tóm tắt luận án tiên sĩ nghiên cứu tổng hợp một số tác nhân quang hoạt từ β-cyclodextrin để ứng dụng trong phân tích các chất quang hoạt bằng phương pháp điện di mao quản

1
GIỚI THIỆU LUẬN ÁN
1. Đặt vấn đề
Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu tổng hợp các dẫn
chất

-CD được công bố sau khi tìm thấy ứng dụng của các dẫn
chất này trong nhiều lónh vực như bào chế dược phẩm, trong phân
tích các chất quang hoạt bằng các phương pháp GC, HPLC, CE,
….Trong lónh vực tách đồng phân cũng có nhiều công trình nghiên
cứu ứng dụng phương pháp CE với các kỹ thuật CZE, MEKC, ….và
tác nhân quang hoạt thường dùng là các dạng , , -CD tự nhiên
hay một số tác nhân quang hoạt chuyên biệt cho các dạng đồng
phân, thường là các dẫn chất cyclodextrin. Đề tài “Nghiên cứu
tổng hợp một số tác nhân quang hoạt từ beta-cyclodextrin để ứng
dụng trong phân tích các chất quang hoạt bằng phương pháp điện
di mao quản” được thực hiện với các nội dung nghiên cứu sau:
- Tổng hợp ở qui mô phòng thí nghiệm và tiêu chuẩn hóa hai tác
nhân quang hoạt từ

-cyclodextrin là 2-O-(2-hydroxypropyl)-

-
cyclodextrin và 2-O-(2-hydroxybutyl)-

-cyclodextrin.
- Ứng dụng các tác nhân quang hoạt tổng hợp để phân tích một số
chế phẩm chứa dược chất quang hoạt bằng phương pháp điện di
mao quản.
2. Tính cấp thiết của đề tài

Do một số dạng đồng phân quang học của một số hoạt chất có
hoạt tính mạnh và ít tác dụng phụ, nên hiện nay ngành công
nghiệp dược phẩm đã và đang nghiên cứu đưa ra thò trường nhiều
chế phẩm của các dạng đồng phân riêng lẻ. Để phân biệt các
dạng đồng phân là một điều khó khăn nên việc phân tách các
đồng phân quang học ngày càng trở thành vấn đề quan trọng trong
lónh vực kiểm nghiệm dược phẩm. Trong các chuyên luận của

2
Dược điển (HPLC, GC), để tách các dạng đồng phân đòi hỏi phải
có các cột sắc ký chuyên biệt rất đắt tiền. Đây là một trở ngại đối
với các nhà phân tích, nhất là trong điều kiện còn nhiều khó khăn
ở các phòng thí nghiệm nước ta.
CE là kỹ thuật rất hiệu quả trong lónh vực phân tích đồng phân
quang học, hiện nay đang được phát triển ở các nước trên thế giới,
nhưng tại Việt Nam phương pháp này chưa được phổ biến rộng,
đặc biệt trong lónh vực tách đồng phân cũng chưa được nghiên cứu
và phát triển.
Trong phân tích các đồng phân quang học, tác nhân quang hoạt là
yếu tố quyết đònh khả năng tách. Hiện nay, xu hướng của các nhà
nghiên cứu là đi từ tác nhân phổ biến nhất là

-CD (tính chọn lọc
cao và giá thành rẻ hơn các dạng

-CD và

-CD) để tổng hợp ra
nhiều tác nhân tách đồng phân chuyên biệt có tính chọn lọc cao
hơn, tan dễ dàng trong các dung môi, giá thành rẻ nhằm tạo điều

kiện thuận lợi cho các nhà phân tích trong việc lựa chọn tác nhân
tách đồng phân thích hợp trong điều kiện số lượng tác nhân quang
hoạt được thương mại hóa còn rất ít.
Nghiên cứu của đề tài với mong muốn phát triển kỹ thuật điện di
mao quản và góp phần ứng dụng kỹ thuật này vào việc phân tích
các đồng phân quang học, nhằm tạo điều kiện thuận lợi trong việc
kiểm tra chất lượng các thuốc chứa hoạt chất có tính quang hoạt.
3. Những đóng góp mới của luận án
- Đã xây dựng được quy trình tổng hợpï tác nhân quang hoạt 2-O-
(2-hydroxypropyl)-

-CD với hiệu suất 62,7%; độ thế trung bình
khoảng 6,3 và độ tinh khiết > 97%.
- Đã xây dựng được quy trình tổng hợp tác nhân quang hoạt 2-O-
(2-hydroxybutyl)-

-CD với hiệu suất 61,5%; độ thế trung bình
khoảng 5,3 và độ tinh khiết > 97%.

3
- Đã tiêu chuẩn hóa hai sản phẩm 2-O-(2-hydroxypropyl)-

-CD
và 2-O-(2-hydroxybutyl)-

-CD. Trong đó, 2-O-(2-hydroxybutyl)-

-
CD hiện nay chưa được thương mại hóa.
- Cung cấp đđầy đđủ các dữ liệu phổ NMR để giúp biện giải và xác

đònh chắc chắn cấu trúc của 2-O-(2-hydroxypropyl)-

-CD và 2-O-
(2-hydroxybutyl)-

-CD. Cho đến nay, trong nước chưa có một
công trình nghiên cứu tổng hợp nào về hai chất này được công bố.
- Đã ứng dụng hai tác nhân quang hoạt 2-O-(2-hydroxypropyl)-

