nghiên cứu phân lập hệ vi sinh vật chủ yếu trong quá trình lên men tự nhiên hạt ca cao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG



VÕ THỊ MỸ LỘC


NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP HỆ VI SINH VẬT CHỦ YẾU
TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN TỰ NHIÊN HẠT CA CAO

Chuyên ngành: Công nghệ sau thu hoạch
Mã ngành: 60.54.10


LUẬN VĂN THẠC SĨ
NGƯỜI HƯỚNG DẪN:
TS. MAI THỊ TUYẾT NGA
TS. NGUYỄN MINH TRÍ




NHA TRANG - NĂM 2013


i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam kết đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Kết quả nêu trong
luận văn là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Tác giả luận văn
Võ Thị Mỹ Lộc

ii

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến:
Cô TS. Mai Thị Tuyết Nga và Thầy TS. Nguyễn Minh Trí đã động viên và
giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Các thầy cô đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho em trong suốt thời
gian học cao học.
Các thầy cô trong hội đồng bảo vệ đề cương luận văn đã có những ý kiến
đóng góp quý báu cho em.
Trung tâm thí nghiệm thực hành, Trường Đại học Nha Trang đã tạo điều kiện
cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.


Võ Thị Mỹ Lộc


iii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii
MỤC LỤC ……………………………………………………………………….iii
DANH MỤC BẢNG vi
DANH MỤC HÌNH vii
MỞ ĐẦU 1
1. Tính cấp thiết của đề tài 1
2. Mục đích của đề tài 2
3. Nội dung nghiên cứu 2
4. Tính khoa học và thực tiễn của đề tài 2
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3
1. Tổng quan về ca cao 3
1.1. Tên khoa học 3
1.2. Đặc điểm, hình dạng của cây và quả ca cao 3
1.3. Các giống ca cao. 4
1.4. Tình hình trồng ca cao ở Việt Nam 5
2. Tổng quan về phương pháp lên men ca cao 6
2.1. Lên men trên nền khô 6
2.2. Lên men thành đống 7
2.3. Lên men trong rổ 8
2.4. Lên men trong thùng 8
3. Tổng quan về vi sinh vật trong lên men ca cao. 9
3.1. Nấm men 11
3.2. Vi khuẩn acetic 15
3.3. Vi khuẩn lactic 16
4. Biến đổi sinh hóa trong lên men ca cao. 19
4.1. Cấu tạo hạt ca cao 19
4.2. Biến đổi về nhiệt độ của khối lên men 19
4.3. Biến đổi pH của khối lên men. 20
4.4. Biến đổi sinh hóa 20
1. VẬT LIỆU VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 26

iv
2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28
2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 28
2.2 Xác định thành phần hóa học ban đầu của nguyên liệu 29
2.3 Đánh giá chất lượng hạt ca cao 29
2.4 Tiến hành đếm và phân lập các chủng vi sinh từ ca cao lên men 30
2.5 Định danh các chủng vi sinh bằng phương pháp giải trình tự gen 32
2.6 Xử lý số liệu và vẽ đồ thị 32
CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 33
1. Chất lượng hạt ca cao sau lên men 33
2. Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học của ca cao trước khi lên men 37
3. Kết quả nghiên cứu sự biến đổi nhiệt độ, pH của các mẫu trong quá trình lên
men 41
3.1. So sánh sự biến đổi nhiệt độ của 12 mẫu nghiên cứu 41
3.2 So sánh sự biến đổi pH của 12 mẫu nghiên cứu trong quá trình lên
men 44
4. So sánh sự biến đổi số lượng các nhóm vi sinh trong quá trình lên men của
12 mẫu lên men. 47
4.1 So sánh sự biến đổi số lượng của nấm men trong quá trình lên men ca cao
tự nhiên của 12 mẫu lên men 47
4.2 So sánh sự biến đổi số lượng của vi khuẩn acetic trong quá trình lên men ca
cao tự nhiên của 12 mẫu nghiên cứu 49
4.3 So sánh sự biến đổi của vi khuẩn lactic trong quá trình lên men ca cao tự
nhiên của 12 mẫu nghiên cứu. 52
5. Xác định đặc điểm hình thái và đặc điểm nuôi cấy của nấm men, vi khuẩn
lactic, vi khuẩn acetic theo dõi trong quá trình lên men (mẫu 10, mẫu 11, mẫu 12).
54
5.1. Kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái và đặc điểm nuôi cấy của nấm
men có số lượng chủ yếu phân lập được từ quá trình lên men ca cao tự nhiên ở

mẫu 10, mẫu 11, mẫu 12 55
5.2. Kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái và đặc tính nuôi cấy của vi
khuẩn acetic có số lượng chủ yếu phân lập được từ quá trình lên men ca cao tự
nhiên ở mẫu 10, mẫu 11, mẫu 12 58
5.3. Kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái và đặc tính nuôi cấy của vi
khuẩn lactic có số lượng chủ yếu phân lập được từ quá trình lên men ca cao tự
nhiên ở mẫu 10, mẫu 11, mẫu 12 61

v

5.4. Kết quả giải trình tự gen của các chủng vi sinh có số lượng chủ yếu phân
lập được trong quá trình lên men ca cao tự nhiên ở mẫu 12. 63
5.4.1. Nấm men 63
5.3.2 Vi khuẩn acetic 65
5.3.3. Vi khuẩn lactic 67
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 69
KẾT LUẬN 69
ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 69
TÀI LIỆU THAM KHẢO 70
I. TÀI LIỆU TRONG NƯỚC 70
II. TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI 70
III. MỘT SỐ TRANG WEB 73






