Hệ vi sinh vật có ích trong sữa

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC & KTMT
VI SINH VẬT HỌC
ĐỀ TÀI: HỆ VI SINH VẬT CÓ ÍCH TRONG SỮA
GVHD: Nguyễn Thị Quỳnh Mai
S/v thực hiện
Nguyễn Tấn Huy- 2008100028
Lê Thị Hải Triều - 2008100267
Vũ Thị Thu Thùy - 2008100057
Nguyễn Bảo Ngân - 2008100030
1
Mục lục
Lời mở đầu 5
Chương I GIỚI THIỆU VỀ SỮA 6
I. Khái niệm và đặc điểm của sữa 6
1. Khái niệm 6
2. Đặc điểm của sữa 6
3. Thành phần của sữa 6
4. Tính chất vật lý 9
II. Các loại sản phẩm từ sữa 9
1. Các sản phẩm sữa tươi 9
2. Các sản phẩm kem tươi (fresh cream) 10
3. Các sản phẩm sữa lên men và kem sữa 10
4. Các sản phẩm sữa đã được loại nước 11
5. Pho-mát (cheese) 11
Chương II MỘT SỐ HỆ VI SINH VẬT CÓ ÍCH TRONG SỮA & ỨNG DỤNG
12
I. Vi khuẩn lactic trong sữa 12
1. Tính chất của vi khuẩn lactic 12

2. Các chủng lên men lactic trong nhóm vi khuẩn lactic 12
3. Vai trò 14
4. Các vi khuẩn sinh hương 15
5. Vi khuẩn Leuconostoc 16
II. Vi khuẩn Propionic 16
1. Tính chất của Propionic 16
2. Tác động của vi khuẩn Propionic đối với các sản phẩm sữa 16
3. Vai trò 16
III. Nấm men (Yeast, Levure) 17
1. Tính chất 17
2. Tác động của nấm men đối với sản xuất sữa 17
3. Vai trò 17
2
IV. Nấm mốc (molds, moulds) 18
* Vai trò 19
V. Ứng dụng sản xuất các loại sữa 19
1. Sữa chua (yaourt) 19
2. Sản xuất phomat 20
3. Sữa tươi 22
Chương III NGHIÊN CỨU VỀ NHÓM VI SINH VẬT CÓ ÍCH TRONG SỮA
24
I. “NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH LÊN MEN SỮA CHUA – CANXI” 24
1. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 24
2. Kết quả và biện luận 24
a. Kết quả phân lập vi khuẩn lactic 24
b. Quy trình công nghệ lên men sữa chua – canxi 25
3. Kết luận nghiên cứu 25
II. “NGHIÊN CỨU ỔN ĐỊNH GIỐNG KEFIR CHO LÊN MEN SỮA CHUA” 25
1.Giới thiệu 26
2. Vật liệu và phương pháp 26

a. Vật liệu 26
b. Phương pháp 26
3. Kết luận 26
III. “NGHIÊN CỨU ĐỘNG HỌC VÀ PHÂN TÍCH CẢM QUAN ĐỐI VỚI VI
KHUẨN LACTIC PHÂN LẬP TỪ PHOMAI TƯƠI LÀM TỪ SỮA CỪU KHÔNG
QUA XỬ LÝ NHIỆT” 27
Tóm tắt 27
1. Vật liệu và phương pháp 27
1.1. Mẫu pho mai 27
1.2. Vi khuẩn 27
1.3. Khả năng lên men đường của các chủng phân lập 28
1.4. Điều kiện nuôi cấy và môi trường 28
1.5. Phân tích lý – hóa 28
1.6. Xác định nồng độ cuối cùng của sinh khối 29
3
1.7. Xác định khả năng phân giải đạm 29
1.8. Phân tích cảm quan 29
2. Kết luận 29
KẾT LUẬN 31
TÀI LỆU THAM KHẢO 32
Lời mở đầu
Vi sinh vật là những sinh vật nhỏ bé xuất hiện đầu tiên trên trái đất. Nói đến ứng
dụng của vi sinh vật là nói đến những sinh vật có kích thước hiển vi. Chúng rất đa
4
dạng với nhiều chủng loại, phân bố khắp mọi nơi trên trái đất, chúng cũng được tìm
thấy ở những nơi xa xôi như sao hỏa, mặt trăng… Mặc dù là những sinh vật nhỏ bé
nhưng chúng đóng một vai trò rất quan trọng có liên quan tới mọi sự sống trên trái đất.
Vai trò của vi sinh vật rất to lớn song chúng cũng gây ra những bất lợi không hề nhỏ
làm thiệt hại cho con người và các sinh vật khác. Để tìm hiểu về vi sinh vật khoa học
đã không ngừng tìm tòi và sáng tạo. Có nhiều phát kiến mới đã ra đời nhờ vi sinh vật

qua đó phục vụ cho cuộc sống con người ngày một tốt hơn. Sự ra đời của môn Vi sinh
vật học đã giúp chúng ta đến gần hơn với khoa học. Vì sao Vi sinh vật học lại thu hút
nhiều nhà khoa học theo đuổi và nghiên cứu nhiều như thế? Câu trả lời mà thực tại
cuộc sống đã trả lời từ lâu… Chúng ta không thể tìm hiểu hết về chúng nhưng ở một
khía cạnh nào đó, việc tìm hiểu về vinh vật là rất cần thiết cho con người.
Vi sinh vật được áp dụng trong nhiều lĩnh vực của cụôc sống như thực phẩm,
dựơc phẩm và đặc biệt là sinh học. Như chúng ta đã biết, sữa là một loại thực phẩm
rất quen thuộc và quan trọng, nó cung cấp rất nhiều các loại chất dinh dưỡng cần thiết
cho cơ thể. Thế nhưng không phải ai trong chúng ta cũng có thể biết được trong sữa là
một thế giới sống khổng lồ với hàng triệu loài vi sinh vật có lợi cũng như có hại.
Trong bài tiểu luận này chúng em sẽ tìm hiểu về hệ vi sinh vật có lợi trong sữa để tăng
thêm phần hiểu biết cũng như sẽ có nhận thức đầy đủ hơn về vi sinh vật.
Chúng em đã cố gắng rất nhiều nhưng không thể tránh khỏi những sai sót, rất
mong cô nhận xét và đóng góp ý kiến để chúng em có thể hoàn thành tốt các bài tiểu
luận sau này.
Chúng em xin chân thành cảm ơn!
Tp HCM, ngày 06, tháng 12, năm 2011.
5
Chương I
GIỚI THIỆU VỀ SỮA
I. Khái niệm và đặc điểm của sữa
1. Khái niệm
Sữa là một dung dịch sinh học được tạo từ tuyến sữa của động vật.
Sữa động vật là một loại thực phẩm chứa nhiều chất dinh dưỡng như: đạm, lipit,
đường lactoza, khoáng, vitamin…
Sữa rất giàu chất dinh dưỡng hầu như có đủ các chất cần thiết cho việc tạo thành
các tổ chức của cơ thể. Vì vậy đó là loại thực phẩm rấy quý đặc biệt là trẻ em.
2. Đặc điểm của sữa
Trong sữa có 90% là nước và có đủ chất dinh dưỡng như protein (cazein); chất
béo; đường lactoza; các vitamin A, D, E, B

