ứng dụng công nghệ phân tử để nghiên cứu các thay đổi ở gen người và dộng vật tại các vùng sinh thái bị ảnh hưởng trước tiếp của chất độc màu da cam

ban chỉ đạo CT 33 bộ khoa học và công nghệ










báo cáo tổng kết đề tài cấp nhà nớc

ứng dụng công nghệ phân tử để nghiên cứu
các thay đổi ở gen ngời và động vật
tại các vùng sinh thái bị ảnh hởng
trực tiếp của chất độc màu da cam




Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. Nông Văn hải
Viện Công nghệ sinh học
Viện KHCN Việt nam



5774-M
23/4/2006

Hà Nội 2005



1
Phần 1: Xuất xứ, Mục tiêu và nội dung của đề tài
1.1.Xuất xứ của đề tài
Trong thời kỳ chiến tranh tại Việt Nam, từ năm 1961 đến năm 1972, Mỹ
đã sử dụng các chất độc hóa học, bao gồm chất da cam và nhiều chất khác, có
chứa một tạp chất siêu độc là 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD/
Dioxin). Một lợng khổng lồ, ớc tính ban đầu là 170 - 500 kg, chất dioxin (tính
trên tổng lợng các chất độc hóa học) đã đợc Mỹ rải vào Việt Nam. Theo công
bố mới đây nhất của các nhà khoa học tại Trờng Đại học Columbia, Mỹ, số
lợng chất độc hóa học do Mỹ sử dụng tại chiến tranh Việt Nam thực ra còn cao
hơn rất nhiều, trong đó lợng dioxin có thể cao hơn từ 2 đến 4 lần so với các
công bố trớc đây (Stellman et al., 2003) và con số này có thể lên tới 1000 kg
(Trần Xuân Thu, 2003).
Ô nhiễm dioxin do chiến tranh hóa học của Mỹ để lại đã và đang gây ra
hậu quả hết sức nặng nề lên môi trờng sinh thái và đặc biệt là đối với sức khoẻ
con ngời Việt Nam. Rất nhiều năm sau chiến tranh, các nghiên cứu cho thấy
nồng độ dioxin trong cơ thể ngời dân sống tại những vùng sinh thái bị nhiễm

chất độc hóa học nặng, nh sân bay Biên Hoà, vẫn còn rất cao (Schecter et al.,
2001), cá biệt có ngời với nồng độ dioxin lên tới 413 pg/g mỡ (Schecter et al.,
2002; Paepke et al., 2003). Đến nay, ở Việt Nam đã có các nạn nhân chất da
cam/ dioxin thế hệ thứ 2 (F1), thứ 3 (F2) (Hoàng Đình Cầu, 2002). Vấn đề cực
kỳ nghiêm trọng là các thế hệ ngời Việt Nam tiếp theo có thể sẽ còn phải gánh
chịu những hậu quả khôn lờng về sự hủy hoại sức khoẻ, bệnh di truyền, ung
th, các dị tật bẩm sinh và nhiều căn bệnh hiểm nghèo khác.
Từ năm 1980, Nhà nớc đã thành lập một ủy ban chuyên trách về điều tra
ảnh hởng của chiến tranh hóa học do Mỹ tiến hành tại Việt Nam (ủy ban
10/80). Hơn 20 năm qua, các hoạt động điều tra, nghiên cứu của ủy ban 10/80
cũng nh của các cơ quan thuộc Bộ Y tế (Trờng Đại học Y Hà Nội, các Bệnh
viện), Bộ Quốc phòng (Học viện Quân y, Trung tâm Nhiệt đới Việt- Nga)
và các bộ, ngành khác về ảnh hởng của chất da cam/ dioxin lên sức khỏe ngời
Việt Nam đã thu đợc rất nhiều kết quả quan trọng (Hoàng Đình Cầu et al. ,
2000; Phan Thị Phi Phi et al., 2000). Đặc biệt, các nghiên cứu về dịch tễ học,
bệnh lý lâm sàng giai đoạn 1980 - 2000 là những t liệu hết sức quý giá về

1
ảnh hởng của dioxin lên sức khỏe con ngời. Tuy nhiên, với điều kiện kinh tế
nớc ta trong thập kỷ 80 và 90 còn gặp nhiều khó khăn, kinh phí cho nghiên cứu
rất hạn hẹp, đồng thời trình độ nghiên cứu khoa học trên thế giới vào giai đoạn
này cũng cha phát triển, nên không thể tiến hành sâu hơn các nghiên cứu ảnh
hởng của dioxin ở mức độ phân tử.
Trong tình hình mới, ngày 1 tháng 3 năm 1999 Thủ tớng Chính phủ đã
ban hành Quyết định số 33/1999/QĐ-TTg về việc thành lập Ban Chỉ đạo Quốc
gia khắc phục hậu quả chất độc hóa học do Mỹ sử dụng trong chiến tranh ở Việt
Nam. Dới sự chỉ đạo của Ban Chỉ đạo 33, Chơng trình 33 cấp Nhà nớc đã và
đang đợc thực hiện. Một trong những hớng quan trọng nhất của Chơng trình
33 là nghiên cứu sâu hơn về ảnh hởng của chất da cam/ dioxin lên sức khỏe con
ngời và tìm ra các giải pháp khắc phục.

Từ tháng 8 năm 2001, Viện Công nghệ Sinh học đã bắt đầu tham gia thực
hiện một đề mục (sau này gọi là đề tài nhánh) Nghiên cứu phát hiện các thay
đổi gene ở nạn nhân bị nhiễm dioxin và các thế hệ tiếp theo (F1, F2) của những
nạn nhân bị phơi nhiễm thuộc đề tài Nghiên cứu các biến đổi về mặt di
truyền, miễn dịch, sinh hoá, huyết học và tồn lu dioxin trên các đối tợng
phơi nhiễm có nguy cơ cao do PGS. TS. Nguyễn Văn Tờng (Trờng Đại học
Y Hà Nội) làm Chủ nhiệm. Vừa qua, đề tài này đã hoàn thành việc nghiệm thu
cấp Nhà nớc.
Đồng thời, theo Quyết định số 1373/QĐ-BKHCNMT ngày 03 tháng 8
năm 2001 và Quyết định số 25633/QĐ - BKHCNMT ngày 14 tháng 11 năm
2001 của Bộ trởng Bộ Khoa học - Công nghệ và Môi trờng (nay là Bộ Khoa
học và Công nghệ), Viện Công nghệ Sinh học đã chính thức đợc giao chủ trì đề
tài, với tên gọi ứng dụng công nghệ phân tử để nghiên cứu các thay đổi gene
ở ngời và động vật tại các vùng sinh thái bị ảnh hởng trực tiếp của chất độc
màu da cam (Thời gian thực hiện: 2001-2004; Chủ nhiệm: TS. Nông Văn Hải).

1
1.2. Mục tiêu, nội dung và kết quả nghiên cứu
Đề tài đ đăng ký mục tiêu, nội dung và kết quả nghiên cứu nh sau
(xem Thuyết minh đề tài):
- Thiết lập Ngân hàng DNA của các đối tợng ngời bị nhiễm chất độc
hóa học do Mỹ sử dụng trong chiến tranh Việt Nam để phục vụ cho các nghiên
cứu khoa học lâu dài.
- ứng dụng Công nghệ phân tử (bao gồm Công nghệ DNA và Công nghệ
protein) để nghiên cứu các thay đổi gene ở ngời: thay đổi cấu trúc (đột biến) và
chức năng của một số gene chọn lọc ở phả hệ của các gia đình nạn nhân bị
nhiễm dioxin và các thế hệ con cháu của họ. Đa ra các kết luận khoa học có
tính thuyết phục cao về ảnh hởng dioxin ở mức độ phân tử đối với con ngời
cũng nh có những kiến nghị cần thiết về biện pháp khắc phục những hậu quả
lâu dài.