-
CD và 2-O-(2-hydroxybutyl)-

-CD để xây dựng thành công các
quy trình tách các đồng phân quang học của 7 dược chất quang
hoạt (amlodipin, nefopam, propranolol, ofloxacin, ketoconazol,
miconazol, promethazin) bằng phương pháp điện di mao quản. Tất
cả quy trình đều được khảo sát đầy đủ và chi tiết tất cả các yếu tố
ảnh hưởng đến khả năng tách đồng phân.
4. Bố cục của luận án
Luận án gồm: 122 trang, đặt vấn đề 3 trang, tổng quan 21 trang,
đối tượng và phương pháp 13 trang, kết quả 49 trang, bàn luận 31
trang, kết luận và đề nghò 4 trang, những đóng góp mới của luận
án 1 trang. Luận án có 42 bảng, 103 hình, 3 sơ đồ, 100 tài liệu
tham khảo (5 tiếng Việt, 95 tiếng Anh), và 93 phụ lục.
NỘI DUNG LUẬN ÁN
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
Trình bày những vấn đề sau:
1.1. Giới thiệu về đồng phân quang học: độ tinh khiết quang học,
các phương pháp xác đònh độ tinh khiết quang học.
1.2. Cyclodextrin:


-CD và dẫn chất của

-CD.
1.3. Tương tác giữa đồng phân với tác nhân quang hoạt

4
1.4. Giới thiệu về một số dược chất quang hoạt: amlodipin,
nefopam, propranolol, ofloxacin, ketoconazol, miconazol,
promethazin.
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Các dẫn chất của

-CD và các chế phẩm chứa đồng phân riêng lẻ
hay hỗn hợp racemic của các dược chất có tính quang hoạt như:
amlodipin besilat, propranolol hydroclorid, ofloxacin, ketoconazol,
miconazol nitrat, promethazin hydroclorid, nefopam hydroclorid.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Nguyên liệu - Dung môi, hóa chất - Trang thiết bò
- Dung môi, hóa chất sử dụng loại dùng cho tổng hợp, phân tích
và cho các loại thiết bò như: HPLC, CE,
- Các chất chuẩn đối chiếu do Viện Kiểm nghiệm thuốc TP.HCM
cung cấp.
- Thiết bò tổng hợp và thiết bò phân tích được trang bò tại Viện
Kiểm nghiệm thuốc TP.HCM, Viện hóa học - Viện Hàn lâm khoa
học Việt Nam.
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2.1. Tổng hợp dẫn chất


-CD
Tổng hợp dẫn chất 2-O-(2-hydroxypropyl)-

-CD:

-CD phản ứng
với 1,2-propylen oxyd trong môi trường NaOH 0,4 M.
Tổng hợp dẫn chất 2-O-(2-hydroxybutyl)-

-CD:

-CD phản ứng
với 1,2-butylen oxyd trong môi trường NaOH 0,4 M.
Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm tổng hợp
- Tiến hành theo dõi thời điểm kết thúc phản ứng tổng hợp và
kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng phương pháp SKLM

5
trên bản mỏng silicagel F
254
với hệ dung môi khai triển: 2-
propanol - nước - amoniac đậm đặc (3:1:1) (tt/tt/tt).
- Đo nhiệt độ nóng chảy.
- Xác đònh góc quay cực riêng.
Xác đònh cấu trúc
- Phổ hồng ngoại (IR)
- LC-MS:
Điều kiện: cột Gemini C18 (150 x 4,6 mm; 5 m). Pha động:
methanol - nước (7:3). Đầu dò khối phổ: kiểu ion hóa ESI, thế phá

mảnh: 50 eV. Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút. Nhiệt độ cột: 40
o
C. Khí
nitơ (nhiệt độ, tốc độ, áp suất phun hơi): 300
o
C, 7 lít/phút, 30 psi.
Nhiệt độ buồng đốt: 100
o
C.
- NMR: được đo trong dung môi methanol (CD
3
-OD), pyridin
(C
6
D
5
N).
Dựa vào phổ
1
H-NMR để xác đònh độ thế trung bình (DS).
Tính hiệu suất phản ứng
2.2.2.2. Tiêu chuẩn hóa HP-

-CD và HB-

-CD tổng hợp
Tính chất: dựa vào cảm quan xác đònh trạng thái, màu, mùi của
sản phẩm.
Độ tan: theo quy đònh chung của DĐVN IV.
Đònh tính

Phổ IR: tiến hành đo phổ bằng kỹ thuật dập viên KBr.
Phổ NMR: phổ
1
H-NMR và
13
C-NMR.
Độ thế (DS)
Dựa vào phổ
1
H-NMR để tính độ thế trung bình (DS).
Độ trong và màu sắc: hòa tan 1,0 g chế phẩm trong 2,0 ml nước và
đun nóng. Dung dòch sau khi để nguội đến nhiệt độ phòng phải
trong và không màu

6
pH: cân 0,5 g chế phẩm hòa tan trong 50 ml nước không có
carbon dioxyd. Đo pH dung dòch sau khi pha.
Góc quay cực riêng: cân 0,5 g chế phẩm hòa tan trong 50 ml nước.
Đo góc quay cực ở 20
o
C.
Kim loại nặng: xác đònh trên 0,5 g chế phẩm.
Giảm khối lượng do sấy khô: xác đònh trên 1,0 g chế phẩm; sấy
120
o
C trong 2 giờ.
Cắn sau khi nung: xác đònh trên 1,0 g chế phẩm.
Độ tinh khiết: Áp dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và
quy về 100% diện tích pic.
- Điều kiện sắc ký: cột Gemini NX RP18 (150 x 4,6 mm; 5 µm).

