Nghiên cứu Tương đương sinh học viên nén Gliclazid giải phóng chậm sản xuất ở Việt Nam theo mô hình thử đơn liều và đa liều

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Phùng Thị Vinh, người thầy
đã tận tụy hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu
thực hiện đề tài.
Xin chân trọng cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, cảm ơn các thầy cô
Phòng Đào tạo sau đại học, Bộ môn Phân tích cùng các bộ môn khác của
trường Đại học Dược Hà nội đã tạo điều kiện tốt cho tôi trong quá trình học
tập tại trường.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc Viện Kiểm nghiệm thuốc
Trung Ương, Trung tâm đánh giá tương đương sinh học nơi tôi công tác đã
luôn quan tâm và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành nhiệm vụ học tập
và nghiên cứu trong thời gian vừa qua.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, đồng nghiệp, bạn bè đã luôn luôn động
viên, chia sẻ, khích lệ và giúp đỡ để tôi có thể có kết quả như ngày hôm nay.
Trần Hoàng
Học viên cao học khóa 12, chuyên ngành
Kiểm nghiệm thuốc – Độc chất
MỤC LỤC
1.3.1. Trên thế giới 14
DANH MỤC BẢNG BIỂU
- Gliclazid là thuốc chống đái tháo đường nhóm sulfonylurea. Tác dụng chủ yếu
của thuốc là kích thích tế bào beta tuyến tụy giải phóng insulin. 10
- Gliclazid dễ hấp thu qua đường tiêu hóa. Nồng độ đỉnh của thuốc đạt sau khi
uống khoảng 2 – 4 giờ với thuốc qui ước và khoảng 7 giờ với thuốc
giải phóng chậm. Thuốc gắn mạnh với protein huyết tương 85 – 94
%. Thời gian tác dụng kéo dài 12 giờ hoặc hơn. Gliclazid được
chuyển hóa mạnh ở gan thành những sản phẩm không còn hoạt
tính. Hầu hết các chất chuyển hóa là dẫn chất của acid carboxylic,
chưa tìm thấy chất nào có hoạt tính được tìm thấy trong máu.
Thuốc chưa biến đổi và các chất chuyển hóa đào thải chủ yếu qua
nước tiểu 60 – 70 %; khoảng 10 – 20 % qua phân ở dạng chuyển

hóa. Thời gian bán thải của gliclazid khoảng 10 – 12 giờ. 10
Chỉ định. 10
- Gliclazid được chỉ định trong đái tháo đường không phụ thuộc insulin typ 2 mà
chế độ ăn kiêng đơn thuần không kiểm soát được glucose huyết. 10
- Gliclazid dùng cho người cao tuổi bị đái tháo đường. 10
Chống chỉ định. 10
- Đái tháo đường phụ thuộc insulin typ 1. 10
- Hôn mê hay tiền hôn mê do đái tháo đường. 10
- Suy gan nặng, suy thận nặng. 10
- Có tiền sử dị ứng với sulfonamid và các sulfonylurea khác. 10
- Phối hợp với viên miconazol. 10
- Nhiễm khuẩn nặng hoặc chấn thương nặng, phẫu thuật lớn. 10
Một số phản ứng ADR có thể xảy ra khi dùng thuốc. 10
● Thường gặp, ADR > 1/100: 10
- Thần kinh trung ương: Đau đầu. 11
- Tiêu hóa: Rối loạn tiêu hóa, buồn nôn. 11
- Da: Phát ban. 11
● Ít gặp, 1/1000 < ADR < 1/100 11
- Rối loạn máu (thường hồi phục): Giảm tiểu cầu, mất bạch cầu hạt, giảm bạch
cầu, thiếu máu. 11
- Da: Phản ứng da, niêm mạc. 11
● Hiếm gặp, ADR < 1/1000 11
- Thần kinh trung ương: Trạng thái lơ mơ, vã mồ hôi. 11
- Tim mạch: Tăng tần số tim. 11
- Da: Tái xanh. 11
- Tiêu hóa: Nôn, đói cồn cào. 11
1.2.2. Một số chế phẩm gliclazid giải phóng chậm có trên thị trường. 11
1.2.3. Một số phương pháp định lượng Gliclazid trong dịch sinh học. 11
Qua các tài liệu tham khảo ta có một số phương pháp định lượng được tóm tắt
như sau: 12

Bảng 1.2: Tóm tắt một số phương pháp định lượng Gliclazid bằng phương pháp
HPLC. 12
1.3.1. Trên thế giới 14
Dựa trên nguyên tắc chất nội chuẩn cho vào chất cần phân tích với mục đích
làm giảm sai số trong quá trình sử lý mẫu đến quá trình phân tích.
Do vậy chất nội chuẩn phải có công thức phân tử tương tự như chất
phân tích, tính chất lý hóa tương tự nhau để trong quá trình xử lý
chiết, tách, chạy sắc ký dễ dàng hơn. 20
Khảo sát trên mẫu chuẩn GLI hòa tan trong pha động, mẫu huyết tương trắng
và mẫu thử tự tạo GLI nồng độ 2,5 µg/mL chuẩn trong huyết tương
trắng (nồng độ xấp xỉ Cmax). 21
c). Phương pháp chiết pha rắn (Rắn – lỏng) [5]. 22
38
38
Hình 3.2: Phổ hấp thụ của GLI 38
Hình 3.3: Phổ hấp thụ của IS 38
Bảng 3.11: Kết quả xác định độ phù hợp của hệ thống sắc ký 44
45
45
Hình 3.13: Sắc ký đồ huyết tương trắng 45
Hình 3.14: Sắc ký đồ huyết tương trắng có pha IS 45
DANH MỤC HÌNH VẼ
- Gliclazid là thuốc chống đái tháo đường nhóm sulfonylurea. Tác dụng chủ yếu
của thuốc là kích thích tế bào beta tuyến tụy giải phóng insulin. 10
- Gliclazid dễ hấp thu qua đường tiêu hóa. Nồng độ đỉnh của thuốc đạt sau khi
uống khoảng 2 – 4 giờ với thuốc qui ước và khoảng 7 giờ với thuốc
giải phóng chậm. Thuốc gắn mạnh với protein huyết tương 85 – 94
%. Thời gian tác dụng kéo dài 12 giờ hoặc hơn. Gliclazid được
chuyển hóa mạnh ở gan thành những sản phẩm không còn hoạt
tính. Hầu hết các chất chuyển hóa là dẫn chất của acid carboxylic,