- Nghiên cứu khả năng thay đổi một số gene ở 2 loài động vật thủy sinh
(cá trắm cỏ, cá trê ) phân bố tại vùng sinh thái chịu ảnh hởng của chất độc hóa
học do Mỹ sử dụng trong chiến tranh tại Việt Nam. Trên cơ sở đó, có những kết
luận có giá trị khoa học cao về nguồn ô nhiễm qua chuỗi thức ăn, đa ra định
hớng và đề xuất biện pháp khắc phục.
1.3. Nội dung nghiên cứu
A. Nghiên cứu các thay đổi gene trên đối tợng ngời:
Đối tợng nghiên cứu: Các phả hệ nạn nhân trong gia đình các cựu
chiến binh (CCB) và ngời dân đã có bằng chứng
bị ảnh hởng trực tiếp của
dioxin, và các thành viên trong gia đình họ (bố mẹ, anh, chị em ruột, con, cháu)
với các chỉ tiêu nh sau:
1) Nạn nhân đã từng sống và làm việc ở vùng bị rải, hoặc điểm nóng từ
6 tháng trở lên (theo Lê Bách Quang, Học viện Quân y) đã đợc các cơ quan
(Học viện Quân y, UB 10-80) nghiên cứu và công bố là có bằng chứng nhiễm
độc dioxin. Các nạn nhân đã có tiền sử bị phơi nhiễm, hiện nay có thể đang
sống tại Hà Nội, Hà Tây, Thái Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên-Huế và các
tỉnh khác. Các đối tợng mới bị phơi nhiễm, chủ yếu c trú tại khu vực sân

1
bay Biên Hoà và Đà Nẵng. Đối chứng: là các thành viên không bị phơi nhiễm
trong các gia đình đó.
2) Đã và đang có những biểu hiện bệnh lý và lâm sàng đặc trng của 11
bệnh có liên quan dến dioxin do Mỹ đã công bố.
3) Có con, cháu trong gia đình mang dị tật bẩm sinh
Ghi chú: Mẫu máu từ các phả hệ nạn nhân đợc su tập thông qua hợp
tác nghiên cứu với Học viện Quân y (PGS. TS. Lê Bách Quang và cộng sự)
Trờng ĐH Y Hà Nội (GS.TSKH. Phan Thị Phi Phi, PGS. TS. Nguyễn Văn
Tờng và cộng sự, PGS. TS. Trịnh Văn Bảo), Viện Huyết học truyền máu- Bệnh
viện Bạch Mai (GS. TSKH. Đỗ Trung Phấn), Bộ Y tế (BS. Trần Mạnh Hùng,

nguyên cán bộ UB 10-80) và các cơ quan khác.
- Lập Ngân hàng DNA từ các phả hệ bị ảnh hởng trực tiếp của dioxin
phục vụ cho các nghiên cứu lâu dài về tác động của dioxin đối với bộ gene của
ngời. Ngân hàng này bao gồm ít nhất 100 - 400 mẫu DNA (bao gồm 20 - 50
phả hệ, trung bình mỗi phả hệ trung bình 5 - 8 cá thể). Đây là vấn đề quan trọng
và cấp bách hàng đầu, vì các nạn nhân có thể chết do tuổi già hoặc bệnh nặng.
- Nghiên cứu quy trình tách chiết, tinh chế và bảo quản lâu dài DNA từ
các mẫu máu.
- Phân lập, tách dòng và đọc trình tự nucleotide của một số gene quan
trọng ở các nhóm bệnh nhân và đối chứng nh: TP53, AHR, CYP1A1, CYP1B1,
hOGG1, IgG, IgM, MSH2, p27KIP1, SOD
- Phân tích đột biến và xử lý số liệu bằng các chơng trình, phần mềm
chuyên dụng.
- Kết luận về ảnh hởng của dioxin lên các nhóm gene chọn lọc nói trên.
- Tổng kết, báo cáo khoa học, công bố kết quả trên các tạp chí, hội nghị
quốc tế và trong nớc.
B. Nghiên cứu các thay đổi gene trên các đối tợng động vật:
- Thu thập một số mẫu động vật thủy sinh (cá trắm cỏ, cá trê) tại các
điểm nóng, bị ô nhiễm nặng: Các thủy vực xung quanh sân bay Biên Hoà, sân
bay Đà Nẵng); đối chứng là mẫu cá cùng loài tại các vùng khác không bị ô
nhiễm. Số lợng mỗi nhóm ít nhất là 3 - 5 mẫu.

1
- Phân lập, tách dòng, và đọc trình tự nucleotide của một số gene, nh:
AHR, CYP1A1, TP53 ở các mẫu cá nói trên.
- Phân tích đột biến và xử lý số liệu bằng các chơng trình, phần mềm
chuyên dụng.
- Kết luận về ảnh hởng của dioxin lên các gene chọn lọc ở cá.
- Tổng kết, báo cáo khoa học, công bố kết quả trên các tạp chí, hội nghị
quốc tế và trong nớc.

1.4. Yêu cầu khoa học đối với sản phẩm
STT Tên sản phẩm Yêu cầu khoa học
1
Ngân hàng DNA ngời bị nhiễm
dioxin và đối chứng
Các chế phẩm DNA genome
ngời từ các phả hệ bị nhiễm
dioxin (100 - 400 mẫu); 0,3- 0,5
mg DNA tinh khiết/mẫu; có thể
bảo quản đợc lâu dài
2
Bộ su tập các đoạn gene ngời
Việt Nam bị ảnh hởng của
dioxin nằm trong vector chọn
dòng
Các plasmid (pBSKS
-
, pCRII-
vector) tinh khiết (0,5 - 1
mg/mẫu); các chủng E. coli
mang các đoạn gene AHR,
CYP1A1, CYP1B1, MSH2,
p27KIP1, p53, hOGG1, SOD,
IgG, IgM
3
Trình tự các đoạn gene (AHR,
CYP1A1, CYP1B1, MSH2,
p27KIP1, p53, hOGG1, SOD,
IgG, IgM) trong phả hệ ngời bị
nhiễm chất độc dioxin

Các trình tự gene đợc đăng ký
trong các Ngân hàng trình tự
gene quốc tế EMBL(EBI)/
Genbank/ DDBJ
4
Báo cáo tổng quan các nghiên cứu
về tác hại của dioxin đối với hệ
gene ở ngời
Phân tích đầy đủ chính xác các
kết quả nghiên cứu trong và
ngoài nớc
5
Tài liệu báo cáo tổng quan các
nghiên cứu về tác hại của dioxin
đối với hệ gene trên cá trắm cỏ và
cá trê
Phân tích khoa học đầy đủ chính
xác kết quả nghiên cứu trong và
ngoài nớc
6
Báo cáo khoa học tại các Hội nghị
khoa học trong nớc
Kết quả khoa học có giá trị cao

1
7
Báo cáo khoa học tại các Hội nghị
khoa học quốc tế
Kết quả khoa học có giá trị cao
8

Công bố (bài báo khoa học) trong
nớc
Kết quả khoa học có giá trị cao
9
Công bố (bài báo khoa học) quốc
tế
Kết quả khoa học đạt trình độ
khu vực và quốc tế
10
Báo cáo tổng kết nghiệm thu đề
tài
Đa ra đợc những bằng chứng
cụ thể và kết luận xác đáng về
các ảnh hởng ở mức độ gene ở
ngời và động vật


1
PHần 2. Tổng quan tài liệu
2.1. Tác động/ ảnh hởng của TCDD/ DIOXIN
TCDD/ Dioxin là một chất siêu độc, thờng lẫn tạp trong thành phần của
thuốc bảo vệ thực vật, cũng nh sinh ra trong chất thải công nghiệp, các quá
trình xử lý (đốt) rác thải, trong khói thuốc lá Xét về độc tính, dioxin chỉ đứng
sau các chất thải phóng xạ. Thời gian bán hủy của dioxin trong cơ thể ngời là 8
năm rỡi, thậm chí lâu hơn.
Tác động của dioxin gây hậu quả hết sức nghiêm trọng đối với môi trờng
sinh thái và đặc biệt là đối với sức khỏe con ngời. Những hậu quả trên ngời và
động vật do dioxin gây ra bao gồm: các bệnh ung th, suy giảm miễn dịch, rối
loạn chức năng thần kinh, quái thai, dị tật bẩm sinh và nhiều bệnh tật khác.
Dioxin là tác nhân gây ung th (carcinogen)!

