Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm sinh học trong phòng trừ bọ ánh kim hại hồi

1
MỞ ĐẦU
1.1 Tính cấp thiết của đề tài
Cây hồi là tên gọi chung của giống Illicium thuộc họ Schisandraceae,
giống hồi Illicium. Hồi là cây trồng có giá trị kinh tế cao, được xem là cây
nguyên sản của vùng Đông Bắc Việt Nam nói chung, tỉnh Lạng Sơn nói riêng.
Cây hồi được trồng ở các huyện miền núi của tỉnh Lạng Sơn như huyện Văn
Quan, Bình Gia, Cao Lộc, Bắc Sơn, Lộc Bình với khoảng 37.000 ha, giá trị
hoa hồi xuất khẩu đã và đang đem lại nguồn thu trên 600 tỷ đồng mỗi năm.
Đây là nguồn nông sản xuất khẩu chính của tỉnh và cũng là nguồn thu nhập
chính của bà con nông dân dân tộc ít người và các xã đặc biệt khó khăn.Cây
hồi không chỉ có vai trò quan trọng trong phát triển kinh tế xã hội của tinh
Lạng Sơn mà nó còn là nét biểu trưng cho văn hóa, địa lý con người xứ Lạng.
Trong quả hồi có chứa đường và rất nhiều các hợp chất hóa học như:
anethol, tecpen, pinen, dipenten, limonen ở dạng tinh dầu. Hồi là một vị
thuốc được dùng trong cả đông y và tây y. Tây y dùng hồi làm thuốc trung
tiện, giúp tiêu hóa, lợi sữa, tác dụng trên hệ thống thần kinh và cơ Gần đây,
tinh dầu hồi được sử dụng như nguồn dược liệu quý trong việc tạo kháng sinh
Tamiflu chống bệnh cúm A/H5N1, H3N2… trên gia cầm.Trong đông y hồi có
tác dụng đuổi hàn, kiện tỳ, khai vị, dùng chữa đau bụng, bụng đầy chướng,
giải độc của thịt cá và trong chế biến thực phẩm khác.
Cây hồi được coi là cây có ít sâu bệnh cho nên nó ít được quan tâm
nghiên cứu trong thời gian dài. Hầu hết các tư liệu về sâu bệnh hại cây hồi
đều rất hiếm. Tuy nhiên trong vài năm trở lại đây tình hình sâu hại trên cây
hồi ngày càng gia tăng nghiêm trọng nhấtlà bọ ánh kim (BAK) hại hồi đang là
mối lo âu hàng đầu cho các rừng hồi.Bọ ánh kim hoa hại hồi là một loài sâu
thuộc họ ánh kim Chrysomelidae đa và đang bùng phát với số lượng lớn, gây
hại nặng trên diện tích hơn 12.000 ha thuộc địa bàn 3 huyện Văn Quan, Cao
1
2
Lộc, Lộc Bình trên tổng số gần 37.000ha rừng hồi của cả tỉnh. Cả trưởng

thành và ấu trùng đều ăn lá cây, ấu trùng tuổi nhỏ ăn nhu mô lá làm cho lá cây
thủng lỗ chỗ, nhưng ấu trùng tuổi lớn lại có thể ăn trụi hết lá, từ lá non, lá
bánh tẻ cho đến lá già.
Khi mật độ sâu cao đã ăn trụi hết lá cây làm cho cây không thể phục
hồi, cánh lá khô héo dần và dẫn đến chết toàn cây, ảnh hưởng lớn mật độ và
năng suất quả hồi. Bọ ánh kim hoa hại hồi đã được các nhà khoa học thuộc
Bảo tàng Australia giám định tên khoa học là Oides sp.
Bọ ánh kimOides sp. là loài sâu hại rất khó phòng trừ, có khả năng phát
tán nhanh. Nếu không phòng trừ kịp thời sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự
tồn tại và phát triển của cây hồi. Để phòng trừ bọ ánh kim hại hồi người dân
đã sử dụng nhiều loại thuốc hoá học, kể cả phương pháp xông khói,tuy nhiên
theo đánh giá của một số cán bộ tại chi cục bảo vệ thực vật (huyện Văn Quan,
tỉnh Lạng Sơn) các phương pháp trên chi phí rất tốn kém hiệu quả phòng trừ
hạn chế do phụ thuộc nhiều vào điều kiện thời tiết. Việc sử dụng thuốc hóa
học đã và đang làm ô nhiễm môi trường sinh thái, tiêu diệt thiên địch tự
nhiên, ảnh hưởng đến sức khoẻ con người, vật nuôi.
Phòng trừ sinh học với các ưu điểm nổi bật như: an toàn, không gây ô
nhiễm môi trường, không gây độc hại đối với con người và sinh vật khác,
hiệu quả bền vững hiện nay đang có xu hướng được sử dụng rộng rãi để
phòng trừ sâu bệnh hại theo hướng bền vững. Cho nên chúng tôi tập trung vào
nghiên cứu theo hướng phòng trừ bằng các biện pháp sinh học.
Cho đến nay chưa có nhiều công trình nghiên cứu nào về việc phòng
trừbọ ánh kimbằng biện pháp sinh học vì thế chúng tôi thực hiện đề
tài"Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm sinh học trong phòng trừ bọ ánh kim
2
3
hại hồi ( Oides sp.)" góp phần bảo vệ môi trường sinh thái, quản lý dịch hại
bền vững.
1.2 Mục tiêu nghiên cứu
Xác định phân lập loài nấm Metarhizium anisopliae(M.anisopliae) và

Beauveria bassiana(B.bassiana)có hoạt lực cao trong việc phòng trừ bọ ánh
kim hại hồi.
Đánh giá hiệu lực phòng trừ của các loài nấm đối với bọ ánh kim hại hồi.
1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
* Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu các đặc điểm sinh học, sinh thái của nấm
M.anisopliae và B.bassianalà cơ sở khoa học quan trọng trong việc tạo chế
phẩm sinh học phòng trừ bọ ánh kim hại hồi.
*Ý nghĩa thực tiễn
Phát triển và sử dụng chế phẩm M. anisopliae và B. bassianatrong
phòng bọ ánh kimhại hồi giảm sử dụng thuốc trừ sâu hoá học, góp phần bảo
vệ môi trường,sản xuất sản phẩm an toàn phục vụ xuất khẩu
3
4
Phần I. TỔNG QUAN
2.1.Cơ sở khoa học
Trong sinh quần nông nghiệp có nhiều tác nhân sinh học là nhân tố
điều hòa tự nhiên, duy trì cần bằng sinh thái của quần thể sinh vật trên đồng
ruộng (Phạm Văn Lầm, 1995) [1].Trong số các tác nhân sinh học gây chết sâu
hại cây trồng thì nấm ký sinh côn trùng chiếm một vị trí đặc biệt quan trọng.
Theo tác giả E. A. Steinhaus (1949) thì các nấm diệt sâu trong thiên nhiên
chưa cần đến con người đã làm được nhiệm vụ điều hoà và tiêu diệt một
lượng lớn các côn trùng gây hại (dẫn theo N. N. Tú và CS)[2].
Nấm gây bệnh cho côn trùng là một tác nhân sinh học quan trọng trong
việc không chế côn trùng gây hại.Vai trò trấn áp những trận dịch lớn do côn
trùng gây hại của các chủng nấm vật ký sinh được trình bày rất rõ trong nhiều
công trình của nhiều tác giả trên thế giới (V.P. Paspelop 1940, Dusky S.R.
1959, Hanada I. 1959 -1964…). Đây là một nhân tố hữu dụng trong hệ thống
quản lý sâu hại tổng hợp IPM (Gillespie; Rombach và CS, 1986).Việc nghiên
cứu bệnh lý học côn trùngđã được tiến hành từ rất sớm.