Pha động: nước. Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút. Đầu dò: RI. Nhiệt độ
cột: 40
o
C. Thể tích tiêm: 20 µl. Nồng độ đo: 2%.
- Đánh giá phương pháp: nội dung đánh giá được tham khảo
theo hướng dẫn của ICH (International Conference on
Harmonization) ban hành vào tháng 11 năm 2005.
2.2.2.3. Khảo sát độ ổn đònh của HP-

-CD và HB-

-CD
Kiểm tra độ ổn đònh của sản phẩm bằng cách bảo quản ở nhiệt độ
25
o
C  2
o
C, độ ẩm 75%  5%. Sau các thời điểm 3, 6, 9, 12 và 24
tháng kiểm tra lại các chỉ tiêu: tính chất, pH, độ tinh khiết và độ
chọn lọc đồng phân.
2.2.2.4. ng dụng HP-

-CD và HB-

-CD để phân tích các chất
quang hoạt bằng phương pháp điện di mao quản
Khảo sát điều kiện tách các hỗn hợp racemic: miconazol,
nefopam, amlodipin, ofloxacin, propranolol, promethazin,
ketocanazol. Khảo sát pH và nồng độ dung dòch điện ly nền, bản
chất và nồng độ tác nhân quang hoạt, bản chất và nồng độ dung

môi hữu cơ thêm vào dung dòch điện ly nền.
Đánh giá quy trình

7
- Tính phù hợp của hệ thống
Yêu cầu: thời gian di chuyển của các pic có RSD  2%; diện tích
pic được chuẩn hóa (Corr Area)  3%; độ phân giải giữa hai pic
đồng phân R
S
 1,5; hệ số bất đối 0,8  As  1,5.
- Tính đặc hiệu: Điện di đồ của mẫu thử phải có pic có thời gian
di chuyển trùng với pic hoạt chất trong mẫu chuẩn. Mẫu trắng
không có pic có thời gian di chuyển trùng với thời gian di chuyển
của các pic hoạt chất trong dung dòch chuẩn. Khi thêm chất chuẩn
vào mẫu thử thì diện tích pic của hoạt chất tăng lên. Phổ tử ngoại
của các pic trong mẩu thử giống phổ tử ngoại của pic trong mẫu
chuẩn. Phổ tử ngoại của hai pic đồng phân giống nhau. Độ tinh
khiết của các pic trong các quy trình đều  99,0%.
- Tính tuyến tính: R
2
> 0,990.
- Độ đúng: tỷ lệ phục hồi 98% - 102%.
- Độ chính xác: RSD  3%.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Tổng hợp dẫn chất

-CD
3.1.1. Tổng hợp 2-O-(2-hydroxypropyl)-

-CD

3.1.1.1. Tổng hợp 2-O-[(RS)-2-hydroxypropyl]-

-CD

-CD phản ứng với 1,2-propylen oxyd theo tỷ lệ 1:25 trong môi
trường NaOH 0,4 M ở 0
o
C - 5
o
C trong 5 giờ, sau đó tiếp tục phản
ứng ở 25
o
C  2
o
C. Phản ứng được thực hiện trong vòng 24 giờ.
Hỗn hợp sau phản ứng được trung hòa bằng dung dòch acid
hydrocloric 20%. Bay hơi nước, cắn được hòa trong một lượng tối
thiểu ethanol. Lọc loại muối, tủa bằng aceton, loại aceton. Tủa
được sấy dưới áp suất giảm ở 80
o
C. Hiệu suất sau khi tinh chế
khoảng 62,7%. Nhiệt độ nóng chảy: từ 250
o
C đến 255
o
C.
 
20
D


=
+125,6
o
. Độ thế khoảng 6,3.

8
Phổ IR (KBr),

(cm
-1
): có các số sóng hấp thu đặc trưng của nhóm
chức O-H (3425), C-H (2932), C-O (1031).
Phổ khối (m/z): 1535
Phổ NMR (CD
3
-OD),

(ppm)): Phổ
1
H-NMR (500 MHz): 1,155
(H
9
); 3,556 (H
4
); 3,591-3,790 (H
7
); 3,765 (H
5
); 3,850 - 3,877 (H
6

);
3,887 (H
3
); 3,974 (H
8
); 4,020 (H
2
); 5,012 (H
1
). Phổ
13
C-NMR (125
MHz): 103,656 (C
1
); 82,904 (C
4
); 78,686 (C
7
); 74,679 (C
3
); 73,909
(C
2
); 73,571 (C
5
); 67,259 (C
8
); 61,174 (C
6
); 19,504 (C

9
).







Hình 3.1. Phổ
1
H-NMR của 2-O-(2-hydroxypropyl)-

-CD





Hình 3.2. Phổ
13
C-NMR của 2-O-(2-hydroxypropyl)-

-CD

O
O
H
H
O

O
CH
2
C
HCH
3
O
7
OH
1
2
3
4
5
6
7
8 9

9
Dữ liệu phổ IR, MS, phổ NMR cho thấy sản phẩm có cấu trúc của
2-O-(2-hydroxypropyl)-

-CD
3.1.1.2. Tổng hợp 2-O-[(S)-2-hydroxypropyl]-

-CD
Thực hiện theo mục 3.1.1.1 nhưng thay 1,2-propylen oxyd bằng
(S)-(-)-1,2-propylen oxyd. Hiệu suất sau khi tinh chế khoảng
61,5%. Nhiệt độ nóng chảy: từ 252
o

C đến 256
o
C.
 
20
D

: +140,1
o
.
Độ thế: 6,18.
3.1.1.3. Tổng hợp 2-O-[(R)-2-hydroxypropyl]-

-CD
Thực hiện theo mục 3.1.1.1 nhưng thay 1,2-propylen oxyd bằng
(R)-(+)-1,2-propylen oxyd. Hiệu suất sau khi tinh chế khoảng
63,2%. Nhiệt độ nóng chảy: từ 251
o
C đến 256
o
C.
 
20
D

: +110,2
o
.
Độ thế: 6,67.
3.1.2. Tổng hợp 2-O-(2-hydroxybutyl)-


-CD

-CD phản ứng với 1,2-butylen oxyd theo tỷ lệ 1:25 trong môi
trường NaOH 0,4M và tiến hành như mục 3.1.1. Hiệu suất khoảng
61,5%. Nhiệt độ nóng chảy: từ 256
o
C - 260
o
C.
 