Từ năm 1997, Cơ quan Nghiên cứu Ung th Quốc tế (International
Agency for Research on Cancer - IARC) và Tổ chức Y tế Thế giới (World
Health Organization - WHO) đã liệt kê dioxin vào Danh sách các chất gây ung
th nhóm 1 (nhóm cao nhất), tức là nhóm đã đợc xác nhận (có đủ bằng chứng)
là chất gây ung th trên ngời (McGregor et al., 1998).
Dioxin là tác nhân độc phôi/ thai (teratogen)!
Các nghiên cứu trên nhiều loài động vật nh gà, chuột nhắt, chuột cống,
thỏ và kể cả ở khỉ (là động vật rất gần với ngời về phơng diện tiến hóa) đều
cho thấy dioxin có tác động gây độc phôi/ thai (sảy thai, chết thai) (Chuyên
khảo độc học, 2002).
Dioxin có phải là tác nhân gây đột biến (mutagen) và độc gene
(genotoxic) hay không?
Sự rối loạn về chức năng các gene đã đợc nghiên cứu rất nhiều. Theo các
số liệu nghiên cứu từ nhiều năm của các nhà khoa học trên thế giới, dioxin tác
động trực tiếp lên tế bào chủ yếu thông qua một chất (protein) thụ cảm (thụ thể)
có tên là Aryl Hydrocarbon Receptor (AHR). Ngoài ra, có thể tồn tại cơ chế tác
động khác (không qua AHR).

1
2.2. Cơ chế tác động của dioxin ở mức độ phân tử
Những năm gần đây, với sự phát triển mạnh mẽ của Sinh học phân tử và
Công nghệ gene, ngời ta đã và đang làm sáng tỏ đợc nhiều vấn đề trong cơ chế
phân tử của tác động tức thời (trực tiếp) cũng nh hậu quả lâu dài tiếp theo (gián
tiếp) của dioxin đối với cấu trúc và chức năng của các gene và sản phẩm của
chúng (protein/enzyme). Có thể phân biệt các tác động này theo 2 nhóm: rối loạn
về chức năng các gene và tác động đột biến (độc gene - genotoxicity).
2.2.1. Sự rối loạn về chức năng các gene
Cơ chế tác động của dioxin lên tế bào thông qua AHR đã đợc nghiên cứu
rất kỹ và đợc khoa học thừa nhận. Các nghiên cứu cho thấy khi tiếp xúc với
dioxin, trong tế bào xảy ra sự biểu hiện tăng cờng gene mã hóa AHR kèm theo

các rối loạn về sự biểu hiện (thay đổi quá trình phiên mã) của hàng loạt gene
tham gia vào quá trình điều khiển sự sinh trởng của tế bào (cell growth
control), cũng nh các gene tham gia vào chu trình phân bào (cell cycle), nh:
TGF (Transforming Growth Factor), cyclin A, c-myc
Thông qua AHR, dioxin hoạt hóa sự biểu hiện các gene nh: cytochrome
P4501A1 (CYP1A1), Plasminogen Activator Inhibitor-2 (PAI-2) Trong khi
đó, nó lại làm suy giảm (ức chế) biểu hiện gene mã hóa yếu tố sinh trởng
chuyển hóa TGF-beta2 Kết quả là quá trình phân bào bị rối loạn gây nên các
hậu quả tiếp theo rất đa dạng. Dioxin còn làm thay đổi (ức chế, giảm biểu hiện)
gene mã hóa Glucose Transporter- 4 (GLUT-4, protein vận chuyển đờng
glucose).
Dioxin đặc biệt nguy hiểm khi tác động lên các gene của các tế bào sinh
sản. Nó bám vào chất thụ cảm hormone (hormone receptor) của tế bào, làm thay
đổi chức năng và cơ chế di truyền của tế bào, gây ra hàng loạt hậu quả nh: làm
thay đổi biểu hiện gene mã hoá 17-20 lyase gây giảm lợng hormone của tế bào
trứng nh progesterone (P) và estradiol (E2) dẫn đến các hậu quả nghiêm trọng;
tác động lên sự phát triển của tinh hoàn (gây teo), có bằng chứng cho thấy gene
mã hoá Src kinase đóng vai trò quyết định trong quá trình này. Một gene mới
đợc phát hiện liên quan đến tác động của dioxin mã hóa cho protein có tên là
25-Dx (thuộc siêu họ protein: cytokine/ yếu tố sinh trởng/ chất thụ cảm
prolactin) có thể gắn với progesterone (P), là chất thụ cảm của hormone này. Tác
động của dioxin lên các gene nhất định đôi khi còn phụ thuộc vào giới tính:

1
chẳng hạn dioxin làm tăng hoạt tính Tyrosine Kinase (TK) ở con đực, trong khi
lại làm giảm hoạt tính này ở con cái. Dioxin có thể liên quan đến sự phát sinh và
phát triển của nhiều bệnh ung th, thông qua các thay đổi ở các gene quan trọng
nh TP53, p27KIP1, p21/waf1, cdc2 p34 kinase và cdk4.
2.2.2. Tác động đột biến (độc gene - genotoxicity)
Mặc dù vẫn cha có bằng chứng về đột biến gene trên ngời, nhng các

nghiên cứu trên chuột thực nghiệm xử lý dioxin cho thấy, khi xâm nhập vào tế
bào, dioxin có thể chuyển hóa, tơng tác với các protein-enzyme và gene khác,
gây nên thay đổi trong DNA, dẫn đến các đột biến và thậm chí tử vong sau 34
ngày.
đặc biệt, thí nghiệm trên chuột còn cho thấy dioxin gây ra sự oxy hóa các
bazơ nitơ trong thành phần nucleic acid, chuyển đổi Guanosine thành 8-
hydroxydeoxyguanosine và quá trình sửa chữa phân tử sau đó không thành công
có thể dẫn đến sai lệch ở các vị trí của bazơ này trong gene (Shertzer et al.,
1998). Tình trạng bị oxy hoá thái quá (oxidative stress) (Muskhelishvili et al.,
2001; Slezak et al., 2000; Hassoun et al., 2001) có thể là một trong những cơ chế
quan trọng gây ra những thay đổi gene (biến dị và di truyền lại cho các thế hệ
con cái) cần phải đợc tập trung nghiên cứu trên các nạn nhân bị nhiễm dioxin.
Giả thuyết về cơ chế phá hủy DNA bởi dioxin thông qua việc tạo ra các
gốc tự do và ảnh hởng của quá trình sửa chữa DNA bị hỏng lên chu trình phân
bào, sự phát sinh ung th và đột biến gene đợc trình bày trên Hình 1 và 2.


Hình 1: Tác động của dioxin lên DNA thông qua việc tạo ra các gốc tự do

1

Hình 2: Các ảnh hởng của sự thay đổi DNA trong tế bào
2.3. Các bệnh có liên quan đến dioxin
Gần đây, Viện Y học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học Hoa Kỳ (Catlin,
2003) đã có báo cáo tổng hợp về các bệnh có liên quan và không liên quan đến
sự phơi nhiễm dioxin nh sau:
Mức 1: Có bằng chứng chính xác về sự liên quan (tổng số có 5 bệnh,
trong đó có 4 bệnh ung th tổ chức mềm). Các bằng chứng đủ để kết luận rằng
có sự liên quan rõ ràng giữa dioxin với các hậu quả của nó trong đó đã loại trừ đi
khả năng về sự may rủi, lầm lẫn hay thành kiến. Dới đây là những bệnh đã có

bằng chứng chắc chắn về mối liên quan giữa sự phơi nhiễm dioxin và những hậu
quả về sức khỏe sau đó.
1. Ung th bạch cầu tế bào lympho mãn tính (Chronic lymphocytic
leukemia, CLL)
2. Sarcom/ ung th mô mềm (Soft- tissue sarcoma)
3. U lympho không Hodgkin (Non-Hodgkin's lymphoma)
4. U lympho Hodgkin (Hodgkin's lymphoma)
5. Bệnh ban clo (Chloracne)
Mức 2: Có bằng chứng mang tính chất gợi ý có liên quan (tổng số có 7
bệnh, trong đó có 3 bệnh ung th). Các bằng chứng này mang tính chất gợi ý vì
cha loại trừ một cách hoàn toàn khả năng về sự may rủi, lầm lẫn hay thành
kiến. Ví dụ, có ít nhất một nghiên cứu có chất lợng cao chỉ ra 1 liên quan trực
tiếp, còn một số nghiên cứu khác thì cha chắc chắn. Sau đây là những bệnh đã

1
có bằng chứng hạn chế hay mang tính gợi ý về sự liên quan giữa dioxin với hậu
quả về sức khỏe.
6. Ung th hệ hô hấp (phổi, khí quản, phế quản, thanh quản)
(Respiratory cancer of lung or bronchus, larynx, and trachea)
7. Ung th tiền liệt tuyến (Prostatic cancer)
8. Đa u tủy xơng (Multiple myeloma)
9. Bệnh thần kinh ngoại vi cấp tính và bán cấp tính thoáng qua (Acute
and subacute transient peripheral neuropathy)
10. Rối loạn chuyển hóa porphyrin (Porphyria cutanea tarda)
11. Tiểu đờng không phụ thuộc insulin (typ 2) (Type 2 diabetes)
12. Nứt gai đốt sống ở con cái các cựu chiến binh (Spina bifida in the
children of veterans)
Đáng chú ý là, khi tính trên tổng số 12 bệnh ở Mức 1 và 2 (nghĩa là các
bệnh có bằng chứng liên quan đến dioxin rõ ràng và tơng đối rõ ràng) có 7
bệnh ung th, chiếm tỷ lệ 58,3%.

Mức 3: Có bằng chứng không đầy đủ để xác định có liên quan hay không
(tổng số có 26 bệnh, trong đó có 11 bệnh ung th). Sau đây là những bệnh có
bằng chứng nhng cha đủ mạnh về chất lợng, độ tin cậy và độ thỏa mãn để kết
luận về sự liên quan hay không liên quan.
13. Ung th gan mật (Hepatobiliary cancer)
14. Ung th mũi hoặc mũi hầu/ tị hầu (Nasal or nasopharyngeal
cancer)
15. Ung th xơng (Bone cancer)
16. Ung th vú (Breast cancer)
17. Ung th hệ sinh sản nữ (cổ tử cung, tử cung, buồng trứng) (Female
reproductive cancer)
18. Ung th bàng quang tiết niệu (Urinary bladder cancer)
19. Ung th thận (Renal cancer)
20. Ung th tinh hoàn (Testicular cancer)
21. Ung th bạch cầu
(khác với CLL) (Leukemia (other than CLL))
22. Ung th da (Skin cancer)
23. Sảy thai tự nhiên (Spontaneous abortion)
24. Dị tật bẩm sinh (Birth defects (other than spina bifida))
25. Thai chết lu và chết sau sinh 6 tuần (Neonatal or infant death and

1
stillbirth)
26. Trẻ sinh thiếu cân (Low birthweight)
27. Ung th bạch cầu cấp tính dòng tủy ở trẻ sơ sinh (Childhood
cancer in offspring, including acute myelogenous leukemia)
28. Dị dạng tinh trùng và vô sinh (Abnormal sperm characteristics and
infertility)
29. Rối loạn nhận thức và tâm lý tri giác (Cognitive and
neuropsychiatric disorders)

30. Rối loạn vận động hoặc phối hợp vận động (Motor or coordination
dysfunction)
31. Rối loạn hệ thần kinh ngoại biên mãn tính (Chronic peripheral
nervous system disorders)
32. Rối loạn chuyển hóa và tiêu hóa (thay đổi về các enzyme trong gan
và dị thờng lipid, loét) (Metabolic and disgetive disorders (changes
in liver enzymes, lipid abnormalities, and ulcers)
33. Rối loạn hệ miễn dịch (ức chế miễn dịch và tự miễn) (Immune
system disoders (immune suppression and autoimmunity))
34. Rối loạn hệ tuần hoàn (Circulatory disorders)
35. Rối loạn hệ hô hấp (Respiratory disorders)
36. ứ đọng chất dạng tinh bột nguyên phát typ AL (AL-type primary
amyloidosis)
37. Lạc nội mạc tử cung (Endometriosis)
38. Tác động đến hằng định nội môi tuyến giáp (Effects on thyroid
homeostasis)
Mức 4: Có bằng chứng hạn chế hay gợi ý là không liên quan (gồm 2
nhóm bệnh ung th). Các nghiên cứu đầy đủ trên tất cả mức độ phơi nhiễm mà
con ngời gặp phải đã không chỉ ra một sự ảnh hởng trực tiếp nào thì đợc kết
luận là không ảnh hởng.
39. Ung th hệ tiêu hóa (dạ dày, tụy, đại tràng, trực tràng)
(Gastrointestinal tumor (stomach cancer, pancreatic cancer, colon
cancer, rectal cancer))
40. Ung th não (Brain tumors)

1
2.4. Tổng quan về các gene đã chọn
2.4.1. Gene m hóa TP53 - chất áp chế ung th
Vai trò của TP53: Ngời bảo vệ của genome (The guard of genome).
ở ngời, gene mã hóa TP53 nằm trên nhiễm sắc thể (NST) số 17 tại vị trí

17p13. Gene này mã hóa cho TP53 có kích thớc 393 amino acid (aa), với cấu
trúc bao gồm: vùng gắn DNA đặc hiệu, vùng oligomer hóa và vùng phosphoryl
hóa.
Khi kiểm tra thấy có sự sai hỏng DNA, TP53 ngừng chu kỳ phân bào tại
các điểm kiểm soát (checkpoint) và hoạt hóa các gene mã hóa các enzyme có
chức năng sửa chữa sai hỏng DNA. Nếu DNA đợc sửa chữa hoàn chỉnh, chu kỳ
tế bào đợc tiếp tục. Nếu DNA không đợc sửa chữa, tế bào sẽ chết theo cơ chế
chết tế bào theo chơng trình (apoptosis).
Nếu TP53 bị sai hỏng hoặc mất chức năng thì các tế bào mang DNA sai
hỏng vẫn đợc nhân lên mang theo các đột biến có hại. Đây là cơ chế gây ra ung
th. Các nghiên cứu cho thấy hơn 50% trờng hợp ung th ở ngời là do có sự
sai hỏng của gene mã hóa TP53. Do đó, TP53 còn đợc gọi là chất áp chế ung
th (Tumor suppressor).
Cơ chế cảm ứng TP53 khi có sự sai hỏng DNA
Loại đột biến DNA gây cảm ứng: gẫy DNA tạo đầu bằng hoặc đầu dính tại
đầu 5' hoặc 3'. Đột biến mất nucleotide ở một sợi không gây cảm ứng TP53.
Cơ chế tích luỹ TP53 nội bào: 1) tăng hiệu quả dịch mã của mRNA TP53
(theo cơ chế điều khiển sau phiên mã); 2) tăng độ bền (thời gian tồn tại) của
TP53 vì TP53 có thời gian bán hủy ngắn trong điều kiện bình thờng (5-20 phút)
và phân hủy TP53 là một quá trình tiêu thụ năng lợng theo con đờng phân hủy
protein phụ thuộc ubiquitin.
Cơ chế TP53 ngăn cản chu kỳ tế bào tại các điểm kiểm soát: thông qua
điều khiển tăng hoặc giảm phiên mã các gene có liên quan.
Điều khiển âm tính: TP53 hạn chế quá trình phiên mã một số gene thông
qua việc tơng tác với các nhân tố phiên mã tạo thành các phức hệ nh: phức hệ
TP53-TBP (TATA binding protein, là một tiểu đơn vị của nhân tố phiên mã

1
TFIID - Transcription initiation factor IID), phức hệ TP53-SP1-CBF (nhân tố
bám promoter CCAAT - CCAAT binding factor).

Điều khiển dơng tính: TP53 tăng cờng phiên mã một số gene bằng cách
tơng tác trực tiếp với vùng DNA gắn đặc hiệu với TP53. Ví dụ: gene p27KIP1,
GADD45 (Growth Arrest and DNA Damage inducible gene GADD45) làm gián
đoạn chu kỳ tế bào; gene MDM2 (Mouse Double Minute 2 homolog) hoặc
HDM2 (Human Double Minute 2 homolog) khôi phục chu kỳ tế bào và gây tác
dụng phản hồi ức chế TP53.
Chết tế bào theo chơng trình (apoptosis): Đây là một quá trình phức tạp
thông qua nhiều con đờng trao đổi, kết quả là gây chết một tế bào nhất định và
loại bỏ nó mà không gây các thơng tổn mô và viêm nhiễm. Quá trình này đóng
vai trò quan trọng trong việc điều hòa mối cân bằng giữa mức sinh sản và mức tử
vong của tế bào và đợc điều khiển bởi nhiều cơ chế khác nhau.
Một trong các cơ chế gây chết tế bào là cơ chế phụ thuộc TP53. Cơ chế
này có mặt ở nhiều loại mô và có tính phụ thuộc loại mô. Cơ chế giả định là
TP53 ức chế sự phiên mã gene BCL2 (B-cell CLL/Lymphoma 2) - nhân tố quy
định sự tồn tại của tế bào chống lại apoptosis và đồng thời tăng cờng sự phiên
mã gene BAX (BCL2-Associated X protein) - tác nhân ức chế BCL2.
TP53 đợc tổng hợp ở tất cả các loại mô, tế bào và có tính bảo thủ cao
trong quá trình tiến hóa. Mặc dù không phải là phân tử thiết yếu cho sự tồn tại
của tế bào nhng TP53 đóng vai trò cực kỳ quan trọng trong việc duy trì sự ổn
định tính di truyền ở mức độ tế bào. Điều này là vô cùng quan trọng vì những
thơng tổn về di truyền sẽ gây ra sự phát triển của các khối u và gây ung th. Vai
trò quan trọng của TP53 nh là một chất áp chế ung th đã đợc khẳng định
thông qua nghiên cứu thống kê cho thấy tỷ lệ trong 6 ngời bị suy giảm chức
năng TP53 thì 1 ngời bị phát triển bệnh thành ung th.
TP53 đợc hoạt hóa khi có sự thơng tổn DNA và hoạt động nh là nhân
tố phiên mã, có thể gắn với vùng DNA đặc hiệu (vùng tơng tác TP53) và tăng
cờng sự phiên mã của các gene đích. Trong trờng hợp này, TP53 hoặc gây
gián đoạn chu kỳ tế bào hoặc cảm ứng apoptosis. Cả 2 chức năng này đều bảo vệ
tế bào chống lại sự khuếch đại các đột biến DNA trong quần thể tế bào.
Sự tổn thơng DNA và phản ứng của TP53

1
Thông thờng, sự gãy phân tử DNA mạch đôi có thể gây cảm ứng TP53.
Điều này đợc chứng minh bằng thí nghiệm vi tiêm một lợng nhất định phân tử
DNA vào nhân của các tế bào nuôi cấy bình thờng. Bằng việc sử dụng các phân
tử DNA mang những đột biến nhất định, ngời ta đã chứng minh rằng các đứt
gãy phân tử của DNA tạo đầu bằng hoặc đầu dính 3 hoặc 5 đều có tác dụng
gây cảm ứng TP53 nh nhau. Ngợc lại, đột biến nucleotide trên một sợi đơn thì
không hoạt hóa cảm ứng.
Nồng độ TP53 nội bào tăng lên tơng ứng với mức độ thơng tổn DNA.
Điều này không phụ thuộc vào quá trình phiên mã của gene mã hóa TP53 mà
liên quan đến cơ chế điều hòa sau phiên mã, làm tăng hiệu quả dịch mã của các
phân tử mRNA đã đợc tổng hợp. Điều hòa sau phiên mã rất quan trọng trong
điều hòa tổng thể sự biểu hiện của gene và đặc biệt cho phép phản ứng nhanh
hơn so với điều hòa phiên mã. Quá trình này liên quan đến tơng tác protein-
mRNA nội bào nhng cơ chế cụ thể làm tăng nồng độ TP53 thì cha đợc làm
sáng tỏ.
Tính ổn định của TP53 cũng có thể góp phần làm tăng nồng độ protein
này tơng ứng với mức độ thơng tổn DNA. TP53 có thời gian tồn tại ngắn, và
sự phân hủy protein là một quá trình tiêu dùng năng lợng có liên quan đến con
đờng phân hủy protein phụ thuộc ubiquitin. Điều này tơng đồng với sự tăng
đột ngột nồng độ và giải thích sự tích luỹ TP53 trong các tế bào khi thiếu hụt các
thành phần của con đờng ubiquitin.
Cảm ứng sự gián đoạn chu kỳ phân bào
Việc tăng nồng độ TP53 khởi phát hàng loạt phản ứng nội bào khi có sự
thơng tổn DNA. Sự biểu hiện của một gene có thể đợc tăng cờng hoặc áp chế
phụ thuộc vào loại promoter điều khiển gene đó.
áp chế biểu hiện gene: Các gene đợc điều khiển bởi các nhân tố phiên
mã thì có thể bị áp chế sự biểu hiện. Trong một số trờng hợp, áp chế biểu hiện
gene là kết quả của việc TP53 tạo phức hợp với các nhân tố phiên mã này và làm

bất hoạt hóa chúng. Các gene bị áp chế bởi TP53 bao gồm các gene bị điều khiển
bởi promoter TATA; TP53 gắn với TBP gây ra sự áp chế. Các nghiên cứu in vitro
cho thấy tơng tác TP53-TBP ngăn cản sự phiên mã của các promoter rất nhỏ.
Các vùng chức năng nằm phía hai đầu TP53 có thể t
ơng tác với các vùng chức
năng của TBP. Protein E1A của adenovirus có thể phá vỡ mối tơng tác TP53-

1
TBP qua đầu C của phân tử TP53 và làm hạn chế quá trình ức chế phiên mã của
TP53.
TP53 cũng tơng tác với các nhân tố phiên mã khác nh CBF và SP1. Điều
này chứng tỏ TP53 áp chế sự phiên mã của những nhóm gene nhất định bằng
việc phong tỏa các nhân tố phiên mã tơng ứng của những gene này.
Vùng bám DNA đặc hiệu
Việc bám DNA đặc hiệu và sự hoạt hóa phiên mã là vai trò cơ bản của
chất áp chế ung th - TP53 bình thờng. TP53 là phân tử tạo thành bởi các vùng
chức năng (modular) và vùng gắn DNA đã đợc xác định là nằm cùng domain
trung tâm phân tử. Sự hoạt hóa phiên mã của TP53 đợc điều khiển bởi sự tơng
tác với nhân tố hoạt hóa đồng thời TAF40 và TAF60 (nhân tố liên kết TBP).
Vùng trình tự gắn đặc hiệu TP53 đợc nghiên cứu kỹ nhất là đoạn DNA
chứa 2 lần lặp lại trình tự 5PuPuPu[A/T][T/A] GpyPyPy 3. Mỗi đoạn lặp lại
tiêu biểu cho 1 phần tơng tác in vivo, mỗi nửa tơng tác này có thể cách nhau
một chuỗi nucleotide mà vẫn có thể gắn với TP53. Phơng pháp xác định khối
lợng bằng kính hiển vi điện tử quét (STEM Scanning Transmission Electron
Microscope) cho thấy TP53 tơng tác với vùng DNA đặc trng thông qua
tetramer, bằng cách tạo liên kết giữa 4 phân tử TP53 đã tạo thành một vòng uốn
DNA. Việc tetramer TP53 gắn với DNA đợc chứng minh lần đầu tiên bằng các
nghiên cứu in vitro phân đoạn kích thớc và phân tích sự xê dịch băng điện di
trên gel (gel shift). Tuy nhiên, các diễn biến trong tế bào thực tế có thể phức tạp
hơn nhiều vì mỗi monomer TP53 đều có chức năng tăng cờng phiên mã kiểu

trans mặc dù không gắn với DNA trong nghiên cứu in vitro.
Sự gắn TP53 với vùng DNA đặc hiệu phụ thuộc vào cấu hình protein.
Dạng 1620+ (phản ứng với kháng thể đơn dòng Pab1620 phụ thuộc cấu hình)
tơng ứng với chức năng áp chế ung th của TP53 và đóng vai trò quyết định
trong việc gắn in vitro với vùng DNA bảo thủ TP53-CON. Các thí nghiệm đối
kháng cho thấy TP53 chuột có thể thay thế cho TP53 ngời (hp53) trong phức hệ
TP53-DNA. Điều này t
ơng ứng với khả năng gắn của TP53 chuột cao hơn hp53
trong phức hệ TP53-DNA tại một nhiệt độ nhất định. Các oligomer giữa TP53
ngời và chuột cũng có thể gắn in vitro với DNA và ái lực liên kết đã đợc xác
định vào khoảng 5x10-10M tơng tự với ái lực của các oligomer của TP53 ngời
và chuột riêng rẽ.

1
Đột biến mất chức năng của TP53
Cho đến nay, ngời ta đã biết đến 21587 đột biến khác nhau của gene
TP53 ( />). Một đột biến điểm vô nghĩa cũng có thể làm mất
chức năng áp chế ung th của TP53. Trong các tế bào của ngời bị ung th, gene
TP53 dờng nh cực kỳ nhạy cảm với các đột biến điểm nằm trong vùng lõi
trung tâm (vùng gắn DNA). Thực tế, gene TP53 đợc coi là gene bị đột biến
thờng xuyên nhất trong quần thể ngời bị ung th và không phụ thuộc loại ung
th nào.
Trong các tế bào ung th, việc mất chức năng của một allele thờng liên
quan đến đột biến vô nghĩa trên allele kia. Mặc dù các đột biến thờng tập trung
chủ yếu trên 25% vùng mang mã, nhng trong thực tế có rất nhiều các điểm
nóng đột biến. Các điểm nóng đột biến thì liên quan đến các loại ung th đặc
trng. Ví dụ, các codon 175, 248 và 273 là các điểm nóng đột biến thờng tạo
nên đột biến vô nghĩa, tuy nhiên bệnh ung th biểu mô tế bào gan
(Hepatocellular carcinoma) khi phơi nhiễm aflatoxin B thờng liên quan đến đột
biến tại codon 249. Các đột biến của gene TP53 trên tế bào dòng tinh thờng liên

quan đến bệnh ung th bẩm sinh còn gọi là hội chứng Li-Fraumeni.
Ngoài các đột biến, TP53 cũng có thể bị bất hoạt bởi các tơng tác
protein-protein đặc hiệu (ví dụ MDM2) và các protein đợc mã hóa bởi DNA
của virus gây ung th biến nạp vào trong tế bào. Thực tế, hiện tợng này gây ra
khái niệm coi TP53 là protein nội bào tạo phức hệ với kháng thể T lớn của virus
SV40 gây ung th ở ngời. Protein E1B của các adenovirus loại 5 và E6 trong
nhóm 16 và 18 của các virus gây u sùi ở ngời (Human papillomavirus) (HPV-
16 và -18) cũng tơng tác với TP53 kiểu dại. Các protein E1B và kháng thể T lớn
dờng nh tạo các phức hệ tơng đối bền với TP53. Ngợc lại, HPV E6 làm
TP53 bị thủy phân nhanh chóng bởi hệ thống phụ thuộc ubiquitin.
Chức năng của TP53 thờng rất nhạy cảm với các đột biến vô nghĩa. Điều
này đã đợc làm sáng tỏ khi vùng chức năng lõi trung tâm, nơi đóng vai trò liên
kết với DNA đích đợc xây dựng mô hình cấu trúc bằng phơng pháp tinh thể tia
X. Ngời ta đã xác định rõ ràng các đột biến gây mất chức năng bám DNA và
các đột biến làm thay đổi cấu trúc không gian của TP53.
Mô hình cấu trúc phân tử đã chỉ ra rằng vùng chức năng bám DNA của
TP53 khác so với các protein bám DNA khác ở chỗ nó có cấu trúc tơng đối mở,

1
đòi hỏi tạo thành cấu trúc kẹp kiểu sandwich B để định vị và định hớng các
thành phần cấu trúc tơng tác với DNA. Cấu trúc kẹp B này tạo thành một nếp
gấp dạng vòng-tấm-xoắn và tạo 2 vòng loop L2 và L3. Cấu trúc này đợc định
hớng và ổn định nhờ các tơng tác của các chuỗi bên và sự tơng tác 4 tiểu
phần dạng nguyên tố kẽm (Zn) (thông qua 3 Cysteine và 1 Histidine). Sự định
hớng này có tính thiết yếu vì dạng vòng-tấm-xoắn và vòng loop L2, L3 tạo
thành bề mặt gắn DNA của TP53. Việc nhận diện vùng DNA đặc hiệu liên quan
đến cả rãnh lớn và rãnh nhỏ của vùng DNA đích.
Các đột biến vô nghĩa xảy ra trên khắp vùng liên kết với DNA với các
điểm nóng ở codon 175, 248 và 273 đều mã hóa Arginine. Mô hình cấu trúc tinh
thể đã chỉ ra rằng các tơng tác chuỗi bên của Arginine 175 có vai trò quan trọng

trong việc duy trì cấu hình đúng (cấu trúc không gian bậc 4) cần thiết cho việc
gắn với DNA đặc hiệu. Đột biến ở vị trí này làm mất tính ổn định của cấu trúc
bậc 4 của TP53 dẫn đến mất khả năng bám DNA và khả năng áp chế ung th.
Đột biến thay thế Arginine 248 và Arginine 273 cũng gây mất khả năng bám
DNA, nhng trong trờng hợp này không làm sai hỏng cấu trúc bậc 4 của TP53,
chứng tỏ rằng các vị trí này là nơi tơng tác trực tiếp với phân tử DNA. Tóm lại,
các đột biến cấu trúc làm sai hỏng cấu trúc bậc 4 của TP53 nên làm mất tính
bám DNA, trong khi đó các đột biến liên kết DNA không làm sai hỏng cấu trúc
không gian của TP53 mà chỉ gây sai hỏng các aa quan trọng liên kết trực tiếp với
DNA.
TP53 là một protein đa chức năng
Tính đa chức năng của TP53 đợc giải thích một phần thông qua lịch sử
nghiên cứu protein này. Đầu tiên, TP53 đợc coi là tác nhân gây ung th nhng
cuối cùng lại là chất áp chế ung th. Trong thực tế, dạng TP53 kiểu dại có 3 dạng
cấu trúc không gian khác nhau (phân biệt bằng phép lai miễn dịch) mỗi loại
tơng ứng với một kiểu chức năng điều khiển sự phát triển của tế bào. Các dạng
cấu trúc khác nhau có thể là kết quả của: 1) sự thay đổi cấu hình bổ sung, 2) sửa
đổi sau phiên mã, 3) tổ hợp khác nhau các exon trong mRNA (alternative
splicing).
Tính linh động cấu trúc không gian là các cơ chế phân tử cho phép một
protein có thể thực hiện các chức năng khác nhau. Đặc tính này có thể do các cơ
chế điều hòa hoạt động TP53 trong các phản ứng phát triển bình thờng của tế

1
bào và dờng nh đây là đặc tính cơ bản của TP53 kiểu dại. Ngời ta cũng cho
rằng có rất nhiều đột biến cấu trúc có thể giữ vững sự ổn định cấu hình của TP53
khi có phản ứng kích thích sinh trởng tế bào. Các nghiên cứu in vivo cho thấy
cấu trúc của TP53 là đối tợng tấn công của các chất độc và của nguyên tố đồng
(Cu), một kim loại độc. Ngời ta cũng giả thiết rằng các cơ chế này điều khiển
các cơ chế điều hòa nội bào cấu hình TP53 để phản ứng với các tín hiệu điều

khiển sự sinh trởng của tế bào và phản ứng với các thơng tổn DNA.
Các sửa đổi sau phiên mã chủ yếu đối với TP53 là sự phosphoryl hóa và có
các vị trí khác nhau tơng ứng với các kinase đặc hiệu nằm ở đầu N và đầu C của
TP53. Quá trình phosphoryl hóa có thể có hiệu quả quyết định lên cấu hình
protein. Mặt khác, cơ chế này có thể tác động lên TP53 theo các cách khác, ví dụ
nh sự hoạt hóa của các hoạt tính gắn DNA đặc hiệu.
Với các vị trí phosphoryl hóa phức nằm trên TP53 và bản chất động lực
của phản ứng phosphoryl hóa/ dephosphoryl hóa, phân tử TP53 có các cơ chế
thực hiện các chức năng là nhiệm vụ vô cùng quan trọng. Ngời ta đã thu đợc
những bằng chứng gián tiếp nh: quá trình phosphoryl hóa liên quan đến phản
ứng tế bào đối với sự thay đổi DNA và TP53 đợc coi là cơ chất của các enzyme
kinase DNA-PK và JNK. Một thí nghiệm quan trọng về hoạt tính DNA-PK liên
quan đến quá trình sửa chữa những đứt gẫy của sợi kép DNA. Tuy nhiên, vai trò
của quá trình phosphoryl hóa phân tử TP53 vẫn cha đợc nghiên cứu rõ ràng.
Cơ chế cắt gắn luân phiên của TP53 chuột đã đợc nghiên cứu và cho thấy
có sự thay thế 17 aa mới tại 26 aa nằm ở đầu C của phân tử TP53 cha cắt gắn.
Ngời ta đã xác định đợc 2 phân tử protein khác nhau trên tế bào biểu mô của
chuột và có thể đợc điều hòa khác nhau tuỳ thuộc thời điểm trong chu kỳ tế
bào. Sự khác biệt về chức năng giữa 2 biến dị của TP53 do cắt gắn là ở chỗ phân
tử TP53 bị cắt gắn luân phiên không thể bám tốt lên sợi đơn RNA hoặc phân tử
DNA.
Tổng kết
TP53 kiểu dại bằng cách nào đó có tính nhạy cảm và phản ứng đối với
những sai hỏng DNA. Phản ứng này gây ra sự tích luỹ TP53 theo cơ chế điều
khiển sau phiên mã. TP53 tác động đến quá trình phiên mã của nhiều gene bằng
cách tơng tác với các protein liên quan đến quá trình điều hòa phiên mã của
gene đó hoặc bằng cách bám trực tiếp với phân tử DNA và hoạt hóa gene kiểu

1
trans. Phân tử TP53 gây ra sự gián đoạn chu kỳ tế bào hoặc gây apoptosis tuỳ

thuộc loại tế bào. Bằng cách ngăn chặn sự tăng sinh của các tế bào bị sai hỏng
DNA, phân tử TP53 đóng vai trò cực kỳ quan trọng trong việc duy trì tính toàn
vẹn của DNA và áp chế ung th.
Việc mất chức năng của TP53 có liên quan đến sự phát triển của hơn nửa
số bệnh ung th ở ngời, và TP53 cũng là đối tợng nghiên cứu của các liệu
pháp chống ung th mới. Một hớng nghiên cứu là sử dụng liệu pháp gene (gene
therapy) để duy trì cấu trúc kiểu dại của TP53. Lĩnh vực nghiên cứu quan trọng
trong tơng lai để phát triển các liệu pháp chống ung th liên quan TP53 là xác
định các cơ chế TP53 phản ứng đợc tự hoạt hóa nh thế nào khi có sự thơng
tổn DNA, và xác định các cơ chế quyết định khi nào thì TP53 làm gián đoạn chu
kỳ tế bào, khi nào gây chết tế bào. Nhiều nghiên cứu cho thấy TP53 có khả năng
áp chế ung th. Tuy nhiên, cũng có bằng chứng cho thấy TP53 là đa chức năng
và thậm chí có chức năng kích thích sự sinh trởng của tế bào. Các hiểu biết đầy
đủ về chức năng của TP53 sẽ có ứng dụng đối với các bệnh liên quan đến ung
th, tái sinh và sửa chữa mô.
2.4.2. Gene m hóa AHR
AHR (Aryl Hydrocarbon Receptor) là một protein thuộc họ PAS (Per-
ARNT-Sim (Single Minded)), gồm 848 aa, khối lợng phân tử 96147 Da. mRNA
của gene mã hóa AHR gồm 3317 ribonucleotide (Itoh, Kamataki, 2003). Gene
này có 11 exon, trong đó 10 exon đã đợc công bố.
AHR là một yếu tố phiên mã hoạt hóa bởi cấu tử (ligand-activated
transcription factor) điều chỉnh các quá trình sinh học và khử độc các
hydrocarbon nhân thơm chứa gốc halogen nh dioxin. (Micka et al., 1997) Các
cấu tử AHR bao gồm dioxin, benzo[a]pyrene, polychlorinated và
polybrominated biphenyls, còn cấu tử nội sinh cha biết rõ. Sau khi liên kết với
cấu tử, AHR sẽ hoạt hóa quá trình phiên mã các gene mã hóa enzyme chuyển
hóa thuốc bao gồm các enzyme xúc tác quá trình chuyển hoá các cơ chất có tiềm
năng chuyển hoá thành các chất gây ung th vừa và mạnh và enzyme xúc tác quá
trình khử độc thuốc chữa ung th hoặc các tạp chất môi trờng khác. Biểu hiện
gene đợc điều hòa bởi AHR cũng liên quan tới nhiều quá trình sống quan trọng

(biệt hoá tế bào, phân bào và apoptosis) thông qua các cơ chế truyền tín hiệu.

1
Cơ chế tác động của dioxin thông qua AHR đã đợc nghiên cứu rất kỹ và
đợc thừa nhận. Các nghiên cứu cho thấy khi tiếp xúc với dioxin, trong tế bào
xảy ra sự biểu hiện tăng cờng gene mã hóa AHR kèm theo các rối loạn về sự
biểu hiện (thay đổi quá trình phiên mã) của hàng loạt gene tham gia vào quá
trình điều khiển sự sinh trởng của tế bào, cũng nh các gene tham gia vào chu
trình phân bào. AHR là một trong các yếu tố cảm ứng quan trọng nhất đối với
gene CYP1A1 và nhiều gene khác (Bảng 1).
Bảng 1: Một số gene chịu sự tác động của AHR
Sản phẩm gene Hớng điều khiển
Có sự điều khiển của AHR
(+): hoạt hóa
(

): ức chế
Cytochrome P4501A1 (CYP1A1) +
CYP1A2 +
CYP1B1 +
Glutathione s-transferase Ya +
NAD(P)H:Quinone oxidoreductase 1 +
UDP-glucuronosyltransferase 3 +
-aminolevulinic acid synthase
+
Prostaglandin Endoperoxide H synthase 2 +
Có khả năng có sự điều khiển của AHR

Plasminogene activator inhibitor-2 +
Transforming growth factor 2

+
Tumor necrosis factor
+
Ornithine decarboxylase +
Malic enzyme +
Tyrosine kinase +
Keratin 17 +
Lipoprotein lipase +
25-Dx +
Glyceraldehyde 3-phosphate
dehydrogenease
+
Adipose type II 5'deiodinase +

