KỸ THUẬT CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT - CÔNG NGHỆ SINH HỌC PPTX

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HUẾ
KHOA SINH HỌC
KHOA SINH HỌC
Học phần :
Công nghệ sinh học
Công nghệ sinh học


Kỹ thuật chuyển gen
Kỹ thuật chuyển gen


ở thực vật
ở thực vật
Giảng viên hướng
dẫn
PGS.TS.Trần Quốc
PGS.TS.Trần Quốc
Dung
Dung
Huế
Huế, ngày 22 tháng 9
Kỹ thuật
Kỹ thuật

chuyển gen
chuyển gen


ở
ở
thực vật
thực vật
Một số khái niệm cơ bản

Chuyển gen
Chuyển gen là đưa một đoạn DNA
ngoại lai vào genome của một cơ
thể đa bào, sau đó đoạn DNA này
sẽ có mặt ở hầu hết các tế bào
và di truyền lại cho đời sau

Gen chuyển
Gen chuyển (
Transgene
Transgene) là gen ngoại
lai được chuyển từ một cơ thể
sang một cơ thể mới bằng kỹ thuật
di truyền


Thực vật chuyển gen
Thực vật chuyển gen là thực vật
có gen ngoại lai (gen chuyển)
xen vào trong DNA genome của

nó
Page  4
Tuy nhiên để chuyển gen vào thực vật (vật chủ) một
cách có hiệu quả thì, các cấu trúc di truyền cần
được thiết kế thích hợp cho sự hợp nhất và biểu
hiện của gen ngoại lai. Cấu trúc di truyền phải
mang một
gen chỉ thị chọn lọc
gen chỉ thị chọn lọc hoặc
sàng lọc
sàng lọc.
Một cấu trúc di truyền cơ bản bao gồm : trình tự
khởi động (promoter), gen mã hóa (coding gene)
và trình tự kết thúc (terminator).
Hai promoter chủ yếu thường được sử dụng cho biến nạp gen ở thực
vật
Promoter CaMV 35S
Promoter CaMV 35S thích hợp cho sự biểu hiện của DNA ngoại lai ở
cây hai
cây hai
lá mầm
lá mầm và
promoter ubiquitin
promoter ubiquitin của ngô thích hợp cho sự biểu hiện
mạnh của
cây một lá mầm.
cây một lá mầm.
Một số khái niệm cơ bản
Một số khái niệm cơ bản

MỤC ĐÍCH QUÁ TRÌNH
MỤC ĐÍCH QUÁ TRÌNH
CHUYỂN GEN Ở THỰC
CHUYỂN GEN Ở THỰC
VẬT
VẬT
Mục đích quá trình chuyển gen
Mục đích quá trình chuyển gen

Nghiên cứu làm sáng tỏ chức năng của
một gen được quan tâm hay từng phần
của gen đó.

Làm thay đổi mức độ biểu hiện của một
gen nội bào.

Chuyển các gen quy định các tính trạng
mong muốn vào tế bào để
thu nhận được
thu nhận được
các tính trạng mới
các tính trạng mới ở tế bào và cây được
chuyển gen.
Cà chua chuyển gen kháng vật ký sinh (bên phải) và cà
Cà chua chuyển gen kháng vật ký sinh (bên phải) và cà
chua đối chứng (bên trái)
chua đối chứng (bên trái)

Quy trình chuyển gen
Phân lập gene
2
Biến nạp vào E.coli
4
Xác định gene và tính trạng
31
Gắn gene vào vector biểu hiện
33
Quy trình chuyển gen
Biến nạp vào mô hoặc tế bào
6
Phân tích cá thể chuyển gen
8
Tách chiết DNA plasmid
35
Chọn lọc và tái sinh cây b.nạp
37
Các nguyên tắc sinh học cơ bản của việc chuyển gen

Không phải toàn bộ các tế bào đều thể
Không phải toàn bộ các tế bào đều thể
hiện
hiện
tính toàn năng.
tính toàn năng.





Các cây khác nhau có
Các cây khác nhau có
phản ứng
phản ứng
không giống nhau
không giống nhau
với sự xâm nhập của một
với sự xâm nhập của một
gen ngoại lai.
gen ngoại lai.




Cây biến nạp
Cây biến nạp
chỉ có thể được tái sinh
chỉ có thể được tái sinh
từ các tế bào có khả năng tái sinh và có khả
từ các tế bào có khả năng tái sinh và có khả
năng thu nhận gen biến nạp vào genome
năng thu nhận gen biến nạp vào genome
Nguyên tắc sinh học cơ bản của chuyển
Nguyên tắc sinh học cơ bản của chuyển
gen
gen








Mô thực vật là " hỗn hợp các quần thể tế bào
Mô thực vật là " hỗn hợp các quần thể tế bào
"có khả năng khác nhau.
"có khả năng khác nhau.




