Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc aspergillus niger

Đồ án tốt nghiệp 1 GVHD: TS. Đặng Minh Nhật
LỜI MỞ ĐẦU
Trong vài thập kỷ trở lại đây, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ
sinh học, các chế phẩm enzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng
hầu hết trong các lĩnh vực kinh tế. Enzyme đã dần từng bước làm thay đổi và nâng
cao một số các quá trình công nghệ trong chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn
nuôi, y tế…đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của xã hội.
Enzyme glucose oxidase (GOD: β-D-glucose:oxygen 1-oxidoreductase, EC
1.1.3.4) là enzyme xúc tác quá trình oxi hóa của β-D-glucose thành axit gluconic
với sự tham gia của phân tử oxi như chất nhận điện tử, đồng thời giải phóng ra
hydroperoxide (H
2
O
2
). GOD được biết đến từ những năm 1950, ngày nay được ứng
dụng nhiều trong công nghiệp thực phẩm và các lĩnh vực khác như: y dược, hóa học
lâm sàng, công nghệ sinh học, trong công nghiệp dệt… [10].
Hiện nay, trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu nhằm mục đích thu nhận
và ứng dụng GOD vào thực tế sản xuất nhưng ở nước ta thì việc nghiên cứu này còn
rất hạn chế và chưa thể sản xuất được chế phẩm GOD. Và đây đang là vấn đề thu
hút sự quan tâm của các nhà khoa học trong và ngoài nước, nắm bắt tình hình đó tôi
đã chọn đề tài: “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào
thô từ nấm mốc Aspergillus niger”.
Mục đích của đề tài:
- Xác định đơn biến ảnh hưởng của nồng độ các nguồn dinh dưỡng carbon,
nitơ và muối canxi cacbonat trong môi trường nuôi cấy, để khả năng sinh
tổng hợp enzyme GOD ngoại bào từ nấm mốc Aspergillus niger là cao nhất.
- Xác định nồng độ muối (NH
4
)
2

SO
4
và pH của môi trường nghiên cứu để hiệu
suất thu nhận chế phẩm enzyme GOD ngoại bào thô là tốt nhất.
- Thu nhận chế phẩm enzyme ngoại bào thô.
Nội dung nghiên cứu của đề tài:
SVTH: Trần Văn Hoàng Lớp 06H2B
Đề tài: “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc
Aspergillus niger”
Đồ án tốt nghiệp 2 GVHD: TS. Đặng Minh Nhật
- Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của saccharose, peptone và CaCO
3
đến quá
trình sinh tổng hợp enzyme GOD ngoại bào từ nấm mốc Aspergilus Niger.
- Sử dụng phương pháp đo độ hấp thụ quang phổ để đánh giá hoạt lực của
enzyme GOD ngoại bào.
- Khảo sát nồng độ bão hòa của muối (NH
4
)
2
SO
4
và sự ảnh hưởng của pH của
MTNC đến khả năng kết tủa enzyme GOD ngoại bào.
- Thu nhận và xác định hoạt độ riêng của chế phẩm enzyme thô.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài:
- Đóng góp dẫn liệu nghiên cứu điều tra sự ảnh hưởng của một số nguồn dinh
dinh dưỡng, tạo tiền đề cho quá trình tối ưu hóa môi trường nuôi cấy cho quá
trình sinh tổng hợp enzyme GOD ngoại bào từ nấm mốc Aspergillus niger,
- Kiểm định và khả năng sinh tổng hợp enzyme GOD ngoại từ nấm mốc

Aspergillus niger,
- Lựa chọn được điều kiện thích hợp cho khả năng kết tủa enzyme GOD ngoại
bào. Tạo tiền đề bước đầu xây dựng quy trình thu nhận chế phẩm enzyme
GOD tinh khiết.
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
SVTH: Trần Văn Hoàng Lớp 06H2B
Đề tài: “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc
Aspergillus niger”
Đồ án tốt nghiệp 3 GVHD: TS. Đặng Minh Nhật
 Giới thiệu chung về nấm mốc
Nấm mốc là vi sinh vật chân hạch, ở thể tản, tế bào không có diệp lục tố, sống
dị dưỡng (hoại sinh, ký sinh, cộng sinh), vách tế bào cấu tạo chủ yếu là chitin, có
hay không có cellulose và một số thành phần khác có hàm lượng thấp. Theo
Elizabeth Tootyll (1984) nấm mốc có khoảng 5.100 giống và 50.000 loài được mô
tả, tuy nhiên, ước tính có trên 100.000 đến 250.000 loài nấm hiện diện trên trái đất
[23] .
 Hình dạng, kích thước, cấu tạo của nấm mốc [23]
Một số ít nấm ở thể đơn bào có hình trứng, đa số có hình sợi, sợi có ngăn
vách (đa bào) hay không có ngăn vách (đơn bào). Sợi nấm thường là một ống hình
trụ dài có kích thước lớn nhỏ khác nhau tùy loài. Đường kính của sợi nấm thường từ
3÷5 µm, có khi đến 10 µm, thậm chí đến 1 mm. Chiều dài của sợi nấm có thể tới vài
chục centimet. Các sợi nấm phát triển chiều dài theo kiểu tăng trưởng ở ngọn. Các
sợi nấm có thể phân nhánh và các nhánh có thể lại phân nhánh liên tiếp tạo thành hệ
sợi nấm khí sinh xù xì như bông. Trên môi trường đặc và trên một số cơ chất trong
tự nhiên, bào tử nấm, tế bào nấm hoặc một đoạn sợi nấm có thể phát triển thành một
hệ sợi nấm có hình dạng nhất định gọi là khuẩn lạc nấm.
Tế bào nấm có cấu trúc tương tự như những tế bào vi sinh vật chân hạch
khác. Vách tế bào nấm cấu tạo bởi vi sợi chitin và có hoặc không có cellulose.
Chitin là thành phần chính của vách tế bào ở hầu hết các loài nấm trừ nhóm

Oomycetina. Những vi sợi chitin được hình thành nhờ vào enzyme chitinsyntase. Tế
SVTH: Trần Văn Hoàng Lớp 06H2B
Đề tài: “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc
Aspergillus niger”
Hình 1.1. Sợi nấm và cấu tạo vách tế bào sợi nấm (theo Samson v ctv., 1995)
Đồ án tốt nghiệp 4 GVHD: TS. Đặng Minh Nhật
bào chất của tế bào nấm mốc chứa mạng nội mạc, không bào, ty thể và hạt dự trữ,
đặc biệt cấu trúc ty thể ở tế bào nấm tương tự như cấu trúc ty thể ở tế bào thực vật.
Ngoài ra, tế bào nấm còn có ribose thể và những thể khác chưa rõ chức năng. Tế
bào nấm không có diệp lục tố, một vài loài nấm có rải rác trong tế bào một loại sắc
tố đặc trưng mà Matsueda và cộng sự (1978) đầu tiên trích ly được và gọi là
neocercosporin (C
29
H
26
O
10
) có màu tím đỏ ở nấm Cercosporina kikuchi. Tế bào nấm
không nhất thiết có một nhân mà thường có nhiều nhân. Nhân của tế bào nấm có
hình cầu hay bầu dục với màng đôi phospholipid và protein, bên trong màng nhân
chứa ARN và ADN.
1.1.2. Dinh dưỡng và tăng trưởng của nấm mốc
Hầu hết các loài nấm mốc không cần ánh sáng trong quá trình sinh trưởng.
Tuy nhiên, có một số loài lại cần ánh sáng trong quá trình tạo bào tử (Buller, 1950).
Nhiệt độ tối thiểu cần cho sự phát triển là từ 2
0
C đến 5
0
C, tối thích là 22
0