1
Choline kinase +
c-fos +
Jun-B +
c-jun +
Jun-D +
Keratinocyte transglutaminase
+/
AP2

Phosphophenolpyruvate carboxykinase

e-erb A

Transforming growth factor
Transforming growth factor 1

CYP2C11

Liver type I 5'deiodinase

Peroxisome proliferator-activated
receptor

Estrogene receptor

Glucocorticoid receptor

Epidermal growth factor receptor

LDL receptor

Ngoài ra, khi bị tác động bởi dioxin, phản ứng miễn dịch phụ thuộc tế bào
T bị
cũng bị kìm hãm thông qua việc hoạt hoá AHR gây ức chế sự hoạt hoá và
tăng lợng tế bào T sau khi kích thích kháng nguyên, dẫn đến làm giảm lợng tế
bào T sinh ra từ cytokine trong quá trình tạo kháng thể. Trong nghiên cứu gần
đây, Ito và cộng sự (2004) đã chỉ ra rằng việc hoạt hoá gen AHR cũng là nguyên
nhân dẫn đến apoptosis và kìm hãm chu trình tế bào. Những thay đổi biểu hiện ở
các gene liên quan đến apoptosis và kìm hãm chu trình tế bào thông qua cơ chế
phụ thuộc các yếu tố đáp ứng chất ngoại sinh (xenobiotic response elements -
XRE) sẽ ức chế sự phát triển của tế bào T.
2.4.3. Giới thiệu chung về Cytochrome P450 và gene m hóa CYP1A1
Các Cytochrome P450 ở ngời là các enzyme chuyển hóa thuốc. Các
enzyme này đợc sử dụng để tổng hợp các phân tử cholesterol, steroid và các
phân tử lipid quan trọng khác nh prostacyclin và thromboxane A2. Hai chất này

1
là sản phẩm trung gian của quá trình tổng hợp arachidonic acid. Các đột biến xảy
ra trên các gene mã hóa Cytochrome P450 hoặc sự thiếu hụt protein này là tác
nhân gây một số bệnh nghiêm trọng ở ngời. Ngoài ra, việc cảm ứng một số
gene Cytochrome P450 khác là nguyên nhân gây ra một số dạng ung th vì các
enzyme này tham gia chuyển hóa các chất tiền gây ung th thành các chất gây
ung th.
Do các protein này đều chứa nhân hem và có một phổ hấp thụ đặc trng
nên đợc gọi là Cytochrome P450. Các protein Cytochrome P450 ở động vật có
vú thờng là protein bám màng. Chúng đợc phát hiện lần đầu tiên tại thể
microsome ở gan chuột. Thể microsome là các thể tan đục đợc tạo thành khi
nghiền nhỏ các tế bào và phân lập các cấu trúc màng vẫn hòa tan trong khi phần
cặn tế bào và ty thể đợc lắng xuống. Hỗn hợp này rất đục khi quan sát trên kính
hiển vi quang học vì chúng rất kém tán sắc. Cách duy nhất để xác định phổ hấp
thụ của các chất này là sử dụng thiết bị đặc biệt với phần tiếp nhận ánh sáng rất
gần với cuvette và sử dụng một nguồn sáng gián đoạn trên các kính hiển vi khác
nhau. Bằng cách này các tạp chất gây nhiễu xạ khác có thể đợc phân tách.
Trong hệ thống này, các thể tan có tính khử cao đợc phản ứng với khí CO trong
cuvette sẽ cho một phổ hấp thụ tơng đối mạnh ở bớc sóng 450nm (do đó đợc
gọi là P450 với P: sắc tố - pigment). Đây đợc gọi là phổ biệt hóa CO khử. Các
phân tử CO liên kết chặt chẽ với nhân hem chứa sắt sẽ cho 2 phổ hấp thụ khác
nhau ở 2 cuvette khác nhau. Phổ này đợc quan sát lần đầu tiên vào năm 1958.
Các protein chứa nhân hem khác không có tính chất đặc biệt này. Nguyên
nhân Cytochrome P450 hấp thụ tại phổ này là do sự hình thành liên kết đặc biệt
tại nhân hem chứa ion sắt (Fe). Bốn liên kết của sắt đợc hình thành với các
nguyên tử N trong vòng hem. Do đó, nguyên tử Fe còn có khả năng tạo thêm 2
liên kết nữa phía trên và dới mặt phẳng liên kết. Trong các phân tử Cytochrome
P450, liên kết thứ 5 tạo thành với anion lu huỳnh (S
-
). Nguyên tố S là từ

Cysteine ở vị trí bảo thủ trong trung tâm hoạt động của enzyme.
Cấu trúc tinh thể nhiễu xạ tia X của các phân tử P450 ở hơn 10 loại vi
khuẩn đã đợc xác định (CYPs 51 [Mycobacterium], 55A1, 101A1, 102A1,
107A1 [eryF], 111A1, 119A1, 121A1 [P450Mt2], 152, 175A1). Các protein này
có tính tan cao trong khi các protein P450 ở sinh vật nhân chuẩn lại liên kết với
màng. Cấu trúc này tơng tự nh các bào quan có cấu trúc màng khác và có thể
các protein này có các domain bám màng. Protein Cytochrome P450 đầu tiên

1
đợc làm tinh thể là từ Pseudomonas putida, một loại vi khuẩn có khả năng sử
dụng long não làm nguồn carbon duy nhất. Chủng vi khuẩn này đợc phát hiện
trên đất dới các cây long não. Các protein này có hình dạng kiểu tam giác với
nhân hem ẩn sâu bên trong. Cấu trúc này cho phép ngăn cản tất cả các phân tử cơ
chất và sản phẩm, kể cả các phân tử nớc tiếp xúc hoặc tách ra khỏi trung tâm
hoạt động. Do đó, ngời ta giả thiết rằng có những cơ chế thay đổi cấu trúc các
phân tử này để có thể mở một số điểm tại các vị trí xúc tác. Phần lớn các enzyme
này có cấu trúc giàu xoắn , phần còn lại có cấu trúc nếp gấp và các cấu trúc
không lặp lại khác. Các phân tử P450 của động vật có vú cũng có cấu trúc bậc
hai tơng tự, nhng ở đầu N có miền (domain) bám màng. Khi loại bỏ đầu N
khỏi phân tử protein thì nó vẫn liên kết với màng. CYP2C5 ở động vật có vú đã
đợc tinh thể hóa sau khi loại bỏ đoạn bám màng ở đầu N và thay thế trình tự kỵ
nớc bên trong bằng đoạn peptide có tính tan cao hơn. Cấu trúc nhiễu xạ tia X
của phân tử tinh thể này đã đợc xác định (Williams et al., 2000). Bản mô tả
ngắn gọn các đặc điểm chính của phân tử này đã đợc công bố trớc đó. Cấu
trúc này tơng đồng với các cấu trúc enzyme Cytochrome P450 tan của vi khuẩn
nhng vẫn có một số khác biệt rõ rệt.
Các Cytochrome P450 xúc tác cho nhiều loại phản ứng nhng quan trọng
nhất là các phản ứng hydroxyl hóa. Chúng đợc gọi là các enzyme oxy hóa đa
chức năng hoặc các monooxygenase, vì chúng phân tách một nguyên tử oxy ra
khỏi cơ chất và giải phóng nớc, khác với các dioxygenase có chức năng giải

phóng phân tử oxy.
Các chất hóa học hoặc dợc phẩm thờng đợc gọi là các chất ngoại sinh.
Các Cytochrome P450 đóng vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi các chất
ngoại sinh, đặc biệt là các dợc phẩm có tính kỵ nớc. Quá trình trao đổi của các
hợp chất này thờng tiến hành theo 2 pha. Đầu tiên là quá trình gắn một gốc
chức năng có tác dụng nh một vật nối với cơ chất. Phản ứng này tạo ra các chất
sửa đổi có tính tan tốt hơn do đó nó có thể chiết bằng dung dịch ure. Có rất nhiều
P450 tham gia xúc tác phản ứng gắn gốc hydroxyl trong pha I của phản ứng trao
đổi thuốc. Sau đó, các phản ứng tiếp theo trong pha II sẽ xảy ra ở vị trí gốc
hydroxyl.
Để có thể tiến hành các phản ứng xúc tác, các Cytochrome P450 cần
nguồn cung cấp electron. Việc bổ sung 2 electron (quá trình khử) vào nhân hem
chứa sắt sẽ làm dễ dàng phá vỡ liên kết O-O. Các electron đợc cung cấp bởi