1
, B
2
, B
9
, B
12
và các chất khoáng (riêng Fe
thì hơi ít). Sữa tươi chưa đun còn chứa một số enzim (men) như: photphataza,
peroxydaza giúp cho việc tiêu hoá được dễ dàng.
Có thành phần dinh dưỡng thấp nhưng đều ở dạng dễ hoà tan, dễ tiêu hoá và cân
bằng. Prôtêin chiếm 3,5% gồm các dạng prôtêin dễ hoà tan, các axit amin rất đa dạng
kể cả các axit amin không thay thế. Lipit chiếm 3,8% gồm các axit béo của bơ. Glucid
chứa nhiều đường lactoza - đây là đường đôi rất dễ tiêu hóa. Ngoài ra còn có chứa
nhiều loại vitamin, khoáng chất, PH trung tính từ 6,8 – 7,2.
3. Thành phần của sữa
Sữa chứa nhiều thành phần khác nhau như: protein, lipid, đuờng laetoza, các
chất khoáng như: Ca, K, P…và các hoạt chất sinh học khác.
Thành phần và chất lượng sữa của các loài hay ở những động vật cùng loài luôn
thay đổi phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: thành phần thức ăn, điều kiện chăn nuôi, sức
khỏe, trọng lượng của con vật, thời kỳ tiết sữa, phương pháp vắt sữa loài giống và
nhiều yếu tố khác. Tuy nhiên thành phần hoá học của sữa luôn có các chất sau:
-Prôtêin: prôtêin có trong sữa tồn tại dưới 3 dạng: casein, albumin, globulin.
Nguồn đạm chính của sữa là chất casein và whey.
6
-Glucid: đường có trong sữa chủ yếu là đường lactoza do đó lactoza còn được
gọi là đường sữa. Trung bình trong mỗi lít sữa chứa khoảng 50g lactoza (tương đương
với 4,7%). Ngoài lactoza trong sữa còn có glucoza, galactoza, fructoza, manoza.
-Các chất khoáng:
Các chất khoáng có trong sữa không nhiều nhưng sự có mặt các chất khoáng

đóng vai trò quan trọng trong cân bằng các chất dinh dưỡng của sữa.
Chất khoáng vi lượng (Fe, Zn, Co, Cu) và chất khoáng đa lượng (K, Na, Ca, S) ở
dạng muối photphat, muối clorua và các muối khác.
-Vitamin:
Sữa là một loại thức uống chứa nhiều loại vitamin nhưng hàm lượng vitamin
trong sữa không cao lắm. Các vitamin chia làm 2 loại: Nhóm tan trong chất béo: A, D,
E và nhóm tan trong nước: B
1
,

B
2
, PP, C.
Hình 1. Cấu trúc Vitamin
-Các chất miễn dịch:
Trong sữa có nhiều chất miễn dịch khác nhau, các chất miễn dịch này có tác
dụng bảo vệ sữa khỏi bị hư hỏng. Hàm lượng các chất miễn dịch không nhiều nhưng
chúng đóng vai trò quan trọng đối với cơ thể.
7
Chất miễn dịch rất dễ bị phá hủy ở nhiệt độ 65 - 70
0
C. Trong sữa có các chất
miễn dịch như antioxin, opsonin, bacteriolyzin, precipitin, aglutimin, ngoài ra sữa còn
chứa một lượng nhỏ bạch cầu.
-Các chất khí :
Trong sữa tồn tại các chất khí như CO
2
(chiếm 50 - 70%), O
2
(chiếm 5 - 10%),

NO
2
(chiếm 20 - 30%).Ngoài ra trong sữa còn phát hiện có Ca
2
NH
3
.
Trong quá trình bảo quản và chế biến sữa hàm lượng các chất khí này thay đổi.
Sự có mặt của các chất khí này gây khó khăn khi gia nhiệt, làm sữa dễ bị trào bọt khi
khử trùng.
-Hệ vi sinh vật sữa:
Trong sữa có nhiều loại vi sinh vật từ những nguồn gốc khác nhau. Trong đó:
+ Một số vô hại và có ý nghĩa tích cực:
- Nhóm vi khuẩn Lactic.
- Nhóm trực khuẩn đường ruột Coli-aerogences.
- Vi khuẩn Butyric (Clostridium).
- Vi khuẩn Propionic.
- Tụ cầu Staphylococcus làm đông sữa rất nhanh.
- Bacillus sporogenes phát triển trong sữa gây pepton hóa nhanh chóng casein
của sữa nhưng không làm đông sữa.
- Bacillus megatherium, Bacilluemycoides phát triển tốt trong sữa, hòa tan các
cục sữa.
Nhìn chung các vi sinh vật như vi khuẩn Lactic, nấm men có trong sữa chua, sữa
lên men, sản phẩm sữa… có tác dụng tốt trong cải thiện sự cân bằng vi khuẩn đường
ruột.
+ Một số gây hư hỏng sữa và các sản phẩm sữa:
- Các loài nấm men có trong sữa gồm có Saccharomyces, Mycoderma, Torula.
Một số nấm men thuộc loài Mycoderma có khả năng tạo enzim phân huỷ prôtêin và
lipid tạo nên các sản phẩm sữa có vị đắng khó chịu.
- Nấm men Torula amara cũng làm cho sữa đắng.

