Phân lập và tuyển chọn chủng vi sinh vật sinh tổng hợp protease tham gia quá trình phân hủy xác động vật



Trong những năm gần đây, nông nghiệp là một trong những ngành đóng
góp quan trọng trong nền kinh tế Việt Nam, trong đó chăn nuôi chiếm một vị trí
không nhỏ. Cùng với sự phát triển khoa học kỹ thuật, các trang trại chăn nuôi
gia súc, gia cầm ngày càng được mở ra với quy mô lớn, kèm theo nhiều vấn đề
bất cập cần được giải quyết.
Các dịch bệnh nguy hiểm như lở mồm long móng, cúm gia cầm H5N1,
tai xanh v.v… liên tiếp xảy ra đã và đang gây thiệt hại kinh tế cho người chăn
nuôi và tiềm tàng mối nguy gây ô nhiễm môi trường sống. Chăn nuôi với quy
mô lớn phát sinh một lượng lớn chất thải ra môi trường.
Việc đào thải xác động vật và các chất thải ra môi trường bên ngoài, đặc
biệt là môi trường nước không những gây ô nhiễm nặng nề cho môi trường sống
do sự phân hủy các thành phần hữu cơ trong xác chết mà còn vô tình tạo điều
kiện thuận lợi cho mầm bệnh cư trú, phát triển và có thể bùng phát thành dịch
bệnh khi có điều kiện thuận lợi.
Để ngăn ngừa nguy cơ gây ô nhiễm môi trường và bùng phát dịch bệnh,
các biện pháp như chôn lấp, thiêu hủy đã được sử dụng để xử lý lượng lớn xác
động vật. Tuy nhiên các phương pháp này đều chưa thật sự an toàn đối với môi
trường và con người. Ủ phân (composting) được coi là phương pháp xử lý
“sạch” đối với môi trường, với nhiều ưu điểm như đơn giản, ít tốn kém, và tạo ra
được nguồn nguyên liệu hữu cơ để làm phân bón cho cây trồng. Tuy nhiên, thời
gian xử lý kéo dài, chiếm nhiều diện tích, và gây mùi khó chịu lại là nhược điểm
lớn khiến nhiều trang trại e ngại khi lựa chọn phương pháp này để xử lý nguồn
chất thải chăn nuôi và xác động vật chết sau mỗi đợt dịch.
Sử dụng vi sinh vật trong các quá trình sinh học đang trở thành một giải
pháp an toàn, hiệu quả, và thực sự thu hút sự quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà
khoa học. Nhiều kết quả nghiên cứu trong lĩnh vực này đã được ứng dụng thành
công, như sử dụng vi sinh vật trong sản xuất bia, rượu, xử lý ô nhiễm dầu trên
biển, hay phân hủy chất thải hữu cơ. Từ những đánh giá tổng quan trên, chúng
tôi đã thực hiện đề tài “Phân lập và tuyển chọn chủng vi sinh vật sinh tổng

hợp protease tham gia quá trình phân hủy xác động vật” .
1

Phân lập chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp protease mạnh để
sản xuất chế phẩm vi sinh thúc đẩy quá trình phân hủy xác động vật, góp phần
giảm thiểu ô nhiễm môi trường, lây lan mầm bệnh.

Đóng góp những dữ liệu khoa học mới về khả năng ứng dụng các vi sinh
vật nhỏ bé trong xử lý lượng chất thải khổng lồ các xác chết động vật sau những
dịch bệnh lớn đang xảy ra với tần suất ngày càng liên tiếp.

Đề xuất giải pháp xử lý nhanh, hiệu quả và an toàn với môi trường sống
lượng xác động vật nuôi chết do dịch bệnh và nguồn chất thải khổng lồ của
ngành chăn nuôi, góp phần xây dựng sự phát triển bền vững của ngành chăn
nuôi nói riêng, và nền kinh tế nói chung.
2

!"#$%&%'()"*+%,
-- ../012345678/90:;<67
--- ..34560:;=>?
Trong nhiều năm gần đây, việc xảy ra liên tiếp nhiều dịch bệnh nguy hiểm
ở động vật nuôi như bò điên, lở mồm long móng, cúm gia cầm H5N1 v.v… đã
khiến số lượng động vật nuôi bị chết và tiêu hủy trở nên quá tải đối với mọi biện
pháp xử lý [14]. Theo thống kê tính đến tháng 12 năm 2005, đại dịch cúm H5N1
đã khiến hơn 150 triệu chim nuôi và hàng chục nghìn chim di cư bị chết hoặc
tiêu hủy [16]. Dịch bệnh LMLM điển hình nhất là đại dịch diễn ra ở Anh năm
2001 đã khiến 7 triệu bò và cừu bị giết chết [13], năm 1967 đã tiêu hủy 44.200
động vật nuôi, ước tính giá trị thiệt hại lên tới 370 triệu bảng, và ở Đài Loan
năm 1997 đại dịch này cũng đã khiến 3,8 triệu lợn bị tiêu hủy, gây thiệt hại 6,9 tỉ
đô la cho ngành chăn nuôi của quốc gia này. Dịch bệnh bò điên, mặc dù phạm vi

phát tán bệnh không rộng song cũng gây hậu quả nặng nề, điển hình là ở Anh
năm 1984 đã khiến 179 bò bị nhiễm bệnh và 4,4 triệu bò bị tiêu hủy [14].
--- ..34560:;9'6/
Ở Việt Nam, theo đánh giá của Ngân hàng Thế giới (WB), nghành chăn
nuôi cũng là một trong những lĩnh vực phát triển nhanh nhất và dự kiến năm
2020 sẽ đóng góp 42% vào GDP nông nghiệp của quốc gia. Tuy nhiên, chính sự
phát triển và mở rộng quy mô sản xuất đã khiến việc xử lý nguồn phế thải và
xác động vật chết do thiên tai và dịch bệnh trở thành một vấn đề đau đầu của
ngành chăn nuôi nói riêng và cả thế giới nói chung. Tính trong năm 2005, Việt
Nam là một trong những quốc gia chịu nhiều tổn thất nặng nề bởi dịch cúm
H5N1, số lượng gia cầm bị chết và tiêu hủy được thống kê cũng lên tới con số
1,2 triệu. Trong những năm gần đây, tình hình dịch cúm gia cầm diễn biến rất
phức tạp. Theo thống kê của Cục Thú y trong năm 2008, dịch bệnh đã tái phát
tại 27 tỉnh, thành, có 96 ổ dịch đã xảy ra tại các hộ chăn nuôi với tổng đàn gia
cầm chết và tiêu hủy là 75.170 con gồm có 29.048 con gà, 43.157 con vịt, 2.965
con vịt xiêm. Dịch bệnh LMLMvới nhiều đợt bùng phát và tốc độ lây lan nhanh
chóng đã gây nhiều tổn thất to lớn cho ngành chăn nuôi. Quý IV/2004, Cục Thú
y thông báo tình hình dịch bệnh LMLM tại các tỉnh diễn biến rất phức tạp,
LMLM do virus type A trên trâu bò đã xảy ra tại 10 tỉnh, bệnh LMLM type
3
A trên heo tại 4 tỉnh, Trong khi đó 80-85 % heo hơi và 98 % trâu bò hơi từ các
tỉnh, thành của cả nước đưa về thành phố Hồ Chí Minh giết mổ hay đã giết mổ
sẵn từ các tỉnh lân cận đưa về tiêu thụ. Tình hình bệnh tai xanh ở lợn thể độc
lực cao xảy ra tại 26 tỉnh thành. Tại khu vực phía nam dịch đã xảy ra tại Lâm
Đồng, Bà Rịa – Vũng Tàu, Tây Ninh, Vĩnh Long, Bến Tre, Bình Phước, Bạc
Liêu gây nhiều thiệt hại cho ngành chăn nuôi và ảnh hưởng đến sức khoẻ người
dân. Đây thực sự là những lượng phế thải khổng lồ mà ngành chăn nuôi của mỗi
nước phải hứng chịu và phải đau đầu để tìm ra giải pháp xử lý hiệu quả, đồng
thời đảm bảo an toàn môi trường, tránh gây lây lan dịch bệnh. Ở Việt Nam, vấn
đề này càng phải được quan tâm và xử lý chặt chẽ bởi do ý thức bảo vệ môi