vi
DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Các loài vi sinh vật phân lập được từ quá trình lên men ca cao 10
Bảng 1.2: Các loài vi sinh vật trong lên men hạt ca cao 13
Bảng 3.1. Bảng mô tả đặc điểm hình thái và đặc điểm nuôi cấy của các chủng nấm men
phân lập được trong quá trình lên men ca cao tự nhiên ở 3 mẫu 10, 11, 12. 55
Bảng 3.2. Đặc điểm hình thái, và đặc tính nuôi cấy của các chủng vi khuẩn acetic có
số lượng chủ yếu phân lập được trong 3 mẫu ca cao lên men tự nhiên 59
Bảng 3.3. Đặc điểm hình thái, và đặc tính nuôi cấy của vi khuẩn lactic 61


vii
DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cây ca cao, quả ca cao 4
Hình 1.2 Lên men ca cao bằng khay 7
Hình 1.3 Lên men thành đống 7
Hình 1.4 Lên men trong rổ 8
Hình 1.5: Lên men ca cao bằng thùng 9
Hình 1.6: Cấu tạo hạt ca cao [16]. 19
Hình 1.7: Biến đổi sinh hóa và quá trình khuếch tán trong cơm nhầy và trong hạt
trong quá trình lên men ca cao [16]. 21
Hình 3.1: Đồ thị biểu diễn % hạt lên men hoàn toàn của 12 mẫu lên men. Các giá trị
trung bình mang chữ cái khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). 33
Hình 3.2: Đồ thị biểu diễn % hạt lên men một phần của 12 mẫu lên men. Các giá trị
trung bình mang chữ cái khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). 34
Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn % hạt dưới mức lên men của 12 mẫu lên men. Các giá trị
trung bình mang chữ cái khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). 35
Hình 3.4: Đồ thị biểu diễn % hạt không lên men của 12 mẫu lên men. Các giá trị trung
bình mang chữ cái khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P < 0,05) 36
Hình 3.5: Kết quả cắt hạt ca cao 37

Hình 3.6: Hàm lượng protein trong 12 mẫu lên men. Các giá trị trung bình mang
chữ cái khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P < 0,05) 38
Hình 3.7: Hàm lượng glucid trong 12 mẫu lên men. Các giá trị trung bình mang chữ
cái khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). 39
Hình 3.8: Hàm lượng nước của cơm nhầy trong 12 mẫu lên men. Các giá trị trung bình
mang chữ cái khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P < 0,05) 39
Hình 3.9: Tỷ lệ cơm/hạt của 12 mẫu lên men. Các giá trị trung bình mang chữ cái
khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P < 0,05) 40
Hình 3.10 Sự biến đổi nhiệt độ của các mẫu trong suốt quá trình lên men 41
Hình 3.11 Sự biến đổi pH của 12 mẫu nghiên cứu trong quá trình lên men. 44
Hình 3.12 Sự biến đổi số lượng nấm men trong quá trình lên men 47

viii

Hình 3.13Sự biến đổi số lượng vi khuẩn acetic của 12 mẫu nghiên cứu trong quá
trình lên men 50
Hình 3.14 Sự biến đổi số lượng vi khuẩn lactic của 12 mẫu nghiên cứu trong suốt
quá trình lên men 52
Hình 3.15. Đặc điểm hình dạng khuẩn lạc và hình thái tế bào của nấm men 58
Hình 3.16. Hình thái dạng khuẩn lạc và hình thái tế bào của LA1 60
Hình 3.17. Hình thái tế bào của vi khuẩn lactic 62
Hình 3.18. Kết quả giải trình tự gen 28S của LN96hN2 (thuộc nhóm NM12.1) 63
Hình 3.19. Kết quả giải trình tự gen 28S của LN120hN1 (thuộc nhóm NM12.2) 63
Hình 3.20. Đồ thị biểu diễn sự biến đổi số lượng của các chủng nấm men trong suốt
quá trình lên men 64
Hình 3.21. Kết quả giải trình tự gen 16S của LA-24 h N4 (thuộc nhóm LA12.1) 65
Hình 3.22. Sự biến đổi số lượng vi khuẩn acetic trong quá trình lên men. 66
Hình 3.23. Kết quả giải trình tự gen 16S của LL12.1 67
Hình 3.24. Sự biến đổi số lượng vi khuẩn lactic Lactobacillus fermentum
(LL12.1)trong suốt quá trình lên men 67

1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Nước ta có khí hậu nhiệt đới với phát triển nông nghiệp là thế mạnh, bên
cạnh đó điều kiện thiên nhiên cũng rất ưu đãi cho sự phát triển của cây công nghiệp.
Để tận dụng tốt mọi tiềm lực phục vụ cho phát triển kinh tế, ngoài việc phát triển
cây nông nghiệp nhà nước cũng rất chú trọng và quan tâm đến phát triển cây công
nghiệp. Ngoài những cây công nghiệp mang lại giá trị kinh tế lớn như cao su, tiêu,
cà phê thì cây ca cao cũng là cây đem lại giá trị kinh tế không nhỏ. Nó được xem là
một trong những cây công nghiệp có tiềm năng lớn đang được chính phủ quan tâm
và đầu tư.
Với sản lượng 5.760 tấn hạt khô niên vụ 2010 -2011 [41], ca cao Việt Nam
chỉ là “hạt bụi” so với những “đại gia” về ca cao như Bờ Biển Ngà hoặc Ghana với
sản lượng cả triệu tấn mỗi năm. Bên cạnh sản lượng thì chất lượng ca cao Việt Nam
cũng là một vấn đề lớn cần chú ý. Đối với các quốc gia trên, công nghiệp ca cao là
một ngành truyền thống trong khi nước ta còn rất non trẻ. Để thực hiện thành công
định hướng của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, đưa cây ca cao trở
thành cây công nghiệp quan trọng, mang lại hiệu quả kinh tế cao, góp phần chuyển
dịch trong cơ cấu cây trồng và tăng thu nhập cho nông dân thì cần phải chú ý nâng
cao nhất lượng hạt ca cao sau lên men.
Quá trình lên men hạt ca cao ở nước ta còn được thực hiện theo phương pháp
thủ công, chủ yếu là dựa vào kinh nghiệm, chưa có nghiên cứu hệ thống về hệ vi
sinh vật trong quá trình lên men tự nhiên hạt ca cao và ứng dụng vào quá trình lên
men, chất lượng hạt ca cao sau lên men không đồng đều, độ lên men thấp, mùi đặc
trưng không rõ ràng, hạt ca cao bị nhiễm khói, có mùi lạ … trong khi đó diện tích
và sản lượng ca cao đang ngày càng gia tăng. Vì vậy, việc nghiên cứu khảo sát hệ vi
sinh vật trong quá trình lên men hạt ca cao, từ đó ứng dụng vào quá trình lên men
nhằm ổn định chất lượng của hạt ca cao sau lên men là vấn đề cần thiết và có ý