chưa tìm thấy chất nào có hoạt tính được tìm thấy trong máu.
Thuốc chưa biến đổi và các chất chuyển hóa đào thải chủ yếu qua
nước tiểu 60 – 70 %; khoảng 10 – 20 % qua phân ở dạng chuyển
hóa. Thời gian bán thải của gliclazid khoảng 10 – 12 giờ. 10
Chỉ định. 10
- Gliclazid được chỉ định trong đái tháo đường không phụ thuộc insulin typ 2 mà
chế độ ăn kiêng đơn thuần không kiểm soát được glucose huyết. 10
- Gliclazid dùng cho người cao tuổi bị đái tháo đường. 10
Chống chỉ định. 10
- Đái tháo đường phụ thuộc insulin typ 1. 10
- Hôn mê hay tiền hôn mê do đái tháo đường. 10
- Suy gan nặng, suy thận nặng. 10
- Có tiền sử dị ứng với sulfonamid và các sulfonylurea khác. 10
- Phối hợp với viên miconazol. 10
- Nhiễm khuẩn nặng hoặc chấn thương nặng, phẫu thuật lớn. 10
Một số phản ứng ADR có thể xảy ra khi dùng thuốc. 10
● Thường gặp, ADR > 1/100: 10
- Thần kinh trung ương: Đau đầu. 11
- Tiêu hóa: Rối loạn tiêu hóa, buồn nôn. 11
- Da: Phát ban. 11
● Ít gặp, 1/1000 < ADR < 1/100 11
- Rối loạn máu (thường hồi phục): Giảm tiểu cầu, mất bạch cầu hạt, giảm bạch
cầu, thiếu máu. 11
- Da: Phản ứng da, niêm mạc. 11
● Hiếm gặp, ADR < 1/1000 11
- Thần kinh trung ương: Trạng thái lơ mơ, vã mồ hôi. 11
- Tim mạch: Tăng tần số tim. 11
- Da: Tái xanh. 11
- Tiêu hóa: Nôn, đói cồn cào. 11
1.2.2. Một số chế phẩm gliclazid giải phóng chậm có trên thị trường. 11

1.2.3. Một số phương pháp định lượng Gliclazid trong dịch sinh học. 11
Qua các tài liệu tham khảo ta có một số phương pháp định lượng được tóm tắt
như sau: 12
Bảng 1.2: Tóm tắt một số phương pháp định lượng Gliclazid bằng phương pháp
HPLC. 12
1.3.1. Trên thế giới 14
Dựa trên nguyên tắc chất nội chuẩn cho vào chất cần phân tích với mục đích
làm giảm sai số trong quá trình sử lý mẫu đến quá trình phân tích.
Do vậy chất nội chuẩn phải có công thức phân tử tương tự như chất
phân tích, tính chất lý hóa tương tự nhau để trong quá trình xử lý
chiết, tách, chạy sắc ký dễ dàng hơn. 20
Khảo sát trên mẫu chuẩn GLI hòa tan trong pha động, mẫu huyết tương trắng
và mẫu thử tự tạo GLI nồng độ 2,5 µg/mL chuẩn trong huyết tương
trắng (nồng độ xấp xỉ Cmax). 21
c). Phương pháp chiết pha rắn (Rắn – lỏng) [5]. 22
38
38
Hình 3.2: Phổ hấp thụ của GLI 38
Hình 3.3: Phổ hấp thụ của IS 38
Bảng 3.11: Kết quả xác định độ phù hợp của hệ thống sắc ký 44
45
45
Hình 3.13: Sắc ký đồ huyết tương trắng 45
Hình 3.14: Sắc ký đồ huyết tương trắng có pha IS 45
NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT
ANOVA : Phân tích phương sai
AUC : Diện tích dưới đường cong
AUMC : Diện tích dưới đường cong nồng độ - thời gian x thời gian
BCS : Hệ thống phân loại sinh dược học
BMI : Chỉ số khối cơ thể

Cτ : Nồng độ thuốc tại thời điểm τ
C
av
: Nồng độ thuốc trung bình ở trạng thái ổn định :
C
max
: Nồng độ thuốc tốt đa
C
min
: Nồng độ thuốc tối thiểu ở trạng thái ổn định
CV% : Hệ số biến thiên
DF : Dao động nồng độ thuốc trong huyết tương
EMS : Trung bình bình phương của sai số
FDA : Cục quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ
GCP : Thực hành tốt lâm sàng
GLI : Gliclazid
GLP : Thực hành tốt phòng thí nghiệm
GMP : Thực hành tốt sản xuất thuốc
HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao
HQC : Mẫu kiểm tra nồng độ cao
HT : Huyết tương
IS : Glibenclamid (nội chuẩn)
Kel : Hằng số tốc độ thải trừ
LLOQ : Giới hạn định lượng dưới
LQC : Mẫu kiểm tra nồng độ thấp
MeCN : Acetonitril
MQC : Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình
MR : Giải phóng chậm
MRT : Thời gian lưu trú trung bình
NTN : Người tình nguyện