C÷27
0
C và
nhiệt độ tối đa mà chúng có thể chịu đựng được là 35
0
C÷ 40
0
C, cá biệt có một số ít
loài có thể sống sót ở 0
0
C và ở 60
0
C.
Nói chung, nấm mốc có thể phát triển tốt ở môi trường axit (pH = 6) nhưng
pH tối thích là 5÷6,5, một số loài phát triển tốt ở pH < 3 và một số ít phát triển ở pH
> 9 (Ingold, 1967). Oxi cũng cần cho sự phát triển của nấm mốc vì chúng là nhóm
hiếu khí bắt buộc và sự phát triển sẽ ngưng khi không có oxi và tất nhiên nước là
yếu tố cần thiết cho sự phát triển. Nấm mốc không có diệp lục tố nên chúng cần
được cung cấp dinh dưỡng từ bên ngoài (nhóm dị dưỡng), một số sống sót và phát
triển nhờ khả năng ký sinh (sống ký sinh trong cơ thể động vật hay thực vật) hay
hoại sinh trên xác bã hữu cơ, cũng có nhóm nấm rễ hay địa y sống cộng sinh với
nhóm thực vật nhất định. Theo Alexopoulos và Mims (1979) cho biết nguồn dưỡng
chất cần thiết cho nấm được xếp theo thứ tự sau: C, O, H, N P, K, Mg, S, B, Mn,
Cu, Zn, Fe, Mo và Ca. Các nguyên tố này hiện diện trong các nguồn thức ăn vô cơ
đơn giản như glucose, muối ammonium sẽ được nấm hấp thu dễ dàng, nếu từ
nguồn thức ăn hữu cơ phức tạp nấm sẽ sản sinh và tiết ra bên ngoài các loại enzym
SVTH: Trần Văn Hoàng Lớp 06H2B
Đề tài: “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc
Aspergillus niger”
Đồ án tốt nghiệp 5 GVHD: TS. Đặng Minh Nhật

thích hợp để cắt các đại phân tử này thành những phân tử nhỏ để dễ hấp thu vào
trong tế bào.
1.1.3. Sinh sản của nấm mốc
Nấm mốc sinh sản dưới 2 hình thức chính: vô tính và hữu tính. Trong sinh
sản vô tính, nấm hình thành bào tử mà không qua việc giảm phân, trái lại trong sinh
sản hữu tính nấm hình thành 2 loại giao tử đực và cái.
 Sinh sản vô tính: The Alexopoulos và Mims (1979), nấm mốc sinh sản vô tính thể
hiện qua 2 dạng: sinh sản dinh dưỡng bằng đoạn sợi nấm phát triển dài ra hoặc phân
nhánh và sinh sản bằng các loại bào tử.
 Sinh sản hữu tính: Sinh sản hữu tính xảy ra khi có sự kết hợp giữa hai giao tử đực
và cái có trải qua giai đoạn giảm phân. Quá trình sinh sản hữu tính trải qua 3 giai
đoạn:
- Tiếp hợp tế bào chất với sự hòa hợp 2 tế bào trần của 2 giao tử .
- Tiếp hợp nhân với sự hòa hợp 2 nhân của 2 tế bào giao tử để tạo một nhân
nhị bội.
- Giảm phân giai đoạn này hình thành 4 bào tử đơn bội qua sự giảm phân từ 2n
NST (nhị bội) thành n NST (đơn bội).
1.1.4. Tìm hiểu về nấm mốc Aspergillus [3]
Giống nấm Aspergillus có thể tới hơn 200 loài, sinh sản vô tính bằng cách tạo
thân quả hoặc cuống bào tử đính. Bào tử đính phát triển thành tế bào rất dày ở bên
trong hệ sợi nấm gọi là tế bào gốc (foot cell). Nó tạo thành sợi cuống dài (stalk) và
kết thúc khi tạo ra một cấu trúc phồng hình củ hành gọi là túi ( Xung quanh túi là
một hoặc hai bộ cuống để đính bào tử gọi là cuống đính bào tử hay thể bình). Từ bộ
cuống đính bào tử cuối cùng, bào tử được sinh ra gọi là bào tử đính (conidia).
SVTH: Trần Văn Hoàng Lớp 06H2B
Đề tài: “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc
Aspergillus niger”
Đồ án tốt nghiệp 6 GVHD: TS. Đặng Minh Nhật
Không có một giống nấm sợi nào khác ngoài giống nấm này có hệ bào tử đính
tương tự. Giống nấm này phát triển rất nhiều trong các vùng khí hậu nhiệt đới và

cận nhiệt đới.
Nấm mốc Aspergillus niger [28]
Aspergillus niger là một nấm sợi đơn bội và là một vi sinh vật rất cần thiết
trong lĩnh vực sinh học. Ngoài việc sản xuất các enzyme ngoại bào và acid citric, A.
niger được sử dụng cho xử các lý chất thải và biến đổi sinh học. Nấm mốc
Aspergillus niger là loài phổ biến nhất của giống nấm mốc Aspergillus. Nó gây ra
một căn bệnh gọi là mốc đen trên một số loại trái cây và rau quả như nho, hành tây,
và đậu phộng, và là một chất gây ô nhiễm phổ biến trong thực phẩm. Nó tồn tại phổ
biến trong đất, từ các môi trường trong nhà…
Cấu trúc tế bào: Quan sát vi thể các sợi nấm của A. niger cho thấy các sợi
được phân chia và có vách ngăn rõ ràng, chiều dài sợi nấm nằm trong khoảng 900-
1600μm. Trên đỉnh sợi nấm có chứa các bào tử túi khác nhau có đường kính 4-
60μm.
Cấu trúc bộ gen: A. niger có tổng kích thước bộ gen rằng khoảng 35,5-38,5
Mb và bao gồm khoảng 13.000 gen. Trong số những gen này, khoảng 8.000-8.500
gen có nhiệm vụ chức năng rõ ràng. Ngoài ra, khoảng 14.000 khung đọc mở (open
reading frames -ORF) đã được xác định trong hệ gen có khả năng có thể mã hóa
một protein. Các trình tự DNA của A. niger bao gồm khoảng 33.900.000 cặp bazơ.

SVTH: Trần Văn Hoàng Lớp 06H2B
Đề tài: “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc
Aspergillus niger”
Hình 1. 2. Hình ảnh về bào tử và sợi nấm A. niger quan sát dưới kính
lup và kính hiển vi
Đồ án tốt nghiệp 7 GVHD: TS. Đặng Minh Nhật
Ứng dụng: A. niger là một loài nấm mốc rất quan trọng, được sư dụng trong
các lĩnh vực công nghệ sinh học. Nhiều sản phẩm sinh học và chế phẩm enzyme
được sản xuất từ A. niger như acid citric, amylase, lipases, cellulolase, xylanase,
protease… A. niger cũng được sử dụng để xử lý các chất thải và quá trình biến đổi
sinh học (biotransformations). Trong 20 năm qua, A. niger được xem là nguồn vi

sinh vật chính để sản xuất chế phẩm enzyme.
 Công nghệ enzyme
 Khái quát về enzyme:[7]
Ennzyme là chất xúc tác sinh học, có bản chất protein, hòa tan trong nước và
trong dung dịch muối loãng. Enzyme có phân tử lượng lớn từ 20.000 đến 100.000
dalton nên không qua được màng bán thấm.
Tất cả các yếu tố làm biến tính protein như acid đặc, kiềm đặc, muối kim loại
nặng…đều có thể làm enzyme bị biến tính và mất hoạt lực xúc tác.
Enzyme có cường lực xúc tác rất lớn: ở điều kiện thích hợp hầu hết các phản
ứng có xúc tác xảy ra với vận tốc nhanh gấp 10
8
- 10
11
lần so với phản ứng không có
chất xúc tác.
Enzyme có tính đặc hiệu cao: mỗi enzyme chỉ xúc tác làm chuyển hóa được
một hoặc một số cơ chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định. Sự tác dụng
có tính chất lựa chọn này gọi là tính đặc hiệu của enzyme. Enzyme có tính đặc hiệu
cao cho nên không tạo ra những sản phẩm phụ.
Enzyme tác dụng trong điều kiện “êm dịu”. enzyme thường tác dụng thích
hợp ở nhiệt độ 30÷50
0
C, pH trung tính và ở áp suất thường, không cần nồng độ acid
hay nồng đọ kiềm mạnh, áp suất cao, do đó không đòi hỏi các thiết bị chịu acid,
kiềm và chịu áp suất cao đắt tiền.
Tất cả các enzyme có nguồn gốc tự nhiên không độc. Điều này có ý nghĩa
quan trọng trong công nghiệp thực phẩm và trong y học.
1.2.2. Công nghệ sản xuất enzyme [23]
Trong sản xuất chế phẩm enzyme, cần chú ý đến những yếu tố:
 Nguồn enzyme

SVTH: Trần Văn Hoàng Lớp 06H2B
Đề tài: “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc
Aspergillus niger”
Đồ án tốt nghiệp 8 GVHD: TS. Đặng Minh Nhật
Có thể thu nhận enzyme từ động vật như trypsin, chimotrypsin, từ thực vật
như papain của đu đủ, amylase của đại mạch. Nhưng enzyme vi sinh vật là nguồn
phổ biến và giá thành có ý nghĩa kinh tế nhất.
 Cách thu nhận
Phải dựa vào đặc trưng sinh học của đối tượng. Đối với vi sinh vật cần chú ý
đến khâu chọn giống, vấn đề di truyền giống, khả năng sinh trưởngvà phát triển của
giống ,đặc tính sinh lí hóa sinh của giống.
1.2.2.3. Các phương pháp nuôi cấy
- Môi trường nuôi cấy: Tùy chủng để chọn môi trường thích hợp, thành phần
dinh dưỡng phải phù hợp với sinh trưởng phát triển, đặc biệt là các yếu tố cần thiết
cho quá trình sinh tổng hợp protein. Cần nắm vững cơ chế điều hòa để có những
thay đổi thích nghi.
- Phương pháp nuôi cấy bề mặt: là nuôi cấy trên môi trường rắn với hàm
lượng nước thấp khoảng 15÷20%. Ngoài thành phần dinh dưỡng là protein, tinh bột,
khoáng …có thể trộn các chất làm xốp để thoáng khí.
Tùy chủng để khống chế nhiệt độ, pH môi trường, độ ẩm, thời gian nuôi
cấy…cho đạt hiệu quả sinh tổng hợp enzyme cao nhất.
- Phương pháp nuôi cấy chìm: là nuôi cấy trong môi trường dịch thể, hàm
lượng chất khô tối đa từ 25÷30%, thường từ 10÷15%. Ngoài protein, tinh bột,
khoáng…còn có thể bổ sung kích thích tố. Cũng như trên, tùy chủng để khống chế
nhiệt độ, pH môi trường, độ ẩm, thời gian nuôi cấy…cho đạt hiệu quả sinh tổng hợp
enzyme cao nhất.
Với hai phương pháp trên, mỗi loại có ưu khuyết điểm riêng. Nuôi cấy bề
mặt thường cho hiệu suất cao, dễ gở bỏ từng phần nếu bị nhiễm, nhược điểm là tốn
mặt bằng nhiều, khó tự động hóa. Phương pháp nuôi cấy chìm dễ tự động hóa, phải
loại bỏ hoàn tan khi bị nhiễm.

SVTH: Trần Văn Hoàng Lớp 06H2B
Đề tài: “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc
Aspergillus niger”
Đồ án tốt nghiệp 9 GVHD: TS. Đặng Minh Nhật
 Thu nhận chế phẩm enzyme:
Đối với canh trường bề mặt hay các đối tượng thực vật, có thể đồng hóa nếu
cần, đó dùng dung dịch đệm hay nước cất để chiết rút enzyme ra khỏi canh trường
bề mặt ta có dịch chiết enzyme. Đối với canh trường bề sâu chỉ cần lọc bỏ sinh khối
là có dịch chiết tương tự trên.
Sau đó có thể dùng các tác nhân kết tủa thuận nghịch như aceton, ethanol,
muối trung tính để có chế phẩm enzyme ở dạng sạch hơn. Từ chế phẩm sạch này,
bằng kỹ thuật điện di, lọc gel… ta có thể tách từng phần để có enzyme tinh khiết
hơn.Tùy mục đích sử dụng để ta tạo ra chế phẩm thích hợp.
Để nâng cao giá trị sử dụng, hiện nay người ta thường tạo ra chế phẩm
enzyme gọi là enzyme không tan.
 Enzyme cảm ứng [4]
Định nghĩa: Một quá trình sinh tổng hợp được gọi là cảm ứng nếu như nó chỉ
xảy ra ở mức độ đáng kể khi trong môi trường có cơ chất đặc hiệu của enzyme này
hoặc các chất trao đổi có cấu trúc tương tự cơ chất. Các enzyme thuộc loại này gọi
là enzyme cảm ứng, các cơ chất kích thích quá trình tổng hợp này gọi là chất cảm
ứng.
Muốn tổng hợp được enzyme cảm ứng cần có 4 điều kiện:
Thứ nhất: có gen tương ứng trong nhiễm sắc thể,
Thứ hai: có nguyên liệu đầy đủ để xây dựng các phân tử enzyme đó (các axit
amin, các hợp phần coenzyme).
Thứ ba: có năng lượng cần thiết cho việc tổng hợp enzyme,
Thứ tư: có chất cảm ứng.
 Phân loại enzyme [7]
Dựa vào vị trí khu trú của enzyme trong tế bào người ta chia làm 3 nhóm
chính:

Enzyme ngoại bào: Enzyme được sinh tổng hợp ra ở trong tế bào rồi sau đó
mới được tiết ra ngoài môi trường trong quá trình nuôi cấy chìm. Đó là trường hợp
các enzyme hydrolase.
SVTH: Trần Văn Hoàng Lớp 06H2B
Đề tài: “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc
Aspergillus niger”
Đồ án tốt nghiệp 10 GVHD: TS. Đặng Minh Nhật
Enzyme nội bào: Enzyme được tổng hợp và sử dụng ở bên trong tế bào. Nói
chung các loại enzyme này thường có mặt hoặc dưới dạng liên hợp, dưới dạng liên
kết hoặc dưới dạng bị ‘nhốt” trong các bào quan của tế bào.
Các enzyme periplasmic: Là những enzyme nằm ở xoang ngoài màng sinh
chất nhưng trong màng tế bào.
1.2.5. Ưu điểm của vi sinh vật trong công nghệ enzyme [4]
So với động vật và thực vật thì thu nhận enzyme từ vi sinh vật có nhiều lợi thế hơn.
- Từ vi sinh vật có thể thu nhận được nhiều enzyme khác nhau, trong đó có những
loại không thể thu nhận từ động vật hoặc thực vật.
- Bằng cách thay đổi điều kiện nuôi cấy hoặc dùng tác nhân điều chỉnh người ta có
thể điều khiển quá trình sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật theo ý muốn.
- Vi sinh vật có khả năng sinh sản và phát triển nhanh, tổng hợp enzyme với tốc độ
cực kỳ lớn trong thời gian ngắn. Chính vì thế việc sản xuất enzyme từ vi sinh vật ít
tốn thời gian.
- Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, vượt xa các enzyme thu nhận
từ các nguồn khác.
- Vi sinh vật có khả năng sinh sản, phát triển và tổng hợp enzyme trên các môi trường
dinh dưỡng đơn giản, dễ kiếm, rẻ tiền (có thể là phế liệu của các ngành sản xuất
khác nhau). Cho nên việc sản xuất enzyme từ vi sinh vật cũng rất kinh tế.
 Giới thiệu về enzyme glucose oxidase
Glucose oxydase (GOD: β-D-glucose: oxygen 1-oxidoreductase, EC 1.1.3.4)
là enzyme xúc tác quá trình oxi hóa β-D-glucose thành acid gluconic bằng cách sử
dụng oxi làm chất chất nhận điện tử, đồng thời sinh ra hydroperoxit (H

2
O
2
). Vi sinh
vật sinh enzyme GOD gần đây đã nhận được sự qua tâm rộng rãi trong việc mở
rộng ứng dụng trong hóa học, dược phẩm, thực phẩm, đồ uống, hóa học lâm sàng,
công nghệ sinh học và trong một số ngành công nghiệp khác. Ứng dụng mới của
GOD là sử dụng trong thiết bị cảm biến sinh học đã làm gia tăng nhu cầu về
enzyme này trong những năm gần đây. Hiện nay đang xem xét và nghiên cứu về
quá trình sản xuất, thu nhận, mô tả đặc tính, cố định và ứng dụng của GOD. Quá
trình sản xuất GOD bằng phương pháp lên men và phương pháp tái tổ hợp được
SVTH: Trần Văn Hoàng Lớp 06H2B
Đề tài: “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc
Aspergillus niger”
Đồ án tốt nghiệp 11 GVHD: TS. Đặng Minh Nhật
xem xét một cách cặn kẽ. Nhiều kỹ thuật tinh chế khác nhau nhằm nâng cao hiệu
quả thu nhận GOD đều được nghiên cứu và công bố. Đã có nhiều nghiên cứu về các
vấn đề động học, tính ổn định và các đặc trưng của enzyme này. Do đó, ứng dụng
của GOD ngày càng rộng rãi trong các ngành công nghiệp khác nhau [19].
 Đặc trưng của glucose oxidase [20]
Trọng lượng phân tử của GOD nằm trong khoảng từ 130÷175kDa. GOD có
tính đặc hiệu cao đối với β-anomer của D-glucose, còn α-anomer không phải là cơ
chất thích hợp. GOD thể hiện hoạt tính thấp với cơ chất 2-deoxy-D-glucose, D-
mannose và D-galactose. Những chất ức chế GOD bao gồm p-chloromecuri-
benzoate, Ag
+
, Hg
2+
, Cu
2+

, hydroxylamine, hydrazine, phenylhydrazine, dimedone
và natri bisulphate . Năm 1968, Nakamura và Fujiki đã thực hiện các nghiên cứu so
sánh trên GOD của A. niger và P. amagasakiense có trọng lượng phân tử của chúng
lần lượt là 152 và 150 kDa. GOD sinh ra bởi cả hai loài sử dụng nguồn
cacbohydrate tương tự nhau trong đó chủ yếu là glucose, mannose và hexosamine.
GOD từ A. niger chứa mannose và hexosamine nhiều hơn GOD từ P.
amagasakiense nhưng ít glucose hơn. Cacbohydrate tổng số được tìm thấy là 16%
của A. niger và 11% của P. amagasakiense. Axit amin chứa trong hai enzyme bao
gồm: GOD từ A. niger chứa histidine, arginine và tyrosine nhiều hơn và chứa lysine
và phenylalanine ít hơn GOD từ P. amagasakiense. Vùng pH tối ưu của GOD từ A.
niger và P. amagasakiense lần lượt là 3,5÷6,5 và 4,0÷5,5. Như vậy, GOD từ A.
niger có vùng pH rộng hơn GOD từ P. amagasakiense.
 Thành phần cấu tạo của glucose oxidase[20]
GOD từ nấm sợi là hợp chất dimer glycoprotein gồm hai chuỗi polypeptid
tiểu đơn vị đồng thể được liên kết với nhau bởi liên kết cộng hóa trị của cầu
disulfua. Hình 1.4 mô tả phân nửa FDA và trung tâm hoạt động chính của tiểu đơn
vị GOD thu nhận từ P. amagasakiense. Cấu trúc của GOD từ P. amagasakiense cho
thấy mỗi tiểu đơn vị đều chứa một mol liên kết bền vững. Nhưng co-factor liên kết
với phân nửa FDA không phải là liên kết cộng hóa trị. GOD từ P. amagasakiense bị
glycol hóa với mannose - hợp chất chứa nhiều hydrocarbonate với hàm lượng xấp
xỉ 11÷13%
SVTH: Trần Văn Hoàng Lớp 06H2B
Đề tài: “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc
Aspergillus niger”
Đồ án tốt nghiệp 12 GVHD: TS. Đặng Minh Nhật
Hình 1. 2. Cấu trúc phân nửa FDA và trung tâm hoạt động chính của GOD thu
nhận từ P. amagasakiense (wohlfahrt và các đồng nghiệp,1999)
Các thành phần của trung tâm hoạt động của GOD từ P. amagasakiense bao
gồm Tyr-73, Phe-418, Trp-430, Arg-516, Asn-518, His-520 và His-563 (hình 1.4) .
Năm 2000 Witt và các đồng nghiệp cho rằng Arg-516 là acid amin có vai trò quan

trọng nhất ảnh hưởng đến hiệu quả kết hợp với β-D Glucose bởi GOD, trong khi đó
ảnh hưởng của Ans-518 là thấp hơn. Còn các chất thơm còn lại là Tyr-73, Phe-418
và Trp-430 đóng vai trò quan trọng trong việc định hướng đúng đắn cơ chất một
cách nhanh nhất có thể cho phản ứng oxi hóa glucose. His-520 và His-563 hình
thành liên kết hydro với gốc –OH từ vị trí số 1 của glucose trong suốt quá trình
phản ứng.
1.3.3. Một số đặc điểm của glucose oxidase
 Đặc điểm cơ chất [20]
GOD có tính đặc hiệu cao với β-D-glucose và ít thể hiện hoạt tính với những
loại đường khác, nó oxi hóa β-D-glucose với sự có mặt của phân tử O
2
ở vị trí C-1
thành δ-glucono-1,5-lactone, sau đó tự động thủy phân thành axit D-gluconic.
Những đặc điểm cấu trúc này và phản ứng đồng phân lập thể cho sự phân biệt rõ
ràng giữa GOD và pyranose oxydase, là một homotetramer, oxi hóa D-glucose ở vị
trí C-2.
 pH tối thích và độ bền [20]
Hoạt tính của enzyme phụ thuộc vào trạng thái ion hóa của amino axit ở
trạng thái hoạt động. pH đóng vai trò quan trọng duy trì hình thể riêng của enzyme.
SVTH: Trần Văn Hoàng Lớp 06H2B
Đề tài: “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc
Aspergillus niger”
Đồ án tốt nghiệp 13 GVHD: TS. Đặng Minh Nhật
Hầu hết protein chỉ hoạt động trong khoảng pH hẹp, thường là từ 5÷9. pH tối thích
của GOD thay đổi từ 5 đến 7. GOD từ hầu hết nấm mốc có pH tối thích trong
khoảng axit đến trung tính như A. niger và P. chrysogenum có pH tối thích là
5,0÷6,0. Trái lại, GOD thu được từ P. funiculosum 433 và P. canescens có pH tối
thích nằm trong khoảng kiềm nhẹ từ 6 ÷ 8,6.
 Nhiệt độ tối thích và độ bền [20]
Enzyme nhạy cảm với những thay đổi của nhiệt độ. Mối quan hệ giữa vận

tốc phản ứng của enzyme và nhiệt độ thay đổi theo hàm số mũ. Cứ tăng nhiệt độ
10
0
C, tốc độ phản ứng enzyme lại tăng gấp đôi. Ở nhiệt độ từ 40
0
C và 70
0
C, hầu hết
enzyme bị biến tính và mất hoạt tính. Enzyme thể hiện hoạt tính tối đa ở nhiệt độ tối
thích của nó. Nhiệt độ tối thích của GOD là 25÷30
0
C đối với P. funiculosum 433 và
40÷60
0
C đối với A. niger và P. amagasakiense ATCC 28686.
 Độ bền khi bảo quản [20]
GOD có chu kì bán rã trong khoảng 30 phút ở 37
0
C. GOD cố định có hiệu
quả cao hơn trong ứng dụng ở 37
0
C. Rượu đa chức bao gồm ethylene glycol,
glycerol, erythritol, xylitol, sorbitol và polyethylene glycol có thể ổn định GOD từ
A. niger. GOD đông khô giữ ổn định được trong ít nhất 6 tháng ở -20
0
C.
 Cơ chế phản ứng của glucose oxidase [20]
GOD là một flavoprotein xúc tác quá trình oxi hóa của β-D-glucose thành D-
glucono-δ-lactone và H
2

O
2
sử dụng phân tử oxi như chất nhận điện tử. Phản ứng
này có thể được tách ra thành một giai đoạn khử và một giai đoạn oxi hóa (Hình
1.5).

Hình 1. 3. Biểu diễn cơ chế của phản ứng GOD [20]
SVTH: Trần Văn Hoàng Lớp 06H2B
Đề tài: “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc
Aspergillus niger”
Đồ án tốt nghiệp 14 GVHD: TS. Đặng Minh Nhật
Trong giai đoạn khử, GOD xúc tác quá trình oxi hóa β-D-glucose thành D-
glucono-δ-lactone, chất này sẽ bị thủy phân thành axit gluconic mà không cần
enzyme xúc tác. Sau đó vòng flavine adenine dinucleotide (FAD) của GOD bị khử
thành FADH
2
. Trong giai đoạn oxi hóa, GOD dạng khử bị oxi hóa trở lại bởi oxi tạo
ra H
2
O
2
. H
2
O
2
bị phân giải bởi catalase (CAT) tạo thành nước và oxi. Năm 1992,
Witteveen tìm thấy enzyme lactonase (EC 3.1.1.17) trong A. niger xúc tác quá trình
thủy phân của glucono-δ-lactone thành axit gluconic.
 Ứng dụng của enzyme glucose oxidase [18]
GOD có vài ứng dụng trong thương mại bao gồm loại bỏ glucose trong sản

xuất bột trứng sấy, cải thiện màu sắc, mùi vị và thời hạn sử dụng của nguyên liệu
thực phẩm, loại bỏ oxi từ nước ép trái cây, thức uống đóng hộp, và từ xốt
mayonnaise để ngăn cản sự trở mùi (sự ôi). Nó cũng được sử dụng trong bộ dụng cụ
phân tích glucose tự động cùng với catalase [11] và chủ yếu là trong bộ cảm biến
sinh học để phát hiện và đánh giá glucose trong dung dịch công nghiệp và trong
dịch của cơ thể như máu và nước tiểu [15]. GOD có tác dụng chống lại với những
tác nhân gây bệnh khác nhau phát sinh từ thực phẩm như Salmonella infantis,
Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Bacillus cereus, Campylobacter
jejuni và Listeria monocytogens. GOD cũng được sử dụng như thành phần của kem
đánh răng [11], cho sản xuất axit gluconic, như chất bảo quản thực phẩm, những bộ
cảm biến glucose ứng dụng cho những bệnh nhân tiểu đường. Những nghiên cứu
mới về GOD nhằm tìm những thuộc tính hữu ích cho các ứng dụng trong công nghệ
sinh học tiếp tục được quan tâm nhiều mặc dù GOD thương mại sẵn có rất phong
phú.
Vài ứng dụng của nó trong công nghiệp được mô tả sau đây.
 Bộ cảm biến glucose để kiểm tra bệnh đái tháo đường
Những người bị đái tháo đường cần kiểm tra thường xuyên lượng glucose
trong máu để biết được sự dao động lượng glucose có thể đẫn đến sự tăng đường
huyết (lượng glucose trong máu cao) và sự giảm đường trong máu (lượng glucose
trong máu thấp) để kiểm soát căn bệnh. Hiện tại, quá trình kiểm tra như thế được
SVTH: Trần Văn Hoàng Lớp 06H2B
Đề tài: “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc
Aspergillus niger”
Đồ án tốt nghiệp 15 GVHD: TS. Đặng Minh Nhật
thực hiện bằng cách sử dụng mẫu máu trích từ ngón tay và máy đo xách tay vài lần
một ngày. Bộ cảm biến được sử dụng để đo lượng đường glucose trong máu. GOD
là một trong những enzyme có thể được dùng trong bộ cảm biến. Những bộ cảm
biến làm việc bằng cách giữ lại vết của lượng electron đi qua một enzyme khi nối
nó với một điện cực và đo điện tích tổng. Bộ cảm biến được sử dụng với nhiều mục
đích khác nhau như: kiểm tra glucose cho sự lên men, phân tích nồng độ glucose

trong thức uống không cồn, dùng cho kiểm tra máu và huyết thanh, cảm biến sinh
học nhiệt thu nhỏ dùng cho tất cả loại máu, cảm biến glucose dùng cho tất cả loại
máu, bộ cảm biến sinh học glucose cho huyết thanh từ máu người.
 Pin sinh học
Pin sinh học là cần thiết khi muốn có nguồn năng lượng nhỏ để duy trì các quá
trình hoạt động. Pin sinh học chuyển năng lượng hóa sinh thành năng lượng điện sử
dụng chất xúc tác sinh học. Pin sinh học gồm bộ hai điện cực được điều chỉnh bởi
enzyme xúc tác sinh học để oxi hóa/khử cơ chất [20].
Một kiểu pin sinh học sử dụng enzyme làm chất xúc tác sinh học ví dụ như
GOD và microperoxidase-8 được sử dụng trên anot và catot [20]. Trên anôt GOD
oxi hóa glucose tạo ra H
2
O
2
, nó đi qua lớp màng xốp ngăn giữa hai điện cực và bị
khử bởi enzyme microperoxidase-8 trực tiếp nhận điện tử từ thanh điện cực cacbon.
 Phụ gia thực phẩm và thức uống
GOD được sử dụng thành công trong việc loại bỏ glucose dư và O
2
trong
thực phẩm và đồ uống để kéo dài thời hạn sử dụng. H
2
O
2
tạo ra bởi phản ứng
enzyme là chất khử trùng tốt và có thể được loại bỏ sau đó bằng cách sử dụng
enzyme thứ hai catalase (CAT) có thể chuyển H
2
O
2

thành O
2
và nước. GOD/CAT
được sử dụng để loại bỏ glucose trong quá trình sản xuất bột trứng, tránh quá trình
sẫm màu gây ra bởi phản ứng Maillard và sử dụng trong công nghiệp làm bánh để
giúp cải thiện cảm quan cho ruột bánh mỳ và bánh sừng bò.
GOD còn có thể được sử dụng để loại bỏ oxy của không khí ở đầu chai đồ
uống trước khi chúng được đóng kín. Hệ thống GOD/CAT kiểm soát quá trình sẫm
màu phi enzyme trong bảo quản và chế biến trái cây, purê. Quá trình loại bỏ oxy bởi
hệ thống enzyme đem lại hiệu quả ổn định. Thêm vào đó, GOD được sử dụng để
SVTH: Trần Văn Hoàng Lớp 06H2B
Đề tài: “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc
Aspergillus niger”
Đồ án tốt nghiệp 16 GVHD: TS. Đặng Minh Nhật
ngăn ngừa sự mất màu và vị cũng như để ổn định màu, vị trong bia, cá, đồ hộp và
đồ uống không cồn bằng cách loại bỏ oxy từ thực phẩm và đồ uống. Ví dụ như,
chúng được sử dụng để giảm sự biến màu xảy ra trong rượu và mayonnaise. Hệ
thống enzyme GOD/CAT có thể làm chậm quá trình oxi hóa lipit trong mayonnaise
giữ ở 5
0
C và 25
0
C. Trong mayonnaise có chứa dầu đậu tương nguyên chất, và đến
một nửa dầu thực vật thêm vào với dầu cá, hệ thống enzyme có chức năng loại bỏ
oxy trong quá trình oxy hóa glucose, do đó làm giảm sự có mặt của oxy cho sự
chuyển hóa lipit. Năm 2006, Bonet đã nghiên cứu ảnh hưởng của GOD đến tính
chất lưu biến bột nhào và chất lượng bánh mỳ và thấy rằng GOD có khả năng cải
thiện bột nhào lúa mì và tính chất bánh mỳ. Tuy nhiên, mức độ enzyme thêm vào
phải rất cẩn thận, vì có thể có những ảnh hưởng ngược lại do thêm vào enzyme quá
thừa.

 Sản xuất rượu độ cồn thấp
GOD được sử dụng trong công nghiệp sản xuất rượu, nó có thể làm giảm độ
cồn của rượu nhờ loại bỏ glucose vì glucose tạo ra cồn. Nhiều thí nghiệm được thực
hiện và người ta nhận thấy quá trình xử lý trước nước quả nho với hệ enzyme
GOD/CAT để chuyển bớt glucose có trong dịch quả thành axit gluconic, quá trình
này có thể làm giảm độ cồn khoảng 2%. Thêm vào đó, GOD còn có khả năng ức
chế quá trình hỏng rượu nhờ vào tác dụng diệt khuẩn của nó [20].
GOD có khả năng sử dụng trong công nghiệp rượu, nó làm giảm độ cồn của
rượu nhờ loại bỏ glucose (bằng cách chuyển thành δ-glucono-1,5-lactone), vì
glucose có thể chuyển thành cồn. Các thí nghiệm đã chỉ ra rằng xử lý rượu bằng
GOD có thể làm giảm độ cồn sinh ra khoảng 2%. Thêm vào đó, GOD có thể ức chế
quá trình hỏng rượu nhờ vào khả năng diệt khuẩn ảnh hưởng lên vi khuẩn axit
axetic và vi khuẩn axit lactic trong suốt quá trình lên men.
 Vệ sinh răng miệng
GOD cũng như lactoperoxidase có thể được sử dụng như chất chống vi
khuẩn trong sản phẩm chăm sóc răng miệng. Khoang miệng chứa những loài
Streptococci như Streptococci mutans, ảnh hưởng đáng kể làm phân hủy răng và có
SVTH: Trần Văn Hoàng Lớp 06H2B
Đề tài: “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc
Aspergillus niger”
Đồ án tốt nghiệp 17 GVHD: TS. Đặng Minh Nhật
ở hầu hết mọi người. H
2
O
2
tạo thành bởi hoạt động của GOD là chất diệt khuẩn hiệu
quả. Khả năng của GOD tiêu diệt S. mutans là nhờ có chuỗi kháng thể lớn.
 Axit gluconic
GOD cũng được sử dụng trong thương mại để sản xuất axit gluconic nhờ quá
trình thủy phân của δ-glucono-1,5-lactone, sản phẩm cuối cùng của xúc tác GOD.

Axit gluconic được sử dụng như phụ gia thực phẩm hoạt động giống bộ điều chỉnh
axit, trong dung dịch khử trùng hay quá trình tẩy màu trong sản xuất thực phẩm và
như muối trong hợp phần hóa học hay cấp thuốc. Axit gluconic cũng được sử dụng
như chất làm chua nhẹ trong thịt và công nghiệp da thuộc. Nó còn được sử dụng
trong công nghiệp xây dựng như phụ gia trong xi măng để tăng lực cản và sức bền
dưới điều kiện thời tiết khắc nghiệt. Nó xuất hiện tự nhiên trong mật ong, trái cây và
rượu.
 Công nghiệp dệt
GOD có những ứng dụng trong công nghiệp dệt như tạo ra H
2
O
2
để tẩy trắng.
Năm 2002, Tzanov đã cố định GOD liên kết cộng hóa trị trên chất nền nhôm oxit và
kính cho kết quả khôi phục cao. Lượng H
2
O
2
lớn nhất là 0.35 g/l và 0.24 g/l đạt
được sau 450 phút để GOD cố định trên chất nền kính và nhôm oxit một cách riêng
biệt. H
2
O
2
tạo thành được kiểm tra để tẩy trắng sợi bông dệt và nhận thấy phù hợp
để tiêu chuẩn hóa quá trình tẩy màu. Từ khi axit gluconic được sản xuất, người ta
không sử dụng chất ổn định khác. Năm 2008, Opwis ứng dụng đồng thời GOD và
peroxidase, ông bắt đầu với glucose như cơ chất cho GOD, H
2
O

2
được tạo thành và
được sử dụng ngay lập tức bởi POD oxi hóa hợp chất màu trong bể nhuộm. Những
enzyme này được sử dụng trong quá trình khử màu và tẩy trắng của sợi tự nhiên
trong công nghiệp dệt.
 Lên men sản xuất enzyme glucose oxidase
1.3.5.1. Những loài nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp enzyme glucose
oxidase [20]
Nguồn vi sinh vật phổ biến nhất cho sản xuất lên men GOD là các loài
Aspergillus, Penicillium và Saccharomyces. GOD được tìm thấy trong nhiều dòng
SVTH: Trần Văn Hoàng Lớp 06H2B
Đề tài: “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc
Aspergillus niger”
Đồ án tốt nghiệp 18 GVHD: TS. Đặng Minh Nhật
sau ở những loài khác nhau như Aspergillus niger, Phanerochaete chrysosporium,
Talaromyces flavus và Penicillum spp. Hiện tại, A. niger, P. amagaskiense và
Penicillium vitale được sử dụng để sản xuất công nghiệp loại enzyme này. Trong đó
A. niger được dung để sản xuất enzyme nội bào, còn Penicillium được dùng để sản
xuất enzyme ngoại bào. Hầu hết GOD thương mại đã sản xuất được tách từ khuẩn
ty của A. niger và nuôi chủ yếu để sản xuất axit gluconic hay muối của nó như natri
gluconate hay calcium gluconate.
Bảng 1. 1 Một số chủng vi sinh vật sản xuất GOD:
Chủng VSV
Phương pháp
nghiên cứu
Hoạt tính Tác giả
Penicillium variabile P16 So màu 5.52U/ml Petruccioli et al
(1999)
Gen GOD của chủng
A.niger được gắn trên

S.cerevisiae
So màu 125U/ml Hodgkins et al
(1993)
Maiherbe et al
(2003)
Aspergillus niger (BTL) So màu 7.5U/ml Hatzinikolaou và
Macris (1995)
S.cereviae tái tổ hợp So màu 3,43U/mg sinh
khối khô
Kapat et al (2004)
Aspergillus niger AM111 So màu 2,5 U/ml Fiedureck và
Gromada (2000)
Penicillium pinophilum
DSM 11428
So màu 1,9U/ml Rando et al (1997)
Aspergillus niger ZBY-7 Chuẩn độ 6U/ml Tongbu et al.
(1996)
SVTH: Trần Văn Hoàng Lớp 06H2B
Đề tài: “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc
Aspergillus niger”
Đồ án tốt nghiệp 19 GVHD: TS. Đặng Minh Nhật
1.3.5.2. Các thông số ảnh hưởng đến quá trình sản xuất enzyme [20]
 Nguồn carbon
Trong suốt quá trình lên men, nguồn cacbon không chỉ đóng vai trò như
thành phần chính để xây dựng vật liệu tế bào mà còn được sử dụng trong quá trình
tổng hợp polysaccharide và đóng vai trò là nguồn cung cấp năng lượng cho tế bào.
Tỷ lệ cacbon được chuyển hóa có thể ảnh hưởng đến sự hình thành sinh khối hay
sản phẩm chuyển hóa (chính hoặc phụ). Lượng đường chuyển hóa càng nhanh sẽ
giúp tế tào phát triển càng nhanh, kết hợp với sự tạo thành lượng lớn các sản phẩm
liên quan hay các chất chuyển hóa chính.

Năm 1995, Hatzinikolaou và Macris đã nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn
cacbon khác nhau đến sự phát triển và sinh tổng hợp GOD của A. niger. Mặc dù
nấm mốc A. niger phát triển trên tất cả các nguồn cacbon mà họ đã kiểm tra, nhưng
enzyme GOD chỉ thể hiện hoạt tính cao khi sử dụng các nguồn glucose, saccharose
và rỉ đường. Hơn nữa, glucose (ở dạng tinh khiết hoặc là sản phẩm thuỷ phân
saccharose bởi invertase) là tác nhân cảm ứng chính cho sự phiên mã gen của
enzyme GOD. Năm 2001, Kona đã sử dụng saccharose như nguồn cacbon chính khi
sử dụng nguồn dinh dưỡng thương mại có chứa nước ngâm bắp để thực hiện lên
men cho A. niger. Năm 1960, Kusai nhận thấy saccharose là nguồn carbon tốt nhất
cho P. amagasakiense sản xuất GOD. Dù sao, nếu pH của môi trường phát triển
được duy trì trong suốt quá trình nuôi thì glucose là nguồn cacbon được lựa chọn.
 Nguồn nitơ
Nitơ vô cơ bao gồm khí amoniac, muối amoni hoặc nitrate. Amoniac được
sử dụng để điều chỉnh pH. Muối amoni như amoni sulphate thường tạo môi trường
axit khi vi sinh vật sử sụng ion NH
4
+
và giải phóng ra axit tự do. Mặt khác, nitrate
thường gây ra khuynh hướng kiềm hoá khi chúng được chuyển hóa. Amoni nitrate
trước hết sẽ gây ra khuynh hướng axit khi ion amoni được sử dụng. Khi các ion
amoni cạn kiệt, nitrat sẽ được sử dụng như nguồn nitơ thay thế và tạo ra môi trường
kiềm. Năm 1995, Hatzinikolaou và Macris nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn
nitơ khác nhau đến sự phát triển và hoạt tính tổng của GOD từ A. niger nuôi trên
SVTH: Trần Văn Hoàng Lớp 06H2B
Đề tài: “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc
Aspergillus niger”
Đồ án tốt nghiệp 20 GVHD: TS. Đặng Minh Nhật
nguồn carbon duy nhất là saccharose và rỉ đường. Họ nhận thấy nồng độ peptone có
ảnh hưởng rõ ràng đến toàn bộ quá trình sản xuất GOD. Với saccharose và rỉ đường
làm nguồn cacbon, hoạt tính cực đại của GOD đạt được lần lượt tại 1÷2% và

0.2÷0.3% peptone. Năm 2001, Kona khảo sát ảnh hưởng của nước ngâm bắp là
nguồn dinh dưỡng duy nhất cho sản xuất GOD từ A. niger và nhận thấy hoạt tính
của GOD tăng lên từ 550 Uml
− 1
đến 640 Uml
− 1
, trong khi đó các nguồn nitơ khác
không thể cải thiện thêm khả năng tổng hợp GOD.
 Canxi cacbonat (CaCO
3
) - tác nhân cảm ứng
Năm 1995, Petruccioli nhận thấy việc bổ sung của CaCO
3
vào môi trường
phát triển trong bình tam giác và trong thùng lên men sẽ ngăn cản pH giảm xuống
trong suốt quá trình nuôi, điều này là cần thiết khi tối ưu hóa quá trình sản xuất
GOD. Năm 1988, Rogalski cho thấy sự tổng hợp của GOD rất nhạy cảm bởi sự tăng
lên của nồng độ CaCO
3
(0÷4,5%) ứng với hoạt tính cực đại tăng lên gần 3,5%.
Hatzinikolaou và Macris cho rằng CaCO
3
gây cảm ứng mạnh trong quá trình sinh
tổng hợp GOD của A. niger và đã chứng minh nó là cần thiết cho quá trình sản xuất.
Năm 1996, Hatzinikolaou đã nuôi A. niger sử dụng môi trường nuôi tối ưu của
Rogalski và chứng minh khả năng cảm ứng của CaCO
3
khi sản xuất GOD (tối ưu
4%), nó cũng duy trì pH của môi trường nuôi trong khoảng 6,5÷6,8. Người ta nhận
thấy hoạt tính của enzyme glucolytic và glucose-6-phosphate isomerase là cao hơn

trong môi trường phát triển không có CaCO
3
, trong khi đó GOD và catalase (CAT)
là khá thấp. Sự có mặt của CaCO
3
sẽ làm tăng hoạt tính của GOD và CAT đồng thời
hoạt tính của glucose-6-phosphate isomerase giảm xuống. Việc thêm CaCO
3
vào
môi trường phát triển có thể gây ra sự chuyển hóa từ phân hủy glucose đến chu
trình pentose phosphate do đó làm tăng lên hoạt tính của GOD. CaCO
3
vào môi
trường phát triển gây ra những thay đổi về hoạt tính của GOD, CAT, 6-
phosphofructokinase (6-PFK) và glucose-6-phosphate dehydrogenase (G-6-PDH).
6-PFK là enzyme điều khiển chủ yếu chu trình Embden-Meyerhof-Parnas (EMP)
trong hầu hết các tế bào sống. Hơn nữa năm 2001, Liu cho thấy những tế bào phát
triển trong môi trường không có CaCO
3
tạo ra mức độ cao của 6-PFK và số lượng
thấp của G-6-PDH, GOD và CAT. Việc thêm CaCO
3
vào môi trường phát triển làm
SVTH: Trần Văn Hoàng Lớp 06H2B
Đề tài: “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc
Aspergillus niger”





 ! !
 ! !"#
$% ! !"#

 ! !
&% ! !
'()*$&)*$+$, /
!0!122

(
Đồ án tốt nghiệp 21 GVHD: TS. Đặng Minh Nhật
tăng sự tạo thành GOD và CAT, và làm giảm sự sự tổng hợp của 6-PFK. Do đó,
quan sát này có thể chỉ ra rằng CaCO
3
gắn liền với sự chuyển hóa từ chu trình phân
hủy đường glucose (EMP) đến quá trình oxi hóa trực tiếp glucose bởi GOD .
Hình 1. 4. Sự chuyển hóa từ chu trình phân hủy đường glucose (EMP) đến quá
trình oxi hóa trực tiếp glucose bởi GOD
 Thành phần môi trường khác
Nồng độ GOD trong A. niger có thể được tăng lên bởi các loại hydrocarbon
khác nhau trong suốt quá trình nuôi. Năm 1994, Li và Chen cho rằng có một sự tăng
lên cực đại hoạt tính GOD nội bào 43%, 110% và 31% khi thêm vào riêng từng loại
n-dodecane, n-hexadecane và dầu đậu nành. Điều này được cho là do sự tăng lên
của hiệu quả tổng hợp enzyme trong tế bào bởi n-dodecane and n-hexadecane và sự
tăng lên của sinh khối với việc thêm vào dầu đậu nành. Năm 1996, Fiedurek nghiên
cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường khác nhau và chất ức chế chuyển hóa
của quá trình sản xuất GOD trong A. niger, và nhận thấy thay thế ammonium
phosphate với natri nitrate trong môi trường muối cơ bản làm tăng đáng kể hoạt tính
GOD đến 269,6%. Hơn nữa, hoạt tính GOD nội bào tăng đến 68,3% trong sự có
mặt của natri orthovanadate (1 mM) và hoạt tính GOD ngoại bào tăng trong sự có

mặt của hematin (1 mM), choline (40 mM) và Tween 80 (0,1%). Sự tăng lên của
hoạt tính GOD ngoại bào thu được trong khoảng 31,4÷53,9%.
SVTH: Trần Văn Hoàng Lớp 06H2B
Đề tài: “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc
Aspergillus niger”
Đồ án tốt nghiệp 22 GVHD: TS. Đặng Minh Nhật
 Ảnh hưởng của thông khí và khuấy trộn
Sự di chuyển khí-lỏng là nhân tố giới hạn trong quá trình lên men hiếu khí.
Một trong những nguyên nhân chính là do tính hòa tan thấp của oxi trong môi
trường lên men khi so sánh với tính hòa tan của nguồn cacbon, nitơ và các dinh
dưỡng khác. Sự cung cấp oxi càng trở ngại hơn trong môi trường nhớt, nơi có nồng
độ tế bào cao và thường thấy trong quá trình lên men của nấm. Vì vậy thông khí và
khuấy trộn là hai nhân tố quan trọng cho quá trình lên men hiếu khí. Sự thông khí
của môi trường phát triển hiếu khí đáp ứng yêu cầu cung cấp oxi cũng như loại bỏ
khí thải ra. Oxi cung cấp cho sự phát triển và sản xuất trong quá trình nuôi nấm
được đảm bảo bởi sự thông khí và khuấy trộn.
Năm 2000, Fiedurek và Gromada xác định phương pháp mới làm tăng oxi
hòa tan trong môi trường phát triển bằng cách thêm vào H
2
O
2
như nguồn oxi duy
nhất. CAT được tạo ra bởi vi sinh vật xúc tác phân hủy H
2
O
2
thành nước và oxi tự
do, trong trường hợp này, H
2
O

2
đóng vai trò như cả chất cho điện tử và chất nhận
điện tử trong phản ứng. Oxi tinh khiết cũng được chứng minh là có lợi cho tốc độ
tăng trưởng của A. niger khi nuôi chìm. Tốc độ tăng trưởng tăng từ 61 mg trọng
lượng nấm khô/100 ml/h (thông khí với không khí) đến 95 mg trọng lượng nấm
khô/100 ml/h (thông khí với oxi tinh khiết). So sánh hoạt tính GOD nuôi ở 24h của
A. niger đã khuấy trộn lần lượt ở 460, 700 và 900 rpm cho thấy hoạt tính của quá
trình nuôi đã khuấy trộn ở 700 rpm khoảng 20÷24% cao hơn quá trình nuôi thông
khí ở 460 rpm. Tăng tốc độ máy khuấy trộn hơn nữa không cải thiện được tốc độ
tăng trưởng hay sản xuất GOD. Quá trình nuôi bão hòa oxi đạt được hiệu suất nấm
sợi cao hơn và sớm hơn 8h so với khi nuôi thông khí. Tuy nhiên, sự tự phân cũng
cao hơn trong môi trường nuôi đã bão hòa oxi. Thêm vào đó, độ nhớt của môi
trường nuôi bão hòa oxi là khoảng 50% thấp hơn quá trình nuôi thông khí. Thành tế
bào của quá trình nuôi thông khí được nhận thấy dày hơn và bền hơn quá trình nuôi
bão hòa oxi, do đó làm cho tế bào bão hòa oxi có sức chịu đựng kém hơn trong thiết
bị khuấy trộn. Đồng thời hoạt tính GOD của quá trình nuôi bão hòa oxi gấp đôi của
SVTH: Trần Văn Hoàng Lớp 06H2B
Đề tài: “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc
Aspergillus niger”
Đồ án tốt nghiệp 23 GVHD: TS. Đặng Minh Nhật
quá trình nuôi thông khí. Bất lợi duy nhất của việc sử dụng oxi tinh khiết là vấn đề
kinh tế khi thực hiện ở qui mô lớn.
 Ảnh hưởng của pH nuôi
Trong số các thông số vật lý, pH của môi trường phát triển đóng vai trò quan
trọng bởi nó gây ra sự thay đổi hình thái trong sinh vật và trong sự tiết enzyme. pH
là một yếu tố quan trọng có ảnh hưởng đến chức năng sinh lý của vi sinh vật bởi nó
ảnh hưởng đến tính hòa tan và hấp thu chất dinh dưỡng, hoạt tính enzyme, hình thái
màng tế bào, sự hình thành sản phẩm và các phản ứng oxi hóa khử. Sự thay đổi pH
trong suốt quá trình phát triển của sinh vật cũng ảnh hưởng đến sự ổn định sản
phẩm trong môi trường. pH nuôi có thể có những ảnh hưởng sâu sắc đến tốc độ sản

xuất và tổng hợp enzyme. pH thích hợp cho quá trình sản xuất GOD có thể khác
nhau do sự tối ưu quá trình phát triển. Hầu hết các chủng thương mại đã sử dụng
cho sản xuất GOD có pH tối ưu giữa 6,0 và 7,0 thuận lợi cho tăng trưởng và sản
xuất enzyme. Trong nhiều quá trình, một số thành phần môi trường như CaCO
3
và
các phosphate khác có khả năng đệm thì không cần thiết phải điều chỉnh pH.
 Ảnh hưởng của nhiệt độ tăng trưởng
Nhiệt độ bên trong của vi sinh vật phải cân bằng với môi trường của nó vì
hoạt động vi sinh vật rất nhạy cảm với nhiệt độ môi trường. Ảnh hưởng của nhiệt độ
đến quá trình sản xuất GOD có liên quan đến sự tăng trưởng của vi sinh vật. Trong
số các loại nấm, hầu hết các nghiên cứu sản xuất GOD được thực hiện với nấm sợi
trong vùng nhiệt độ từ 25÷37°C. Hiệu suất tối ưu của GOD đạt được ở 27÷37°C
cho A. niger. Năm 1995, Hatzinikolaou và Macris đã khảo sát ảnh hưởng của nhiệt
độ tăng trưởng đến toàn bộ quá trình sản xuất GOD ở 22,5°C đến 32°C, và nhận
thấy 27,5°C là nhiệt độ tối ưu.
 Qui trình sản xuất enzyme glucose oxidase
Bước chủ yếu sau khi hoàn thành quá trình lên men là thu nhận và tinh chế
GOD. Hình 1.7 mô tả qui trình tổng quát làm tinh khiết GOD. GOD được làm tinh
khiết để ứng dụng trong thương mại sản xuất từ những nấm khác nhau bao gồm
A.niger và những loài Penicillium như P.pinophilum, P.amagasakiense, P.chysoge-
num, P.notatum, và P.funciculosum. GOD được sản xuất là enzyme nội bào hoặc
SVTH: Trần Văn Hoàng Lớp 06H2B
Đề tài: “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc
Aspergillus niger”
Đồ án tốt nghiệp 24 GVHD: TS. Đặng Minh Nhật
ngoại bào. Những tế bào phải được phân cắt để giải phóng hoàn toàn enzyme GOD
trong canh trường . Đã có nhiều cuộc thảo luận về vị trí nội bào hay ngoại bào ở
enzyme của A.niger và những loài Penicillium. Trong khi đó, vị trí tế bào chất của
A.niger được mô tả rõ ràng, phù hợp với sự tồn tại của chuỗi nhận biết trước trong

bộ gen GOD của A.niger. Là chuỗi của vị trí ngoại biên, sự giải phóng enzyme từ
khuẩn ty có thể dễ dàng hơn bằng lực cơ học và vật lý, khuấy trộn hoặc siêu âm.
Những phương pháp khác nhau để phân cắt tế bào sử dụng đối với nhiều loại nấm
khác nhau, bao gồm đồng nhất hóa, siêu âm và kết hợp của cả hai. Năm 2000,
Taubert đã nghiên cứu tổng quát những phương pháp khác nhau để phân cắt hai loại
nấm khác nhau (Ganoderma applanatum và Pycnoporus cinnabarinus). Tế bào nấm
bền vững riêng với vài phương pháp phân hủy chung dùng cho những loại men và
vi khuẩn cũng như phương pháp phân cắt cơ học hoặc không cơ học được mô tả bởi
Christi và Moo-Young (1986). Để giải phóng enzyme bội bào cũng như GOD liên
kết tế bào trong canh lỏng, các phương pháp khác nhau như siêu âm, nghiền, đồng
nhất hóa và tan băng được sử dụng. Sau khi phân hủy tế bào, GOD được giải phóng
trong canh trường lên men có thể được phân tách khỏi tế bào, ly tâm, hoặc lọc. Các
kỹ thuật lắng khác nhau được sử dụng để làm tinh khiết GOD bao gồm ammonium
sulphat, uranyl acetat, potassium hexacyanoferrate và đồng sulphat. Chất lắng
ammonium sulphat được ứng dụng thành công để lắng cả GOD nội bào và ngoại
bào có thể là do GOD từ Penicillium được glycosyl hóa. GOD từ P.amagasakiense
là glycoprotein chứa 11÷13% carbohydrate được mô tả như loại mannose bậc cao.
Khi thực hiện quá trình lắng theo kỹ thuật sắc ký phân chia như sắc ký trao
đổi ion, điểm đẳng điện trung bình của GOD được tìm thấy nằm khoảng pH= 4 ÷5.
Nhìn chung, sắc ký trao đổi ion được sử dụng cho mục đích làm sạch. GOD được
chiết chủ yếu với gradient muối; mặc dù pH hỗn hợp và gradient muối trước đây
được sử dụng. Điểm đẳng điện của CAT từ P. chrysogenum là 6,5. Sự khác biệt
trong giá trị pI của GOD và CAT có thể được sử dụng cho quá trình làm sạch GOD
để đảm bảo rằng nó được giải phóng từ CAT bởi sử dụng sắc ký trao đổi ion.
SVTH: Trần Văn Hoàng Lớp 06H2B
Đề tài: “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc
Aspergillus niger”
')/3
4-5.
677

89!
4:.
4; 3!<!7(=!:.
>?
!@-#A
!5B>%C
>?
')/3
4D.7
4C.<!0D!
3B<E !5D<F!G
4C.H0<!0
2!> !I., 
J!Sơ đồ quy trình thu nhận enzyme Glucose oxidase
Đồ án tốt nghiệp 25 GVHD: TS. Đặng Minh Nhật
Kể từ khi phân tách sắc ký trao đổi ion trên cơ sở những pI khác nhau, người
ta tìm thấy GOD từ P. amagakiense chứa 4 isoenzym khác nhau của những giá trị
pI là 4,37; 4,42; 4,46 và 4,51. GOD mang điện tích âm trong nước cất 2 lần tùy
thuộc vào pI của nó là 4÷5. Nó được hấp thu ở đầu cột. Trên quá trình chiết với bộ
đệm chiết (pH= 3,6), GOD trở thành điện tích dương và hấp thu từ nhựa trao đổi
ion. Những phần chiết khác nhau của GOD mang những lượng điện tích khác nhau
và phân tách chúng khỏi nhau. Phần phân chia đầu tiên, GOD A có ít điện tích hơn
GOD B trong qui trình làm sạch; do đó sự ảnh hưởng của xung điện tích với hình
thể của GOD A thì nhỏ và có hoạt tính enzyme cao. GOD B mang nhiều điện tích
âm hơn GOD A, và do đó nó có thể chỉ được chiết ra sau GOD A và cũng phá hủy
SVTH: Trần Văn Hoàng Lớp 06H2B
Đề tài: “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc
Aspergillus niger”