nghĩa quan trọng.
Xuất phát từ thực tiễn trên, dưới sự hướng dẫn của TS. Mai Thị Tuyết Nga
và TS. Nguyễn Minh Trí, tôi đề xuất được thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phân lập
hệ vi sinh vật chủ yếu trong quá trình lên men tự nhiên hạt ca cao”.

2

2. Mục đích của đề tài
Nghiên cứu hệ vi sinh vật chính tham gia vào quá trình lên men tự nhiên hạt
ca cao, phân lập và định danh chúng.
3. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu phân lập, định danh các chủng vi sinh vật chính trong quá trình
lên men tự nhiên hạt ca cao:
 Nghiên cứu phân lập và định danh các chủng nấm men chủ yếu
(chiếm ưu thế).
 Nghiên cứu phân lập và định danh các chủng vi khuẩn lactic chủ yếu
(chiếm ưu thế).
 Nghiên cứu phân lập và định danh các chủng vi khuẩn acetic chủ yếu
(chiếm ưu thế).
4. Tính khoa học và thực tiễn của đề tài
- Đề tài sẽ cung cấp dẫn liệu khoa học về hệ vi sinh vật chính trong lên men tự
nhiên hạt ca cao ở Việt Nam.
- Đề tài cũng là bước khởi đầu phục vụ cho quá trình nghiên cứu chuyên sâu
về lĩnh vực này.

3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN
1. Tổng quan về ca cao.
1.1. Tên khoa học

Giới: Plantae-Plants
Phân giới: Tracheobionta-Vascular plants
Nhóm: Magnoliophyta-Flowering plants
Lớp: Magnoliopsida-Dicotyledons
Phân lớp: Dilleniidae
Bộ: Malvales
Chi: Theobroma L. - Theobroma
Loài: Theobroma cacao L. – Cacao
(National Plant Database. 2004.) [45]
1.2. Đặc điểm, hình dạng của cây và quả ca cao.
Cây ca cao là loại cây rừng có nguồn gốc từ Châu Mỹ. Nó là loại cây đa
niên, chịu mát nhưng thích hợp với khí hậu nhiệt đới, các nước trồng nhiều như: Bờ
biển Ngà, Ghana, Nigeria, Ecuador, Brazil, Malaysia, Philippines, đây là những
quốc gia nằm gần vùng xích đạo.
Ca cao là cây có tán thuộc tầng trung bình, rễ chùm, sống dưới bóng những
cây cổ thụ già, chiều cao của nó có thể đến 11 m. Ca cao thích hợp với đất mùn xốp,
có mạch nước ngầm không quá sâu, độ cao không nên quá 700 m so với mực nước
biển. Nó là loại cây khá nhạy cảm với sự thay đổi đột ngột của nhiệt độ. Nhiệt độ lý
tưởng cho sự phát triển của cây ca cao là ban đêm không dưới 20 °C, ban ngày
khoảng 30 °C. Khi nhiệt độ xuống dưới 16 °C có thể dẫn tới tình trạng các mầm nụ
non bị hư, gây mất mùa, thất thu.
Cây có thể sống tới 15-20 năm, sau 3 năm cây bắt đầu ra hoa, kết trái và cho
trái quanh năm. Ca cao ra trái trực tiếp từ thân hoặc từ những cành lớn, sản lượng
đạt cao nhất khi cây khoảng 9-10 tuổi, trung bình mỗi cây cho khoảng 20- 30 trái /
năm. Năm được mùa có thể đến 50 trái / năm.
Trái ca cao khi chưa chín có màu xanh, khi chín có màu vàng, Dáng bầu dục
thuôn dài, có chiều dài khoảng 15 tới 25 cm và đường kính khoảng từ 7-10 cm.
Trong mỗi trái có 5 dãy hạt mỗi dãy khoảng 25 tới 50 hạt (mỗi hạt khô nặng khoảng

4

1gram). Như thế tính trung bình mỗi năm cây có thể mang lại 3-4 kg / năm. Nếu
thời tiết thuận lợi cây có thể cho 5-7 kg / năm.




Hình 1.1 Cây ca cao, quả ca cao
Việc thu hoạch ca cao cũng cần sự khéo léo và cẩn thận vì nếu thu hoạch không
cẩn thận có thể làm ảnh hưởng và rơi rụng những nụ non đang nhú ra từ thân cây.
Trái ca cao sau thu hoạch sẽ được bổ ra để tách hạt phục vụ cho quá trình lên men.
1.3. Các giống ca cao.
Có 3 giống ca cao chính là Criollo, Forastero và Trinitario. Criollo là giống
cho hương vị đặc biệt, hạt ca cao Criollo thường được dùng để pha trộn vào các loại
ca cao khác khi chế biến, hoặc để dùng làm nguyên liệu để sản xuất ra những loại
chocolate đặc biệt. Tuy nhiên Criollo thường hay bị bệnh tật tấn công, loại ca cao
này ngày nay được trồng rất ít trên thế giới.
Forastero cho năng suất cao nên được trồng rộng rãi. Ngày nay 80% ca cao
trên thế giới được trồng là ca cao Forastero.