Do bọ ánh kim sinh trưởng và phát triển trong tiểu khí hậu ẩm thấp nên
rất thuận lợi cho sự lây nhiễm của bệnh nấm. Thành phần nấm ký sinh đa
dạng phong phú, chúng là yếu tố gây chết chủ yếu đối với bọ ánh kim. Trong
thành phần nấm ký sinh tự nhiên trên bọ ánh kim hại hồi thì loài nấm
M.anisopliae và B.bassianacó mức độ xuất hiện cao nên có nhiều tiềm năng
trong việc khống chế quần thểbọ ánh kim. Đánh giá bước đầu cho thấy đây là
nguồn nấm có nhiều triển vọng trong việc phát triển chế phẩm sinh học để
4
5
phòng bọ ánh kim.Thông tin nói trên là những luận cứ quan trọng, làm cơ sở
định hướng cho việc thực hiện đề tài“Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm sinh
học trong phòng trừ bọ ánh kim hại hồi”
2.2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
2.2.1. Tình hình nghiên cứu sâu bệnh hại cây hồi ở ngoài nước
* Sơ lược về sâu bệnh hại cây hồi
Hồi nói chung và giống hồi I. verum nói triêng có sự phân bố rất hẹp,
chúng chỉ sống trên núi cao của một số nước trên thế giới cho nên những
nghiên cứu về sâu bệnh hại hồi trên thế giới khá hiếm hoi. Còn tác giả Hook
lại nhận định rằng trên giống đại hồi I. verum, các loài nấm gây hại là vấn đề
cần phải quan tâm bởi cây hồi sinh trưởng trong điều kiện độ ẩm cao, rất
thuận lợi cho các loài nấm bệnh phát triển (Agroforesty database 4.0). Những
ghi nhận về sâu bệnh hại trên cây hồi nơi là quê hương của cây hồi (Trung
Quốc) cũng khá hiếm. Trong một nghiên cứu của Yuelan (2004) về cây hồi đã
phát hiện ra loài sâu hại mới Pseudodoniella sp. gây hại trên cây hồi ở tỉnh
Guangxi từ tháng 5 cho đến đầu mùa đông, trưởng thành qua đông trên thân
cây và đẻ trứng vào tháng 3 cho đến tháng 4 năm sau. Tác giả Zhao (2009) đã
công bố thành phần sâu bệnh hại cây hồi tại tỉnh Funing (Trung Quốc) gồm
có 20 loại sâu bệnh gây hại cho cây hồi. Trong đó có 9 loài bệnh, 10 loài sâu
và 1 loài thực vật ký sinh. Khi cây hồi ở tỉnh Lạng Sơn bị loài sâu hại thuộc
họ bọ ánh kim Chrysomelidae gây hại nặng. Mẫu vật này đã được gửi đến

Bảo tàng Australia và loài gây hại này mới chỉ được giám định đến giống với
tên khoa học là Oidessp[17].
Họ Chrysomelidae là một họ lớn trong bộ cánh cứng Coleoptera với hơn
40.000 loài phân bố trên toàn thế giới hầu hết trong số chúng là loài ăn thực
vật, thành phần ký chủ của chúng tương đối phức tạp (Jolivet và cs, 1995).
5
6
Thành phần loài của họ chrysomelidae ở Anh khá phong phú, chúng gồm 264
loài thuộc 60 giống của 7 họ phụ, trong đó họ phụ Galerucinae có số lượng
giống loài lớn nhất (32 giống, 142 loài)[18]. Chỉ tính riêng số loài thuộc bọ
ánh kim Chrysomelidae ở bang Ohio (Mỹ) đã có tới hơn 400 loài chúng thuộc
99 giống của 12 họ phụ. Trong đó họ phụ Halticinae có số giống loài nhiều
nhất, chúng tương ứng là 27 giống, 124 loài (Hughes, 1944). Số loài thuộc họ
Chrysomelidae ở Đài Loan ghi nhận được chưa nhiều, chỉ có 43 loài thuộc 36
giống của 10 họ phụ được giám định với 5 loài được ghi nhận lần đầu tiên cho
hệ côn trùng Đài Loan. Trong số đó, họ phụ Galerucinae có số lượng loài nhiều
nhất (19 loài) (Kimoto, 1965). Khi nghiên cứu về thành phần các loài thuộc họ bọ
ánh kim ở vùng Châu Á Thái Bình Dương tác giả Kimoto và Gressitt (1963) đã
thống kê và giám định được 1.249 loài thuộc 5 họ phụ, bổ sung 178 loài mới
thuộc côn trùng họ ánh kim cho khu hệ côn trùng Trung Quốc và Hàn Quốc.
Trong cuốn sách này có loài Oides leucomelaena được ghi nhận gây hại trên cây
có dầu ở Trung Quốc trong một phạm vi rất hẹp, những thông tin về loài này cũng
rất hạn chế. Ở vùng Thái Lan và Đông Dương, tác giả đã ghi nhận được 188 loài
thuộc 36 giống của 5 họ phụ, trong đó họ phụ Cryptocephalinae có số loài nhiều
nhất với 81 loài, 16 loài mới đã được bổ sung cho danh sách các loài côn trùng họ
ánh kim ở Thái Lan và Đông Dương (Kimoto và Gressitt (1981).
* Đặc điểm sinh học của một số loài sâu hại chính trên cây hồi
Những dữ liệu khoa học về đặc điểm sinh học của các loài sâu hại trên
cây hồi khá khiêm tốn và sơ sài.Loài sâu hại Pseudodoniella sp. được ghi
nhận có 3-4 lứa/năm các lứa gối lên nhau.Chúng qua đông ở giai đoạn trưởng