QC : Mẫu kiểm tra
R : Thuốc đối chứng
SD : Độ lệch chuẩn
SKD : Sinh khả dụng
T : Thuốc thử
T
1/2
: Thời gian bán thải
TB : Trung bình
TDKD : Tác dụng kéo dài
TĐSH : Tương đương sinh học
T
max
: Thời gian đạt nồng độ thuốc tối đa
WHO : Tổ chức Y tế thế giới
τ : Khoảng cách liều
* Các đơn vị đo lường được viết tắt như sau
- Đơn vị đo chiều dài
Centimet : cm
Milimet : mm
Micromet : µm
Nanomet : nm
- Đơn vị đo khối lượng
Gam : g
Miligam : mg
Microgam : µg
- Đơn vị đo thể tích
Lít : L
Mililit : mL
Microlit : µL

ĐẶT VẤN ĐỀ

Gliclazid là một dẫn chất nhóm sulfonylurea được dùng trong điều trị
bệnh tiểu đường, một căn bệnh gia tăng khi xã hội phát triển. T‡ lệ người bị
bệnh tiểu đường trên thế giới ngày một tăng lên, nhu cầu dùng các thuốc trị
bệnh tiểu đường cˆng tăng theo. ‰ Việt nam, số bệnh nhân mắc bệnh tiểu
đường cˆng đã tới 1 – 2,5 % dân số và có t‡ lệ biến chứng, tử vong cao nhất
trong các bệnh nội tiết. Trên thị trường trong nước, các chế phẩm chứa
gliclazid đã được lưu hành và sử dụng trong điều trị, phần lớn là các thuốc
nhập ngoại. Gần đây, một số cơ sở sản xuất trong nước đã và đang nghiên cứu
sản xuất các chế phẩm có chứa gliclazid, trong đó có cả những dạng thuốc
giải phóng chậm như Glidin (Công ty Dược phẩm Vellpharm). Tuy nhiên,
chất lượng của các chế phẩm sản xuất trong nước chưa được khŠng định, việc
cấp phép lưu hành cˆng như lựa chọn trong điều trị còn đang được xem xét.
Trên thế giới, hầu hết các nước có nền công nghiệp Dược phát triển đều
đã có quy chế r‹ ràng về yêu cầu dữ liệu tương đương sinh học trong việc cấp
phép lưu hành, đồng thời ban hành các hướng dẫn nghiên cứu về lŒnh vực
này. Tuy nhiên, qui chế đăng ký thuốc của nước ta vẫn chưa yêu cầu về tương
đương sinh học và sinh khả dụng. Khái niệm về sinh khả dụng và tương
đương sinh học mới được đề cập tới trong đào tạo và nghiên cứu khoa học
khoảng gần chục năm trở lại đậy. Những nghiên cứu ban đầu mang tính chất
nhận thức khái niệm và tiếp cận phương pháp. Nhiều vấn đề chưa được và
gần như không thể giải quyết được trong thời gian qua, đặc biệt là các vấn đề
liên quan tới kỹ thuật. Hạn chế về trình độ và thiếu các thiết bị hiện đại đã
làm giảm giá trị và khả năng ứng dụng thực tiễn của các nghiên cứu, phần nào
đó do chưa có một yếu tố nào thúc đẩy các nhà sản xuất trong nước quan tâm
đầu tư cho những nghiên cứu này. Gần đây, tình hình nghiên cứu về chủ đề
1
này đã được cải thiện khá nhiều nhờ có thêm kinh nghiệm thực tế và sự
hưởng ứng của các doanh nghiệp.

Với các thuốc dạng rắn dùng đường uống, đặc biệt thuốc giải phóng
chậm, ảnh hưởng của công thức bào chế và yếu tố đường tiêu hóa lên quá
trình hấp thu của thuốc khá nhiều. Do vậy, việc nghiên cứu đánh giá khả năng
hấp thu các dạng thuốc này là rất cần thiết. Hơn nữa, với các dạng giải phóng
chậm, nghiên cứu sinh khả dụng còn cần để chứng tỏ quá trình giải phóng
dược chất chậm trong cơ thể và giúp kiểm soát nồng độ thuốc trong máu.
Để đánh giá một cách đích thực chất lượng của chế phẩm Gliclazid sản
xuất trong nước, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu Tương
đương sinh học viên nén Gliclazid giải phóng chậm sản xuất ở Việt Nam
theo mô hình thử đơn liều và đa liều”.
Mục tiêu của đề tài là:
1. Xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích Gliclazid trong huyết
tương người bằng phương pháp HPLC.
2. Đánh giá tương đương sinh học cho chế phẩm gliclazid giải phóng
chậm sản xuất trong nước so với Diamicron
®
MR 30 mg.
2
Phần 1: TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG VÀ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC
1.1.1. Khái niệm chung
- Sinh khả dụng: là thông số biểu thị t‡ lệ thuốc vào được vòng tuần hoàn
chung ở dạng còn hoạt tính so với liều đã dùng (F%), tốc độ (T
max
) và mức độ
(C
max
) thuốc thâm nhập được vào vòng tuần hoàn chung. Sinh khả dụng
invivo được biểu thị dưới 2 khái niệm: Sinh khả dụng tuyệt đối và sinh khả
dụng tương đối, trong đó sinh khả dụng tương đối thường được dùng nhiều