- Một số loài nấm mốc có trong sữa như Endomyces lactic; giống Mucor,
Aspergillus, Pennicilium, Oidium có khả năng phân giải prôtêin và lipid nên thường
8
gây vị đắng trong các sản phẩm sữa. Nấm mốc thường phát triển sau nấm men, vì thế
người ta thường thấy chúng trong các sản phẩm sữa bị hỏng nặng hay ở phomat mềm.
Do đó khi bảo quản lâu sữa có thể bị kéo sợi, biến thành màu xanh, vàng hay đỏ
hoặc bị mốc đều do nhiễm khuẩn.
+ Một số gây bệnh cho người tiêu dùng:
Các vi sinh vật gây bệnh có trong sữa chia thành hai nhóm:
- Nhóm 1: gây bệnh cho người là các vi sinh vật gây bệnh lao, sẩy thai, nhiệt
thán, nhiễm độc E.Coli…
- Nhóm 2: các vi sinh vật gây bệnh của người truyền qua cho người qua sữa như
thương hàn, kiết lị, thổ tả, nhiễm độc Streptococcus, Staphylococcus….
4. Tính chất vật lý
Sữa là một chất lỏng màu trắng đục, có độ nhớt lớn hơn hai lần so với nước, có
vị đường nhẹ và có mùi ít rõ nét. Sữa có những tính chất sau:
- Mật độ quang ở 150
0
C: 1.030
÷
1.034
- Tỷ trọng ở 15,5
0
C: 1.0306g/cm
3
- Điểm đông: -0.54 độC
÷
-0.59 độC
- pH: 6.5
÷

6.7
- Độ acid tính bằng độ Dornic (
0
D) 16
÷
18 (decigam acid lactic/1 lít sữa).
- Chỉ số khúc xạ ở 20
0
C: 1.35
II. Các loại sản phẩm từ sữa
1. Các sản phẩm sữa tươi
a. Sữa tươi nguyên kem (whole milk)
Đây là loại sữa tươi lấy trực tiếp từ con bò, không bị loại chất gì và cũng không
có chất gì được thêm vào. 88% thành phần sữa này là nước, chất béo từ sữa (chất béo
bơ) chiếm khoảng 3.5%.
b. Sữa gầy (skim milk, non-fat milk)
Loại sữa này được loại đi phần lớn thành phần chất béo, còn lại chỉ khoảng dưới
0.5%.
c. Sữa có hàm lượng béo thấp (low-fat milk)
Sữa này có hàm lượng chất béo từ 0.5%-2%. Sữa này cùng với sữa không béo
thường được bổ sung vitamin A và D để tăng giá trị dinh dưỡng.
9
2. Các sản phẩm kem tươi (fresh cream)
a. Whipping cream:
Có hàm lượng béo khoảng 30-40%, chia ra làm 2 loại: light whipping cream (30-
35%) và heavy whipping cream (36-40%)
b. Light cream:
Còn có tên gọi là table cream hay coffee cream, chứa 18-30% hàm lượng béo,
thường là 18%.
c. Half and half:

Kem tươi có hàm lượng béo từ 10-18%.
3. Các sản phẩm sữa lên men và kem sữa
a. Kem chua (Sour cream)
Kem chua được lên men bởi vi khuẩn axit lactic khiến kem trở nên đặc và có vị
thơm nhẹ. Thành phần chất béo là 18%.
b. Crème fraiche:
Đây là 1 dạng heavy cream đã được lên men, được sử dụng rất rộng rãi trong chế
biến các loại sốt trong ẩm thực Âu do tính dễ hoa tan vào nước sốt, lại thêm có mùi
thơm nhẹ rất dễ chịu.
c. Butter milk:
Là sữa tươi dạng lỏng, thường là 1 dạng skim milk, đã được làm chua bởi vi
khuẩn được cấy vào sữa. Buttermilk được sử dụng trong những công thức cần có sữa
vị chua.
d. Sữa chua (yogurt)
Là sữa ủ cho lên men, kết cấu giống như custard (người VN đã quá quen thuộc
với sữa chua rồi).
4. Các sản phẩm sữa đã được loại nước
a. Evaporated milk: (sữa đặc không đường)
Sữa này đã được loại 60% nước và sau đó được đóng hộp.
b. Condensed milk (sữa đặc có đường)
Giống như loại sữa trên nhưng đã được thêm vào 1 lượng đường lớn, khiến sữa
có vị ngọt đậm. Sữa này cũng được đóng lon hoặc hộp.
c. Dried whole milk (bột sữa)
10
Rất đơn giản, đây là loại sữa nguyên kem được làm khô thành bột.
5. Pho-mát (cheese)
Loại cheese phổ biến được làm từ sữa và sử dụng nhiều nhất trong làm bánh là
cream cheese. Tiếp đó là các loại pho-mát của Ý cũng được sử dụng nhiều là
Mascarpone, Ricotta.
Chương II

MỘT SỐ HỆ VI SINH VẬT CÓ ÍCH TRONG SỮA
& ỨNG DỤNG
I. Vi khuẩn lactic trong sữa
Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn gây lên men lactic, chúng có thể lên men được
các đường mono hoặc disaccarit nhưng không lên men được tinh bột (chỉ có loài
L.delbrueckii đồng hoá được tinh bột).
Đây là nhóm vi sinh vật quan trọng nhất đối với sữa. Nhóm này có tác dụng lớn
trong bảo quản cũng như chế biến sữa và các sản phẩm từ sữa (sữa chua, bơ, pho mát).
11
Trong quá trình sống chúng biến đổi đường lactoza có trong sữa thành axit lactic.
Ngoài ra, chúng còn tạo thành một số sản phẩm phụ có tác dụng nâng cao phẩm chất
sữa, đặc biệt là hương vị.
1. Tính chất của vi khuẩn lactic
 Vi khuẩn lactic thuộc họ Lactobacillceae và được xếp vào 4 nhóm:
Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus, Leuconostoc.
 Thuộc vi khuẩn gram (+), không có bào tử, không di động, là tế bào hình cầu,
hình que.
 Hô hấp hiếu khí hay yếm khí tuỳ tiện, không sản sinh ra enzim Catalaza vì
chúng không phân hủy dung dịch H
2
O
2
(dung dịch oxy già), không sản sinh ra các hợp
chất nitrat.
 Ít hoặc không tiết ra enzim proteaza trong sữa nhưng đôi khi trong phomai các
vi khuẩn lactic đóng vai trò quan trọng trong việc phá hủy thành phần cazein.
 Lên men đường tạo thành axit lactic và các sản phẩm phụ khác (các axit bay
hơi, este, cồn, axeton, deaxetyl…).
2. Các chủng lên men lactic trong nhóm vi khuẩn lactic
 Các liên cầu khuẩn lactic (Streptococus lactis):

12
Hình 2. Streptococus
Nhóm liên cầu khuẩn lactic này có đường kính từ 0,5 - 1,5
m
µ
. Các tế bào hình
cầu xếp thành cặp hoặc chuỗi, có chiều dài khác nhau. Gồm 2 chủng điển hình trong
sữa là Streptococus lactis và Streptococus cremoris.
Streptococus lactis là vi khuẩn có tế bào hình ôvan, có thể hơi dài, thường xếp
thành đôi hoặc chuỗi ngắn, thuộc giống ưa ấm. Nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng của
vi khuẩn này là 30 - 35
0
C và ở nhiệt độ này nó có thể làm đông tụ sữa sau 10 - 12 giờ
phát triển (nhiệt độ tối thiểu cho phát triển là 10
0
C và tối đa là 40 - 45
0
C). Trong sữa,
Streptococus lactis lên men lactic và làm sữa chua tới 110 - 120
0
T, đồng thời tạo cho
sữa chua có mùi vị thanh khiết nhưng cũng có một vài chủng của giống này làm cho
sữa có mùi khê hoặc thoảng những mùi lạ khác.
Vi khuẩn này được sử dụng rộng rãi trong chế biến các sản phẩm sữa như sữa
chua, crem-bơ chua, pho mát. Khi đông tụ sữa các cục vón chặt và nhẵn được tạo
thành.
Streptococus cremoris là vi khuẩn thường thấy trong sữa có dạng hình cầu và có
kích thước 0,6 - 0,7
m
µ

, xếp thành chuỗi dài ưa ấm và tạo ít axit trong môi trường.
Giống này lên men lactic ở nhiệt độ tối thích cho phát triển là 20 - 25
0
C (tối thiểu là
10
0
C và tối đa là 36 - 38
0
C) làm sữa chua tới 110 - 115
0
T, sữa bị đông sau 12 giờ nuôi
cấy. Streptococus cremoris làm cho sữa có mùi vị thanh khiết, dễ chịu nên được dùng
làm chín kem để chế biến bơ.
 Các trực khuẩn lactic (Lactobacterium). Sản phẩm lên men của trực khuẩn
cũng giống như các liên cầu khuẩn (axit lactic, axetic, CO
2
, cồn…) và có hai dạng lên
men điển hình và không điển hình. Lên men lactic điển hình nhờ các trực khuẩn ưa
ấm và ưa nhiệt, lên men lactic không điển hình nhờ Betabacteri.
Trực khuẩn lactic ưa nhiệt mà điển hình là Lactobacterium bulgaricum - là trực
khuẩn rất dài, tế bào hình gậy, đứng riêng lẻ hoặc thành chuỗi, được tìm ra do
Mesnhicov ở sữa chua Bungaria. Có khả năng lên men glucoza ở nhiệt độ 40 - 45
0
C.
Trong khi phát triển chúng tạo nhiều axit lactic (cao hơn liên cầu khuẩn, có thể tới 300
– 350
0
T), tích tụ 3,2% axit lactic. PH thích hợp là 6,5 (có thể phát triển ở pH 3,8). Ở
nhiệt độ thích hợp chúng làm đông tụ sữa sau 12 giờ.
Ngoài ra thuộc nhóm này còn có các giống như: Lactobacillus helveticum,

L.acidophilum, L.jugurti, L.lactis.
13
Trực khuẩn lactic ưa ấm điển hình là Lactobacterium casei - là trực khuẩn rất
ngắn, xếp thành chuỗi, gây lên men sữa chua tự nhiên.
Hô hấp yếm khí tuỳ tiện. Lên men tốt glucoza, maltoza, lactoza tạo trong môi
trường 0,8 - 1% axit lactic. Sinh axit lactic (180 - 200
0
T), làm đông sữa sau 2 – 3
ngày, cho vị chua dễ chịu. Ở điều kiện thường gây chua sữa trong 10 – 12 giờ, nhiệt
độ thích hợp cho lên men là 40 - 45
0
C (nhiệt độ tối thiểu là 10
0
C và tối ưu là 35
0
C) và
có thể phát triển ở nồng độ muối cao 5,5%.
Có tác dụng trong quá trình ủ chín phomat nhờ nó có hoạt tính proteaza nên có
thể phân hủy.
Trong sữa thường gặp hai giống trực khuẩn lactic ưa ấm là L.casei và
L.platarum.
3. Vai trò
Trong công nghệ lên men các sản phẩm từ sữa như yaourt, kefir, phô mai và một
số loại bơ, người ta chỉ sử dụng các loài vi khuẩn lactic để thực hiện những chuyển
hóa cần thiết. Ví dụ như: Streptococcus lactic phát triển ở 30- 35
o
C và làm đông tụ
sữa ở nhiệt độ này sau 10- 12h, nó là tác nhân của quá trình chế biến sữa chua;
Streptococcus cremoris phát triển ở nhiệt độ 20- 25
o

C, khi chúng phát triển trên sữa
làm sữa có mùi đặc biệt dễ chịu, ứng dụng trong chế biến bơ nhất là bơ chua. Giống vi
khuẩn lactic trong sản xuất công nghiệp là giống vi khuẩn thuần khiết được nhân lên
qua nhiều cấp từ một tế bào vi khuẩn ban đầu đã qua tuyển chọn. Còn các vi khuẩn
lactic có mặt trong sữa tươi sau khi vắt được xem là những chuyển hóa ngoài ý muốn
của nhà sản xuất trong quá trình bảo quản sữa trước khi chế biến. Các vi khuẩn lactic
nhiễm vào sữa thuộc nhiều giống khác nhau như Streptococcus, Latococcus,
Lactobacilus, Leuconostoc, Bifidobacterium, …Chúng thuộc nhóm vi khuẩn lên men
đồng hình lẫn dị hình, khi thanh trùng ở 80
o
C hầu hết các vi khuẩn lactic bị nhiễm
trong sữa sẽ bị tiêu diệt.
- Các trực khuẩn lactic: là tác nhân của quá trình chế biến sữa chua, phomat, ủ
lên men thức ăn gia súc. Bao gồm Lactobacterium bulgarium tích tụ đến 3,2% acid
lactic, 40-45
o
C, gây đông tụ sữa sau 12h. Lactobacterium helveticum là trực khuẩn
phomat phát triển ở nhiệt độc 22- 50
o
C tạo độ acid trong sữa là 200-300
o
T,
Lactobacterium lactic phát triển ở nhiệt độ 22-50
o
C, ngoài ra còn có hai trực khuẩn
14
xếp chuỗi là Lactobacterium casei có thể phát triển ở nồng độ muối cao 5,5% và
Lactobacteriium plantararum. Cả hai có tác dụng trong quá trình ủ phomat.
Betabacterium Causasium, Betabacterium breve: hai loại này khi phát triển trong sữa
cho độ acid thấp, không tạo được những cục đông.

+ Lactobacillus cuemeris fermenti: Thường thấy chúng trong sữa ủ chua. Trực
khuẩn không chuyển động, thường tồn tại tế bào đơn bào và có khi tạo thành chuỗi.
Thường thường chuỗi được tạo thành trong thời gian lên men. Kích thước tế bào (3-8
× 0,3 × 1,0 µm) khả năng tạo acid tối đa trong môi trường 0,9- 1,2%.
4. Các vi khuẩn sinh hương
Gồm các liên cầu khuẩn có khả năng tạo một hương đáng kể những axit bay hơi
(axit axetic, propionic) và các chất thơm (este, diaxetyl) ở trong sữa họăc sản phẩm từ
sữa. Phần lớn các vi khuẩn này có enzym xitritaza. Nhờ enzym này các vi khuẩn mới
có thể lên men được axit xitric.
Đặc điểm của các liên cầu khuẩn này thường đứng riêng rẽ hoặc xếp hàng đôi
hay xếp thành chuỗi dài ngắn khác nhau, tế bào của chúng thường nhỏ hơn Streptococus
latis và S.cremoris. Nhiệt độ thích hợp để chúng phát triển là 30
0
( riêng đối với
S.diacetilactis phát triển tốt ở 35
0
C ).
Gồm các chủng điển hình là: Streptococus citrovorus, S.paracitrovorus,
S.diacetilactis…S.citrovorus phát triển yếu trong sữa và không gây đông sữa.
S.paracitrovorus phát triển mạnh và ở nhiệt độ tối thích gây đông sữa sau 2 - 3 ngày.
S.diacetilactis tạo thành axit latic nhiều hơn cả trong nhóm các vi khuẩn sinh
hương và làm đông sữa sau 16 - 48 giờ. Giống này tạo thành diaxetyl, làm cho sữa có
mùi vị dễ chịu nên chúng được dùng phối hợp với S.lactis và S.cremoris trong chế
biến sữa chua, phomat và bơ cho mùi vị tốt hơn.
5. Vi khuẩn Leuconostoc
Là các vi khuẩn lên men lactic dị hình, có dạng hình cầu. Trong môi trường axit
chúng trở nên dài và nhọn ra, lên men đường tạo chất thơm như acetyl, metyleacbimot
hoặc acetoin điển hình là Leuconostoc citrovorum dùng để chế men trong sản xuất bơ.
II. Vi khuẩn Propionic
Vi khuẩn Propionic là những vi khuẩn gây lên men propionic, tức là quá trình

chuyển hóa axit và muối lactat thành axit propionic, CO
2
và nước
15
1. Tính chất của Propionic
Vi khuẩn propionic thuộc giống Propionibacterium là những trực khuẩn hơi bị
uốn cong, gam (+), không sinh bào tử, không chuyển động và trong điều kiện không
thuận lợi thì tế bào chúng có khi hình kim.
Là loại vi khuẩn hiếu khí tùy tiện nhưng phát triển tốt trong điều kiện kị khí.
Phát triển ở PH môi trường 4,5 – 5. Nhiệt độ tối thích cho phát triển của chúng là 30 -
35
0
C nhưng vẫn mọc tốt ngay cả 15 - 25
0
C, chúng bị chết ở 60 - 70
0
C.
2. Tác động của vi khuẩn Propionic đối với các sản phẩm sữa
Vi khuẩn Propionic có vai trò quan trọng trong việc chế biến phomat. Các axit
axetic và propionic được tạo thành trong quá trình lên men làm cho mùi vị phomat có
hương vị đặc trưng và tạo những lỗ hổng trong khối phomat.
Trong sữa vi khuẩn Propionic phát triển chậm và làm đông sữa sau 5 - 6 ngày,
tạo axit propionic tương đối cao (160
0
C - 170
0
C).
3. Vai trò
Vi khuẩn Propionic chuyển hóa đường thành acid propionic, acid acetic, khí
CO

2
,… làm hư hỏng chất lượng sữa. Tuy nhiên, trong công nghệ sản xuất một số loại
phô mai như Emmenthal, Gruyère,… Người ta thường sử dụng canh trường
Propionibacteium thuần khiết để tạo ra lỗ hỏng (mắt phô mai) và hương vị đặc trưng
cho sản phẩm. Hầu hết các vi khuẩn propionic bị tiêu diệt khi thanh trùng sữa ở 75
o
C
trong thời gian 20 giây.
III. Nấm men (Yeast, Levure)
1. Tính chất
Các loài nấm men chính có trong sữa có cấu tạo đơn
bào, không di động, có dạng hình cầu hoặc hình trụ, sinh
sản theo kiểu nảy chồi .
2. Tác động của nấm men đối với sản xuất sữa
Các loài nấm men gây phản ứng lên men đường lacto tạo CO
2
và rượu, đây là
phản ứng sinh hóa trong quá trình hình thành một số sản phẩm của sữa chua.
16
Hình 3. Nấm men
Có những nấm men không phân hủy lacto được nhưng khi vi khuẩn lactic trong
sữa chua chuyển đường thành gluco và galacto thì nấm men gây lên men các đường
đơn giản này tạo nên các sản phẩm cần thiết cho các loại sữa cần lên men.
Trong sữa có các loài nấm men chính là: Sacharomyces, Mycoderma và Torula.
Sacharomyces có thể lên men được lactoza, có giá trị lớn trong việc chế sữa chua
(kefia và kumic).
Mycoderma (nấm men tạo màn) có hoạt tính proteaza vì vậy nấm men này gây
cho các sản phẩm sữa có vị đắng nhưng làm tăng thời hạn bảo quản bơ.
Torula có tác dụng làm rắn bơ.
Ngoài ra trong nấm men có nhiều giống có thể phân hủy được casein và chất béo

của sữa.
3. Vai trò
Một số nấm men có thể sử dụng đường lactose cho quá trình trao đổi chất.
Chúng phát triển trong sữa và gây ra những biến đổi về thành phần hóa học trong quá
trình bảo quản sữa. Các nấm men không phân giải được gluxit thì không được dùng
trong công nghệ sản xuất sữa chỉ riêng có giống Toralopsis thì được ứng dụng trong
công nghệ chế biến bơ. Để tăng thời hạn bảo quản của bơ, một số nấm men thuộc họ
Mycoderma có khả năng tạo enzym phân hủy protein, lipit làm cho các sản phẩm sữa
có vị đắng khó chịu.
Ở một số địa phương, nấm men được sử dụng trong công nghệ sản xuất các sản
phẩm lên men truyền thống từ sữa. Như cộng hòa Liên bang Nga, kefir là sản phẩm
lên men từ sữa bởi hệ sinh vật gồm vi khuẩn lactic và nấm men. Các sản phẩm chính
của quá trình lên men ethanol, acid lactic, CO
2
,… tạo vị chua và nồng đặc trưng cho
kefir.
IV. Nấm mốc (molds, moulds)
Nấm mốc có khả năng phân giải prôtein, lipit tạo ra vị đắng, chúng phát triển sau
nấm men. Nấm mốc sử dụng chủ yếu trong phomát như Mucor, Pinicillium,
Aspergillus. Các loại vi sinh vật thường được sử dụng để làm chín phomát là vi khuẩn
propionic, nấm mốc.
17
Nấm mốc trong sữa không phát triển ở sữa tươi, thường phát triển trong các sản
phẩm sữa chua. Chúng đồng hóa axit lactic làm môi trường chuyển dần sang kiềm,
chúng phát triển trên phomat bị mềm làm cho phomat có màu sắc khác nhau.
Các loại nấm mốc thường gặp trong sữa và các sản phẩm sữa như: Edomyces
lactis tạo màng trắng trên mặt bơ, phomat;Mucor, Ascomycetes, Fungi,
Phycomycetes, Penicillium, Aspergillus… thường tạo trên bề mặt phomat, bơ các vết
màu khác nhau và gây mùi hôi, Odium lactis tạo trên bề mặt sữa hoặc váng chua một
lớp trắng đặc biệt có mùi thơm .

Ngoài các hệ vi sinh vật có tác dụng tốt đối với sữa và sản phẩm sữa thì còn một
số vi sinh vật không lợi và có hại khác như:
Khuẩn đường ruột (Escherichia Coli): không làm
đông sữa, lên men mạnh lacto và sinh khí làm cho các
cục sữa đông có rãnh. Và nó được dùng làm tiêu chuẩn để
đánh giá sự nhiễm bẩn của sữa, phomat.
Hình 4. Escherichia Coli
Vi khuẩn Butyric khi phát triển trong sữa biến acid lactic thành acid bay hơi,
acid butiric, CO
2
, H
2
làm sữa có mùi khó chịu và gây hư hỏng nặng. Thanh trùng sữa
theo phương pháp Pasteur không có hiệu quả và vi khuẩn này có khả năng tạo bào tử
và chịu nhiệt độ cao.
Vi khuẩn gây đắng (Streptococcus Liquefaciens) nhiệt độ thích hợp 30
0
C, có khả
năng tạo các acid, tạo enzym đông tụ sữa và các acid và enzym này tác dụng đồng thời
lên protein của sữa làm đặc lại thành cục và độ acid giảm, loại này phát triển trong sữa
và các sản phẩm sữa gây quá trình pepton hóa do đó tạo vị đắng khó chịu cho sản
phẩm.
Vi khuẩn gây thối: không gây lên men đường sữa, chúng là vi khuẩn sinh bào tử,
có khả năng sinh enzym phân giải protein sữa tạo pepton và biến chúng thành các acid
tự do NH
3
làm sữa có phản ứng kiềm.
* Vai trò
Một số loại nấm sợi thường có trong sữa: Penicillium camembertii, P.
roquefiortii, P. casei, Geotrichum candiidum, Rihizopus stolonifer,…

18
Trong số nấm sợi nói trên, vài loài thuộc giống Penicillium được sử dụng trong
sản xuất một số loại phô mai. Việc nhiễm nấm sợi vào sữa gây nhiều khó khăn trong
công nghiệp chế biến sữa, đặc biệt là sản xuất phô mai và ảnh hưởng xấu đến chất
lượng sản phẩm.
Tuy nhiên, khác với nhóm vi khuẩn sinh bào tử chịu nhiệt hầu hết các loài nấm
men và nấm sợi đều bị tiêu diệt trong quá trình thanh trùng sữa ở 75
o
C trong thời gian
từ 10 – 15 giây. Vấn đề quan trọng là phải tuân thủ nghiêm ngặt các qui định về vệ
sinh để tránh hiện tượng tái nhiễm VSV vào sữa sau khi đã qua thanh trùng.
V. Ứng dụng sản xuất các loại sữa
1. Sữa chua (yaourt)
Là sản phẩm lên men lactic các dạng lỏng khác nhau, đã khử trùng Pasteur (sữa
chua 3%, mỡ sữa trộn với sữa đã vớt váng - sữa gầy làm tăng hàm lượng chất tan, cải
thiện cấu trúc gen, protein…). Dưới tác dụng của nhiều loại vi khuẩn lactic khác nhau
như: Streptococcus lactic, S.Ceremmonis, S.Themophilus, Lacto Batecillus
Bungaricus…
Hình 5. Sữa chua
Quá trình yếm khí xảy ra ở 42-45
0
C trong 3-4 giờ. Lactoza sẽ chuyển thành acid
lactic, pH dung dịch sữa giảm từ 4-5 casein đông tụ, sữa keo sệt quánh mịn giống như
gel có vị chua dịu (40-60
0
SH). Hương dễ chịu. Phần quan trọng trong hương thơm đặc
biệt của yaourt là các hợp chất cacbon và dyxetyl đặc biệt là axetin (axetandehit)
chiếm ưu thế. Người ta làm sẵn các viên sữa chua từ các loại vi khuẩn và nấm men.
Dùng viên này bỏ vào cốc sữa thì quá trình lên men được định hướng nên quá trình
lên men ngắn và hương vị thơm ngon hơn vì có thêm nấm men hoạt động.

19
2. Sản xuất phomat
Vai trò vi sinh vật trong các giai đoạn chế biến phomat khác nhau là rất khác
nhau.
- Giai đoạn 1: Vi khuẩn lactic hoạt động chuyển đường sữa thành acid lactic,
trong điều kiện acid này, enzyme đông tụ sữa hoạt động mạnh
hơn, tác dụng làm đông tụ sữa càng nhiều hơn. Một phần enzym bị thuỷ phân thành
pepton, các acid amin tự do…tập hợp lại trong cục đông.
Hình 6. Phomat
Trong quá trình chế biến số lượng vi khuẩn trong phần phomat tăng lên rất nhiều
không chỉ vì tách một phần huyết thanh, vì làm đặc thêm phần phomat và chính còn vì
sự sinh sản của vi khuẩn.
- Giai đoạn 2: quá trình lên men lactic vẫn tiếp tục. Sau khi ép số lượng vi
khuẩn trong 1g phomat đạt đến khoảng một tỷ tế bào
- Giai đoạn 3: là giai đoạn muối phomat, có tác dụng chống lại sự xâm nhập
của các vi sinh vật có hại.
- Giai đoạn 4: Trước hết, Streptococeus lactic lên men lacto cho đến khi hết
đường này. Chúng chết dần dần và được thay thế bằng trực khuẩn lactic. Dần dần trực
khuẩn lactic cũng chết và vi khuẩn Propionic bắt đầu hoạt động mạnh chuyển các
muối lactat thành acid propionic, acid axetic và khí CO
2
làm cho phomat có vị chua và
mùi hăng đặc trưng .
Tác động của vi sinh vật chủ yếu và các enzym đông tụ sữa dẫn đến những
chuyển hóa trong phomat như sau:
- Dưới tác dụng của hệ vi khuẩn lactic và vi khuẩn propionic:
Đường sữa Acid lactic Acid acetic
20
Acid propionic
Khí CO

2
- Dưới tác dụng của enzym đông tụ sữa, vi khuẩn lactic và một số cầu khuẩn:
Cazein Pracazein Pepton các acid amin và amoniac
- Dưới tác động của nấm mốc và một số trực khuẩn lactic:
Lipit Acid béo Acid butiric Keton
bay hơi Acid capronic Andehit
Acid caprilic Rượu
Ete
Người ta nhận thấy có sự khác nhau về thời gian phát triển của chuỗi cầu khuẩn
lactic và trực khuẩn lactic. Lúc đầu nhóm Streptococcus lactic và Streptococcus
diacetilatis phát triển mạnh, riêng nhóm Streptococcus cremoris phát triển chậm hơn
khá nhiều. Ngay trong quá trình làm chín phomat, mối quan hệ này vẫn giữ nguyên.
Sau đó Streptococcus cremoris lai chết sớm hơn Streptococcus lactic và
Streptococcus diacetilactis. Nhóm trực khuẩn lactic trong phomat tươi không nhiều
(vài ngàn tế bào trong 1g) nhưng đến giai đoạn ủ chín 1.5-2 tháng, số lượng của chúng
tăng dần và đến 4 tháng thì tăng vài tỷ tế bào trong 1g phomat, sau đó chúng chết rất
nhanh.
Trong số các trực khuẩn lactic trung sinh, loài Lactobacterium plantarum giữ
vai trò quan trọng hơn cả đối với quá trình phân giải protein
để giải phóng các acid amin tự do làm tăng giá trị dinh dưỡng của phomat. Trường
hợp phomat được nấu ở nhiệt độ cao lần thứ hai sự sinh sản của chuỗi cầu khuẩn bị ức
chế mạnh, số lượng chúng chỉ còn lại khoảng 10% so với thời điểm trước khi nâng
nhiệt độ lên trong điền kiện này trực khuẩn lactic cũng phát triển chậm lại.
Nhóm vi khuẩn sinh hương phối hợp với S.lactis và S.cremoris trong chế biến
phomat cho mùi vị tốt hơn.
Đối với một số loài phomat, người ta dùng nấm mốc Penicillium candidum và
Penicillium camembeti phát triển trên bề mặt phomat tạo hương và vị. Bên trong khối
phomat, lúc đầu các vi khuẩn lactic phát triển mạnh mẽ, có thể lên tới 6 - 7 tỷ tế bào
trong 1g phomat mới ủ chín vài ngày, độ 10 ngàu sau chúng chết dần chỉ còn độ vài
21

triệu tế bào, sau đó nấm mốc bắt đầu phát triển trên bề mặt phomat, tiết ra enzym
proteaza để thủy phân cazein và trung hòa acid trên bề mặt phomat.
3. Sữa tươi
Sản phẩn sữa tươi trên thế giới hiên nay được chế biến và đóng gói dưới hai
dạng là sữa tươi thanh trùng va sữa tươi tiệt trùng.
Hình 7. Các loại sữa tươi
Sữa tươi nguyên chất 100% được chế biến trên dây chuyền khép kín, sữa tươi
được xử lý nhiệt (Paxtơ hóa) ở 86
0
C trong 15 giây.
Do xử lý ở nhiệt độ trên trong thời gian ngắn nên tiêu diệt được hầu hết hệ vi
sinh vật hoại sinh và gây bệnh của sữa nếu có, nhưng không làm thay đổi đến cấu trúc
vật lý, cũng như những cân bằng hóa học, những thành phần sinh hóa như enzym và
vitamin của sữa.
Tuy nhiên với nhiệt độ Paxtơ hóa này, trong sữa vẫn còn tồn tại một số ít vi sinh
vật kháng nhiệt, chúng có thể phát triển dễ dàng ở nhiệt độ cao (nếu sữa được bảo
quản ở nhiệt độ không đạt yêu cầu 4
o
C). Các vi sinh vật này thường sinh ra enzym
phân giải protein phá hủy cazein làm hư sữa. Ngoài ra, trong quá trình bảo quản,
những vi khuẩn lactic trong sữa phát triển gây axit hóa sữa (sữa bị chua).
Trong sữa nhiều nhất là vi khuẩn lactic, giống điển hình là Streptococuslactic
và Lactobactrium. Khi có mặt của hai loại vi khuẩn này trong sữa, chúng sữa lên men
lactic, fomic, succinic và ít khí.
22
Chương III
NGHIÊN CỨU VỀ NHÓM VI SINH VẬT CÓ ÍCH
TRONG SỮA
I. “NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH LÊN MEN SỮA CHUA – CANXI” (Vương
Trọng Hào, Tống Thị Mơ - Khoa sinh - KTNN trường ĐHSP Hà Nội - 4/2002)

1. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
- Các chủng vi khuẩn lactic được phân lập từ sữa chua Vinamilk.
- Các hoá chất được sử dụng đều có độ tinh khiết cao và an toàn thực phẩm.
- Môi trường phân lập vi khuẩn lactic.
- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn lactic.
- Xác định hàm lượng axit lactic.
- Đánh giá chất lượng sữa chua - canxi theo phương pháp cảm quan.
2. Kết quả và biện luận
a. Kết quả phân lập vi khuẩn lactic.
Từ sữa chua của Công ty sữa Vinamilk tiến hành phân lập vi khuẩn lactic lên
men sữa chua trên môi trường MRS có CaCO
3
ở nhiệt độ 40
0
C/ 28h. Tách từng khuẩn
lạc, kiểm tra hình dạng kích thước vi khuẩn, khả năng đông tụ sữa, khả năng tạo
hương của các chủng vi khuẩn lactic.
Khi lên men sữa chua người ta thường dùng 2 chủng L. bulgaricus (trực khuẩn)
và S. thermophilus (liên cầu khuẩn) để lên men sữa chua. Để lên men sữa chua Công
ty sữa Vinamilk cũng dùng 2 chủng vi khuẩn đó. Đối chiếu với tiêu chuẩn hình thái,
sinh lý, sinh hoá chúng tôi cho rằng:
23
Chủng V
1
(trực khuẩn) có thể thuộc loài L. bulgaricus.
Chủng V
2
(liên cầu khuẩn) có thể thuộc loài S. Thermophilus
* Sau đó là 4 bước :
 Lựa chọn môi trường nuôi cấy L. bulagaricus V

1
và S. thermophilus V
2
.
 Nghiên cứu tỷ lệ giữa hai chủng L. bulgaricus V
1
và S. thermophilus V
2
trong
hỗn hợp giống lên men.
 Xác định nồng độ CaCl
2
để làm sữa chua – canxi.
 Xác định thời gian lên men canxi.
 Đánh chất lượng sữa chua - canxi.
b. Quy trình công nghệ lên men sữa chua – canxi
3. Kết luận
1. Hai chủng vi khuẩn phân lập được từ sữa chua của Công ty Sữa Vinamilk lên
men sữa chua có thể thuộc về loại trực khuẩn - Lactobacillus bulgaricus và liên cầu
khuẩn Streptococcus thermophilus.
2. Môi trường nuôi cấy thích hợp cho 2 chủng vi khuẩn lactic lên men sữa chua
là môi trường MT2: Nước ép cà chua - 100g/l, glucoza 10g/l, cao nấm men 10g/l,
CaCO2 10g/l và một vài nguyên tố khoáng, pH = 6,9.
3. Hai chủng Lactobacillus bulgaricus V
1
và Streptococcus thermophilus V
1
được phối hợp theo tỷ lệ 2:1 cho sữa chua chất lượng cao nhất và thời gian nhân giống
là 28-36h.
24

4. Quy trình công nghệ lên men sữa chua như sau
+ Nồng độ CaCl
2
trong môi trường lên men là 5g/l.
+ Thời gian lên men sữa chua - canxi 6h-8h/4
0
C
+ Thời gian tạo hương cho sữa chua 6h/6
0
C.
II.NGHIÊN CỨU ỔN ĐỊNH GIỐNG KEFIR CHO LÊN MEN SỮA CHUA
(Trần Thị Ngọc Mai - Khoa Công Nghệ Thực Phẩm, Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ
TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam – Tháng 4/2010)
1.Giới thiệu
Nghiên cứu được tiến hành dựa trên cơ sở nuôi cộng sinh chủng vi khuẩn lactic
Lactobacillus spp và nấm men Saccharomyces cerevisiae, khảo sát các yếu tố ảnh
hưởng đến quá trình cộng sinh sự phối hợp tỷ lệ giống, điều kiện cộng sinh – cơ chất,
pH, nhiệt độ, thời gian để tạo ra được hạt kefir ổn định về chất lượng.
Kiểm tra tính ổn định của hạt kefir bằng cách cho tiến hành lên men sữa trong
điều kiện tối ưu, sau quá trình lên men sẽ đo các chỉ tiêu hóa lý, vi sinh, cảm quan của
sản phẩm sữa chua, để kiểm tra tính ổn định chất lượng của thành phẩm.
2. VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP
a. Vật liệu
Nấm men Saccharomyces cerevisiae (Viện Pasteur), sữa tươi tiệt trùng
(Vinamilk), đường saccharose…
b. Phương pháp
- Phương pháp vi sinh: phân lập vi khuẩn lactic, nhuộm Gram, thử nghiệm
oxydase, thử nghiệm catalase, định lượng vi khuẩn lactic bằng phương pháp đo mật
độ quang, định lượng nấm men bằng phương pháp đếm trực tiếp sử dụng buồng đếm
hồng cầu.

- Phương pháp hóa lý: đo nồng độ chất khô –
o
Bx, pH, đo độ chua –
o
T, độ cồn.
- Phương pháp cảm quan: đánh giá cảm quan theo phương pháp cho điểm,
phương pháp so hàng.
3. Kết luận
Qua khảo sát các điều kiện tối ưu cho quá trình cộng sinh của vi khuẩn lactic và
nấm men, tôi thu được các kết quả sau:
- Tỉ lệ vi khuẩn lactic : nấm men cho cộng sinh là 2:1.
25