thành trên những thân cây. Trưởng thành kết đôi giao phối và đẻ trứng vào
giữa tháng 3 và tháng 4 năm sau, ấu trùng xuất hiện vào giữa hoặc cuối tháng
5. Cả trưởng thành và ấu trùng đều chích hút ở những phần non của cây như
búp non, ngọn non, nụ và hoa (Yuelan, 2004). Ngoài ra còn một loài sâu bộ
6
7
cánh vảy khác thuộc họ Geometridae chưa xác định được tên khoa học, gây
hại rất nặng trên cây hồi, chúng có 3-4 lứa/năm, qua đông ở giai đoạn nhộng
hoặc ấu trùng. Ban ngày trưởng thành thường nấp ở những nơi tối và bẩn,
chúng có xu hướng ánh sáng yếu. Trứng phát triển trong khoang bụng và có
tới 300 trứng, thời gian phát dục của trứng 6-13 ngày. Ấu trùng tuổi nhỏ ăn ở
mặt sau lá cây khi ấu trùng tuổi lớn chúng có thể ăn toàn bộ lá cây. Nhộng
được làm trong lớp đất mặt tơi xốp ở độ sâu khoảng 6-10 cm [19]. Cho đến
nay những nghiên cứu về đặc điểm sinh học của loài sâu hại bộ cánh cứng
cũng như sâu hại thuộc họ Chrysomelidae trên cây hồi chưa hề được nghiên
cứu hay đề cập đến trong bất kỳ tài liệu nào đã được tham khảo.
* Biện pháp phòng trừ
Một số biện pháp phòng trừ sâu hại cây hồi được đề cập trong các tài
liệu tham khảo đều là những biện pháp thủ công cơ giới vật lý. Các tác giả
khuyến cáo lợi dụng các đặc điểm sinh học của chúng như giai đoạn chúng
qua đông, vị trí, thời điểm qua đông để có những biện pháp thu bắt làm giảm
mật độ của chúng vào năm sau. Rất ít biện pháp hóa học được khuyến cáo,
hoạt chất beta-cypermethrin có được khuyến cáo nhưng với nồng độ khá cao
800-1000 lần so với nồng độ khuyến cáo [20].
2.2.2 Tình hình nghiên cứu các chủng nấm gây hại côn trùng trên thế giới
Nấm gây bệnh cho côn trùng là một tác nhân sinh học quan trọng trong
việc không chế côn trùng gây hại. Vai trò trấn áp những trận dịch lớn do côn
trùng gây hại của các chủng nấm vật ký sinh được trình bày rất rõ trong nhiều
công trình của nhiều tác giả trên thế giới (V.P. Paspelop 1932- 1940, Dusky
S.R. 1959,Tanada I. 1959 -1964, Hall I. M. 1964,… ).Đây là một nhân tố hữu

dụng trong hệ thống quản lý sâu hại tổng hợp IPM (Gillespie; Rombach và
CS, 1986)[15].Trên thế giới, việc sử dụng nấm ký sinh gây bệnh để để phòng
7
8
trừ sinh học đối với các loài côn trùng đã được quan tâm nghiên cứu và ứng
dụng từ rất sớm.
Năm 1815, Agostino Bassi đã mô tả tỷ mỷ về nấm trắng Muscardin
(B.bassiana) trên tằm dâu và đưa ra biện pháp phòng trừ (dẫn theo T. K.
Chỉnh, 1996). Sau đó một số công trình nghiên cứu về nấm có ích của tác giả
như Oduen (1837), Luis Pasteur (1885-1890), Carte A và Levrat D (1909)
.v.v đã công bố những tài liệu trong đó miêu tả tỉ mỉ về hình thái các chủng
vi nấm ký côn trùng và sự phân bố của chúng trong tự nhiên. Trong giai đoạn
này vấn đề sử dụng nấm có ích trong đấu tranh sinh học cũng được quan tâm
nghiên cứu. Người đi tiên phong trong lĩnh vực này chính là nhà khoa học
người Nga Ilya Ilich Mechnikov (1884). Ông cùng người học trò của mình là
nhà côn trùng học Isac Krasirsik đã tiến hành sản xuất bào tử nấm M.
anisopliae , trộn với đất bột để tung ra đồng ruộng diệt sâu non và trưởng
thành bọ đầu dại hại củ cải đường (Bothinoderes punctiventris) và đã đạt
được hiệu quả gây chết đến 55-80% sau 10-14 ngày[3].
Tiếp đó rất nhiều công trình nghiên cứu sản xuất và ứng dụng nấm có
ích phòng trừ sâu hại cây trồng. Các công trình tập trung nghiên cứu khả năng
nhân nuôi nấm và đã xác định được môi trường thích hợp để nhân sinh khối
một số chủng nấm như Cordyceps norvegica (Sopp U. J. ,1911), Euprocties
phacorhoca (Speare A. G. 1912) Entomophthorales sp (Wolff M., 1925)
[15]. Ở thời kỳ đó thì thành tựu này là một tiến bộ rất to lớn. Nó giúp vạch ra
phương hướng sử dụng vi sinh vật đấu tranh với côn trùng hại trên quy mô
lớn. Sau giai đoạn này các thí nghiệm về nhân sinh khối và sử dụng nấm ký
sinh để đấu tranh sinh học với các loại sâu hại đã được bổ xung và hoàn thiện
hơn bởi các nhà nghiên cứu khoa học người Nga như V.P. Pospelov (1932).
L.V. Chesnova (1959),…. Cũng trong khoảng thời gian này, tại Mỹ, Edward

8
9
Steinhaus (1944) là người đầu tiên thành lập phòng thí nghiệm về bệnh lý học
côn trùng thuộc trường Đại học tổng hợp Califonia ở Berkeley.
Trong những thập kỷ 60 đến 80 của thể kỷ trước, việc nghiên cứu nuôi
cấy các nấm ký sinh gây bệnh cho côn trùng hại đã được phát triển rất mạnh
mẽ. Trong đó phải kể đến các công trình nghiên cứu nhân nuôi và sử dụng các
loại nấm ký sinh côn trùng để phòng trừ các loại sâu hại cây trồng nông, lâm
nghiệp của Muller – Cogler E. (1961) Hall I.M. (1963-1964), Camera J. W.,
Mac – Bain (1963-1967), Ferron P. (1967), Madelin M.F. (1965-1966),
Ignoffo C.M. (1977),, H. D Burges và CS. (1982), N. K. Maniania và CS.
(1984) … Các công trình đã tập trung nghiên cứu rất tỷ mỷ về phương pháp
để nhân giống, các môi trường dinh dưỡng, các thiết bị nuôi cấy, phương
pháp thu bào tử từ sinh khối nấm, tạo chế phấm sinh học và sử dụng chúng
trên đồng ruộng(dẫn theo T. K. Chỉnh, 1996)[3].
Trong những năm gần đây, một loạt các công trình nghiên cứu sản xuất
và ứng dụng chế phẩm sinh học từ các nguồn nấm kí sinh côn trùng. Các chế
phẩm sinh học từ các nguồn nấm ký sinh có một vai trò quan trọng trong việc
phòng chống sâu hại cây trồng đồng thời bảo vệ môi trường và sức khỏe con
người (Noris et al., 2002; dẫn theo Sahayaraj K .et al. 2008) [15]
Tại Bắc và Trung Mỹ các công trình khoa học chủ yếu tập trung nghiên
cứu sử dụng các loại nấm ký sinh đề phòng trừ sâu đục thân ngô, ruồi trắng
hại khoai lang và các côn trùng sống trong đất như vòi voi hại rễ chanh, bọ
hung hại mía, côn trùng nhóm Scarab (Stimac J.L., 1994; L.L. Allee, 1998;
Hunter D. M, 2000; Frank D.C, Borets, 2004). Ở Mỹ các nhà khoa học đã
chú trọng nghiên cứu và sử dụng nấmPaecilomyces,M. anisopliae và B.
bassiana trong việc phòng trừ nhiều loại sâu hại, bao gồm sâu hại khoai tây,
bông, lúa mì đậu đỗ và ngô (Campell và CS, 1985; Hajek và CS., 1987;
9
10