20
D

= +118,6
o
.
Độ thế trung bình khoảng 5,3.
Phổ IR (KBr),

(cm
-1
): có các số sóng hấp thụ đặc trưng của
nhóm chức O-H (3405), C-H (2933), C-O (1031).
Phổ khối (m/z): 1477
Phổ NMR (CD
3
-OD,

(ppm))

Phổ
1
H-NMR (500 MHz): 0,982 (H
10
); 1,437-1,567 (H
9
); 3,474 (H
4
);
3,533 (H
2
), 3,670-3,903 (H
7
), 3,711 (H
8
), 3,761 (H
5
), 3,867-3,950
(H
6
), 3,885 (H
3
), 4,992 (H
1
). Phổ
13
C-NMR (125 MHz): 103,784
(C
1
); 83,187 (C

4
); 76,543 (C
7
); 74,621 (C
3
); 74,123 (C
2
); 73,626
(C
5
); 72,691 (C
8
); 61,743 (C
6
); 27,167 (C
9
); 10,336 (C
10
).
Từ dữ liệu phổ IR, MS, phổ NMR cho thấy sản phẩm có cấu trúc
của 2-O-(2-hydroxybutyl)-

-CD

10

Hình 3.4. Phổ
1
H-NMR của 2-O-(2-hydroxybututyl)-

-CD








Hình 3.5. Phổ
13
C-NMR của 2-O-(2-hydroxybutyl)-

-CD
3.2. Tiêu chuẩn hóa dẫn chất HP-

-CD và HB-

-CD
Mức chất lượng của các chỉ tiêu trong tiêu chuẩn được xây dựng
dựa vào kết quả của nhiều lần thử nghiệm.

O
HO
O
CH
2
C
HCH
2
C
H
3
O
7
O
H
O
H
1
2
3
4
5
6
7
8
9

10

11
Bảng 3.5. Tóm tắt tiêu chuẩn cơ sở của HP-

-CD
Chỉ tiêu
Mức chất lượng
Tính chất
Bột trắng hoặc gần như trắng.
Dễ tan trong nước và methanol.
Đònh tính
Phải có phổ đặc trưng của 2-O-(2-
hydroxypropyl)-

-CD.
Độ trong và màu sắc
Dung dòch chế phẩm phải trong và không
màu.
pH
Từ 7,5 đến 8,5.
Góc quay cực riêng
Từ +123
o
đến +128
o
.
Giảm khối lượng do làm khô
Không quá 8%.
Kim loại nặng

Không quá 20 ppm.
Cắn sau khi nung
Không quá 0,1%.
Độ tinh khiết
 97,0% tính theo chế phẩm nguyên trạng.
Độ thế
Từ 6,0 đến 7,0.
Bảng 3.10. Tóm tắt tiêu chuẩn cơ sở của HB-

-CD
Chỉ tiêu
Mức chất lượng
Tính chất
Bột trắng hoặc gần như trắng.
Dễ tan trong nước và methanol.
Đònh tính
Phải có phổ đặc trưng của 2-O-(2-
hydroxybutyl)-

-CD.
Độ trong và màu sắc
Dung dòch chế phẩm phải trong và không
màu.
pH
Từ 8,7 đến 10,0.
Góc quay cực riêng
Từ +115
o
đến +120
o

.
Giảm khối lượng do làm khô
Không quá 5%.
Kim loại nặng
Không quá 20 ppm.
Cắn sau khi nung
Không quá 0,1%.
Độ tinh khiết
 97,0% tính theo chế phẩm nguyên trạng.
Độ thế
Từ 5,0 đến 6,0.

12
Các tiêu chuẩn đã được thẩm đònh tại Viện Kiểm nghiệm thuốc
TP.Hồ Chí Minh.
3.3. Khảo sát độ ổn đònh của HP-

-CD và HB-

-CD
Sau 24 tháng bảo quản ở điều kiện nhiệt độ 25
o
C  2
o
C, độ ẩm
tương đối 75%  5% chất lượng HP-

-CD và HB-

-CD vẫn ổn

đònh và khả năng tách đồng phân đối với các dược chất so với thời
điểm ban đầu vẫn không thay đổi

Bảng 3.11. Kết quả khảo sát độ ổn đònh của HP-

-CD
Chỉ tiêu
Số tháng

0
3
6
9
12
24
Tính chất
Đạt yêu cầu thời điểm 0
pH
8,16
8,47
8,44
8,32
8,32
8,26
Độ tinh khiết (%)
98,55
97,97
98,01
98,21
97,85

97,79

Bảng 3.12. Kết quả khảo sát độ ổn đònh của HB-

-CD
Chỉ tiêu
Số tháng

0
3
6
9
12
24
Tính chất
Đạt yêu cầu thời điểm 0
pH
8,95
9,01
8,94
8,89
8,94
8,82
Độ tinh khiết (%)
97,95
97,23
97,93
98,01
97,41
97,39

13
Bảng 3.13. Kết quả khảo sát độ ổn đònh của HP-

-CD và HB-

-
CD đối với độ chọn lọc đồng phân của một số dược chất quang
hoạt
Tác nhân
quang
hoạt
Hoạt
chất
Độ phân giải (R
S
)
0
tháng
3
tháng
6
tháng
9

tháng
12
tháng
24
tháng
HP-

-CD
MIC
2,52
2,32
2,45
2,64
2,53
2,68
NEF
3,22
3,41
3,19
3,30
3,45
3,27
AML
2,28
2,21
2,18
2,31
2,45
2,27
OFL

2,57
2,73
2,68
2,36
2,41
2,68
PRL
1,73
1,89
1,74
1,71
1,80
1,68
PRM
0,71
0,67
0,58
0,63
0,73
0,79
KET
1,10
0,98
1,15
0,89
1,20
1,26
HB-

-CD

MIC
2,46
2,50
2,71
2,39
2,49
2,61
NEF
1,85
1,78
1,81
1,90
1,72
1,68
AML
2,84
2,90
3,01
2,74
2,86
2,60
OFL
2,55
2,32
2,60
2,74
2,35
2,58
PRL
1,83

