosh
(1997), Inhibition of ethylene production and 1- aminocyclopropane- 1-
carboxylate oxidase activity by tropolones.
[7] Fusao Mizutani,* Jian Guo Dong And Shang Fa Yang (1995), Effect
of pH on CO
2
-activated 1-aminocyclopropane-1- carboxylate oxidase
activity from apple fruit.
[8] Yang S.F. and N.E. Hoffman. Ethylene biosynthesis and its regulation
in higher plants. Annu. Rev. of Plant Physiol. Vol 35, 1984.
[9] M.D.C. Antunes a,*, E.M. Sfakiotakis (2000), Effect of high
temperature stress on ethylene biosynthesis, respiration and ripening of
‘Hayward’ kiwifruit.
[10] Yang S.F., Hoffman N.E (1984), “Ethylene biosynthesis and its
regulation in higher-plants”, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.,
Vol 35, pp. 155 189.
[11] M.A. Moya-León and P. John, 1994, Activity of 1- minocyclopropane
1-Carboxylate (ACC) Oxidase (Ethylene-Forming Enzyme) in the Pulp and
Peel of Ripening Bananas
22
[12] Golam Rabbany và cộng sự, 2010, Effect of Essential Oils on In Vitro

Activities of 1-Aminocyclopropane-1carboxylate (ACC) Synthase and
ACC Oxidase from Winter Squash Mesocarp
[13] James R. Gorny and Adel A. Kader1, 1996, Controlled-atmosphere
Suppression of ACC Synthase and ACC Oxidase in ‘Golden Delicious’
Apples during Long-term Cold Storage
[14] Atul Batra, Vidhu A. Sane, Prabodh K. Trivedi, Aniruddha P. Sane and
Pravendra Nath, 2010, Suppression of ACC oxidase expression in tomato
using heterologous gene from banana prolongs shelf-life both on vine and
post-harvest
[15] I. Sestari, F.F. Sasaki, M.L.L Jomori and R.A. Kluge, 2010,
Improvement of Cold Tolerance in ‘Tahiti’ Lime Through Heat Treatments.
[16] S. Zamani, M. Kazemi and M. Aran, 2011, Postharvest Life of Cut
Rose Flowers as Affected by Salicylic Acid and Glutamin
[17] Jean-Marc Lelievre, Line Tichit, Patrick Dao; Effects of chilling on the
expression of ethylene biosynthetic genes in Passe-Crassane pear (Pyrus
communis L.) fruits
[18] Liu Y., Su L.Y., Yang S.F. (1985), “Ethylene promotes the capability
to malonylate 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid and α-amino acids in
preclimateric tomato fruits”, Plant Physiol 77, pp. 891-895.
[19] J G Dong, J C Fernández-Maculet, and S F Yang, 1992, Purification
and characterization of 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase from
apple fruit.
[20] Park a, Jung, Gorinstein, 2006, Ethylene treatment of ‘Hayward’
kiwifruits (Actinidia deliciosa) during ripening and its influence on ethylene
biosynthesis and antioxidant activity.
[21] 283-307; Kende. H; “Ethylene biosynthesis”; Annu. Rev. Plant
Physiol. Plant Mol. Biol., Vol 44, 1993
[22] Simaan, W. Ghattas, C. Gaudin, T. Tron, M. Réglier; “Study of the
mechanism of ACC Oxidase”; Natural system and chemical modelisation;
Laboratoire de Bioinorganique Structurale; 2006

23
[23] Frederick B. Abeles, Page W. Morgan, Nikal E. Saltveit; “Ethylene in
plant biology”; Academic Press. inc; 1992
[24] Mita S, S. Kawamura, K. Yamawaki, K. Nakamura, H. Hyodo.
Differential expression of genes involved in iosynthesis and perception of
ethylen during ripening of passion fruit (passiflora edulis sims). Plant cell
Physiol 39, 1998.
[25] Moya-León MA., P. John. Activity of 1- aminocy clopropane-1-
carboylate (ACC) oxidase (ethylene- forming enzyme) in the pulp and peel of
ripening bananas. Journal of Horticultural Science 69, 1994.
[26] Jian G.D., J. C. F. Maculet, and S. F. Yang. Purification and
characterization of 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase from apple
fruit. Plant Biology 89, 1992.
[27] Pathak N., H. A. Mehar, P. Dhawan, K. S. Manoj and N. Pravendra.
Expression and activities of ethylene biosynthesis enzymes during ripening
of banana fruits and effect of 1-MCP treatment. Plant Gene Expression
Laboratory, National Botanical Research Institute, Rana Pratap Marg,
Lucknow, 226001, India. Department of biochemistry, MSB, UMDNJ, 185,
South Orange Av., Newark, NJ, 07103, USA. Department of Forest
Genetics and Plant Physiology, Umea Plant Science Centre, Umea, Sweden.
Author for correspondence, 2003.
24
MỤC LỤC
hợp etylene 1
4.1.7Ảnh hưởng của việc làm lạnh đến sản sinh ethylene, hoạt động 17
của ACC synthase và ACC oxidase [17] 17
4.1.8Hoạt độ ACO trong bảo quản quả Kiwi [20] 18
4.1.9 Ảnh hưởng của Fe2+ và NaHCO3 đến hoạt độ ACO 18
4.1.10 Ảnh hưởng của 1– MCP đến hoạt lực ACO 19
KẾT LUẬN 21

TÀI LIỆU THAM KHẢO 22
25