Thành phần của "quần thể tế bào" được xác
Thành phần của "quần thể tế bào" được xác
định bởi loài, kiểu gen, từng cơ quan, từng giai
định bởi loài, kiểu gen, từng cơ quan, từng giai
đoạn phát triển của mô và cơ quan.
đoạn phát triển của mô và cơ quan.




Thành tế bào
Thành tế bào
ngăn cản
ngăn cản
sự xâm nhập của DNA
sự xâm nhập của DNA
ngoại lai.
ngoại lai.



Khả năng xâm nhập ổn định của gen vào
Khả năng xâm nhập ổn định của gen vào
genome
genome
không tỷ lệ với sự biểu hiện tạm thời của
không tỷ lệ với sự biểu hiện tạm thời của
gene.
gene.




Các DNA (trừ virus) không chuyển từ tế bào
Các DNA (trừ virus) không chuyển từ tế bào
này sang tế bào kia.
này sang tế bào kia.




Các DNA (trừ virus) khi xâm nhập vào genome
Các DNA (trừ virus) khi xâm nhập vào genome
của tế bào vật chủ chưa đảm bảo đã là liên kết ổn
của tế bào vật chủ chưa đảm bảo đã là liên kết ổn
định với genome
định với genome
.

.

Dựa vào các gen đánh dấu
Dựa vào các gen đánh dấu



Gen đánh dấu bao gồm các
Gen đánh dấu bao gồm các


gen chỉ thị chọn lọc
gen chỉ thị chọn lọc


và
và
sàng lọc
sàng lọc
.
.


Các
Các


gen chỉ thị chọn lọc
gen chỉ thị chọn lọc
có tác dụng

có tác dụng


mã hóa các
mã hóa các
protein khử độc các nhân tố ức chế trao đổi chất
protein khử độc các nhân tố ức chế trao đổi chất
như chất kháng sinh hay chất diệt cỏ.
như chất kháng sinh hay chất diệt cỏ.


Các
Các


gen chỉ thị sàng lọc
gen chỉ thị sàng lọc


thường được sử dụng là
thường được sử dụng là
các gen
các gen


β - glucuronidase
β - glucuronidase
(
(
gusA

gusA
),
),
luciferase
luciferase


và
và
gần đây hơn là gen mã hóa protein phát huỳnh
gần đây hơn là gen mã hóa protein phát huỳnh
quang xanh lục (
quang xanh lục (
green fluorescent
green fluorescent
) của sứa .
) của sứa .
Page  13
Gen chỉ thị chọn lọc phổ biến





Gen
Gen
npt II
npt II : Gen mã hóa cho
neomycin
neomycin

phosphotransferase
phosphotransferase, đây là một enzyme vi sinh vật có khối
lượng phân tử 25kD, xúc tác cho phản ứng
phosphoryl
phosphoryl hóa
một số loại
kháng sinh gốc aminoglycoside
kháng sinh gốc aminoglycoside như
neomycin
neomycin,
kanamycin
kanamycin và
G148
G148. Trong phản ứng này, nhóm
phosphate Ɣ
phosphate Ɣ
của
ATP
ATP được gắn vào phân tử chất kháng sinh làm nó trở
nên
bất hoạt
bất hoạt do ngăn trở sự liên kết của kháng sinh với
ribosome.
ribosome.



Gen
Gen
bar

bar

: là tên gọi của một gen mã hóa cho enzyme
phosphinothricin acetyltransferase
phosphinothricin acetyltransferase (
PAT
PAT), có tác dụng làm mất
độc tính của
phosphinothrcin
phosphinothrcin (PPT), là hoạt chất chính của
thuốc trừ cỏ như
Bialaphos
Bialaphos và
Basta
Basta. Gen
bar
bar

được tạo dòng
đầu tiên từ một dòng vi khuẩn
Streptomyces hygroscopius.
Streptomyces hygroscopius.
Page  14


Các gen chỉ thị sàng lọc phổ biến
Các gen chỉ thị sàng lọc phổ biến

Gen
Gen
gus A
gus A : là gen mã hóa cho
sinh tổng hợp enzyme β-
sinh tổng hợp enzyme β-
glucuronidase
glucuronidase.
β-glucuronidase
β-glucuronidase là một
hydrolase
hydrolase xúc
tác cho sự phân giải các
β-glucuronide
β-glucuronide, sản phẩm phân
giải có màu chàm đặc trưng, dễ nhận biết và thường
dùng để nhận biết sự tồn tại của gen
gus A
gus A là
X-Gluc
X-Gluc (
5 -
5 -
bromo -4 -chloro - 3 - indolyl - β - D - glucuronide
bromo -4 -chloro - 3 - indolyl - β - D - glucuronide). Dung
dịch
X-Gluc
X-Gluc không màu dưới tác động của enzyme

β -
β -
glucuronidase
glucuronidase sẽ chuyển sang
màu xanh chàm.
màu xanh chàm.

Gen
Gen
lacZ
lacZ : là gen mã hóa cho
enzyme β-galactosidase
enzyme β-galactosidase có
khối lượng phân tử 116 kD. Gen
lacZ
lacZ ở
E.coli
E.coli được dùng
rất phổ biến trong công nghệ gen và đã có sẵn của hệ
thống phương pháp kiểm tra rất nhạy với thuốc thử
X-
X-
Gal
Gal. Sự tồn tại của
lacZ
lacZ trong tế bào thực vật đã được
khẳng định. Vì vậy trước khi kiểm tra sự có mặt của
gen
gen
lacZ ngoại lai

lacZ ngoại lai, cần phải bất hoạt gen lacZ nội sinh bằng
glutaraldehyde
glutaraldehyde.
PPCG



Chuyển gen qua trung gian
Chuyển gen qua trung gian
Chuyển gen trực tiếp
Chuyển gen trực tiếp
1
1
2
2
Phương pháp chuyển gen ở thực vật
Phương pháp chuyển gen ở thực vật
Phương pháp này được thực hiện nhờ vi khuẩn
tạo khối u ở thực vật, chủ yếu qua T-plasmid .
Dựa vào cơ chế vi khuẩn
Argobacterium
Argobacterium sau
khi xâm nhiễm vào tế bào , chúng gắn các
đoạn
T-DNA
T-DNA vào bộ máy di truyền của tế bào
thực vật, dẫn đến sự rối loạn dưỡng chất nội
sinh, tạo ra khối u (trường hợp
A.tumefaciens

A.tumefaciens)
hay rễ tơ (
A.rhizogenes
A.rhizogenes). Khả năng chuyển gen
này đã được khai thác để chuyển gen ngoại lai
vào thực vật theo ý muốn.
Chuyển gen qua trung gian
Page  19


Vi khuẩn Agrobacterium
Vi khuẩn Agrobacterium


Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens
và
và
Agrobacterium
Agrobacterium
rhizogenes
rhizogenes


là hai loài gây bệnh cho thực vật
là hai loài gây bệnh cho thực vật
được sử dụng như các vector tự nhiên để mang
được sử dụng như các vector tự nhiên để mang
các gen ngoại lai vào mô và tế bào thực vật .

các gen ngoại lai vào mô và tế bào thực vật .


A.tumefaciens
A.tumefaciens
có chứa 1 plasmid lớn kích thước
có chứa 1 plasmid lớn kích thước
khoảng 200kb gọi là
khoảng 200kb gọi là
Ti-plasmid
Ti-plasmid
chính là tác
chính là tác
nhân gây bệnh cho cây. Khi cây bị nhiễm
nhân gây bệnh cho cây. Khi cây bị nhiễm
A.tumefaciens
A.tumefaciens
qua các vết thương, biểu hiện là
qua các vết thương, biểu hiện là
các
các
khối u
khối u
hình thành ngay ở chỗ lây nhiễm. Sự
hình thành ngay ở chỗ lây nhiễm. Sự
hình thành khối u sau đó có thể tiếp tục mà
hình thành khối u sau đó có thể tiếp tục mà
không cần có sự có mặt của VK (nguyên nhân là
không cần có sự có mặt của VK (nguyên nhân là
do

do
A.tumefaciens
A.tumefaciens
đã chuyển một đoạn DNA của
đã chuyển một đoạn DNA của
Ti-plasmid xâm nhập vào hệ gen của cây bị
Ti-plasmid xâm nhập vào hệ gen của cây bị
bệnh).
bệnh).
Page  21
Ti-plasmid
Ti-plasmid




Trong thế giới thực vật đều tồn tại các thể plasmid,
đó là các vòng DNA tự sản sinh độc lập .
Đặc điểm quan trọng của
plasmid
plasmid là chúng có thể liên
kết vào NST nhưng cũng có thể tồn tại bên ngoài
NST một cách độc lập.
Các plasmid của
Argobacterium
Argobacterium được sử dụng vào
công nghệ gen thực vật có 2 dạng
vector
vector

cis
cis
và
và
trans
trans. Đây là 2 dạng vector rất thuận lợi để tái tổ
hợp gen ngoại lai và chuyển vào tế bào thực vật

Dạng cis
Dạng cis chỉ sử dụng Ti-plasmid và tế bào vật chủ
là
Argobacterium tumefanciens
Argobacterium tumefanciens mà
không có
không có sự
tham gia của vi khuẩn và các plasmid khác.

Dạng trans
Dạng trans là dạng mà sử dụng hai hay nhiều loại
plasmid và vi khuẩn cùng lúc
Page  22
Ti - plasmi
Bản đồ các dạng Ti-plasmid
Bản đồ các dạng Ti-plasmid
A.Dạng tự nhiên ban đầu B.Dạng Cis C.Dạng Trans
A.Dạng tự nhiên ban đầu B.Dạng Cis C.Dạng Trans
Page  24



Mặc dù hệ thống chuyển gen gián tiếp nhờ
Mặc dù hệ thống chuyển gen gián tiếp nhờ


Agrobacterium
Agrobacterium
là
là
có
có
hiệu quả đối với một số loài
hiệu quả đối với một số loài


nhưng
nhưng


không phải tất cả thực
không phải tất cả thực
vật có thể biến nạp bằng con đường này
vật có thể biến nạp bằng con đường này
.
.
Đặc biệt là
Đặc biệt là
lớp một lá
lớp một lá

mầm
mầm
bao gồm các
bao gồm các
cây ngũ cốc chính
cây ngũ cốc chính
trên thế giới
trên thế giới
như lúa, lúa
như lúa, lúa
mì và ngô là
mì và ngô là
không
không
được biến nạp dễ dàng nhờ
được biến nạp dễ dàng nhờ
A.tumefaciens
A.tumefaciens
.
.



Để khai thác và sử dụng
Để khai thác và sử dụng
A.tumefaciens
A.tumefaciens
như một vector
như một vector
chuyển gen các nhà khoa học đã

chuyển gen các nhà khoa học đã
loại bỏ
loại bỏ


các gen gây khối u
các gen gây khối u
và
và
gen mã hóa opine của T - DNA
gen mã hóa opine của T - DNA
và
và
thay thế
thay thế


vào đó là marker
vào đó là marker
chọn lọc
chọn lọc
, trong khi vẫn
, trong khi vẫn
duy trì
duy trì


vùng bờ phải và bờ trái của T-
vùng bờ phải và bờ trái của T-
DNA và các gen vir

DNA và các gen vir
.
.
Gen chuyển được xen vào vùng giữa các
Gen chuyển được xen vào vùng giữa các
vùng bờ của T-DNA. Nó sẽ được chuyển vào tế bào và trở nên
vùng bờ của T-DNA. Nó sẽ được chuyển vào tế bào và trở nên
hợp nhất với NST tế bào thực vật.
hợp nhất với NST tế bào thực vật.



Một vài yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp là : l
Một vài yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp là : l
oại
oại
mô được biến nạp, giai đoạn phát triển của mô, mức độ khởi
mô được biến nạp, giai đoạn phát triển của mô, mức độ khởi
đầu của vi khuẩn A.tumefaciens sử dụng, môi trường để nuôi
đầu của vi khuẩn A.tumefaciens sử dụng, môi trường để nuôi
cấy mô sau khi biến nạp, marker được sử dụng để chọn lọc thể
cấy mô sau khi biến nạp, marker được sử dụng để chọn lọc thể
biến nạp, loại vector sử dụng và kiểu gen của thực vật.
biến nạp, loại vector sử dụng và kiểu gen của thực vật.
Page  25


Vùng T-DNA
Vùng T-DNA

Vùng T-DNA
Vùng T-DNA
đó là
đó là
một đoạn DNA có kích thước
một đoạn DNA có kích thước
khoảng 25kb
khoảng 25kb
trong đó có chứa đoạn gen mã hóa
trong đó có chứa đoạn gen mã hóa
cho quá trình sinh tổng hợp auxin, cytokinin,
cho quá trình sinh tổng hợp auxin, cytokinin,
opine là các gen gây nên khối u (
opine là các gen gây nên khối u (
oncogenes
oncogenes
).
).
Trong Ti-plasmid,vị trí của T- DNA được giới
Trong Ti-plasmid,vị trí của T- DNA được giới
hạn bằng RB và LB.
hạn bằng RB và LB.


Vùng Vir
Vùng Vir
là vùng phụ trách khả năng lây nhiễm.
là vùng phụ trách khả năng lây nhiễm.