Anderson và CS., 1988; Quintela và CS., 1990; Bing, 1991). Ở Canada đã
nghiên cứu ứng dụng nấm B. bassiana và Paecilomyces để phòng trừ châu
chấu hại lúa và loài rệp vừng (Heyden và CS, 1992). Còn tại các nước Mỹ La-
tinh mà điển hình là tại Brazil đã có nhiều công trình nghiên cứu với xu
hướng sử dụng nấm M. anisopliae và B. Bassiana,Paecilomyces để phòng trừ
côn trùng trong đất hại cây trồng (Lobolima và CS., 1992; Quitella và
CS.,1998; Fernandes E. K. và CS., 2008). Hiện nay tại Bzazi các chế phẩm
nấm ký sinh đã ứng dụng tới vài triệu hecta cây trồng.
Ở các nước Châu Âu như Đức, Anh, Italy, Séc, Balan và Rumani đã
tập trung nghiên cứu và ứng dụng nấm M. anisopliae để diệt côn trùng. Tại
Đức ứng dụng nấm diệt mối đất, sâu vòi voi hại nho (Hanel; Andersch và
Zimmerman) .Tại Nga chế phẩm Boverin phòng trừ thành công bọ cánh cứng
Colorado Beetle (Ferron 1978) . Một số nước Bắc Âu như Phần Lan, Thuỵ
Điển cũng đã có nhiều nghiên cứu sử dụng nấm có ích để phòng trừ sâu hại
cây trồng (Wandresch và CS ,1990; Vainio và CS 1990; Keller và CS 1993).
Còn tại Châu Á, các tác giả ở Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản, đã sử
dụng nấm Paecilomyces farinosus, B. bassiana (Am, Wu.) và M. anisopliae
để phòng trừ sâu róm thông Dendrolimus punctatus (Fan và CS), sâu đục thân
(Li), châu chấu hại lúa Locusta migratoria ( Lu và CS. 1993). Tại Malaysia,
nấm xanh Metarhizium anisopliae đã được nghiên cứu để phòng trừ mối đất
đạt hiệu quả 64,75% sau 14 ngày. Tại Philippines, đã nghiên cứu sử dụng
nấm xanh để diệt rầy nâu hại lúa đạt hiệu lực 60% sau 10 ngày. Năm 1986,
Rombach và cộng sự đã tiến hành phun nấm M. anisopliae, M. flavoviride, B.
bassiana và Hirsulella citriformis ở liều lượng 5 x 10
12
bt/ha phòng trừ rầy
nâu hại lúa và nhận thấy hiệu quả của chế phẩm đạt cao nhất sau 2 tuần [16].
10
11
Tại Nhật Bản, năm 1988 một số nhà khoa học đã sử dụng nấm xanh để phòng

trừ dòi hại rễ củ cải đạt hiệu quả trên 70%, sau 10 ngày.
Những năm 1985-1995, thế kỷ XX nhiều nhà khoa học ở Liên xô cũ,
Bungari đã nghiên cứu. ứng dụng thuốc nấm Beauverin trừ sâu hại rau và sâ
róm hại thông đạt kết quả tốt, hiệu quả trừ sâu róm thông đạt trên 90%, năng
suất ổn định và chất lượng an toàn(Videnova E. , K. Velichcova )[8].
Tại Châu Á, năm 1990 ở Philippin, tác giả R. Aguda và CS đã nghiên
cứu ứng dụng nấm B.bassiana trừ rầy nâu Nilaparvata lugens hại lúa , kết quả
phòng trừ đạt trên 70%[13].
Tại Úc, năm 1991 Miler đã nghiên cứu nấm M. anisopliae để phòng trừ
bọ hung hại mía trên đồng ruộng đạt hiệu quả 68%. Hiện nay trên thế giới đã
sản xuất và thương mại hóa thành công nhiều loại chế phẩm sinh học từ nấm
với tên thương mại như Cobican, Bioplast. Metarquino, Biogreen từ các
chủng nấm M. Anisopliae; chế phẩm Boverin, Boverol, Boverosil, Ostrinil,
Mycotrol WP, BotaniGard, Naturalis –L ( từ các chủng nấm B. bassiana
(Buut và Cropping 2000, 2001) và các chế phẩm Prefera, Peak Bardan,
Futureco Nofly có nguồn gốc từ nấm Paecilomyces fumosoroseus để phòng
trừ nhiều loại sâu hại cây trồng.
Năm 1995 tác giả Milner R. Đã lựa chọn được chủng M. Anisopliae từ
loài Antitrogus sp. và Lepidiota sp. với liều lượng LC
50
là 1x10
6
– 5x10
6
bào
tử/gam để phòng trừ bọ hung hại mía, tác giả ghi nhận thấy hiệu quả 87,6%
sau 10 ngày thí nghiệm, năng suất mía cao, chất lượng an toàn.
* Một số đặc điểm của nấm M.anisopliae và B.bassiana
Cuối thế kỷ XIX, đầu thế kỷ XX các nhà bệnh lý côn trùng trên thế giới
mới công bố nhiều công trình nghiên cứu về những chủng nấm có khả năng

diệt côn trùng hại cây trồng thông qua giám định và miêu tả. Năm 1944, tại
11
12
trường đại học tổng hợp California, nhà khoa học Edward Steinhaus, người
đầu tiên thành lập ra phòng thí nghiệm chuyên nghiên cứu về bệnh lý học côn
trùng bằng kính hiển vi điện tử, tác giả tập trung chủ yếu vào 2 chi nấm côn
trùng có triển vọng:
a- : Chi Beauveria
Vì nấm có mầu trắng nên thường gọi tên là nấm bạch cương hoặc nấm
trắng. Nhiều nước như Liên Xô cũ, Anh và Mỹ đã sản xuất thành công chế
phẩm nấm Beauveria với tên thương mại là Beauverin dựa vào động tố.
Trong chi này có 3 loài nấm chính có khả năng diệt côn trùng, đó là:
- Beauveria bassiana
- Beauveria tenella
- Beauveria brongniartii.
Trong 3 loài trên thì loài Beauveria bassianachiếm 85-90% tỉ lệ ký sinh trên
côn trùng hại cây trồng, vì thế nhiều nơi chỉ nghiên cứu nấmBeauveria
bassiana.
* Đặc điểm hình thái của nấm B. bassiana
NấmB.bassiana sinh ra những bào tử trần đơn bào(1 tế bào), không
mầu, hình cầu hoặc hình trứng, đường kính từ 1-4µm sợi nấm có đường kính
nằm ngang từ 3-5µm phát triển mạnh trên môi trường nhân tạo hoặc trên cơ
thể côn trùng, chúng mang nhiều giá sinh bào tử, phồng to ở phía dưới với
kích thước 3-5 x 3-6 µm. Các giá bào tử trần thường tạo thành các nhánh ở
phần ngọn hoặc trực tiếp tạo thành ra nhánh của giá, phần ngọn của bào tử có
dạng cuống hẹp hình dích zắc không đều.
*Độc tố của nấm B. Bassiana là Beauvericin
Năm 1696 R.L Hamill và cộng sự đã xác định được độc tố diệt côn
trùng của nấm bạch cương B. bassiana và đặt tên cho độc tố này là
12