1,69
1,70
1,67
1,89
1,74
PRM
1,75
1,67
1,79
1,83
1,62
1,67
KET
2,67
2,45
2,51
2,52
2,49
2,60
. 3.4. Ứng dụng HP-

-CD và HB-

-CD để phân tích các chất
quang hoạt bằng phương pháp điện di mao quản
3.4.1. Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến độ chọn lọc đồng
phân:
Điều kiện cố đònh: cột silica nung chảy, đường kính trong 50 µm,
chiều dài tổng cộng 63,5 cm và chiều dài hiệu quả 54 cm. Điện
thế: 20 kV. Nhiệt độ mao quản: 25

o
C. Phương pháp tiêm: 50

14
mbar x 5 giây. Bước sóng phát hiện: bước sóng hấp thụ cực đại
của mỗi hoạt chất.
Khảo sát sự thay đổi độ phân giải giữa các pic đồng phân trong
hỗn hợp racemic của miconazol, nefopam, amlodipin, ofloxacin,
propranolol, promethazin, ketoconazol theo: pH của dung dòch
BGE, nồng độ dung dòch BGE (dung dòch TRIS-phosphat), bản
chất và nồng độ dung môi hữu cơ được thêm vào dung dòch BGE,
bản chất và nồng độ tác nhân quang hoạt (

-CD, HP-

-CD, HB-

-
CD).
3.4.2. Đánh giá quy trình
Bảng 3.16 trình bày điều kiện điện di thích hợp để phân tách đồng
phân của một số chất quang hoạt.
Bảng 3.16. Điều kiện dung dòch điện ly nền và tác nhân quang
hoạt của các quy trình phân tích đồng phân
Hoạt
chất
BGE
Tác nhân quang hoạt
TRIS
(mM)

pH
DMHC (%)

-CD
(mM)
HP-

-
CD
(mM)
HB-

-
CD
(mM)
MeCN
MeOH
MIC
50
2,5


2



2

2
NEF
50
2,5
25

30



30



20
AML
50
2,5



10



5
OFL
50
2,5

30



30
PRL
50
2,5

20

30



20
PRM
100
2,5

20


30
KET
50
3,0

15

15
Đánh giá quy trình theo các chỉ tiêu:
- Tính phù hợp của hệ thống
Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống cho thấy sau 6 lần
điện di các thông số đều nằm trong giới hạn cho phép.
Như vậy, các quy trình đều đạt tính phù hợp của hệ thống.
- Tính đặc hiệu: các quy trình đều có tính đặc hiệu.
- Tính tuyến tính: kết quả khảo sát tính tuyến tính cho thấy có sự
tương quan tuyến tính giữa Corr Area và nồng độ hoạt chất với hệ
số R
2
> 0,990.
- Độ chính xác và độ đúng
Kết quả thống kê cho thấy các quy trình có tỷ lệ hồi phục nằm
trong giới hạn cho phép của tỷ lệ hồi phục lý thuyết 98% - 102%
và RSD ≤ 3% đối với độ chính xác.
Kết luận: hỗn hợp racemic của miconazol, nefopam đều có thể
tách được bằng cả ba tác nhân quang hoạt

-CD, HP-

-CD và HB-

-CD. Hỗn hợp racemic của amlodipin, propranolol, ofloxacin chỉ
tách được bằng hai tác nhân HP-


-CD và HB-

-CD. Hỗn hợp
racemic của promethazin, ketoconazol chỉ tách được với tác nhân
HB-

-CD.
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN
Để tổng hợp dẫn chất

-CD đã sử dụng nguyên liệu

-CD loại
dược dụng của Trung Quốc. Phổ
1
H-NMR và
13
C-NMR của

-CD
(được đo trong DMSO), nhằm kiểm tra nguyên liệu đồng thời có
số liệu đònh hướng cho việc kiểm tra cấu trúc của các dẫn chất
tổng hợp.
Phổ
1
H-NMR: 5,702 (H
1
); 3,671 (H
2

); 3,633 (H
3
); 3,34 (H
4
), 3,30
(H
5
); 3,608 (H
6a
); 3,555 (H
6b
). Phổ
13
C-NMR: 102,035 (C
1
); 72,491
(C
2
); 73,151 (C
3
), 81,640 (C
4
), 72,132 (C
5
), 60,041 (C
6
)

16
Về cơ bản phổ NMR không biến đổi nhiều so với phổ glucose

thông thường. Do cấu trúc của

-CD có dạng hình nón cụt nên các
carbon cũng như proton ở từng mắt xích dù cùng vò trí (2 hoặc 3, 4,
) cũng không còn tương đương cộng hưởng từ nữa vì chúng khác
nhau về đònh vò không gian.
4.1. Tổng hợp dẫn chất

-CD
4.1.1. Tổng hợp 2-O-(2-hydroxypropyl)-

-CD
Theo công bố của tác giả Seung H. C. và cộng sự, cho thấy với tỷ
lệ phản ứng giữa

-CD và propylen oxyd là 1:25, thực hiện ở nhiệt
độ phòng trong 24 giờ trong môi trường NaOH 0,4 M sẽ tạo dẫn
chất 2-O-(2-hydroxypropyl)-

-CD có độ thế khoảng 4,01. Kết quả
khảo sát cho thấy với tỷ lệ 1:25 phản ứng ở điều kiện 0
o
C - 5
o
C
trong 24 giờ sẽ cho sản phẩm 2-O-(2-hydroxypropyl)-

-CD có
hiệu suất 62,7% và độ thế khoảng 6,3.
Xác đònh cấu trúc

Trong phản ứng giữa

-CD và propylen oxyd, do propylen oxyd là
một oxiran rất hoạt động về mặt hóa học nên cả hai liên kết C-O
của vòng oxiran đều có thể bò cắt đứt. Khi phản ứng được thực
hiện trong môi trường kiềm, vòng oxiran sẽ bò mở theo hướng ít
gây cản trở về không gian nhất, kết quả 95% sản phẩm tạo thành
là alcol bậc 2
Phổ MS: 2-O-(2-hydroxypropyl)-