5

Trinitario là giống mới được cấy ghép giữa Criollo và Forastero, nó có mùi
thơm đặc biệt của Criollo và sản lượng cũng như khả năng chống chịu sâu bệnh của
Forastero. Tuy nhiên do nó là giống mới nên sản lượng trên thị trường thế giới còn
ít [36, 39, 40, 41].
Ở Việt Nam, tính đến nay thì Viện khoa học kỹ thuật nông lâm nghiệp Tây
Nguyên đã có khoảng trên hơn 60 giống ca cao, trong đó đã chọn được một số
giống cho năng suất cao có nhiều triển vọng. Thời gian sinh trưởng của cây có thể
kéo dài từ 25-40 năm, thích nghi ở nhiệt độ 30-32

0
C, tối thiểu 18-21
0
C, độ ẩm
thích hợp từ 70-80%. Cây có thể phát triển trên nhiều loại đất khác nhau: đất triền
dốc, đất cát, phù sa ven sông, nghèo dinh dưỡng nhưng có bóng che và nguồn nước,
độ pH từ 5-8, tối ưu khoảng 5,5-6,7. Được trồng phổ biến ở các vùng Tây Nguyên,
duyên hải miền Trung, Đông Nam Bộ và một số tỉnh của miền Tây Nam Bộ. Có
thời vụ trồng từ đầu đến giữa mùa mưa. Thời gian thu hoạch chính vào 2 đợt là
tháng 11-12 và tháng 3-4 năm sau. Một số giống được trồng phổ biến ở Việt Nam
như giống CCL-01, CCL-03, CCL-05, CCL-06, CCL-07, CCL-09, CCL-10. Mỗi
giống có đặc điểm hình thái khác nhau nhưng nhìn chung chúng đều có khả năng
sinh trưởng mạnh, cho năng suất cao và có khả năng kháng được bệnh thối quả tốt.
Trong đó giống CCL-10 có năng suất cao nhất đạt 5,14 kg hạt khô / cây; 5,65 tấn
hạt khô / ha và có khả năng kháng bệnh thối quả cao [41].
1.4. Tình hình trồng ca cao ở Việt Nam
Ở nước ta, cây ca cao được trồng giới thiệu vào một số vùng miền nam Việt
Nam từ đầu những năm 1950, cho đến nay đã trở thành cây trồng quen thuộc và
đem lại lợi ích kinh tế cao cho người nông dân. Theo Bộ NN&PTNT, hiện nay cây
ca cao đã được trồng tại 15 tỉnh thành trên cả nước, với tổng diện tích khoảng
21.100 ha [4]. Diện tích ca cao trồng nhiều nhất ở khu vực phía Nam, trong đó
Đồng bằng sông Cửu Long chiếm trên 50% tổng diện tích (khoảng 12.100 ha) với
năng suất bình quân hơn 7 tạ hạt/ha.
Theo kế hoạch của Chính phủ, đến năm 2020, Việt Nam sẽ có khoảng 80.000
ha ca cao, trong đó có 60.000 ha kinh doanh, đạt năng suất bình quân 18 tạ/ha, sản
lượng khô 108.000 tấn, hạt ca cao xuất khẩu đạt 86.000 tấn / năm và kim ngạch xuất
khẩu đạt 100-120 triệu USD / năm [38], và trở thành quốc gia hàng đầu trên thị

6

trường xuất khẩu sản phẩm này. Lâm Đồng sẽ là một mắt xích quan trọng trong
“bản đồ ca cao” của cả nước với quy mô vùng nguyên liệu là 4.000 ha vào năm
2015 và tiến tới 5.000 ha vào năm 2020.
Năm 2011, dự án trồng và thâm canh cây ca cao đã ký hợp đồng với 12
Trung tâm Khuyến nông các tỉnh: Gia Lai, Đăk Lăk, Đăk Nông, Lâm Đồng, Bình
Thuận, Đồng Nai, Bình Phước, Bà Rịa – Vũng Tàu, Tiền Giang, Vĩnh Long, Trà
Vinh và Bến Tre. Kết quả năm 2011, mô hình đạt quy mô 220 ha. Trong năm 2012,
dự án sẽ triển khai trồng mới 59 ha tại: Lâm Đồng 15 ha, Gia Lai 17 ha, Đăk Nông
10 ha và Bình phước 17 ha. Tuy nhiên bước đầu triển khai dự án còn gặp nhiều khó
khăn [43].
Thời gian gần đây, thị trường tiêu thụ của cây cao ngày càng rộng mở với
hàng chục doanh nghiệp trong và ngoài nước chế biến ca cao xuất khẩu với giá thu
mua ca cao hạt cho bà con nông dân trên 50.000 đồng / kg. Trong năm 2011, cả
nước đã xuất khẩu được 240 tấn hạt ca cao, đạt kim ngạch xuất khẩu 520.000 USD.
Nhiều điểm sơ chế và thu mua hạt ca cao (trái tươi và hạt khô) phát triển nhanh
chóng tại các vùng trồng ca cao [36,37,38,39,40,41].
2. Tổng quan về phương pháp lên men ca cao
Có một số phương pháp lên men như: lên men trên nền khô, lên men thành
đống, lên men trong rổ, lên men trong thùng.
2.1. Lên men trên nền khô [21]
Là phương pháp lên men chủ yếu ở Trung Mỹ, ở vùng này giống ca cao
được trồng phổ biến là Criollo. Hạt ca cao ẩm được làm khô trực tiếp trên nền.
Chúng được lên men và làm khô trong cả ngày. Để hạt ca cao Criollo lên men, hình
thành và phát triển hương vị thì cần thời gian từ 2-3 ngày. Đối với hạt Forastero thì
thời gian lên men cần để hình thành và phát triển hương vị khoảng từ 5-8 ngày. Mặc
dù giống Criollo được thay thế một lượng lớn bằng giống cây trồng lai tạo với
Forastero nhưng phương pháp lên men này vẫn tồn tại. Phương pháp lên men này
tạo hương vị tốt cho hạt Criollo nhưng nó không phù hợp với giống Forastero,
giống này cần thời gian lên men dài hơn để hương vị có thể phát triển tốt nhất.

7

Phương pháp lên men này thuận tiện, tuy nhiên có một số bất lợi như chúng tạo điều
kiện cho nấm mốc nguy hiểm lây nhiễm, phát triển và tạo ra các hương vị không
mong muốn.

Hình 1.2 Lên men ca cao bằng khay

2.2. Lên men thành đống [21]
Là một phương pháp lên men phổ biến ở Ghana và một số nước trồng ca cao
khác ở châu Phi, thỉnh thoảng phương pháp này được áp dụng ở vùng Amazon của
Brazil. Phương pháp này không yêu cầu vị trí lên men cố định, nó phù hợp cho lên
men theo qui mô nhỏ ở hộ gia đình. Lên men thành đống thường cho hạt ca cao chất
lượng cao. Đống lên men dao động trong khoảng từ 25 kg đến 1000 kg. Trên mỗi
đống lên men được phủ kín bằng lá chuối, khối lên men được kiểm tra định kỳ để
đảm bảo chất lượng và hạn chế sự phát triển của nấm mốc. Thời gian lên men của
phương pháp này từ 4-7 ngày.

Hình 1.3 Lên men thành đống


8

2.3. Lên men trong rổ [21]
Được sử dụng chủ yếu ở Nigeria, vùng Amazon, Philippines và một số vùng
của Ghana. Ca cao được đựng trong các rổ rồi phủ lá lên để lên men. Bề mặt của rổ
được bao phủ bởi lớp lá chuối. Quá trình lên men cũng xảy ra tương tự như đối với
lên men các đống nhỏ, với phương pháp này, không nên sử dụng với khối lượng hạt
nhỏ hơn 25 kg.

Hình 1.4 Lên men trong rổ
2.4. Lên men trong thùng [21]
Phương pháp này cải tiến hơn các phương pháp khác. Nó được sử dụng cho
các khu vực có diện tích trồng ca cao lớn do lượng ca cao sử dụng trong lên men
phải lớn và ổn định. Mặc dù kích thước của các thùng lên men có khác nhau nhưng
chúng đều được thiết kế theo một tiêu chuẩn chung.
Thùng lên men có thể riêng lẻ cũng có thể được thiết kế thành hình chữ nhật
lớn, sau đó chúng được chia thành các ngăn nhỏ với diện tích khoảng 1 x 1 m. Ở
các kích thước khác nhau thì lượng ca cao lên men chứa trong thùng khác nhau.
Mỗi thùng lên men chứa khoảng từ 600 kg đến 700 kg hạt ca cao tươi. Các
thùng lên men được đặt bên trên, phía dưới có các rãnh cho phép dịch cơm nhầy bị
phân giải sau lên men thoát ra ngoài.
Thùng lên men được làm từ các tấm gỗ ghép lại, chúng có các lỗ hoặc các
rãnh giữa các tấm ván để nước dễ dàng rút đồng thời cho không khí lưu thông.
Thông thường người ta sử dụng kết hợp các thùng lên men nhỏ (0,4 x 0,4 m
hoặc 0,4 x 0,5 m) với nhau tạo thành một dãy từ 20 đến 30 thùng, và xếp thành 3
đến 5 dãy theo hình bậc thang. Đến thời gian đảo hạt người ta chỉ mở nắp thùng và

9

làm hạt từ thùng bên trên rơi xuống dãy thùng bên dưới, phương pháp này đảm bảo
cho không khí di chuyển vào bên trong khối hạt được đều hơn.

Hình 1.5: Lên men ca cao bằng thùng
Lượng hạt chứa trong các thùng lên men phải cách đỉnh thùng ít nhất 10 cm
và được che phủ bằng lá chuối hoặc bao tải giúp cho nhiệt của khối lên men không
thoát ra ngoài và ngăn chặn hiện tượng bề mặt khối lên men bị khô.
Ở Malaysia, quả ca cao sau khi thu hoạch được bảo quản 15 ngày để ổn định
thành phần trước khi tách hạt để lên men. Quá trình lên men quyết định đến hương
thơm, sự thay đổi màu sắc bên ngoài và bên trong hạt. Khi quá trình này kết thúc,

hạt được phơi khô hoặc sấy khô.
3. Tổng quan về vi sinh vật trong lên men ca cao.
Quá trình lên men bắt đầu ngay khi hạt được tách ra khỏi trái ca cao, rất
nhiều loại vi sinh vật từ bề mặt trái ca cao, dao, găng tay, các xô chứa hạt sau khi
tách, từ bề mặt thùng (khay, nền khô, hoặc rổ) lên men và từ lá chuối. Sau khi vi
sinh vật xâm nhập, chúng tiến hành lên men cơm nhầy khối hạt và làm thay đổi
thành phần khối hạt. Cơm nhầy của hạt chưa khoảng 85% nước, 2,7% pentosans,
0,7% saccarose, 10% glucose và fructose, 0,6% protein, 0,7% acid và 0,8% muối
vô cơ, chúng là một môi trường giàu chất dinh dưỡng cho vi sinh vật phát triển [21].
Lên men hạt là công đoạn đầu tiên trong sản xuất chocolate. Có rất nhiều vi
sinh vật tham gia vào quá trình lên men ca cao, tuy nhiên các nhóm vi sinh xuyên
suốt trong quá trình lên men hạt ca cao là nấm men, vi khuẩn sinh acid lactic, vi
khuẩn sinh acid acetic [21]. Điều kiện khí hậu ảnh hưởng đến chủng loại vi sinh vật
trong quá trình lên men [27].

10

Theo nghiên cứu xác định loài vi sinh vật trong lên men ca cao ở phía Đông
Java, Indonesia (giống Criollo và Trinitario), trong 2-3 ngày đầu của quá trình lên
men các loài vi sinh vật khác nhau thuộc các nhóm nấm men, vi khuẩn sinh acid
lactic, vi khuẩn sinh acid acetic được tìm thấy như Kloeckera apis, Saccharomyces
cerevisiae, Lactobacillus cellobiosus, Lactobacillus plantarum và Acetobacter
pasteurianus [23].
Dưới đây là một số loài vi sinh vật được tìm thấy trong quá trình lên men ca
cao ở một số nước như Ghana, Malaysia, Beleze [18].
Bảng 1.1: Các loài vi sinh vật phân lập được từ quá trình lên men ca cao [20]
Quốc gia Vi sinh
vật
Ghana
a

Malaysia
a
Belize
b

Vi
khuẩn
lactic
Lactobacillus
plantarum
Lactobacillus mali
Lactobacillus
collinoides
Lactobacillus
fermentum
Lactobacillus
plantarum
Lactobacillus
collinoides
Lactobacillus plantarum
Lactobacillus fermentum
Lactobacillus brevis
Lactobacillus buchneri
Lactobacillus cellobiosus

Lactobacillus casei
subsp. pseudoplantarum
Lactobacillus delbrueckii

Lactobacillus

fructivorans
Lactobacillus kvàleri
Lactobacillus gasseri
Leuconostoc
messenteroides
Leuconostoc
paramesenteroides
Leuconostoc oenos
Vi
khuẩn
sinh
Acetobacter rancens
Acetobacter
ascendens
Acetobacter
rancens
Acetobacter
Acetobacter spp.
Gluconobater oxydans

11

acid
acetic
Acetobacter xylinum
Gluconobater
oxydans
lovaniensis
Acetobacter
xylinum

Gluconobater
oxydans
Nấm
men
Candida spp.
Hansenula spp.
Kloeckera spp.
Pichia spp.
Sacharomyces spp.
Sacharomycopsis
spp.
Schizosacharomyces
spp.
Torulopsis spp.
Candida spp.
Debaryomyces
spp.
Hanseniaspora
spp.
Hansenula spp.
Kloeckera spp.
Rhodotorula spp.
Sacharomyces spp.
Torulopsis spp.
Brettanomyces claussenii

Candida spp.
Candida boidinii
Candida cocoai
Candida intermedia

Candida guilliermondii
Candida krusei
Candida reukaufii
Kloeckera javanica
Pichia
membranaefaciens
Sacharomyces cerevisiea
Sacharomyces chevalieri
Sacharomyces spp
Schizosascharomyces
malidevorans
a
: Nguồn: Carr và cộng sự

b
: Nguồn: S.S Thompson và Pfeifer, số liệu chưa công bố
3.1. Nấm men
Theo nghiên cứu của nhóm tác giả Nguyễn Thị Hoài Trâm, Trần Xuân
Ngạch, Lê Thị Liên Thanh, Trường Đại Học Kỹ Thuật, Đại Học Đà Nẵng về
“Nghiên cứu phân lập và định tên một số nòi nấm men trong quá trình lên men hạt
ca cao”, sau khi dựa vào đặc điểm hình thái, đặc điểm nuôi cấy, sinh lý của khuẩn
lạc và tế bào nấm men rồi so sánh với khóa phân loại nấm men, nhóm tác giả đã dự
đoán tên của 4 loài nấm men phân lập được như sau Hansenia spora uvarum,
Galactomyces reessii, Candida sorboxylosa, Candida fructus [7].

12

Theo Nielsen và cộng sự, nấm men có mặt ngay trong giai đoạn đầu của quá
trình lên men. Từ số lượng ban đầu tính theo log (CFU/g) = 6,07-7,45 sau 12 h số
lượng nấm men tăng lên log (CFU / g) = 7,24-8,03 [9]. Trong khi theo Ardhana &

Fleet, số lượng tế bào nấm men lúc đầu là 10
4
-10
5
CFU/g, và sau 24-36 h lên men
chúng phát triển đến số lượng cực đại là 10
7
-10
8
CFU/g, sau đó số lượng bị giảm
nhưng vẫn duy trì cho đến khi quá trình lên men kết thúc [17].
Theo Luc De Vuyst và cộng sự, nấm men có mặt trong suốt giai đoạn đầu
của quá trình lên men (24 - 48 h lên men) [16]. Đối với lên men đống, số lượng tế
bào nấm men đếm được tối đa là 9,1×10
7
. Một số loài chiếm ưu thế trong phương
pháp lên men này là Candida krusei, P. membranifaciens, P. kluyveri,
Hanseniaspora guilliermondii và Trichosporon asahii [13].
Theo Nielsen và cộng sự và Ardhana & Fleet (2003), trong 24 h đầu thì H.
guilliermondii là loài chiếm ưu thế. Sau đó, thỉnh thoảng mới thấy sự có mặt của H.
guilliermondii, còn Candida zemplinina (Sipiczki, 2003) được tìm thấy trong suốt
quá trình lên men.
Theo Ardhana & Fleet nghiên cứu hệ vi sinh vật trong lên men ca cao ở
Indonesia cho thấy trong 24-36 h đầu Kloeckera apis là loài chiếm ưu thế (chiếm
70-90% tổng số nấm men trong suốt giai đoạn đầu), sau đó nó giảm xuống nhanh
chóng. Sau Kloeckera apis, là Saccharomyces cerevisiae và Candida tropicalis,
chúng có vai trò quan trọng trong quá trình lên men. Các loài nấm men này phát
triển mạnh ở giai đoạn đầu và chiếm ưu thế trong suốt giai đoạn sau của quá trình
lên men (48-120 h) [23].
Theo các nghiên cứu trên cho thấy ở mỗi nghiên cứu khác nhau thì thời điểm

phát triển cũng như các loài vi sinh vật khác nhau. Điều này chứng tỏ sự đa dạng và
phong phú về chủng loại vi sinh, cũng như sự khác nhau về thời điểm xuất hiện.
Bảng 2 sẽ thể hiện sự khác nhau đó

13

Bảng 1.2: Các loài vi sinh vật trong lên men hạt ca cao [35]
Giờ lên men
Vi sinh vật
0 24 48 72 96 120

144
Nấm men


Candida inconspicua
+ + + + + + +
Hanseniaspora guillermondii
+ + + - - - -
Pichia fermentans
+ - + + - - -
Y
arr
owia
lipolytica
- + + + - - -
Candida zeylanoide
- + + - - - -
Vi khuẩn lactic

Lactobacillus plantarum hay
Lactobacillus
paraplantarum

- + + + + + +
Lactobacillus pentosus
- + + + + - -
Lactobacillus paracasei subsp.
paracasei

- - + + + + +
Lactobacillus brevis
- - + + + - -
Vi khuẩn sinh acid acetic


Acetobacter lovaniensis
- - + + - - -

Trong một số nghiên cứu về điều kiện phát triển của nấm men thì theo Doyle
và cộng sự, chủng S.cerevisiae có khả năng phát triển ở nhiệt độ 40
0
C, Kloeckera
apis phát triển ở 37
0
C và phát triển yếu ở 40
0
C. Tất cả các chủng S. cerevisiae và
các loài nấm khác phát triển tốt trong môi trường có ethanol từ 7% đến 10%. Các

loài Kloeckera phát triển được ở ethanol 5%, nhưng không phát triển được ở nồng
độ cao hơn [21].
Theo Gálvez và cộng sự thì trong 43 chủng nấm men phân lập được thuộc
các chi Candida, Hanseniaspora, Pichia và Yarrowia. Các loài khác nhau thì có vai
trò khác nhau như loài Candida insconspicua được chứng minh là có khả năng đồng
hóa acid lactic. Các loài Hanseniaspora guillermondii lên men đường tạo thành
ethanol. Đa số các loài nấm men phân lập được đều có thể đồng hóa ethanol. Các
loài Pichia fermentans fermentans var, Yarrowia lipolytica và chủng nấm men

14

Candida có vai trò thủy phân (Carr, 1982; Cascante và cộng sự, 1994; Schwan,
1997) [34].
Nấm men chuyển hóa đường (saccarose, glucose, và / hoặc fructose) tạo
thành rượu (ethanol) trong điều kiện nồng độ carbohydrate cao (điều kiện đặc trưng
của khối hạt ca cao tươi), oxy hạn chế (do quá trình lên men được ủ đậy kín) và độ
pH dưới 4,0 (do acid citric trong khối hạt ca cao cao). Ban đầu số lượng chúng chỉ
2-7 và phát triển đến mức tối đa là 7-9 log CFU/g ca cao lên men. Dưới tác dụng
của enzyme invertase, saccarose còn lại được tạo thành glucose, fructose, và 18,8 kJ
nhiệt/1 mol saccarose được thủy phân. Tuy nhiên, nồng độ saccarose phụ thuộc vào
độ chín của quả và hoạt động của invertase. Hơn nữa, glucose được chuyển hóa
thành ethanol bằng cách lên men kỵ khí, để lại một phần lớn fructose chưa lên men
[18].
Nồng độ ethanol khoảng 2,5% là kết quả của quá trình lên men dưới tác dụng
của nấm men. Ethanol tạo thành đi kèm với sự gia tăng nhiệt độ ở mức độ vừa phải
do có quá trình tỏa nhiệt khi chuyển đổi đường thành ethanol (và carbon dioxide),
nhiệt độ của khối lên men tăng từ 25 – 30 °C đến 35 – 40 °C trong vòng 48 giờ.
Ethanol biến mất khi xuất hiện quá trình oxy hóa ethanol thành acid acetic dưới tác
dụng của vi khuẩn acetic, sản phẩm hình thành trong quá trình lên men khuếch tán
vào lá mầm, làm nóng hạt, và bay hơi [18].

Bên cạnh ethanol, nấm men còn sinh ra các sản phẩm khác như acid acetic,
acid malic, và acid succinic, chúng tạo nên một hệ đệm trong cơm nhầy ca cao.
Cũng như rượu, các acid béo và các este acid béo, chúng góp phần tạo nên hương
vị, các hợp chất tiền sinh hương của ca cao (Schwan và Wheals, 2004). Bên cạnh
đó, hoạt động của nấm men là nguyên nhân làm giảm độ nhớt và làm thoát nước
của khối ca cao lên men do chúng tiết ra các enzyme pectin làm phá vỡ cấu trúc
cơm nhầy (Gauthier và cộng sự 1977; Sanchez và cộng sự 1984, 1985; Schwan và
cộng sự 1995, 1997; Ardhana & Fleet 2003; Jespersen và cộng sự 2005). Khoảng
trống được tạo thành giữa các hạt do cơm của khối hạt bị lên men tạo điều kiện cho
không khí xâm nhập vào bên trong, thúc đẩy sự phát triển của vi khuẩn acetic và vi
khuẩn lactic.


15

3.2. Vi khuẩn acetic
Vi khuẩn acetic hoạt động trong khoảng từ 24 đến 112 h của quá trình lên
men. Quá trình này là quá trình lên men hiếu khí, nó xảy ra từ giai đoạn đầu của quá
trình lên men và tiếp tục kéo dài trong những giai đoạn sau cho đến khi kết thúc, khi
đó điều kiện cho hoạt động của vi khuẩn acetic là tối ưu nhất. Khi một lượng lớn
cơm nhầy được chuyển hóa và lượng nước mất đi cũng lớn, không khí bên trong
khối hạt tăng lên, và khi nhiệt độ tăng trên 37 °C, vi khuẩn acetic chịu nhiệt phát
triển với số lượng ban đầu từ 3-5 tăng lên tối đa là 5-8 log (CFU / g) ca cao lên men
[18].
Theo Nielsen và cộng sự thì thỉnh thoảng vi khuẩn acetic được tìm thấy trong
12 h đầu của quá trình lên men. Từ 24 h trở đi vi khuẩn acetic phát triển với một số
lượng lớn và sau 36-48 h lên men, số lượng của chúng đạt log (CFU / g) = 7,7-7,8,
ở những giai đoạn sau số lượng của chúng giảm.
Bên cạnh đó theo nghiên cứu quá trình lên men ca cao ở Indonesia cho thấy
trong 12 h đầu của quá trình lên men số lượng vi khuẩn acetic đạt tối đa là 10

5
-10
6

CFU/g (Ardhana & Fleet, 2003) [10]. Tuy nhiên, theo một số tài liệu thì ban đầu số
lượng vi khuẩn acetic là 10
3
-10
4
CFU / g, trong quá trình lên men số lượng chúng
tăng lên 10
6
-10
7
CFU / g (Lopez, 1972; Samah và cộng sự, 1993; Schwan, 1998)
[21].
Ở vùng Trinidad, người ta thấy vi khuẩn sinh acid acetic chiếm khoảng 80-
90% tổng số vi sinh vật sau 2 ngày lên men ca cao [20]. Theo báo cáo của Carret và
cộng sự (1979) vi khuẩn acetic là một trong những vi sinh vật đặc biệt quan trọng
trong việc lưu thông khí bên trong khối lên men, chúng có vai trò oxy hóa ethanol
do nấm men sản xuất ra để tạo thành acid acetic [19]. Một số loài vi khuẩn acetic
được phân lập như Glucononbacter oxydans, Acetobacter aceti và Acetobacter
pasteurianus nhưng chưa có thông tin xác định sự sinh trưởng, phát triển của loài
này (Carret và cộng sự, 1979; Carr & Davies, 1980; Ardhana & Fleet, 2003) [12].
Theo các thử nghiệm của Frateur, tất cả các chủng phân lập được đều thuộc
loài Acetobacter lovaniensis, chúng chuyển hóa ethanol tạo acid acetic, sau đó có
thể dùng acid acetic để tạo CO
2
và H
2

O. Trong đó loài A. lovaniensis là loài duy
nhất được phân lập có khả năng oxy hóa acid acetic [34].

16

Vi khuẩn acetic có vai trò quan trọng đối với chất lượng hạt ca cao sau lên
men. Nó chuyển hóa đường và acid hữu cơ tạo thành các aldehyde, ceton và các sản
phẩm dễ bay hơi khác (Drysdale và Fleet, 1988), nó tạo ra hương thơm đặc trưng
cho hạt sau lên men (Bainbridge và Davies, 1912; Knapp, 1937; Roelofsen và Gies
Berger-, 1947) [12]. Tuy nhiên nó cũng có thể gây ảnh hưởng đến chất lượng cảm
quan của hạt [20].
Hoạt động chính của vi khuẩn acetic là oxy hóa ethanol tạo thành acid acetic.
Quá trình oxy hóa này tạo ra một lượng lớn nhiệt (khoảng 496 kJ/mol ethanol bị
oxy hóa), quá trình này chủ yếu làm tăng nhiệt độ của khối lên men, có thể đạt 45-
50 °C hoặc cao hơn [18], hạn chế được sự phát triển của nhiều loại vi sinh vật khác
[20]. Nồng độ ethanol giảm đi kèm với sự giảm nồng độ acid lactic, cho thấy quá
trình oxy hóa đồng thời ethanol tạo acid acetic và acid lactic chuyển hóa thành CO
2

và nước. Nồng độ acid acetic ở mức cao nhất khoảng 2%, sau đó chúng giảm có thể
là do nhiệt độ của khối lên men cao làm acid acetic chuyển thành CO
2
, nước và
nhiệt lượng (1754 kJ/mol acid acetic được oxy hóa). Ngoài ra quá trình oxy hóa
acid acetic và acid lactic còn làm pH của khối lên men tăng [18].
Khi ethanol đã bị oxy hóa hoàn toàn để tạo thành acid acetic, CO
2
, H
2
O thì

quá trình lên men lắng xuống và nhiệt độ của khối lên men cũng giảm xuống một
cách nhanh chóng [20].
Trong quá trình lên men có đảo trộn khối lên men, việc đảo hạt này tạo điều
kiện cho vi khuẩn acetic phát triển (số lượng tế bào, nồng độ acid acetic) và tăng
nhiệt độ của khối lên men (Carr và cộng sự1979;. Nielsen và cộng sự 2007a; Camu
và cộng sự 2008a). Bên cạnh đó, đối với khối lên men nhỏ việc đảo trộn này làm
nồng độ acid acetic tăng quá cao, kết quả là hạt ca cao sau lên men có chứa một
lượng lớn acid acetic, chúng làm vị chua trong chocolate tăng lên (Camu và cộng sự
2008a, 2008b.) [16].
3.3. Vi khuẩn lactic
Nấm men tiếp tục hoạt động sinh ethanol và làm phân hủy cơm nhầy của
khối hạt, tạo điều kiện cho không khí đi vào bên trong khối hạt lớn hơn. Nhiệt độ và
pH của khối hạt lên men tăng lên đến 40 °C và pH tăng lên khoảng 4,0. Đây là
những điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của vi khuẩn lactic. Vi khuẩn lactic có
mặt từ giai đoạn đầu của quá trình lên men, phát triển một cách nhanh chóng từ 3-5