13
Beauvericin. Năm 1971 Y.A. Ovehinnokov và cộng sự đã tổng hợp lại độc tố
này, tác giả Jame và cs đã xác định bản chất của độc tố sinh ra trong quá trình
trao đổi chất đó là vòng peptid có các sắc tố màu vàng tenelin và basianin,
những sắc tố này có thể do hydroxylat progesteron và những phần nhỏ tách ra
từ testosteron (C
19
H
28
O
2
) sinh ra. Về mặt hóa học, độc tố Beauvericin có danh
pháp là xyclo (N-metyl L-phenylalanin-D-α-hydroxy-izovaleryl).Đây là một loại
depxipeptid vòng, có điểm sôi khoảng 93-94
o
C. Từ một lít môi trường nuôi cấy
nấm Beauveria bassiana, các nhà khoa học Trung Quốc ở trường Đại học Tổng
hợp Nam Khai (Thiên Tân) đã tách được 1,5g độc tố Beauvericin và từ 1 kg môi
trường đặc các tác giả đã tách ra được 3,8 g Beauvericin.
*Cơ chế tác động của nấm B. bassiana lên cơ thể con trùng:
Trong tự nhiên khi bào tử nấm B. bassiana rơi vào cơ thể côn trùng,
thông qua tiếp xúc lây lan, gặp điều thời tiết thích hợp chỉ sau 12-24h thì bào
tử nấm nẩy mầm, chúng hình thành sợi đâm xuyên qua lớp vỏ kitin sau đó
phát triển bên trong cơ thể côn trùng, côn trùng phải huy động các tế bào bạch
huyết để chống đỡ những nấm Beauveria tiết độc tố Beauvericin có chứa
Proteaza và một số chất khác phá huỷ ngay cả tế bào bạch huyết, làm cho sâu
chết, sợi nấm mọc rất nhiều trong cơ thể sâu và sau đó chui ra ngoài, tạo ra
một lớp bào tử phủ trên cơ thể sâu[4].
*Triệu chứng của sâu nhiễm bệnh
Triệu chứng đặc trưng nhất là sự thay đổi các di động của côn

trùng, sự di động này tùy theo mức độ phát triển của bệnh. Khi bị bệnh các
mô dần dần bị phá hủy từng phần, lúc đầu côn trùng di động yếu sau ngừng
hẳn nằm im một chỗ cho đến khi chết.Khi bị bệnh nấm, vận động của côn
trùng ngừng từ 2-3 ngày thậm chí một tuần trước khi nấm phát triển đầy trong
thân côn trùng. Chỉ những côn trùng bị thương hay bị bệnh nấm, màu sắc toàn
13
14
thân mới thay đổi và xuất hiện những vết đen. Khi sâu hại bị bệnh do nấm B.
bassiana ở chỗ bào tử bám vào, nấm phát triển vào bên trong thân sâu tạo nên
một vệt đen không có hình thù nhất định. Côn trùng chết do nấm thường có
màu hồng, vàng nhạt, trắng và toàn thân cứng lại. Khi bị bệnh nấm thân côn
trùng bị ngắn lại hoặc khô là do hệ thống tiêu hóa bị tổn thương hoặc do thiếu
thức ăn. Vi sinh vật gây bệnh trên côn trùng thường tác động đến những mô
nhất định, côn trùng bị nấm B. bassiana ký sinh thì tuyến mỡ và các mô khác
bị hòa tan là do enzym lipaza và proteaza của nấm tiết ra, cũng chính nhờ đặc
điểm đó mà người ta có thể xác định được côn trùng bị bệnh là do động vật
nguyên sinh hay là do nấm bậc thấp (Coelomycidium, Entomophyhora ) gây
ra. Hiện tượng chết hoặc gắn liền với hiện tượng tiêu hủy mô là đặc trưng của
bệnh nấm, quá trình này tiến triển qua hai giai đoạn:
- Hiện tượng chấn thương: Các mô tổn thương bị phá hoại là do nấm từ
bên ngoài gây ra, trong trường hợp này các lympho máu đọng lại và mô tái
sinh được tạo nên trên bề mặt phần thân côn trùng bị chấn thương.
- Hiện tượng nhiễm trùng máu: của côn trùng khi bị bệnh nấm là do
lympho máu chứa đầy sợi nấm.
b- :Chi Metarhizium:
Nấm Metarhizium nằm trong nhóm nấm bất toàn Deuterumycetes, loài
nấm này có sự phát triển mạnh trên môi trường thạch, có mầu xanh tối với
kích thước 5-8µm lúc đầu mầu trắng – vàng, sau chuyển dần sang màu xanh
lục, nên gọi là nấm lục cương hay nấm xanh. Các nhà khoa học trên thế giới
nghiên cứu đã xác định chi nấm Metarhizium có 2 loài nấm chính ký sinh gây

bệnh trên côn trùng:
- Metarhizyum anisopliaaeký sinh chủ yếu trên bộ cánh bằng
Isoptera( mối)
14
15
bộ cánh thẳng Orthoptera(cào cào,châu chấu), bộ cánh đều, bộ cánh cứng
- Metarhizyum flavoviride ký sinh chủ yếu trên cá pha côn trùng bộ
cánh thẳng Orthoptera, bộ cánh cứng, 1 số sâu non bộ cánh vẩy
*Đặc điểm hình thái cơ bản:
Chi nấm Metarhizium có sợi nấm và bào tử lúc đầu có màu trắng rồi
chuyển sang màu xanh,cuống sinh bào tử ngắn:
Nấm Metarhizium favoviride: có bào tử trần hình oval hay hình trứng.
Nấm Metarhizium anisopliae: bào tử hình cổ chai hay hình trụ, hình hạt
đỗ. Kích thước bào tử khoảng 3,5- 6,4 µm, bào tử có màu lục xám đến màu
xanh oliu, chúng thường đứng riêng rẽ hoặc có thể xếp thành chuỗi.
*Độc tố của nấm Metarhizium:
Bao gồm 1 số ngoại độc tố Dextruxin A,B,C,D.
Dextruxin A có công thức nguyên là C
29
H
47
O
7
N
5
có điểm sôi là 188
0
C.
Dextruxin B có công thức nguyên là C
30

H
51
O
7
N
5
có điểm sôi là 234
0
C.
*Cơ chế tác động của nấm M. alisopliaelên cơ thể con trùng:
Cũng giống như nấm B. bassiana, khi bào tử nấm M. alisopliae rơi vào
cơ thể côn trùng, thông qua tiếp xúc lây lan trên côn trùng hại cây trồng [4]
2.3. Tình hình nghiên cứu ở trong nước
2.3.1. Tình hình nghiên cứu sâu bệnh hại cây hồi ở trong nước
* Thành phần sâu bệnh hại cây hồi
Qua các cuộc điều tra sâu bệnh hại cây trồng nông nghiệp các năm
1967-1968, 1977-1978, 1997-1998 và sâu bệnh hại rừng trồng 2000-2005
(Viện Bảo vệ thực vật, 1976; 1999a; 1999b; Bộ Nông nghiệp & PTNT, 2006)
cây hồi và sâu bệnh hại cây hồi hầu như không được quan tâm nghiên cứu.
15
16
Chỉ đến khi bọ ánh kim bùng phát mạnh ở Lạng Sơn mới có một số thông tin
về thành phần sâu bệnh hại trên cây hồi ở xã Yên Phúc huyện Văn Quan của
tỉnh Lạng Sơn mới được đăng tải, những thông tin này được trích dẫn từ một
báo cáo của một đề tài tốt nghiệp đại học từ những năm 1994-1995. Tại thời
điểm đó tác giả đã ghi nhận được 19 loài sâu hại, 5 loài bệnh gây hại trên cây
hồi và nguy hiểm hơn cả là loài sâu hại bọ ánh kim Oides leucomeleana Pic.
(Cao Anh Đương, 2012)[12].
Thành phần sâu hại họ bọ ánh kim Chrysomelidae điều tra được ở miền
Bắc nước ta năm 1967-1968 trên các cây trồng nông nghiệp và cây dại gồm

147 loài (Viện Bảo vệ thực vật, 1976). Kết quả điều tra ở miền Nam có số loài
thuộc họ ánh kim ít hơn rất nhiều so với tập hợp côn trùng họ ánh kim ở miền
Bắc, chúng chỉ có khoảng 20 loài và là những sâu hại thứ yếu (Viện Bảo vệ
thực vật, 1999a). Trên nhóm cây ăn quả số loài côn trùng họ ánh kim ghi nhận
được cũng không nhiều, chúng chỉ có 14 loài gây hại trên cây mận, đào, cam,
quýt, nhãn vải, táo hầu hết trong số chúng là sâu hại thứ yếu, chưa có tài
liệu nào ghi nhận về loài bọ ánh kim gây hại cây hồi ở Việt Nam (Viện Bảo
vệ thực vật, 1999b).
* Đặc điểm sinh học của một số loài sâu hại chính trên cây hồi
Những nghiên cứu về đặc điểm sinh học của côn trùng cánh cứng họ
ánh kim ở Việt Nam rất ít. Chỉ mới có một số loài như bọ ăn lá nâu vàng xanh
Phyllocharis undulata ăn lá cây mò hoa trắng và loài sâu gai hại ngô
Dactylispa balyi (Gestro) đã được nghiên cứu đặc điểm sinh học (Bùi Hải
Sơn, 1990). Nhưng những nghiên cứu này khá sơ sài và mới dừng lại ở việc
xác định được các tuổi, thời gian phát dục các pha và vòng đời của chúng mà
chưa khai thác được các đặc điểm sinh học khác như xác định được khoảng
nhiệt độ thích hợp và không thích hợp cho loài phát triển hay tỷ lệ chết của
loài qua các tuổi khác nhau Trong một vài số báo Nông nghiệp gần đây tác
16
17
giả Cao Anh Đương có đề cập đến loài bọ ánh kim hoa Oides leucomelaena
hại cây hồi mà tác giả đã từng nghiên cứu trong những năm 1994-1995, tác
giả đã ghi nhận loài bọ ánh kim (BAK) gây hại trên cây hồi từ tháng 2 đến
tháng 7-9 hàng năm, trứng được đẻ thành từng ổ trên những cành tăm và được
phủ một lớp sáp. Khi trứng mới được đẻ có màu trắng sữa, sau chuyển dần
sang màu xám ghi và dần đồng màu với vỏ cây hồi, trứng thường được đẻ rộ
vào khoảng tháng 6-8 và ấu trùng xuất hiện vào tháng 2-3 năm sau và rất có
thể loài bọ ánh kim này qua đông ở giai đoạn trứng (Cao Anh Đương, 2012).
* Biện pháp phòng trừ bọ ánh kim
Thực tế đã cho thấy biện pháp hóa học được một số bà con nông dân sử

dụng trong phòng chống BAK đều cho hiệu quả phòng chống không cao. Cao
Anh Đương đã nhận định biện pháp hóa học có hiệu quả rất kém trong phòng
trừ BAK hại cây hồi bởi khả năng bay của trưởng thành và địa lý đồi núi hiểm
trở cũng như phương tiện bơm phun không phù hợp. Biện pháp canh tác có hiệu
quả tốt trong giảm mật độ BAK hại hổi. Việc vệ sinh đồng ruộng, dẫy cỏ và phá
nơi làm tổ của nhộng hay trong khi thu hái quả hồi tiến hành tiêu diệt ổ trứng của
BAK là một trong những giải pháp tốt giảm mật độ BAK cho vụ hồi sau (Cao
Anh Đương, 2012).
Những nghiên cứu về sâu bệnh hại cây hồi cũng như loài BAK hại cây
hồi ở Việt Nam còn khá hiếm và sơ sài. Cho đến nay mới chỉ có duy nhất
thông tin về tổng số loài sâu bệnh đã xác định được và một số đặc điểm sinh
học của loài BAK đã được nghiên cứu trong một báo cáo tốt nghiệp đại học
năm 1994-1995.
2.3.2. Tình hình nghiên cứu các chủng nấm gây hại côn trùng trong nước
Ở nước ta hướng ứng dụng nấm ký sinh công trùng để phòng trừ sâu hại
cây trồng được đề cập đến trong những năm 70 của thế kỷ trước, nhưng trong
15 năm trở lại đây mới có nhiều công trình nghiên cứu được công bố về lĩnh
17
18
vực này. Các công trình nghiên cứu về nấm ký sinh côn trùng tại nước ta chủ
yếu tập trung vào công tác thu thập chủng, phân lập các chủng giống bản địa
và phát triển sinh khối tạo chế phẩm sinh học phòng trừ các loại sâu mà bị
chính chủng nấm đó ký sinh.
Năm 1981 GS.TS Nguyễn Lân Dũng nghiên cứu nấm lục
cươngMetarhizium mô tả hình thái, phân tích cơ chế tác dụng, hướng dẫn
cách phân lập nuôi cấy và phương pháp sản xuất sinh khối Metarhizium[5].
Từ năm 1992, Phạm Thị Thùy và cs thuộc viện Bảo vệ thực vật đã phân
lập, nuôi cấy và thử nghiệm các chủng Metarhizium thuộc 2 loàiMetarhizium
anisopliae và Metarhizium flavoviride để phòng trừ cho các loài sâu bọ hại
cây nông, lâm nghiệp bằng phương pháp phun trực tiếp bào

tử Metarhizium trên đồng ruộng.
Năm 1996, Tạ Kim Chỉnh đã phân lập, nuôi cấy một số
chủngM.anisopliae và thử nghiệm để diệt châu chấu di cư và các loài sâu
bệnh hại cây nông nghiệp[3].
Phạm Thị Thùy và cộng sự (2002 - 2003), đã nghiên cứu sử dụng
nấmM.anisopliae để diệt bọ hại dừa cho tỉnh Bình Định bằng phương pháp
phun trực tiếp.Kết quả cho thấy chế phẩm nấm M. anisopliae đều có hiệu quả
cao với ấu trùng và trưởng thành của bọ dừa, đặc biệt là hiệu quả kéo dài đến
8 tuần sau phun.Điểm giá trị nhất của chế phẩm nấm là hiệu quả kéo dài,nấm
không gây ô nhiễm môi trường và nguy hiểm đối với con người, không làm
mất đi những loài kí sinh thiên địch có ích khác[6].
Từ năm 1998 đến năm 2002, Trịnh Văn Hạnh và cs ở Trung tâm
nghiên cứu phòng trừ mối đã nghiên cứu tuyển chọn các
chủng Metarhiziumcó hiệu lực cao để phòng trừ các loài gây hại điển hình ở
nước ta, như loài mối nhà nguy hiểm nhất Coptotermes formosanus Shiraki.
18
19
Chế phẩm Metarhizium từ nghiên cứu của Lê Thùy Quyên để diệt trừ
các loài sâu xanh bướm trắng, sâu khoang ăn lá và đặc biệt là khả năng tiêu
diệt được một số loài côn trùng hại cây trồng trong đất như bọ hung, mối đất.
Nấm có hiệu quả cao để phòng trừ bọ hung đen ăn mía, mối đất ăn thông
trắng, bồ đề, hại cây điều, cây ăn quả, sâu xanh bướm trắng ăn su hào, bắt cải,
sâu khoang hại cà chua…cho kết quả diệt trừ sâu bệnh hơn 70%.
Viện Bảo vệ thực vật đã nghiên cứu và sử dụng nấm Me.anisopliae và
B.bassiana để phòng trừ một số sâu hại cây trồng (Phạm Thị Thuỳ, 1994).
Bào tử nấm Metarhizium có khả năng gây chết trên 50% (LT50) cá thể các
loại sâu bộ cánh vảy như sâu xanh da láng Spodoptera exigua, sâu xanh
Heliothis armigera với lượng là 10
5
bt/ml sau 48 giờ (Tạ Kim Chỉnh, Lý Kim

Bảng, 1995). Nấm xanh M.anisopliae được ứng dụng vào việc quản lý sâu rầy
hại lúa (Nguyễn Thị Lộc, 1997, 2001). Việt Nam cũng đã có sản phẩm với tên
thương mại là Mat được chế từ nấm xanh M.anisopliae trừ bọ cánh cứng hại
dừa và Boverit trừ sâu róm thông và các loại sâu hại cây trồng khác (Viện
Bảo vệ thực vật, 2001) .
Năm 2002 Trung tâm sinh học - Viện bảo vệ thực vật đã nghiên cứu
hoàn thiện quy trình nhân sinh khối nấm B.bassiana, trên cơ sở cải tiến môi
trường nhân sinh khối với việc bổ xung 10% trấu và một số phụ gia vào môi
trường cơ bản. Với quy trình này đã sản xuất chế phẩm nấm B.bassiana đạt
lượng bào tử 2,5 x10
9
bt/g. Còn đối với nấm M.anisopliae nhóm đề tài đã sử
dụng với nguyên liệu là tấm gạo, luộc rồi sấy khô, hỗn hợp với dịch CaCO
3
0,5% để nhân lượng lớn sinh khối nấm với lượng bào tử đạt 3,2 x 10
9
bt/g. Đã
hoàn thiện công nghệ sản xuất theo phương pháp lên men xốp bằng các
nguyên liệu rẻ tiền (Nguyễn Thị Chúc Quỳnh và CTV, 2009; Lê Văn Trịnh và
CTV 2010) [7]. Hai chế phẩm nấm do Trung tâm sản xuất với tên thương mại
là Mat và Boverit đã được đưa vào danh mục thuốc bảo vệ thực vật được
19
20
phép sử dụng ở Việt Nam năm 2001.
Từ năm 1996 đến nay, Trung tâm Đấu tranh sinh học - Viện Bảo vệ
thực vật đã thu thập, phân lập, tạo thuần và tuyển chọn được 28 chủng (10
chủng Beauveria và 18 chủng Metarhizium) trên các loại sâu hại khác nhau
tại các tỉnh phía Bắc và phía Nam. Trong số đó đã chọn được 4 chủng có hoạt
lực diệt côn trùng rất cao và hiện đang sử dụng để sản xuất chế phẩm là 2
chủng B.bassiana và M.anisopliae ở phía Bắc, 2 chủng B.bassiana và

M.anisopliae ở phía Nam. Hai chế phẩm nấm với tên thương mại là Mat và
Boverit đã được đưa vào danh mục thuốc bảo vệ thực vật được phép sử dụng
ở Việt Nam vào năm 2001, để phòng trừ sâu tơ hại rau, rầy nâu hại lúa, bọ
cánh cứng hại dừa, sâu róm hại thông và một số loại sâu hại cây trồng nông
lâm nghiệp khác . Về công nghệ sản xuất, các cơ sở nghiên cứu ở trong nước
đã ứng dụng và phát triển các công nghệ đã có trên thế giới trong đó chủ yếu
là công nghệ lên men xốp. Đồng thời đã cải tiến một số khâu trong quy trình
sản xuất cho phù hợp với điều kiện của nước ta. Đã hoàn thiện công nghệ sản
xuất B.bassiana theo phương pháp lên men xốp bằng các nguyên liệu rẻ tiền.
Đối với nấm M.anisopliae các tác giả đã sử dụng với nguyên liệu là tấm gạo,
luộc rồi sấy khô, hỗn hợp với dịch CaCO
3
0,5% để nhân lượng lớn sinh khối
với lượng bào tử 3,2 x 10
9
bt/g (L. V. Trịnh và CS, 2010).
Trung tâm Đấu tranh sinh học - Viện Bảo vệ thực vật trong một vài
năm trở lại đây đãquan tâm nghiên cứu một số chủng có tiềm năng trong
phòng trừ sinh học đối với một số loại sâu miệng chích hút. Năm 2010, nhóm
nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng thuộc Trung tâm, đã tiến hành thu thập
phân lập được một số nguồn nấmký sinh trên rầy nâu, rầy xám, rầy lưng trắng
hại lúa. Đánh giá bước đầu cho thấy, đây là những nguồn nấm có nhiều triển
vọng để phát triển chế phẩm sinh học phòng một số loài rầy hại lúa. Đã sản
20
21
xuất được 2.355kg Beauveria và 3.275kg Metarhizium sử dụng trừ sâu keo da
láng, sâu khoang ăn lá đậu tương và sâu xanh đục quả đậu xanh. Hiệu quả của
Beauveria với sâu xanh là 68,2% - 72,3%, còn của Metarhizium đạt từ 69,2-
75,1%, hiệu quả của nấm Metarhizium trừ bọ hại dừa ở các tỉnh phía Nam
như Bến Tre, Bình Định, Bà Rịa Vũng Tàu đạt 63,63% - 81,42%.

Trên cây ăn quả, kết quả của mô hình trình diễn trên cam, quýt, bưởi ở
tỉnh Tiền Giang cho thấy, chế phẩm nấm M. anisopliae có hiệu quả cao với
rầy mềm hại cam quýt, đạt tới 83,3 % còn đối với rầy chổng cánh hại cam
quýt cũng đạt được 70,4%. Hiệu quả kinh tế của mô hình sử dụng chế phẩm
nấm đạt lợi nhuận cao hơn đối chứng 1.682.000 đồng/ha (N.T Lộc, 2006).
21
22
Phần II: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
3.1. ĐÔI TƯỢNG VÀ NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
3.1.1 Đối tượng nghiên cứu
- Chủng nấm M.anisopliaevàB.bassianaký sinh bọ ánh kim hại hồi đã được
phân lập tại Viện bảo vệ thực vật.
- Bọ ánh kim hại hồi( Oides sp. ).
- Cây hồi giống.
3.1.2. Dụng cụ thí nghiệm
- Nồi hấp vô trùng, tủ sấy vô trùng, buồng cấy vô trùng
- Tủ lạnh, tủ định ôn, kính hiển vi
- Đèn cực tím, đèn cồn
- Đĩa petri, bình tam giác
- Que cấy, pipet, bông, giấy thấm
- Một số dụng cụ cân đong khác.
3.1.3. Nguyên vật liệu, hoá chất
Nguyên liệu: sử dụng các nguyên liệu rẻ tiền như bột ngô mảnh, cám
gạo, gạo, bột đậu tương, bã bia.
Hoá chất:
- Agar
- Đường: Glucose, Sacharose
- Pepton, chất bám dính.
- Một số hóa chất khác.

3.1.3. Phạm vi nghiên cứu
- Phân lập và làm thuần 2 chủng nấm M.anisopliae và B.bassiana trong phòng
thí nghiệm.
22
23
- Đánh giá khả năng ký sinh của chủng nấm M.anisopliae và B.bassiana
trong phòng thí nghiệm, nhà lưới, ngoài đồng ruộng.
3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu
- Địa điểm:Viện Bảo Vệ Thực Vật – phường Đức Thắng – Đông Ngạc –
quận bắc Từ Liêm – Hà Nội.
-Thời gian thực hiện: từ ngày 1/3/2014 đến 7/6/2014.
3.3. Nội dung nghiên cứu
- Đánh giá khả năng ký sinhcủa chủng nấm M.anisopliaevàB.bassiana đối với
bọ ánh kim.
- Phân lập lại và làm thuầnchủng nấm M.anisopliae vàB.bassiana
- Xác định môi trường thích hợp để nhân sinh khối
nấmM.anisopliaevàB.bassiana
- Đánh giá hiệu quả gây chết bọ ánh kim của chủng nấm
M.anisopliaevàB.bassiana trong phòng thí nghiệm và nhà lưới
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1.Đánh giá khả năng ký sinh bọ ánh kim hại hồi ( Oides sp. ) của một
số nguồn nấm đã được phân lập tại Viện bảo vệ thực vật
Thí nghiệm đánh giá khả năng ký sinh gây chết bọ ánh kim của các
dòng nấm ký sinh trong điều kiện phòng thí nghiệm được bố trí 4 công thức,
mỗi công thức tương ứng với một dòng nấm đã phân lập được, các thí nghiệm
sử dụng nồng độ 1.10
8
bt/ml:
CT 1: Metarhizium anisopliae ( MaBAK)
CT 2: Beauveria bassiana (BbBAK)

CT 3: Paecilomyces javanicus (PaeR)
CT 4: Đối chứng phun nước lã
23
24
Mỗi công thức 5 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại thử nghiệm trên 10 cá
thể sâu tuổi 2-3 (đặt trong phòng thí nghiệm). Sâu khoẻ mạnh được chuyển từ
Lạng Sơn về.
Trước khi phun tiến hành phun thử vào bình định mức để xác định số
lần phun/hộp. Sau đó tiến hành phun dung dịch nấm ướt đều lá các hộp đã
thả sâu non BAK tuôi 2-3.
Hiệu lực gây chết sâu được tính theo công thức Abbott.
C
a
- T
a
M(%) = x 100
C
a
trong đó: M: tỉ lệ (%) chết
C
a
: Số sâu sống ở công thức đối chứng sau thí nghiệm.
T
a
: Số sâu sống ở công thức thí nghiệm sai thí nghiệm.
3.4.2. Phân lập lại và làm thuầnchủng nấmM.anisopliaevàB.bassiana
Các mẫu sâu nhiễm nấm tiến hành lấy nguồn nấm cấy trên môi trường
PDA (Peptone Dextroza Agar)+ kháng sinh streptomycin.
Phân lập tạo tảng nấm điển hình. Sau đó cấy chuyển để làm thuẩn.
Sau khoảng 24-48h cấy chuyển tiến hành cắt đỉnh sinh trưởng (WA) và

cấy sang môi trường mới.
Định loại các chủng nấm có ích dựa trên kỹ thuật truyền thống và khóa
phân loại của H. L. Barnett và Barry B. Hunter.
+Phân lập, tạo dòng thuần các nguồn nấm đã thu thập được
Phân lập, làm chủng thuần các nguồn nấm ký sinh BAK hại hồi theo
phương pháp nghiên cứu vi sinh thường áp dụng tại Việt nam[9,10,11].
Bước 1: Nấu môi trường PDA với thành phần 200g khoai tây, 20g Agar
và 5g đường Dextrose trong 1000ml nước (khoai tây thái lát đun sôi ở 100
0
C
trong thời gian 20 phút và lọc lấy dịch chiết sau đó cho agar và đường vào).
24
25
Khử trùng môi trường PDA trong nhiệt độ 121
0
C (áp xuất 1 atm) trong thời
gian 30 phút, sau đó để nguội khoảng 55
o
C và bổ xung kháng sinh
streptomycin 0,1%. Đổ môi trường ra đĩa petri (đã được sấy khử trùng ở
250
o
C trong 2,5 giờ) và để nguội.
Bước 2: Cấy phân lập mẫu nấm: Tiến hành vệ sinh mẫu nấm kí sinh,
dùng que cấy đã khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, sau đó làm nguội và chấm
nhẹ vào điểm có bào tử đặc trưng của các nguồn nấm ký sinh trên cơ thể rầy
và không bị nhiễm tạp sau đó cấy ria nhẹ lên bề mặt môi trường. Để đĩa môi
trường cấy phân lập trong phòng thí nghiệm 2-3 ngày, thấy khuẩn lạc đặc
trưng của nấm xuất hiện thì tiến hành cấy tách ra các đĩa môi trường khác
nhau để làm thuần chủng.

+ Phương pháp tách đơn bào tử tạo dòng thuần nấm M.anisopliae và
B.bassiana
Tạo dòng nấm thuần bằng phương pháp tách đơn bào tử trên đĩa thạch
WA. Bằng cách dùng que cấy thuỷ tinh chấm nhẹ vào bề mặt khuẩn lạc, rồi
cấy vào đĩa thạch môi trường WA. Sau đó dùng trang thuỷ tinh trang đều ra
bề mặt đĩa thạch và để đĩa thạch đó trong điều kiện phòng thí nghiệm. Sau
khoảng 12 - 24 giờ tiến hành soi đĩa nấm đó bằng kính lúp để bàn để sát bào
tử nấm nảy mầm. Khi thấy bào tử nảy mầm, dùng que cấy có đầu nhọn hình
lưỡi mác cắt riêng phần thạch chứa bào tử đó cấy sang đĩa môi trường khác,
sau đó để đĩa có chứa đơn bào tử đó trong điều kiện phòng thí nghiệm
3.4.3.Xác định môi trường thích hợp để nhân sinh khối nấm
Với nấm M.anisopliae
Thí nghiệm được tiến hành với 3 công thức khác nhau:
1/ MT1:Cám gạo 50gam + bột ngô mảnh 30gam + bã bia20gam
2/ MT2: Gạo hấp chín 100 gam.
3/ MT3: Bột ngô mảnh80 gam + bã đậu phụ 20g
25