-CD được tổng hợp từ

-CD là
một olygomer vòng với số mắt xích là n = 7. Từ dữ liệu của phổ
MS có thể đánh giá mức độ thế của sản phẩm 2-O-(2-
hydroxypropyl)-

-CD.
Phổ NMR
Tùy thuộc vào nồng độ kiềm, nhóm hydroxypropyl tạo thành từ
propylen oxyd sẽ ưu tiên thế vào vò trí OH bậc 1 hoặc bậc 2 của
các đơn vò -D-glucopyranose trong phân tử

-CD. Theo công bố

17
của tác giả Seung H. C. và cộng sự, trong điều kiện môi trường
NaOH 0,4 M sản phẩm chính tạo thành sẽ là dẫn chất 2-O-(2-
hydroxypropyl)-


-CD.
Tuy nhiên,

-CD có rất nhiều tâm phản ứng trong phân tử, nên
khó khống chế điều kiện phản ứng để tạo thành một sản phẩm duy
nhất sau phản ứng. Do đó, khi tiến hành phản ứng trong môi
trường NaOH 0,4 M, ngoài sản phẩm thế chính ở vò trí OH của C
2

còn có thể lẫn các sản phẩm thế ở C
3
và C
6
. Ngoài ra, sản phẩm
cũng có thể là một hỗn hợp của các sản phẩm có độ thế khác
nhau. Trong quá trình tinh chế, cũng không thể loại được các sản
phẩm này.
Để xác đònh các mối tương quan giữa carbon và các proton, các dữ
liệu phổ NMR của sản phẩm 2-hydroxypropyl-

-CD được đo trong
pyridin C
6
D
5
N để giảm bớt ảnh hưởng của các tín hiệu OH.
Như vậy, trên dữ liệu phổ
13
C-NMR của sản phẩm 2-O-(2-
hydroxypropyl)-


-CD cho thấy 6 pic của đường là phù hợp với
những tài liệu đã công bố về phổ
13
C của đường glucose tồn tại ở
dạng polymer liên kết 1-O-4. Trên phổ DEPT chỉ rõ pic của nhóm
CH
2
-O, của nhóm CH-OH và pic của nhóm -CH
3
. Như vậy, đây là
ba pic phù hợp với nhóm thế 2-hydroxypropyl.
Ngoài ra, ở phổ HMBC đã có tương quan C
4
-H
1
chứng minh mạch
liên kết 1-O-4 và trong phổ COSY cũng nhận ra pic tương quan 2
 7a, 7b chứng minh vò trí gắn vào khung đường của nhóm thế là
C
2
.
Từ dữ liệu phổ của sản phẩm 2-O-(2-hydroxypropyl)-

-CD tổng
hợp cho thấy không có sự thế vào C
6
mà chỉ có sự thế vào C
2
và

nếu có vào C
3
thì không đáng kể vì H
6
hoàn toàn không có tương
quan HMBC và COSY với H
7
, H
5
, C
7
, C
5
. Còn vò trí C
3
vì tín hiệu
quá gần C
2
nên có thể có sự lẫn khi khảo sát pic tương quan. Vì

18
vậy, để giúp khẳng đònh cấu trúc của sản phẩm tổng hợp, có thể so
sánh với phổ của sản phẩm 2-O-(2-hydroxypropyl)-

-CD thương
mại đo trong cùng điều kiện và cùng dung môi pyridin C
6
D
5
N.

Theo dữ liệu phổ NMR của một sản phẩm thương mại đo trong
dung môi pyridin C
6
D
5
N cho thấy hệ thống phổ
1
H-NMR và
13
C-
NMR gần như không có chênh lệch nào đáng kể so với phổ của
sản phẩm tổng hợp.
Sự giống nhau của 2-O-(2-hydroxypropyl)-

-CD thương mại và 2-
O-(2-hydroxypropyl)-

-CD tổng hợp trong hệ thống phổ NMR có
thể khẳng đònh cấu trúc của sản phẩm tổng hợp là 2-O-(2-
hydroxypropyl)-

-CD.
4.1.2. Tổng hợp (S)-HP-

-CD và (R)-HP-

-CD
Mức độ ảnh hưởng của nhóm thế quang hoạt lên sự thay đổi góc
quay cực riêng là không đủ lớn để có thể làm cho giá trò
20

][
D

của
2-O-[(S)-2-hydroxypropyl]-

-CD và 2-O-[(R)-2-hydroxypropyl]-

-
CD trái dấu.
Bảng 4.6. Bảng so sánh độ thế và
20
][
D

của HP-

-CD.

HP-

-CD
(S) HP-

-CD
(R) HP-

-CD
Độ thế
6,30

6,18
6,67
20
][
D


+125,6
o

+140,1
o

+110,2
o


0
14,5
o

- 15,4
o



: hiệu số góc quay cực riêng (x) của sản phẩm X so với sản phẩm
HP-

-CD

Kết quả phổ
1
H-NMR cho thấy không có sự khác nhau về độ dòch
chuyển hóa học giữa các nhóm thế 2-O-(2-hydroxypropyl)-, 2-O-
[(S)-2-hydroxypropyl]-, và 2-O-[(R)-2-hydroxypropyl.
Ngoài ra, do góc quay mặt phẳng phân cực là tổng giá trò góc quay
của tất cả carbon bất đối trong phân tử nên theo kết quả của bảng

19
4.6. cho thấy không có sự racemic hóa trong quá trình phản ứng.
Ngoài ra, dựa theo các tài liệu đã được công bố trên thế giới, sản
phẩm 2-O-[(S)-2-hydroxypropyl]-

-CD và 2-O-[(R)-2-
hydroxypropyl]-

-CD tạo thành sẽ tương ứng với nguyên liệu ban
đầu (S)-(-)-1,2-propylen oxyd, (R)-(+)-1,2-propylen oxyd.
4.1.3. Tổng hợp 2-O-(2-hydroxybutyl)-