trường của người dân không cao, mặc khác người ta nằm trong vùng khí hậu
nhiệt đới ẩm gió mùa là điều kiện thuận lợi để gây phát tán mầm bệnh nếu như
lượng chất thải trên không được thu gom và xử lý kịp thời.
Bên cạnh đó, các loại phế phẩm từ ngành công nghiệp chăn nuôi như
phân, nước thải, thức ăn thừa v.v… và đang thu hút sự quan tâm nhiều nhất hiện
nay đó là phụ phẩm của ngành giết mổ đang trở thành các nguồn có nguy cơ cao
gây ô nhiễm môi trường. Theo thống kê của Cục Chăn nuôi, lượng chất thải rắn
do vật nuôi thải ra bao gồm phân, các chất độn chuồng, thức ăn thừa, xác gia
súc, gia cầm chết, chất thải lò mổ v.v… trong năm 2008 là 80,49 triệu tấn. Song,
ước tính hiện nay, chỉ có khoảng 40% lượng chất thải này được xử lý. Số còn lại
thường được thải thẳng ra ao, hồ, kênh, rạch v.v… gây ô nhiễm nặng nề cho môi
trường sống.
--%@ABCA@ADEFGD@0:;
Xử lý động vật chết có thể được thực hiện bởi nhiều phương pháp khác
nhau. Một số phương pháp xử lý xác động vật và phụ phẩm của ngành chăn
nuôi thường gặp là thiêu hủy (incineration), chôn lấp (burial) và ủ làm phân trộn
(composting) [16].
---BCA@A<FHA
Phương pháp chôn lấp là đặt đối tượng như xác chết động vật, phụ phẩm
động vật vào trong lòng đất thông qua hố, hào, được phủ lên trên bằng một lớp
đất. Chôn lấp là một trong những phương pháp được sử dụng sớm nhất.
Động vật chết sẽ được chôn lấp trong hố hoặc hào, hoặc được đắp thành
ụ. Chôn cất phải được thực hiện theo các hướng dẫn sau đây (hình 2.1):
4
- Chôn lấp phải được thực hiện ở khu vực xa nhất có thể. Khu chôn lấp
được bố trí cách xa giếng, suối và các nguồn nước khác tối thiểu là 9,1 km
hoặc cách xa vùng đất thường xuyên bị ngập lụt.
- Phần đáy của hố chôn phải cách mực nước ngầm, hoặc các vết gãy địa
chất ít nhất 60cm. Đất ở khu vực chôn lấp cần phải được kiểm tra để đảm bảo
tính phân hủy tốt xác động vật.

- Hố chôn phải có độ sâu khoảng 160 – 180cm, và có độ dốc ổn định.
- Động vật chết được đặt gọn trong hố chôn, cách miệng hố 60cm. Lớp
phủ mặt phía trên và xung quanh xác động vật bị chôn được tối thiểu là 90cm.
Lớp phủ trên cùng phải thoát nước được, tránh để nước bị ứ đọng lại.
- Tất cả các dòng chảy bề mặt phải được chuyển vào một rãnh thoát nước
dẫn ra khỏi hố.
- Khu chôn lấp phải được kiểm tra thường xuyên và được bồi đầy đất ở
những chỗ bị lún. Ở những vùng điều kiện đất không đáp ứng cho việc chôn xác
động vật thì được xử lý bằng cách lấp. Xác được đặt trên mặt đất và phủ đất lên
trên một lớp dày 90 cm. Ụ đất chôn phải có thành để ngăn nước từ các ao, hồ
xung quanh tràn vào [12].
.--2<D@0:;F?IJ=F'KL:L3L=-MNNOP
.--8.2Q1R:=0F?:?
37SIT$KMNNUP-
5
.-V-8.2Q1R:=0W:?3
7SIT$KMNNUP-
.-X-8.2Q1RYMZM[/M=0
Y/M3Q87SIT$KMNNUP-
.-U-8.21RD@0:;F?IT$KMNNUP-
Một số phương pháp chôn lấp khác được trình bày ở các hình 2.2, 2.3, 2.4, 2.5.
Phương pháp chôn lấp là phương pháp dễ thực hiện, không yêu cầu công
nghệ cao và chi phí thấp nên rất được sử dụng rất phổ biến. Bên cạnh đó, chôn
lấp là giải pháp ưu tiên để xử lý xác động vật khi xảy ra dịch, hoặc thảm họa lũ
lụt vì có hiệu suất xử lý lớn.
Song thời gian chôn lấp kéo dài, xảy ra quá trình lên men kỵ khí tạo các
loại khí có mùi và nguy hại như H
2
S, NH
3

, CH
4
, CO
2
, NO
x
, SO
x
,… Đồng thời,
phát sinh một lượng lớn nước rò rỉ từ các hố chôn, có khả năng gây ảnh hưởng
xấu cho môi trường, và dễ dẫn đến nguy cơ bùng phát dịch bệnh nguy hiểm
trong cộng đồng dân cư. Đối với bãi chôn lấp cũ (không hợp vệ sinh): không có
lớp lót đáy, không có hệ thống thu gom và xử lý khí thải và nước thải. Vì thế,
mặc dù chi phí chôn lấp thấp nhưng tốn nhiều diện tích nên chi phí đất cao, chi
6
phí xử lý môi trường sau khi chôn lấp cũng rất cao, những tác động đến môi
trường và sức khoẻ cộng đồng là nghiêm trọng và lâu dài.
Công nghệ chôn lấp hợp vệ sinh, có thu gom và xử lý nước rác và khí bãi
rác, kể cả có và không thu hồi năng lượng, thì chi phí đầu tư cũng rất lớn (cho
giá trị đất sử dụng, hệ thống xử lý gas và động cơ gas phát điện), chi phí vận
hành cao nên giá thành sản xuất điện cao, thị trường tiêu thụ khó chấp nhận.
---BCA@A\7
Phương pháp thiêu hủy sử dụng các nguồn nguyên liệu phụ trợ như
propan, diesel hoặc khí gas tự nhiên được coi là đảm bảo về mặt an toàn sinh
học. Phương pháp thiêu hủy cũng là một trong các phương pháp lâu đời để xử lý
xác chết và phụ phẩm động vật. Phương pháp này được nhiều nước phát triển sử
dụng vì nó có một số ưu điểm như không đòi hỏi nhiều diện tích đất, do đó giảm
được thể tích chôn lấp, loại bỏ được các mầm bệnh song không hoàn toàn do
hiệu suất xử lý không cao và gây ô nhiễm không khí nghiêm trọng do sản sinh ra
nhiều chất độc hại như dioxin, NO

x
, SO
x
[15], lại tốn kém hơn do chi phí đầu tư
và bảo trì rất cao so với các phương pháp khác. Tại các lò thiêu hủy cũng đòi hỏi
các nhân viên vận hành phải có trình độ cao. Ngoài tác động thứ cấp do một
lượng các chất khí độc hại, sau khi đốt tạo ra một lượng tro không phân hủy
được từ các bộ phận như sừng, móng hoặc xương động vật, nếu không xử lý tốt
thì sẽ tạo ra một lượng bụi không khí, và gây tác động xấu đến môi trường và
sức khỏe con người.
--V-BCA@A\AR
Ủ phân được hiểu là quá trình phân hủy sinh học hiếu khí các chất hữu cơ
đến trạng thái ổn định dưới tác dụng của oxy và sự hoạt động của vi sinh vật, tạo
thành sản phẩm giống như mùn gọi là compost. Đây là phương pháp xử lý xác
động vật được áp dụng để tận dụng giá trị dinh dưỡng còn lại từ sản phẩm ủ làm
phân bón phục vụ cho ngành nông nghiệp.
Phương pháp ủ phân đang được coi là giải pháp có nhiều triển vọng với
nhiều ưu điểm như giá thành thấp, dễ tiến hành với các nguồn nguyên liệu thô
và trang thiết bị máy móc sẵn có ở nông trại, nguy cơ gây ô nhiễm không khí
thấp. Ngoài ra trong quá trình xử lý, các đống ủ thường được duy trì ở nhiệt độ
cao trong một thời gian dài (130
0
F – 150
0
F) nên tạo điều kiện giết chết các mầm
bệnh, cỏ dại và ấu trùng bay [12].
Quá trình ủ thường gồm 3 giai đoạn:
7
- Tiền xử lý rác (cắt nhỏ, bổ sung chất dinh dưỡng, trộn chế phẩm, )
- Ủ (phân hủy ổn định sinh học chất hữu cơ)

- Xử lý sau ủ (nghiền, sàng, đóng gói,…)
Giai đoạn ủ đòi hỏi kiểm soát tốt các điều kiện: độ ẩm (50-60%), nhiệt độ
(40-55
0
C), pH (7-7.5), oxy (thông khí ), kích cỡ hạt,
Sau khi quá trình phân hủy hoàn thành, sản phẩm cuối cùng được tận dụng
làm phân bón giàu dinh dưỡng cho cây trồng nông nghiệp [13]. Tuy nhiên
nhược điểm lớn nhất của phương pháp này đó là quá trình phân hủy chủ yếu dựa
vào hoạt động của tập đoàn các vi sinh vật có sẵn trong tự nhiên nên đòi hỏi một
thời gian xử lý dài, tốn nhiều diện tích và thường gây mùi khó chịu [15].
Phương pháp ủ phân được coi là phương pháp thích hợp, an toàn với môi
trường để xử lý lượng xác thải động vật ngày càng tăng do dịch bệnh. Tuy
nhiên, thời gian phân hủy kéo dài (thường từ 30-60 ngày đối với phương pháp ủ
hiếu khí) là nhược điểm lớn nhất của phương pháp này. Ngoài ra, việc sinh ra
các khí có mùi khó chịu như NH
3
, H
2
S v.v., đặc biệt đối với phương pháp ủ kỵ
khí cũng là một trong những yếu tố chính cản trở người chăn nuôi lựa chọn
phương pháp này để xử lý xác chết động vật.
-V-]^7/A=L1L
-V--"?6:L^7/A=L1L
Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, các
chế phẩm enzym được sản xuất càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết trong
các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Hàng năm
lượng enzym được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với giá
trị trên 500 triệu USD, được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau [4].
Protease là enzym được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành
sản xuất như: chế biến thực phẩm (đông tụ sữa làm pho mát, làm mềm thịt, bổ

sung để làm tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm
trong chế biến thực phẩm…), sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp…
Qua nhiều năm, việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung
cấp protease đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra
nhiều hơn. Tuy nhiên giá thành chế phẩm protease còn khá cao, do đó cũng hạn
chế việc sử dụng rộng rãi enzym trong sản xuất. Các chế phẩm thu được sau quá
trình nuôi cấy sản xuất enzym chưa phải là chế phẩm có độ tinh khiết cao vì
protein chỉ chiếm 20-30% [4].
8
Nhóm enzym protease (peptid – hidrolase 3.4) xúc tác quá trình thuỷ phân
liên kết liên kết peptide (-CO-NH-)
n
trong phân tử protein, polypeptide đến sản
phẩm cuối cùng là các axit amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng
thuỷ phân liên kết este và vận chuyển axit amin.
.-O-<.L^7/A=L1L\7ARAREA=L-
Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ
tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ
vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa ) và động vật
(gan, dạ dày bê ). So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có
những đặc điểm khác biệt. Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất
phức tạp bao gồm nhiều enzym rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình
dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất.
Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzym khác nhau nên protease vi sinh vật
thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng.
Phân loại Protease:
9
Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4)
.-_-TC`ARFaA=L1L
Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase.

- Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân
chia thành hai loại:
+ Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của
chuỗi polypeptide để giải phóng ra một axit amin, một dipeptide hoặc một
tripeptide.
+ Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi
polypeptide và giải phóng ra một axit amin hoặc một dipeptide.
- Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành
bốn nhóm:
+ Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serin
trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động
xúc tác của enzym. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và
subtilisin. Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzym động vật như chymotrypsin,
10
Peptidase (Protease)
(E.C.3.4)
Exopeptidase
(E.C. 3.4.11-17)
Endopeptidase
(E.C. 3.4.21-99)
Aminopeptidase
Carboxypeptidase
Serine proteinase
Cystein proteinase
Aspartic proteinase
Metallo proteinase
trypsin, elastase. Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzym vi khuẩn như subtilisin
Carlsberg, subtilisin BPN. Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng
kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng.
+ Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt

động. Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin,
một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng. Các cystein proteinase
thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng.
+ Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin.
Nhóm pepsin bao gồm các enzym tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin,
renin. Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động
và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính.
+ Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy
ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo
proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác
dụng của EDTA.
Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:
- Protease axit: pH 2-4
- Protease trung tính: pH 7-8
- Protease kiềm: pH 9-11
Các protease của các vi sinh vật có trung tâm hoạt động khác nhau, nhưng
các enzym này đều xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptid theo cùng
một cơ chế chung như sau:
ES Enzym – S  Enzym – S + P1  Enzym + P2
Trongđó: E: Enzym, S: cơchất, Enzym-S: phức chất enzym-cơchất,
P1,P2: là sản phẩm đầu tiên và thứ 2 của phản ứng.
-V--=L1Lb:1:;
Enzym protease phân bố chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn…gồm
nhiều loài thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clostridium, Streptomyces
và một số và một số loại nấm men.
-V---=L1L:c
Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại
endopeptidase hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại
trên, do đó protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao. Chúng có khả
năng phân hủy tới 80% các liên kết peptide trong phân tử protein [6]. Lượng

11
protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn, chiếm 59% lượng
enzym được sử dụng [6].
Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là Bacillus
subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi
Clostridium. Trong đó, B. subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất [1].
Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động thích hợp ở vùng
pH trung tính và kiềm yếu. Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở
khoảng pH hẹp (pH 5-8) và có khả năng chịu nhiệt thấp. Các protease trung tính
tạo ra dịch thủy phân protein thực phẩm ít đắng hơn so với protease động vật và
tăng giá trị dinh dưỡng. Các protease trung tính có khả năng ái lực cao đối với
các axit amin ưa béo và thơm. Chúng được sinh ra nhiều bởi B. subtilis, B.
mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium [1].
Vì vậy, trong công nghiệp thực phẩm người ta thường lựa chọn các chế phẩm
protease trung tính có nguồn gốc vi khuẩn. Protease kiềm và ưa kiềm của vi
khuẩn có khả năng hoạt động trong phổ pH rộng, chịu nhiệt tốt với nhiệt độ tối
ưu là khoảng 60
0
nên những protease này thường được ứng dụng trong ngành
công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa.
-V---=L1LH/

Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được
ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae, A.
terricola, A. fumigatus, A. saitoi, Penicillium chysogenum… Các loại nấm mốc
này có khả năng tổng hợp cả ba loại protease: acid, kiềm và trung tính. Nấm
mốc đen tổng hợp chủ yếu các protease acid, có khả năng thủy phân protein ở
pH 2,5-3 [1].
Protease nấm mốc có ưu điểm là phổ pH hoạt động rộng (pH = 4-11),
bền trong môi trường có pH thấp (pH = 2,5-6), và thường hoạt động tối ưu

trong môi trường axit (pH = 4-4,5). Việc tách chiết protease từ nấm cũng đơn
giản, và khá dễ dàng do chúng sinh trưởng thích hợp với quá trình lên men
rắn. Tuy nhiên, hoạt tính enzym không cao và khả năng chịu nhiệt kém hơn so
với enzym vi khuẩn.
Một số nấm mốc khác như: A. candidatus, P. cameberti, P. roqueforti…
cũng có khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản
xuất pho mát.
12
-V--V-=L1LDac
Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vi
khuẩn và nấm mốc. Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một số chủng có khả
năng tổng hợp protease cao như: Streptomyces grieus, S. fradiae, S.
Trerimosus [1].
Các chế phẩm protease từ xạ khuẩn được biết nhiều là pronase (Nhật)
được tách chiết từ S. grieus, enzym này có đặc tính đặc hiệu rộng, có khả năng
thủy phân tới 90% liên kết peptide của nhiều protein thành axit amin. Ở Liên Xô
(cũ), người ta cũng tách được chế phẩm tương tự từ S. grieus có tên là protelin.
Từ S. fradiae cũng có thể tách chiết được keratinase thủy phân karetin. Ở
Mỹ, chế phẩm được sản xuất có tên là M-Zim dùng trong sản xuất da [1].
Protease từ S. fradiae cũng có hoạt tính elastase cao, do đó chúng được dùng
trong công nghiệp chế biến thịt.
Hầu hết các protease phân cắt protein ở các liên kết đặc hiệu, vì thế có thể
sử dụng các enzym này theo chiều phản ứng tổng hợp để tổng hợp các liên kết
peptide định trước. Yếu tố tăng cường quá trình tổng hợp bao gồm pH, các
nhóm carboxyl hoặc nhóm amin được lựa chọn để bảo vệ, khả năng kết tủa sản
phẩm, phản ứng trong hệ hai pha lỏng.
Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất
enzym ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống, với nhiều ưu điểm như:
chu kỳ sinh trưởng ngắn nên có thể thu hoạch nhiều lần trong năm, có thể điều
khiển được sinh tổng hợp enzym theo hướng có lợi, giá thành thấp, chủ động về

nguồn nguyên liệu nuôi cấy vi sinh vật và giống vi sinh vật. Tuy nhiên trong mọi
trường hợp, cần lưu ý khả năng sinh độc tố của chủng sử dụng để có biện pháp
phòng ngừa, xử lý thích hợp.
-V-V-,3A=L1L
Protease được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp như công
nghiệp thực phẩm, công nghiệp nhẹ, công nghiệp dược phẩm và nông nghiệp…
Trong công nghiệp chế biến thịt, protease được dùng làm mềm thịt nhờ sự
thủy phân một phần protein trong thịt, kết quả làm cho thịt có một độ mềm thích
hợp và có vị tốt hơn. Protease được sử dụng để làm mềm thịt và tăng hương vị
thịt. Ngoài papain còn có thể dùng chế phẩm protease của vi sinh vật để thủy
phân một phần các protein có trong thành phần thịt, do đó chất lượng của các loại
thịt được nâng cao.
13
Sử dụng protease để sản xuất dịch đạm: từ Streptomyces fradiae tách được
chế phẩm keratineza thuỷ phân được keratin rất có giá trị để sản xuất dịch đạm
từ da, lông vũ. Nếu dùng axit để thuỷ phân sẽ mất đi hoàn toàn các axit amin
chứa lưu huỳnh, nếu dùng kiềm để thuỷ phân sẽ bị raxemic hoá (chuyển dạng L-
sang D- làm giảm giá trị sinh học của axit amin). Để thuỷ phân sâu sắc và triệt
để protein (trong nghiên cứu, chế tạo dịch truyền đạm y tế) cần dùng các
protease có tính đặc hiệu cao và tác dụng rộng, muốn vậy người ta thường dùng
phối hợp cả 3 loại protease của 3 loài: vi khuẩn, nấm mốc, thực vật với tỷ lệ
tổng cộng 1 - 2% khối lượng protein cần thuỷ phân. Ưu điểm của việc thuỷ phân
protease bởi enzym là bảo toàn được vitamin của nguyên liệu, không tạo ra các
sản phẩm phụ, không làm sẫm màu dịch thuỷ phân.
Trong chế biến thuỷ sản: Khi sản xuất nước mắm (và một số loài mắm)
thường thời gian chế biến thường là dài nhất, hiệu suất thuỷ phân (độ đạm) lại
phụ thuộc rất nhiều địa phương, phương pháp gài nén, nguyên liệu cá. Nên
hiện nay quy trình sản xuất nước mắm ngắn ngày đã được hoàn thiện trong đó
sử dụng chế phẩm enzym thực vật (bromelain và papain) và vi sinh vật để rút
ngắn thời gian làm và cải thiện hương vị của nước mắm. Tuy nhiên vẫn còn

một số tồn tại cần phải hoàn thiện thêm về công nghệ.
Trong công nghiệp sữa, protease được dùng trong sản xuất phomat nhờ
hoạt tính làm đông tụ sữa của chúng. Protease từ một số vi sinh vật như A.
candidus, P. roquerti, B. mesentericus,… được dùng trong sản xuất pho mát.
Trong công nghiệp sản xuất bánh mì, bánh quy protease làm giảm thời gian
trộn, tăng độ dẻo và làm nhuyễn bột, tạo độ xốp và nở tốt hơn.
Trong sản xuất bia, chế phẩm protease có ý nghĩa quan trọng trong việc
làm tăng độ bền của bia và rút ngắn thời gian lọc. Protease của A. oryzae được
dùng để thủy phân protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn.
Trong công nghiệp da, protease được sử dụng làm mềm da nhờ sự thủy
phân một phần protein của da, chủ yếu là collagen, thành phần chính làm cho da
bị cứng. Kết quả đã loại bỏ khỏi da các chất nhớt và làm cho da có độ mềm dẻo
nhất định, tính chất đó được hoàn thiện hơn sau khi thuộc da. Trước đây, để làm
mềm da người ta dùng protease được phân lập từ cơ quan tiêu hóa của động vật.
Hiện nay, việc đưa các protease tách từ vi khuẩn (B. mesentericus, B. subtilis),
nấm mốc (A. oryzae, A. flavus) và xạ khuẩn (S. fradiae, S. griseus, S. rimosus )
14
vào công nghiệp thuộc da đã đem lại nhiều kết quả và dần dần chiếm một vị trí
quan trọng.
Trong công nghiêp dệt: Protease vi sinh vật được sử dụng để làm sạch tơ
tằm, tẩy tơ nhân tạo (các sợi nhân tạo được bằng các dung dịch cazein, gelatin)
để sợi được được bóng, dể nhuộm. Protease có tác dụng thủy phân lớp protein
serisin đã làm dính bết các sợi tơ tự nhiên, làm bong và tách rời các loại tơ tằm,
do đó làm giảm lượng hoá chất để tẩy trắng.
Ngoài ra, protease còn được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều ngành khác như:
- Điều chế dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị
trong thực phẩm và sản xuất một số thức ăn kiêng.
- Protease của nấm mốc và vi khuẩn phối hợp với amylase tạo thành hỗn
hợp enzym dùng làm thức ăn gia súc có độ tiêu hóa cao, có ý nghĩa lớn trong
chăn nuôi gia súc và gia cầm.

- Điều chế môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật để sản xuất vắc xin,
kháng sinh…
- Sản xuất keo động vật, chất giặt tổng hợp để giặt tẩy các chất bẩn
protein, sản xuất mỹ phẩm,…
-X-aBC::cBacillus
-X--d8/\Bacillus
Theo khoá phân loại của Bergey, chi Bacillus thuộc họ Bacillaceae, lớp
Bailli, ngành Firmicutes trong giới vi khuẩn.
Các vi khuẩn chi Bacillus là những vi khuẩn to, hình que, Gram dương, dinh
dưỡng hữu cơ hiếu khí hoặc yếm khí tùy tiện, hầu hết có phản ứng catalase dương
tính, hình thành nha bào, đề kháng cao với nhiệt.
Sau 24 giờ nuôi cấy trên môi trường thạch máu cừu, Bacillus anthracis
không gây dung huyết, trong khi đó Bacillus cereus tạo ra vòng dung huyết trên
thạch máu [9].
Vi khuẩn thuộc chi Bacillus phân bố rộng rãi trong tự nhiên, đa dạng về
sinh thái. Các loài Bacillus đã, đang và ngày càng trở thành những vi sinh vật
quan trọng hàng đầu về mặt ứng dụng. Vi khuẩn thuộc chi Bacillus có tiềm năng
lớn về các enzym ngoại bào. Nhiều trong số các enzym ngoại bào này là những
enzym thủy phân các phân tử hữu cơ lớn. Chính vì thế vi khuẩn này có nhiều
ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau như: công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa,
15
công nghiệp thực phẩm, bánh kẹo, đồ uống, công nghiệp dược phẩm, công
nghiệp thuộc da, công nghiệp dệt và trong xử lý chất thải .
Bacillus có khả năng sinh bào tử. Thông thường bào tử được tạo ra khi tế
bào đã trải qua giai đoạn phát triển mạnh nhất, hay do cạn kiệt chất dinh dưỡng.
Mỗi tế bào dinh dưỡng sinh ra một bào tử. Khi bào tử trưởng thành tế bào dinh
dưỡng tự phân giải, bào tử được giải phóng ra khỏi tế bào mẹ. Bào tử có khả
năng chịu nhiệt, tia tử ngoại, phóng xạ và nhiều độc tố, vì chúng có khả năng tồn
tại ở trạng thái bào tử trong nhiều năm. Bào tử của vi khuẩn không phải là một
hình thức sinh sản mà chúng chỉ là một hình thức thích nghi để giúp vi khuẩn

vượt qua những điều kiện sống bất lợi. Đa số Bacillus sinh trưởng tốt ở pH = 7,
một số phù họp với pH = 9-10 như Bacillus alcalophillus, hay có loại phù hợp
với pH = 2-6 như Bacillus acidocaldrius. Về nhiệt độ có nhiều chủng ưa nhiệt
độ cao (45
0
C – 75
0
C), hay ưa lạnh (5
0
C – 25
0
C), nhưng thường gặp Bacillus
sống ở nhiệt độ 34
0
C – 37
0
C.
.-[-.3acFaI$P:.@0/"=/\
:cBacillus IeP
-X--=L1LbBacillus
Hệ thống enzym của Bacillus đặc biệt là Bacillus subtilis rất phong phú và
đa dạng gồm protease, amylase, glucoamylase, cellulase… Protease của
Bacillus ưa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lượng phân tử từ 20.000-
30.000. Ổn định trong khoảng pH 6-12 và hoạt động trong khoảng pH rộng 7-12
.
Một nghiên cứu gần đây của nhóm tác giả Ngô Tự Thành và cộng sự đã
phân lập được 236 chủng Bacillus từ các mẫu đất và nước thải khác nhau cho
thấy enzym protease của các chủng T20, TR6 và TH5 có tác dụng tốt trong xử lý
nước thải [7].
16

Một số ứng dụng của Bacillus trong nuôi trồng thủy sản đã được nghiên
cứu như đóng góp nguồn dinh dưỡng và enzym tiêu hóa cho các đối tượng nuôi
trồng thủy sản. Ngoài ra các nghiên cứu ứng dụng còn cho thấy khả năng tăng
cường miễn dịch không đặc hiệu như chủng Bacillus sp. HY1 được phân lập từ
nước nuôi tôm có khả năng ức chế tốt các vi khuẩn Vibrio. Chủng Bacillus sp.
HY1 có khả năng kháng Staphylococcus aureus, Sarcina lutea…, nhưng không
có khả năng kháng E. coli. [5]. Nhờ có ưu điểm kháng tốt vi khuẩn nên chủng vi
khuẩn này đang được thử nghiêm trong các chế phẩm sinh học.
Bacillus tiết ra enzym phân hủy các chất như carbonhydrate, các chất béo
và protein thành những đơn vị nhỏ hơn. Chúng cũng có khả năng phân hủy các
chất hữu cơ tích lũy trong nền đáy ao nuôi tôm. Bacillus có tác dụng làm giảm
COD, H
2
S trong ao tôm làm tăng năng suất nuôi. Bacillus được ứng dụng trong
trường hợp làm tăng quá trình phân hủy hữu cơ tránh đáy ao, làm giảm các chất
dư thừa tích tụ đáy ao, giảm phát sinh khí độc, mùi hôi đáy như NH
3
, H
2
S…
Một số nghiên cứu còn cho thấy khả năng ức chế các tác nhân gây bệnh
bằng cách tiết vào môi trường chất có tính sát khuẩn hoặc kìm khuẩn gây ảnh
hưởng đến quần thể vi sinh khác [5], [7]. Mục đích gián tiếp là cạnh tranh dinh
dưỡng và năng lượng có sẵn trong môi trường. Nghiên cứu của Stein (2005) cho
thấy tiềm năng sản sinh chất kháng sinh của B. subtilis đã được ghi nhận hơn 50
năm qua. Hiện nay tác giả đã tổng kết có vài trăm dòng vi khuẩn B. subtilis có
khả năng tiết ra hơn 20 chất kháng sinh với cấu trúc khác nhau [17].
Như vậy, có thể thấy các chế phẩm vi sinh có chứa vi khuẩn Bacillus có
thể góp phần làm giảm rủi ro do dịch bệnh nhờ vào khả năng giúp cải thiện
sức khỏe của tôm cá, cải thiện môi trường và ức chế tác nhân gây bệnh trong

ao nuôi.
17
V
f* gh"Mi*K"'jgk"&"*+%,
V--2Blm
Đối tượng nghiên cứu của đề tài là các các chủng vi sinh vật tham gia vào
quá trình phân hủy xác động vật thu nhận từ các hầm chôn xác động vật của
Phân viên Thú y miền Trung.
V-- n:48/m
- Thời gian thực hiện : từ 1/2012 đến 5/2012.
- Địa điểm nghiên cứu : Bộ môn Công nghệ Sinh học, Phân viện Thú y miền
Trung.
- Mẫu để phân lập vi khuẩn được lấy từ hầm chôn xác động vật của Phân
viện Thú Y miền Trung.
V-V-03m
- Phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật từ các hầm chôn xác động vật có
khả năng sinh tổng hợp protease tham gia vào quá trình phân hủy xác động vật.
- Xác định các đặc tính vi sinh vật học của chủng vi sinh vật phân lập được.
- Xác định các điều kiện tối ưu ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp
protease của chủng vi sinh vật phân lập được.
- Xác định các đặc tính lý hóa của enzym protease của chủng vi sinh vật
phân lập được.
- Đánh giá khả năng phân hủy protein của chủng vi sinh vật phân lập
được trong trên cơ chất thịt trong quy mô phòng thí nghiệm.
V-X-';F6:ABCA@Am
V-X--';F6MQH:>54
<=Bn<H7
Môi trường I (môi trường phân lập): 1% (w/v) peptone; 0,3% (w/v) cao
thịt; 0,5% (w/v) NaCl; 0,5% (w/v) Glucose; bổ sung 2% (w/v) agar, pH = 7 hấp
khử trùng 110

0
C trong 30 phút.
Môi trường II (kiểm tra hoạt tính protease): 1% (w/v) peptone; 0,3% (w/v)
cao thịt; 0,5% (w/v) NaCl; 0,5% (w/v) Glucose; bổ sung 2% (w/v) agar, 1%
(w/v) casein, pH = 7, hấp khử trùng 121
0
C trong 30 phút.
Môi trường III (kiểm tra hoạt tính cellulase): 1%(w/v) peptone; 0,3% (w/v)
cao thịt; 0,5% (w/v) NaCl; bổ sung 2%(w/v) agar, 0,5% (w/v) Glucose, 1%
(w/v) CMC, pH = 7, hấp khử trùng 110
0
C trong 30 phút.
Môi trường IV (kiểm tra hoạt tính amylase): 1% (w/v) peptone; 0,3%
(w/v) cao thịt; 0,5% (w/v) NaCl; 0,5% (w/v) Glucose; bổ sung 2% (w/v) agar,
1% (w/v) tinh bột tan, pH = 7, hấp khử trùng 110
0
C trong 30 phút.
18
@Ho
Các hoá chất được sử dụng trong nghiên cứu đều đạt độ tinh khiết phân
tích, chủ yếu là hóa chất của các hãng như Merck, Sigma, Favorgen được trình
bày qua bảng 3.1:
eYV-- Ap@Fa334:6/
qr&%( r&%(
Môi trường nuôi cấy Pepton, cao thịt, NaCl, agar
Định tính enzym protease
Peptone, cao thịt, NaCl, agar, casein,
dung dịch nhuộm Comassie Briliant
Blue (30% v/v methanol, 10% v/v
axetic axit, 0,1% w/v CBB), dung

dịch tẩy (30% v/v methanol, 10% v/v
axetic axit)
Định tính cellulase, amylase
Peptone, cao thịt, NaCl, agar, tinh bột,
CMC, thuốc thử Lugol
Nhuộm gram Crystal violet, lugol, ethanol, fuchsin
Tách chiết DNA vi khuẩn
Lysozyme, protease K, lysis buffer
type 4, wash buffer type 6, elution
buffer type 5, RNAse A
Phản ứng khuếch đại gen (PCR)
DNA, primer, taq, H
2
O, dNTP buffer,
MgCl
2
>54
Nghiên cứu được thực hiện với các trang thiết bị, máy móc hiện đại, có độ
chính xác cao của Bộ môn Công nghệ Sinh học và Phòng Thí nghiệm chung,
Phân viện Thú Y miền Trung. Bao gồm có : tủ cấy, tủ ấm, tủ lạnh -4
0
C, -20
0
C,
-80
0
C, nồi hấp khử trùng, máy PCR, bể điều nhiệt cách thủy, máy li tâm lạnh,
máy đo quang phổ kế, máy lắc, cân phân tích, máy chuẩn pH, hệ thống điện di
ngang, pipet, máy ảnh, kính hiển vi.
V-X-- BCA@Am

Phương pháp nghiên cứu tổng quát được trình bày ở các hình 3.1 và 3.2.
19
Lấy mẫu đất
Phân lập các chủng vi sinh vật
Sàng lọc chủng vi khuẩn có hoạt tính
protease mạnh nhất
(Phương pháp khuếch tánthạch)
Đặc điểm hình thái
(Quan sát dưới kính hiển vi)
Đặc điểm sinh hóa
(Test catalase, amylase, cellulase)
Nhận diện vi sinh vật
(Phương pháp PCR)
Xác định các yếu tố ảnh hưởng
đến sinh tổng hợp protease
(Anson cải tiến)
Xác định các đặc tính lý hóa
của enzym protease
(Anson cải tiến)
Động thái
sinh trưởng
Nhiệt độ
nuôi cấy
pH nuôi
cấy
Độ bền
nhiệt
Nhiệt độ
tối ưu
pH tối ưu

.V--TC`52=ss6/F\:1:;
20
.V--TC`52=ss6/@@6tYAR\7
V-X---BCA@AFH7/u
Chúng tôi tiến hành lấy mẫu ở cả bốn hầm chôn xác động vật của Phân
viện. Mẫu đất được lấy vào các bình tam giác nút bông đã được khử trùng trước
đó (15g mẫu đất/bình), rồi đem về phòng thí nghiệm và tiến hành phân tích vi
sinh trong vòng 24 giờ.
V-X---RF;A:c
Mẫu đất lấy về (115 mẫu) được lắc trong 30ml dung dịch nước muối sinh
lý 0,9% trong 30 phút, sau đó tiến hành pha loãng bằng nước muối sinh lý từ 10
-
1
đến 10
-7
lần. Hút 100µl dịch ở các nồng độ pha loãng khác nhau trang trên đĩa
thạch chứa môi trường I đã chuẩn bị sẵn. Các đĩa thạch được đem ủ trong tủ ấm
ở 30
0
C, sau 24-48 giờ trên đĩa thạch sẽ xuất hiện nhiều dạng khuẩn lạc. Các
khuẩn lạc được cấy chuyển sang các đĩa môi trường I mới bằng phương pháp ria
ba pha để thu được các khuẩn lạc riêng rẽ. Có thể tiếp tục cấy chuyển 2 hoặc 3
lần như vậy cho đến khi thu được các khuẩn lạc thuần.
V-X--V-4sA=L1L5vABCA@A>@a
Tất cả các chủng vi sinh vật sau khi phân lập được tiến hành kiểm tra khả
năng sinh enzym protease. Các chủng được nuôi cấy lắc 200 vòng/phút, ở 30
0
C
trong 24 giờ. Dịch nuôi cấy được đem ly tâm ở 4
0

C với tốc độ 6000 vòng/phút
trong 5 phút để loại bỏ cặn tế bào. 50µl các dịch nổi được đem nhỏ vào các
giếng 10mm đã được đục sẵn trên các đĩa môi trường II-agar. Các đĩa này được
để ở 4
0
C trong 24 giờ để cho phép toàn bộ dịch nổi khuếch tán vào trong thạch,
sau đó chuyển qua tủ ấm 30
0
C để enzym phân giải cơ chất casein. Sau 24 giờ,
các đĩa thạch được nhuộm với dung dịch nhuộm Comassie Briliant Blue (30%
21
Lựa chọn chủng để lên men sản xuất
Lên men chủng được chọn theo phương
pháp lên men trên môi trường rắn
Thu sinh khối
Phối trộn trên cơ chất
Chế phẩm chứa vi khuẩn
Đánh giá khả năng phân hủy
ở quy mô phòng thí nghiệm
v/v methanol, 10% v/v axetic axit, 0,1% w/v CBB) (bảng 2.1) trong 30 phút, và
rửa lại bằng dung dịch tẩy (bảng 2.1). Vòng phân giải protein sẽ xuất hiện màu
sáng hơn so với môi trường xung quanh. Tiến hành đo đường kính vòng phân
giải để bước đầu đánh giá hoạt độ enzym protease của các chủng vi sinh vật.
V-X--X-4FBlasA=L1LLABCA@A$1Y>
Hoạt tính protease được xác đinh theo phương pháp Anson cải tiến.
Protease tác dụng với cơ chất casein tạo thành các sản phẩm hoà tan trong TCA.
Thuốc thử Folin-Ciocalteau có chứa phosphomolipdic axit và phosphowolframic
axit, các gốc này phản ứng với gốc tyrosine (Tyr) và tryptophan (Trp) trong
phân tử protein tạo thành phức chất màu xanh da trời hấp thụ cực đại ở bước
sóng 750nm. Do đó ta có thể xác định hoạt tính protease thông qua hàm lượng

tyrosine và tryptophan.
Một đơn vị hoạt tính được định nghĩa là lượng enzym trong điều kiện tiêu
chuẩn, sau 1 phút phân giải protein tạo thành các sản phẩm hoà tan trong TCA
cho phản ứng màu với thuốc thử Folin-Ciocalteau tương ứng với 1µmol
tyrosine.
>
Phản ứng enzym
Ống thí nghiệm: hút 0,5ml dịch enzym vào ống nghiệm giữ ở 40
0
C, thêm
0,5ml dịch casein (đã đạt 30
0
C) lắc đều giữ ở 30
0
C trong 10 phút. Sau đó cho
3ml TCA vào, hỗn hợp được lắc đều và giữ 30 phút ở nhiệt độ phòng để dừng
phản ứng hoàn toàn rồi ly tâm 10 phút với 10.000 vòng/phút để thu dịch trong
suốt có chứa sản phẩm hoà tan của phản ứng enzym. Hàm lượng của sản phẩm
trong dung dịch lọc được xác định bằng phản ứng màu.
Ống kiểm tra: hút 0,5ml dịch enzym và 3ml TCA vào ống nghiệm, lắc
đều để bất hoạt enzym, thêm 0,5ml casein vào lắc đều và làm tiếp tục như ống
thí nghiệm. Mỗi ống thí nghiệm của một dịch vi sinh vật có một ống kiểm tra
riêng.
Ống đối chứng: thay 0,5ml dịch nuôi vi sinh vật bằng 0,5ml nước cất. Các
bước tiếp theo tiến hành tương tự như ống thí nghiệm.
Phản ứng màu
Lấy 0,5ml dịch sau phản ứng enzym cho vào các ống nghiệm, thêm 2ml
Na
2
CO

3
6% lắc đều. Bổ sung 0,5ml thuốc thử Folin pha loãng 5 lần, lắc đều. Sau
30 phút để ở nhiệt độ phòng đem so màu ở máy quang phổ bước sóng 750nm.
22
Hiệu số hấp thụ đọc trên máy so màu giữa ống thí nghiệm và ống kiểm
tra được đối chiếu trên đồ thị chuẩn tyrosine. Hoạt tính của 1ml dịch enzym
được tính theo công thức
X =
2.
.4.
t
ba
Trong đó: X là số đơn vị hoạt tính trong 1ml dịch enzym, 4 là thể tích
hỗn hợp phản ứng enzym, a là số µmol tyrosine tương ứng với hiệu số đọc trên
máy giữa ống thí nghiệm và ống kiểm tra, b là độ pha loãng dung dịch enzym, t
là thời gian phản ứng (10 phút).
KBnco chuẩn bị dung dịch Tyr 1µmol/ml trong 0,2N HCl.
Sau đó, tiến hành pha loãng bằng 0,2N HCl để được các nồng độ từ 0,1-1
µmol/ml. Lấy 0,5ml các dung dịch này và làm phản ứng màu như trên.
Đường chuẩn có phương trình y = 1,576x + 0,071.
Trong đó: y là độ hấp phụ ở bước sóng 750nm, x là nồng độ tyrosine
trong dải 0,1-1µmol/ml.
.V-V-`4Bnc 7=1L
V-X--U-BCA@Amd8/.@:1:;
#1@3B?s8:: lấy 1 giọt dịch vi sinh vật nuôi cấy trên môi
trường lỏng đặt lên lam kính. Bổ sung muối sinh lý 0,9% và quan sát dưới kính
hiển vi vật kính dầu với độ phóng đại 1000X.
0/"=/: nhỏ một giọt nước vô trùng lên lam kính, sau đó dùng que
cấy vô trùng lấy một ít sinh khối vi khuẩn hoà vào giọt nước, dàn mỏng giọt
huyền phù, hong khô và cố định vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn. Nhuộm tiêu bản

bằng dung dịch crystal violet trong 1 phút rồi rửa bằng nước cất, vẩy khô. Sau
đó nhuộm tiếp bằng dung dịch Lugol, để trong 1 phút. Đổ dung dịch lugol, rửa
23
qua bằng cồn ethanol, nhỏ cồn ethanol cho chảy qua tiêu bản đến khi dịch rửa
không còn màu thì thôi, rửa nước, thấm nhẹ xung quanh vết bôi. Nhuộm tiếp
bằng dung dịch fuchsin để 1 phút, rửa lại bằng nước và để khô. Quan sát sự bắt
màu thuốc nhuộm của vi khuẩn dưới vật kính dầu. Gram dương sẽ bắt màu xanh
tím, Gram âm bắt màu hồng.
V-X--O-4s/7F1L
Các chủng được nuôi cấy lắc 200 vòng/phút, ở 30
0
C trong 24 giờ. Dịch
nuôi cấy được ly tâm ở 4
o
C với tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút để loại bỏ
cặn tế bào. 50µl các dịch nổi được đem nhỏ vào các giếng 10mm đã được đục
sẵn trên các đĩa môi trường IV. Các đĩa này được để ở 4
0
C trong 24giờ để cho
phép toàn bộ dịch nổi khuếch tán vào trong thạch, sau đó chuyển qua tủ ấm 30
0
C
để enzym phân giải cơ chất tinh bột. Sau 24 giờ, các đĩa thạch được đem nhuộm
với dung dịch lugol và quan sát vòng sáng xuất hiện trên nền xanh đen của đĩa
thạch do tinh bột phản ứng với iốt.
V-X--_-4sLFFF1L
Các bước tiến hành tương tự phương pháp định tính amylase. Dịch nổi vi
sinh vật được đem nhỏ vào các giếng đục sẵn trên đĩa thạch chứa cơ chất của
cellulase là CMC (môi trường III). Quan sát vòng sáng xuất hiện trên nền màu
hồng nhạt của đĩa thạch do CMC phản ứng với thuốc thử.

V-X--[-4sF1L
Chủng vi sinh vật được nuôi cấy trên môi trường I cho phát triển với mật
độ dày đặc. Nhỏ trực tiếp 1ml H
2
O
2
3% lên sinh khối vi sinh vật, và quan sát
xem sự sủi bọt khí có xảy ra hay không.
V-X--w-;36:1:;5vAYm%x
@>K$:c
DNA vi khuẩn được tách chiết bằng bộ kit tách chiết Favorgen theo hướng
dẫn của nhà sản xuất (phụ lục 1).
Ym%x
Để kiểm tra vi khuẩn nghiên cứu có phải Bacillus sp. như dự đoán, chúng
tôi sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho vi khuẩn Bacillus sp. được Andretta và cộng
sự thiết kế năm 2004. Cặp mồi sử dụng để khuếch đại đoạn gen 16S rDNA có
kích thước 1500bp.
Mồi xuôi 9F: Uy"$" "$ %% ""% $%"Vy
Mồi ngược 1525r: Uy$"$$$""$"" "$ %%$"%%Vy
Thành phần phản ứng PCR
24
eYV-- ApAYm%x
ApAYm 8s=/0AYmIzFP
Nước cất
Buffer 1 (5X Green Gotaq)
Mồi xuôi
Mồi ngược
dNTP 25mM
DNA khuôn
Taq DNA polymerase

13,05
5,0
0,5
0,5
0,2
3,0
0,25
S8sAYm U IzFP
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR gồm có các bước: biến tính các mẫu
DNA ở 94
0
C trong 2 phút. Sau đó thực hiện 35 chu kỳ gồm: 94
0
C trong 1 phút ,
55
0
C trong 1 phút, 72
0
C trong 3 phút và cuối cùng 72
0
C trong 10 phút.
Sản phẩm được khuếch đại bằng phản ứng PCR, sau đó được điện di trên
gel agarose 1% có bổ sung ethidium bromide (EtBr). So sánh độ dài băng DNA
vi khuẩn phân lập với các băng DNA chuẩn (Marker) dưới ánh sáng tử ngoại.
V-X--N-{@4@7>2YB9>1SlAA=L1L
0@1=B9
Chủng Bacillus sp. phân lập được được nuôi lắc ở 30
0
C, 200 vòng/phút

trong môi trường I trong 32 giờ. Dịch nuôi vi khuẩn được thu tại các thời điểm
khác nhau để xác định hoạt độ protease và mật độ tế bào.
{@460<H72B
Để khảo sát nhiệt độ tối ưu, chủng vi khuẩn được nuôi cấy lắc 200
vòng/phút trong môi trường I, tại các nhiệt độ khác nhau 28
0
C, 30
0
C, 40
0
C,
50
0
C, 60
0
C, 70
0
C . Sau 24 giờ, dịch nuôi vi sinh vật được đem xác định mật độ
vi sinh vật trên máy quang phổ tại bước sóng 620nm, và hoạt độ enzym protease
trong dịch nuôi cấy được xác định bằng phương pháp Anson cải tiến. Kết quả
thu được sẽ cho phép chúng tôi xác định được nhiệt độ nuôi cấy tối ưu để chủng
vi khuẩn Bacillus phân lập được sinh enzym protease.
{@4A2B
Để khảo sát pH tối ưu của môi trường cho chủng vi khuẩn Bacillus đã
phân lập sinh enzym protease, chúng tôi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn, lắc 200
vòng/phút ở nhiệt độ tối ưu đã xác định được trước đó, trong môi trường I với
25