hơn trong nghiên cứu phát triển các sản phẩm thuốc generic [1], [4], [13].
- Tương đương sinh học: hai thuốc được gọi là tương đương sinh học nếu
chúng là những chế phẩm tương đương bào chế hoặc là thế phẩm bào chế có
sinh khả dụng tương tự nhau sau khi dùng cùng một mức liều, trong cùng một
điều kiện thử nghiệm [4], [13].
- Tương đương bào chế: những chế phẩm thuốc được coi là tương
đương về mặt bào chế nếu các thuốc này chứa cùng một lượng dược chất
giống nhau, cùng một dạng bào chế và đạt các tiêu chuẩn chất lượng do dược
điển quy định [4], [13].
- Thế phẩm bào chế: là những chế phẩm thay nếu chúng chứa cùng một
dược chất nhưng khác nhau về mặt hóa học (base, muối, este …) hoặc khác
nhau về dạng thuốc hay hàm lượng [13].
- Nghiên cứu đơn liều: nghiên cứu được thực hiện để đánh giá các thông
số dược động học sau khi dùng một liều duy nhất [19].
- Nghiên cứu đa liều ở trạng thái ổn định: nghiên cứu thực hiện để đánh giá
các thông số DĐH trong một khoảng liều ở trạng thái ổn định. Cho người tình
nguyện dùng thuốc đến khi đạt đến trạng thái ổn định, sau đó dùng một liều
3
thuốc nghiên cứu để xác định thông số dược động học từ thời điểm bắt đầu dùng
liều này ở trạng thái ổn định cho đến thời điểm dùng liều tiếp theo [19].
- Thuốc giải phóng chậm (tác dụng kéo dài): là những chế phẩm có khả
năng giải phóng dược chất liên tục theo thời gian để duy trì nồng độ dược
chất trong máu trong phạm vi điều trị trong khoảng thời gian dài, nhằm nâng
cao hiệu quả điều trị, giảm bớt tác dụng không mong muốn, giảm số lần dùng
thuốc cho người bệnh [12].
Hình 1.1: Đồ thị biến thiên nồng độ dược chất trong máu theo thời gian
1. Dạng quy ước
2. Dạng giải phóng chậm
MEC: Nồng độ tối thiểu có tác dụng
MTC: Nồng độ tối thiểu gây độc

1.1.2. Các phương pháp đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học
Có nhiều phương pháp đánh giá SKD và TĐSH [18, 17-33], [20]. Sau
đây là các phương pháp hay dùng:
- Thử in vivo ở người bằng cách so sánh sự biến thiên nồng độ dược chất
hoặc chất chuyển hóa trong máu, huyết tương, huyết thanh hoặc các dịch sinh
học thích hợp khác theo thời gian.
- Thử in vitro nếu đã chứng minh được là có tương quan tỉ lệ thuận với
số liệu SKD in vivo trên người.
4
- Thử in vivo ở người bằng cách đo tổng lượng dược chất hoặc chất
chuyển hóa bài tiết qua nước tiểu theo thời gian.
- Thử in vivo trên người bằng cách đo tác dụng dược lý của dược chất
hoặc chất chuyển hóa theo thời gian nếu phương pháp đánh giá đủ nhậy,
chính xác và tin cậy.
- So sánh tác dụng lâm sàng bằng phương pháp thích hợp, tin cậy.
1.1.3. Quy trình thực hiện đánh giá tương đương sinh học
Hiện nay, đánh giá tương đương sinh học thực hiện theo hướng dẫn của
FDA, Canada, ASEAN…, và dược điển của một số nước như Mỹ, Trung
Quốc…[9], [10], [13], [14], [17], [28], [31].
1.1.3.1. Thiết kế nghiên cứu
- Thiết kế: Trong nghiên cứu TĐSH, để hạn chế sự ảnh hưởng của các
yếu tố các thể người ta hạn chế thiết kế nghiên cứu song song mà thường thiết
kế nghiên cứu chéo, 2 thuốc, 2 giai đoạn (ô vuông la tinh 2x2) áp dụng khi so
sánh 1 thuốc thử và 1 thuốc chứng hoặc thiết kế chéo, 3 thuốc, 3 giai đoạn
(3x3) khi cần so sánh 2 thuốc thử và một thuốc đối chứng. Đối với thuốc giải
phóng chậm thiết kế như sau:
+ Thiết kế chéo (2 x 2), đơn liều, 2 thuốc, 2 giai đoạn, 2 trình tự.
+ Thiết kế chéo (2 x 2), đa liều, 2 thuốc, 2 giai đoạn, 2 trình tự.
+ Thiết kế chéo (3 x 3), đơn liều, 3 thuốc, 3 giai đoạn, 6 trình tự.
Các nghiên cứu này thực hiện trong tình trạng đói hoặc không đói.

- Thời gian đào thải: Thời gian nghỉ giữa hai giai đoạn dùng thuốc
phải đủ để liều đã dùng ở giai đoạn trước được đào thải hết trước khi dùng
liều sau. Thời gian này được tính bằng 7 lần thời gian bán thải của thuốc.
Đối với thuốc giải phóng chậm thời gian nghỉ có thể dài hơn phụ thuộc vào
từng thuốc.
5
- Liều thử: Mức liều thử thường dùng là liều tương ứng với 1 đơn vị có
hàm lượng cao nhất được lưu hành trên thị trường hoặc bằng mức liều thường
dùng trong lâm sàng. Trường hợp không thể định lượng được do nồng độ quá
thấp, có thể thử với liều cao hơn nhưng không được vượt quá mức liều tối đa
ghi trên nhãn. Trường hợp thuốc có tác dụng phụ có hại hoặc quá nhiều nguy
cơ, nên thử với mức liều thấp.
- Lấy mẫu: Thời điểm và khoảng thời gian lấy mẫu phải được thiết lập
sao cho có thể ước lượng tương đối chính xác giá trị C
max
và thu được đường
cong nồng độ trong huyết tương theo thời gian để ước lượng chính xác mức
độ hấp thu. Thời gian lấy mẫu đáp ứng khi giá trị AUC
0-t
ít nhất bằng 80% giá
trị AUC
0-∞
. Để có một đường cong dược động học lý tưởng thì số điểm lấy
mẫu tối thiểu phải lấy 12 điểm, 1 điểm trước khi uống thuốc, 3 – 4 điểm ở pha
hấp thu trước C
max
, 3 điểm xung quanh C
max
, 5 - 6 điểm ở pha thải trừ. Toàn bộ
quá trình lấy mẫu phải tuân thủ theo quy định của GCP.

1.1.3.2. Đối tượng thử
Tùy theo loại thuốc mà chọn đối tượng thử khác nhau, tốt nhất là đánh
giá trên NTN. Đối với thuốc có độc tích cao, thuốc có nồng độ dược chất
trong máu thấp hoặc khi thăm dò trong quá trình phát triển sản phẩm, nghiên
cứu SKD in vivo có thể tiến hành trên động vật thí nghiệm [20].
Phải lựa chọn đủ số lượng NTN để đảm bảo kết quả phân tích thống kê.
Dùng tối thiểu 12 người cho một nghiên cứu. Số lượng NTN có thể nhiều hơn
nếu dược chất thuộc loại có tốc độ và mức độ hấp thu biến thiên giữa các cá
thể là khác nhau nhiều. NTN khỏe mạnh, thuộc cả hai giới, tuy nhiên không
nghiên cứu trên đối tượng là phụ nữ mang thai. Các tiêu chí về chỉ số khối cơ
thể phải đạt các yêu cầu theo cánh tính của Metropolitan Index 1983 cho người
lớn. NTN cần được kiểm tra lâm sàng, xem xét tiền sử bệnh và các xét nghiệm
cơ bản. NTN phải có khả năng hiểu các thông tin về nghiên cứu và tự viết bản
6
tình nguyện tham gia nghiên cứu. NTN tự nguyện tham gia nghiên cứu và ký
vào Bản cam kết tình nguyện tham gia nghiên cứu theo mẫu được Hội đồng
đạo đức thông qua. Các thông tin về NTN và kết quả xét nghiệm, nghiên cứu sẽ
được giữ bí mật trong hồ sơ nghiên cứu. Tên, địa chỉ, hình ảnh NTN sẽ không
được công bố trong các báo cáo kết quả, báo, tạp chí nếu không được sự đồng
ý của NTN.
1.2.3.3. Thuốc thử và thuốc đối chứng
- Thuốc thử: Thuốc dùng trong nghiên cứu SKD và TĐSH phải được sản
xuất theo tiêu chuẩn GMP. Chế phẩm được lấy từ lô sản xuất công nghiệp.
Nếu mẫu thử lấy từ lô sản xuất thử (pilot) thì cỡ lô này không được dưới 10%
cỡ lô sản xuất chuẩn. Các mẫu thuốc dùng trong nghiên cứu phải được kiểm
tra chất lượng trước khi đưa vào thử.
- Thuốc đối chứng: Là các thuốc phát minh cùng loại. Nếu các thuốc phát
minh không có sẵn trên thị trường tại thời điểm nghiên cứu, có thể dùng một
thuốc tương đương đã được cấp phép thay thế.
- Kết quả định lượng dược chất mẫu thuốc thử và thuốc đối chứng dùng

trong nghiên cứu phải có hàm lượng không được khác nhau quá 5%. Nếu quá
thì phải hiệu chỉnh các thông số phụ thuộc liều để so sánh đánh giá kết quả.
1.1.3.4. Phân tích mẫu sinh học
Phân tích mẫu dịch sinh học phải thực hiện theo các nguyên tắc thực
hành tốt phòng thí nghiệm (GLP). Các thiết bị phân tích phải được bảo trì,
hiệu chuẩn theo định kỳ để đảm bảo thông số thiết bị nằm trong giới hạn cho
phép. Các phương pháp phân tích sinh học dùng để xác định dược chất hoặc
chất chuyển hóa trong dịch sinh học phải đặc hiệu, được thẩm định đầy đủ và
có hồ sơ để cung cấp kết quả tin cậy. Mục đích của việc thẩm định phương pháp
là đánh giá mức độ tin cậy của phương pháp dùng trong xác định nồng độ chất
cần phân tích trong dịch sinh học. Theo quy định của FDA, thẩm định phương
7
pháp gồm 6 chỉ tiêu như: (1) tính đặc hiệu, (2) độ chính xác, (3) độ đúng, (4) giới
hạn định lượng, (5) khoảng tuyến tính, (6) độ ổn định của dược chất ở điều kiện
phân tích và trong quá trình bảo quản. Tất cả các chỉ tiêu phải đạt các quy định
theo hướng dẫn của FDA cˆng như dược điển Mỹ, Trung Quốc.
1.1.3.5. Phân tích số liệu
Phân tích số liệu đánh giá TĐSH là lượng hóa sự khác nhau về SKD giữa
các thuốc thử và thuốc đối chứng. Phân tích thống kê được sử dụng để đánh
giá sự khác nhau này. Cơ sở của phương pháp là khoảng tin cậy 90% cho tỉ số
của trung bình quần thể thử và quần thể đối chứng: µ
T
/µ
R
cho một số thông số
khảo sát.
Thông số dược động học được tính toán từ nồng độ như AUC, MRT,
C
max
được phân tích chuyển dạng logarit cơ số 10 hoặc cơ số e. Riêng đối với

T
max
được xử lý theo phương pháp thống kê phi tham số. Phân tích phương sai
được sử dụng để đánh giá ảnh hưởng của các nguồn biến thiên như: trình tự,
giai đoạn, cá thể, thuốc đến kết quả nghiên cứu.
Khoảng chấp nhận của các thông số DĐH theo tiêu chuẩn của Mỹ và
Châu Âu nằm trong khoảng dao động 0,80 – 1,25 của chế phẩm thử so với
chế phẩm đối chứng.
Trên thế giới, thông thường các thông số DĐH được tính toán theo phần
mềm thống kê như: Kinetica, Winnolin, SAS Trong đề tài chúng tôi tính
toán thông số DĐH được lập trên phần mềm Ecell theo những nguyên tắc
trên, phần mềm đã được thẩm định đầy đủ trước khi đưa vào sử dụng [14].
1.1.4. Đảm bảo đạo đức trong nghiên cứu
Để đảm bảo vấn đề đạo đức trong nghiên cứu Y – sinh học, đề cương
nghiên cứu phải được xem xét và phê duyệt bởi hội đồng đạo đức độc lập với
nhóm nghiên cứu theo các quy định hiện hành. Tất cả các hoạt động nghiên
cứu chỉ được thực hiện sau khi đề cương được phê duyệt. Bản cam kết của
8
người tình nguyện phải được ký trước khi tiến hành bất kỳ hoạt động gì với
người tình nguyện [6], [37].
1.1.5. Đảm bảo chất lượng kết quả nghiên cứu
Để đảm bảo chất lượng kết quả nghiên cứu, quá trình lấy mẫu phải tiến
hành trong điều kiện cơ sở lấy mẫu phải đạt tiêu chuẩn (GCP), NTN phải
được tuyển chọn đạt các yêu cầu đối với thuốc thử nghiệm, quá trình phân
tích mẫu phải định lượng trong phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn vể GLP và
ISO. Cơ sở vật chất được thẩm định và đánh giá định kỳ. Tất cả các thiết bị
dùng trong nghiên cứu được hiệu chuẩn theo kế hoạch, nghiên cứu viên được
đào tạo về GLP, GCP và các phương pháp chung về đánh giá SKD và TĐSH
[11], [37].
1.2. TỔNG QUAN GLICLAZID

1.2.1. Tính chất lý hóa và cách sử dụng
Gliclazid (GLI) là dẫn chất của nhóm sulfonylurea được điều chế bằng
phương pháp tổng hợp.
Tên khoa học: 1-(hexanhydrocyclopenta[c]pyrol-2(1H)yl)-3[(4-
methylphenyl) sulphonylurea]
Công thức phân tử: C
15
H
21
N
3
O
3
S
Khối lượng phân tử: 323,4 g/mol
Công thức cấu tạo:
Tính chất: Tinh thể hay bột kết tinh trắng, hầu như không tan trong
nước, tan nhiều trong Methylenclorid, tan ít trong acetone và alcol. Nhiệt độ
nóng chảy 181
0
C. Gliclazid là một acid yếu có pK
a
5,8, có tính thân mỡ LogP
(octanol/water) 2,1. Theo bảng phân loại dược chất của BCS thì gliclazid
được xếp vào nhóm 2 có tính tan kém và tính thấm tốt. Do đó có thể chiết
9
tách GLI trong dịch sinh học bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng với dung
môi hưu cơ. Trong môi trường acid hấp thụ mật độ quang ở bước sóng 230
nm, môi trường bazơ là 263 nm [11], [25], [30].
Sử dụng trong lâm sàng [3], [8].

- Gliclazid là thuốc chống đái tháo đường nhóm sulfonylurea. Tác dụng chủ yếu
của thuốc là kích thích tế bào beta tuyến tụy giải phóng insulin.
- Gliclazid dễ hấp thu qua đường tiêu hóa. Nồng độ đỉnh của thuốc đạt sau khi
uống khoảng 2 – 4 giờ với thuốc qui ước và khoảng 7 giờ với thuốc giải phóng chậm.
Thuốc gắn mạnh với protein huyết tương 85 – 94 %. Thời gian tác dụng kéo dài 12
giờ hoặc hơn. Gliclazid được chuyển hóa mạnh ở gan thành những sản phẩm không
còn hoạt tính. Hầu hết các chất chuyển hóa là dẫn chất của acid carboxylic, chưa tìm
thấy chất nào có hoạt tính được tìm thấy trong máu. Thuốc chưa biến đổi và các chất
chuyển hóa đào thải chủ yếu qua nước tiểu 60 – 70 %; khoảng 10 – 20 % qua phân ở
dạng chuyển hóa. Thời gian bán thải của gliclazid khoảng 10 – 12 giờ.
Chỉ định.
- Gliclazid được chỉ định trong đái tháo đường không phụ thuộc insulin typ 2
mà chế độ ăn kiêng đơn thuần không kiểm soát được glucose huyết.
- Gliclazid dùng cho người cao tuổi bị đái tháo đường.
Chống chỉ định.
- Đái tháo đường phụ thuộc insulin typ 1.
- Hôn mê hay tiền hôn mê do đái tháo đường.
- Suy gan nặng, suy thận nặng.
- Có tiền sử dị ứng với sulfonamid và các sulfonylurea khác.
- Phối hợp với viên miconazol.
- Nhiễm khuẩn nặng hoặc chấn thương nặng, phẫu thuật lớn.
Một số phản ứng ADR có thể xảy ra khi dùng thuốc.
● Thường gặp, ADR > 1/100:
10
- Thần kinh trung ương: Đau đầu.
- Tiêu hóa: Rối loạn tiêu hóa, buồn nôn.
- Da: Phát ban.
● Ít gặp, 1/1000 < ADR < 1/100
- Rối loạn máu (thường hồi phục): Giảm tiểu cầu, mất bạch cầu hạt, giảm bạch
cầu, thiếu máu.

- Da: Phản ứng da, niêm mạc.
● Hiếm gặp, ADR < 1/1000
- Thần kinh trung ương: Trạng thái lơ mơ, vã mồ hôi.
- Tim mạch: Tăng tần số tim.
- Da: Tái xanh.
- Tiêu hóa: Nôn, đói cồn cào.
1.2.2. Một số chế phẩm gliclazid giải phóng chậm có trên thị trường.
Trên thị trường chế phẩm gliclazid có nhiều loại biệt dược khác nhau dưới
nhiều dạng bào chế khác nhau. Hiện nay các dạng thuốc qui ước trong nước sản
xuất khá nhiều, các dạng thuốc giải phóng chậm đã và đang nghiên cứu sản xuất.
Bảng 1.1: Tóm tắt một số chế phẩm gliclazid có trên thị trường
STT
Tên chế phẩm
Dạng
bào chế
Số đăng ký Hãng sản xuất
1
Reclide MR 30
(gliclazid 30 mg)
Viên nén VN-10122-05
Dr.Reddys Laboratories
Ltd
2
Diamicron MR
(gliclazid 30 mg)
Viên nén
bao phim
VN-0456-06
Les Laboratories Servier
Industrie (Pháp)

3
Diamicron
(gliclazid 80 mg)
Viên nén VN-2360-97
Les Laboratories Servier
Industrie (Pháp)
4
Clazic SR 30 mg
(gliclazid 30 mg)
Viên nén VNB-3950-05
Công ty United Pharma -
VN
5
Zanycrone
(gliclazid 80 mg)
Viên nén VD-5133-08
Công ty CP Dược Phẩm
Hà Tây
1.2.3. Một số phương pháp định lượng Gliclazid trong dịch sinh học.
11
Qua các tài liệu tham khảo ta có một số phương pháp định lượng được tóm tắt
như sau:
Bảng 1.2: Tóm tắt một số phương pháp định lượng Gliclazid bằng phương
pháp HPLC.
STT
Tài
liệu
Điều kiện sắc ký
Chuẩn
nội

Xử lý mẫu
1 30
- Cột: RP8, 250x4 mm, 5µm
(Superspher)
- Detector: 235 nm
- Pha động: TEA-TFA-
MeCN-Nước (0,1:0,1:45:55)
- Tốc độ dòng: 0,9 mL/phút
- Thể tích tiêm: 20 µL.
1-(3-
zabicyclo[3.3.3]oct-3-
yl)-3-o-
- Dung dịch chuẩn, thử: 0,2
mg/mL trong MeCN – Nước
(2:3).
2 27
- Cột: RP18, 250x4 mm, 5µm
(Lichrospher)
- Detector: 229 nm
- Pha động: Đệm acetate
(0,02M, pH4) – MeCN
(50:50, v/v).
- Tốc độ dòng: 1,5 mL/phút
- Thể tích tiêm: 20 µL.
Glibenclamid
Hút 0,5 mL HT + 1 mL đệm
phosphat 0,2M + 500 ng IS.
Lắc vortex 10 giây. Thêm 6
mL dicloromethan lắc, ly
tâm 2900 g/10 phút. Cô N

2
45
0
C. Cắn + 400 µL PĐ, lắc
+ 1 mL hexan, lắc, ly tâm
2900 g/5 phút.
3 24
- Cột: Capcell Pack C18 UG
120, 250x1, 5 mm, 5 µm
(Shiseido Co), nhiệt độ cột 26
0
- Detector: 229 nm
- Pha động: Đệm KH
2
PO
4
40
mM, pH 4,6 - MeCN-
Isopropyl alcol (5:4:1, v/v/v).
- Tốc độ dòng: 0,22 mL/phút
- Thể tích tiêm: 30 µL.
Glyburid
0,5 mL HT + 100 µL dung
dịch IS + 0,5 mL acetonitril.
Lắc Vortex 10 giây. Thêm 4
mL chloroform, lắc 1 phút.
Ly tâm 3000 vòng/15 phút.
Cô N
2
40

0
C. Cắn hoà tan
trong 100 µL pha động.
12
4 22
- Cột: C18 ODS, 200 x 4,6
mm, 5 µm, nhiệt độ cột 45
0
.
- Pha động: MeCN - Nước
(49:51) pH 2,8.
- Detector: 229 nm.
- Tốc độ dòng 1,2 mL/phút.
- Thể tích tiêm: 20 µL
Glipizid
1 mL HT + 0,1 mL Glipizid
+ 0,2 mL HCl 0,4 mol/L + 5
mL benzen-isopropanol
(98:2). Lắc vortex 2 phút. Ly
tâm 5 phút, tốc độ 2000
vòng/phút. Lấy 4 mL dung
môi cô N
2
60
0
C. Phần còn lại
hoà tan trong 0,16 mL
MeCN.
5 23
- Cột: C18

- Pha động: MeOH 0,5% -
Acid formic (80:20, v/v).
- Detector: ESI-MS
- Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút.
Tolbutamid
Chiết bằng n-hexan-
dicloromethan (1:1, v/v).
Nhận xét:
- Phương pháp 1: Định lượng gliclazid trong chế phẩm, không có quy
trình xử lý mẫu trong huyết tương, không áp dụng được.
- Phương pháp 2: Quy trình xử lý mẫu phức tạp tốn nhiều thời gian, do
phải qua 2 lần chiết nên gặp nhiều sai số và thường cho hiệu suất chiết thấp.
- Phương pháp 3: Quy trình xử lý mẫu đơn giản, phương pháp có
khoảng tuyến tính lớn 0,1 – 10 µg/mL, nhưng phương pháp chưa thẩm định
đầy đủ, chủ yếu dùng trong lâm sàng cá thể hóa điều trị (số lượng mẫu ít).
Mặt khác Gliburid không có trong danh sách chất chuẩn quốc gia nên khó áp
dụng trong điều kiện thực tế nước ta hiện nay.
- Phương pháp 4: Quy trình xử lý mẫu tương đối đơn giản : chiết lỏng
– lỏng trong môi trường acid yếu nhưng sử dụng dung môi độc hại (benzen)
vì vậy không nên sử dụng.
- Phương pháp 5: Có độ nhậy cao, giá trị LLOQ rất nhỏ 2,5 ng/mL,
song sử dụng detector khối phổ là một phương pháp mới với thiết bị hiện đại
13
đắt tiền chưa phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm ở Việt Nam, thông tin
về phương pháp còn chưa đầy đủ.
Trên cơ sở tham thảo các phương pháp định lượng đã được công bố,
chúng tôi dự kiến xây dựng phương pháp định lượng GLI trong huyết tương
NTN bằng HPLC với detector PDA.
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TĐSH Ở TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM
1.3.1. Trên thế giới

Đánh giá SKD và TĐSH được thực hiện từ nhiều thập k‡ trước, ở các
nước có nền công nghiệp Dược phát triển như Canada, Mỹ, Pháp, Đức,
Indonesia, Malaysia, Philippin và một số nước trong khu vực. Mỗi quốc gia
khi quy định thử nghiệm đều ban hành các hướng dẫn nghiên cứu và quy chế
trong quản lý. Tuy nhiên các hướng dẫn chung thì rất phổ biến, những hướng
dẫn cho các dạng thuốc cụ thể thì chưa có nhiều. Trong đó, Mỹ là quốc gia
đầu tiên thực hiện luật bản quyền trong sản xuất dược phẩm và quy định r‹
việc cấp phép lưu hành cho thuốc generic. Cho đến nay cơ quan quản lý thuốc
và thực phẩm Mỹ (FDA) đã ban hành nhiều qui chế và hướng dẫn cho việc
nghiên cứu và cấp phép lưu hành thuốc. Các qui chế của Mỹ qui định khá r‹
ràng về hồ sơ cần đệ trình khi đăng ký sản xuất và lưu hành các loại thuốc,
cˆng như các trường hợp thay đổi sau khi cấp phép. Đồng thời FDA cˆng ban
hành các tài liệu mang tính chất hướng dẫn kỹ thuật cho việc thực hiện
nghiên cứu như hướng dẫn về thẩm định phương pháp nghiên cứu, hướng dẫn
về xử lý và bảo quản mẫu sinh học và xem xét miễn thử SKD và TĐSH in
vivo cho các thuốc dạng rắn [15], [18], [19], [35]. Dược điển Mỹ ban hành
chuyên luận " Hướng dẫn nghiên cứu tương đương sinh học in vivo ", kèm
theo quy trình thử cho một số chế phẩm cụ thể, trong đó có 2 thuốc giải
phóng chậm (Diclofenac và Pentoxyphillin) [25].
14
Gần đây ở ASEAN, việc đánh giá TĐSH đã trở thành yêu cầu cấp thiết và
được thực hiện trong một số năm qua. Các nước này đưa ra quy chế đăng ký
thuốc trong nước và một số thuốc nước ngoài xin lưu hành đều phải trình kết
quả đánh giá TĐSH. Sự gia tăng các thuốc generic trên thị trường cˆng là một
trong những yếu tố quan trọng thôi thúc các nhà quản lý của Bộ Y tế tìm ra
một biện pháp để lựa chọn các thuốc generic có tương đương điều trị dùng
trong lâm sàng. Trên thực tế, nghiên cứu của các nước ASEAN cˆng thực hiện
trên chế phẩm qui ước, và hiếm có nghiên cứu trên chế phẩm giải phóng chậm.
‰ Châu Âu, năm 1987 đã có hướng dẫn về nghiên cứu SKD (Investigation
of Bioavailability), năm 1991 quy định chính thức đầu tiên về nghiên cứu SKD

và TĐSH đã được ban hành.
Nhằm tạo sự thống nhất trong khối EU về đánh giá hiệu quả điều trị của
thuốc, tháng 6/2001 U‡ ban về các chế phẩm thuốc độc quyền (CPMP) thuộc
cơ quan Châu Âu đánh giá thuốc đã ban hành hướng dẫn về nghiên cứu SKD
và TĐSH.
Tổ chức Y tế Thế Giới (WHO) đã dự thảo hướng dẫn chung cho các
nghiên cứu đánh giá thuốc generic, trong đó đề cập đến thuốc TDKD cần
phải thực hiện nghiên cứu, nhưng chưa có hướng dẫn chi tiết. Theo hướng
dẫn của WHO, các quốc gia nên có các quy định cụ thể sẽ được ban hành
riêng để phù hợp với trình độ quản lý và năng lực kỹ thuật thực tế của từng
quốc gia [36].
Một số nước châu Á như Hàn Quốc, Trung quốc cˆng đưa ra những
hướng dẫn cho việc thử nghiệm SKD và TĐSH nhưng bằng tiếng địa phương.
Dược điển Trung quốc đã đưa ra quy trình thử TĐSH cho thuốc giải phóng
chậm [28].
Chi phí đánh giá TĐSH của thuốc trên người tình nguyện khá tốn kém.
Theo thống kê của FDA, thực hiện đánh giá một chế phẩm có thể chi phí từ
15