-CD
Theo công bố trong công trình của tác giả Yunhe.W. và cộng sự tỷ
lệ phản ứng giữa

-CD và butylen oxyd khoảng 1:10 và phản ứng
được thực hiện ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ sẽ cho sản phẩm có
hiệu suất khoảng 40,8% và độ thế khoảng 3,07. Kết quả thăm dò
điều kiện cho thấy để sản phẩm có hiệu suất khoảng 61,5% và độ
thế khoảng 5,3 thì phản ứng được tiến hành ở 0
o

C - 5
o
C trong 24
giờ với tỷ lệ giữa

-CD và butylen oxyd là 1:25.
Phổ MS: từ dữ liệu của phổ MS có thể đánh giá mức độ thế của
sản phẩm 2-O-(2-hydroxybutyl)-

-CD.
Phổ NMR: cấu trúc dự đoán phổ NMR của 2-O-(2-hydroxybutyl)-

-CD tương tự như của 2-O-(2-hydroxypropyl)-

-CD nhưng nhóm
2-hydroxypropyl được thay bằng nhóm 2-hydroxybutyl.
Các dữ liệu phổ NMR của 2-O-(2-hydroxybutyl)-

-CD đo trong
pyridin C
6
D
5
N đều phù hợp với dự đoán. Phổ
13
C-NMR và
1
H-
NMR có sự khác biệt rõ ràng so với phổ
13

C-NMR và
1
H-NMR của
2-O-(2-hydroxypropyl)-

-CD. Đó là sự xuất hiện thêm pic của
nhóm -CH
2
- trên phổ
13
C-NMR. Như vậy, đã chứng minh có sự
hiện diện của nhóm thế 2-hydroxybutyl.
Cũng như sản phẩm 2-O-(2-hydroxypropyl)-

-CD, ở phổ HMBC
cũng đã chứng minh mạch liên kết 1-O-4 nhờ tương quan C
4
 H
1

và nhóm thế gắn vào khung đường glucose ở vò trí C
2
nhờ tương
quan COSY (2  7a, 7b).

20
2-O-(2-hydroxybutyl)-

-CD là sản phẩm chưa được thương mại
hóa. Khi so sánh phổ NMR của sản phẩm với phổ NMR của dẫn

chất 2-hydroxybutyl-

-CD đã công bố, kết quả cho thấy phổ
1
H-
NMR và
13
C-NMR của sản phẩm phù hợp với phổ đã được đã
công bố trong tài liệu. Như vậy, từ các dữ liệu phổ NMR của sản
phẩm 2-O-(2-hydroxybutyl)-

-CD tổng hợp và dữ liệu của tài liệu
đã công bố có thể xác đònh cấu trúc của sản phẩm tổng hợp là 2-
O-(2-hydroxybutyl)-

-CD.
4.2. Tiêu chuẩn hóa dẫn chất HP-

-CD và HB-

-CD
Mục tiêu của đề tài là ứng dụng HP-

-CD và HB-

-CD vào lónh
vực phân tích làm tác nhân tách đồng phân, do đó, việc tiêu chuẩn
hóa chỉ bao gồm các chỉ tiêu và mức chất lượng phù hợp cho một
hóa chất dùng trong phân tích.
Tiêu chuẩn của (S)-HP-


-CD và (R)-HB-

-CD không được xây
dựng vì 1,2-(S)-(-)-propylen oxyd và 1,2-(R)-(+)-propylen oxyd
dùng để tổng hợp (S)-HP-

-CD và (R)-HB-

-CD rất đắt tiền, trong
khi đó sản phẩm tổng hợp ứng dụng trong phương pháp CE làm tác
nhân tách một số dược chất quang hoạt đã không có sự cải thiện
nổi bật so với khi dùng 2-O-(2-hydroxypropyl)-

-CD.
4.3. Ứng dụng HP-

-CD và HB-

-CD để phân tích các chất
quang hoạt bằng phương pháp điện di mao quản
Một số dược chất thuộc các nhóm thuốc thông dụng như: kháng
sinh, kháng nấm, kháng viêm, chống dò ứng, tim mạch, đã có
những công trình nghiên cứu chứng minh dạng đồng phân riêng lẻ
có hoạt tính cao hơn hay ít tác dụng phụ hơn so với dạng racemic.
Hiện nay, trên thò trường dược phẩm đã có những chế phẩm ở
dạng đồng phân riêng lẻ: thuốc trò cao huyết áp S-amlodipin,
kháng sinh levofloxacin, Do đó, việc xây dựng phương pháp để

21

phân biệt các dạng đồng phân của các dược chất quang hoạt nhằm
giúp kiểm tra chất lượng của các chế phẩm này là cần thiết.
KẾT LUẬN
Luận án “Nghiên cứu tổng hợp một số tác nhân quang hoạt từ

-
cyclodextrin để ứng dụng trong phân tích các chất quang hoạt
bằng phương pháp điện di mao quản” đã hoàn thành các nội dung
nghiên cứu để đạt được mục tiêu đề ra.
1. Tổng hợp một số tác nhân quang hoạt từ

-CD ở qui mô
phòng thí nghiệm
Tổng hợp dẫn chất 2-O-(2-hydroxypropyl)-

-CD: hiệu suất
khoảng 62,7% (khối lượng sản phẩm khoảng 4,7 g /lần tổng hợp).
Tổng hợp dẫn chất 2-O-[(S)-2-hydroxypropyl]-

-CD: hiệu suất
khoảng 61,5%. Tổng hợp dẫn chất 2-O-[(R)-2-hydroxypropyl]-

-
CD: hiệu suất khoảng 63,2%. Tổng hợp dẫn chất 2-O-(2-
hydroxybutyl)-

-CD: hiệu suất khoảng 61,5% (khối lượng sản
phẩm khoảng 4,7 g /lần tổng hợp).
2. Xác đònh cấu trúc và độ tinh khiết của chất tổng hợp
- Xác đònh cấu trúc các sản phẩm tổng hợp bằng phổ IR, LC-MS,

NMR. Kiểm tra độ tinh khiết của các chất tổng hợp bằng sắc ký
lớp mỏng và đo các chỉ số hóa lý: điểm chảy, góc quay cực riêng.
- Xác đònh độ tinh khiết của sản phẩm 2-O-(2-hydroxypropyl)-

-
CD và 2-O-(2-hydroxybutyl)-

-CD tổng hợp bằng phương pháp
sắc ký lỏng hiệu năng cao: dẫn chất 2-O-(2-hydroxypropyl)-

-CD
có độ tinh khiết khoảng 98,56% tính theo chế phẩm nguyên trạng.
Dẫn chất 2-O-(2-hydroxybutyl)-

-CD có độ tinh khiết khoảng
98,06% tính theo chế phẩm nguyên trạng.
3. Tiêu chuẩn hóa tác nhân tổng hợp
3.1. Tiêu chuẩn hóa và xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho tác nhân 2-
O-(2-hydroxypropyl)-

-CD

22
- Tính chất: bột trắng hoặc gần như trắng. Dễ tan trong nước và
methanol.
- Đònh tính: Chế phẩm phải có phổ đặc trưng của 2-O-(2-
hydroxypropyl)-

-CD.
- Độ trong và màu sắc: dung dòch chế phẩm phải trong và không

màu.
- pH: từ 7,5 đến 8,5.
- Góc quay cực riêng:
 
20
D

từ +123
o
đến +128
o

- Giảm khối lượng do làm khô:  8%.
- Kim loại nặng:  20 ppm.
- Cắn sau khi nung:  0,1%.
- Độ tinh khiết: phải  97% tính theo chế phẩm nguyên trạng.
- Độ thế: tư ø6,0 đến 7,0.
3.2. Tiêu chuẩn hóa và xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho tác nhân 2-
O-(2-hydroxybutyl)-

-CD
- Tính chất: bột trắng hoặc gần như trắng. Dễ tan trong nước và
methanol.
- Đònh tính: Chế phẩm phải có phổ đặc trưng của 2-O-(2-
hydroxybutyl)-

-CD.
- Độ trong và màu sắc: dung dòch chế phẩm phải trong và không
màu.
- pH: từ 8,7 đến 10,0.

- Góc quay cực riêng:
 
20
D

từ +115
o
đến +120
o
.
- Giảm khối lượng do làm khô:  5%
- Kim loại nặng:  20 ppm.
- Cắn sau khi nung:  0,1%.
- Độ tinh khiết: phải  97% tính theo chế phẩm nguyên trạng.
- Độ thế: từ 5,0 đến 6,0.

23
Tiêu chuẩn cơ sở của HP-

-CD và HB-

-CD đã được thẩm đònh
tại Viện Kiểm nghiệm thuốc thành phố Hồ Chí Minh.
4. Ứng dụng tác nhân quang hoạt tổng hợp để phân tách các
chất quang hoạt bằng phương pháp điện di mao quản
Ứng dụng hai tác nhân quang hoạt 2-O-(2-hydroxypropyl)-

-CD
và 2-O-(2-hydroxybutyl)-


-CD để làm tác nhân tách một số dược
chất quang hoạt miconazol nitrat, nefopam hydroclorid, amlodipin
besilat, ofloxacin, propranolol hydroclorid, promethazin
hydroclorid, ketoconazol bằng phương pháp điện di mao quản.
- Đã khảo sát điều kiện điện di tách thích hợp: pH và nồng độ
dung dòch điện ly nền, bản chất và nồng độ tác nhân quang hoạt,
bản chất và nồng độ dung môi hữu cơ thêm vào dung dòch điện ly
nền.
- Xây dựng được các quy trình tách cho 7 dược chất quang hoạt
bằng phương pháp điện di mao quản: miconazol nitrat, nefopam
hydroclorid, amlodipin besilat, ofloxacin, propranolol hydroclorid,
promethazin hydroclorid, ketoconazol.
+ Cả ba tác nhân quang hoạt

-CD, HP-

-CD và HB-

-CD đều
tách thành công đồng phân quang học của miconazol và nefopam.
+ Hai tác nhân quang hoạt HP-

-CD và HB-

-CDõ tách thành
công đồng phân quang học của amlodipin, ofloxacin và
propranolol.
+ Chỉ có tác nhân quang hoạt HB-

-CD tách thành công đồng

phân quang học của promethazin và ketoconazol.
- Đánh giá các quy trình phân tích trên các chỉ tiêu: tính phù hợp
của hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ chính xác, độ đúng.
Tất cả các quy trình đã được thẩm đònh tại Viện Kiểm nghiệm
thuốc thành phố Hồ Chí Minh.

24
- Ứng dụng các quy trình đã được thẩm đònh để xác đònh các chế
phẩm ở dạng đồng phân riêng lẻ, xác đònh độ tinh khiết đồng phân
của các dạng chế phẩm cũng như các nguyên liệu làm thuốc.
ĐỀ NGHỊ
Các kết quả nghiên cứu đạt được nêu trên là cơ sở khoa học để
thực hiện các nghiên cứu tiếp theo:
- Tiếp tục ứng dụng hai tác nhân quang hoạt 2-O-(2-
hydroxypropyl)-

-CD và 2-O-(2-hydroxybutyl)-

-CD để tách thêm
các dược chất quang hoạt khác bằng phương pháp điện di mao
quản.
- Sử dụng 2-O-(2-hydroxypropyl)-

-CD, 2-O-(2-hydroxybutyl)-

-
CD, 2-O-[(S)-2-hydroxypropyl]-

-CD, 2-O-[(R)-2-hydroxypropyl]-


-CD làm pha tónh quang hoạt để tách các dược chất quang hoạt
bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao.