chuyển gen chịu hạn ở đậu tương

ĐạI HọC THáI NGUYÊN
TRƯờNG ĐạI HọC NÔNG LÂM

nguyễn kim oanh
Tên đề tài:
Bớc đầu khảo sát quy trình chuyển gen chịu hạn
GmNAC
vào
giống đậu tơng ĐVN9 thông qua vi khuẩn
Agrobacterium
tumefaciens
khoá luận tốt nghiệp đại học
Hệ đào tạo : Chính quy
Chuyên ngành : Công nghệ sinh học
Khoa : Công nghệ sinh học
& Công nghệ thực phẩm
Khoá học : 2006 - 2010
Thái Nguyên - 2010
ĐạI HọC THáI NGUYÊN
TRƯờNG ĐạI HọC NÔNG LÂM

nguyễn kim oanh
Tên đề tài:
Bớc đầu khảo sát quy trình chuyển gen chịu hạn
GmNAC
vào
giống đậu tơng ĐVN9 thông qua vi khuẩn
Agrobacterium
tumefaciens
khoá luận tốt nghiệp đại học
Hệ đào tạo : Chính quy

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học
Khoa : Công nghệ sinh học
& Công nghệ thực phẩm
Khoá học : 2006 - 2010
Ngời hớng dẫn : 1. TS. Nguyễn Văn Đồng
(Phòng TNTĐ - CNTBTV - Viện Di Truyền Nông Nghiệp)
2. KS. Bùi Tri Thức
(Khoa CNSH & CNTP - Đại học Nông Lâm Thái Nguyên)
Thái Nguyên - 2010
LờI CảM ƠN
Trớc hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Văn Đồng đã tận
tình giúp đỡ, hớng dẫn tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt
nghiệp.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với sự giúp đỡ to lớn, những ý
kiến đóng góp quý báu, sự hớng dẫn tận tình của ThS. Hà Văn Chiến, KS. Bùi Tri
Thức và KS. Nguyễn Tiến Dũng trong quá trình tôi thực hiện và hoàn thành khóa
luận này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới tập thể cán bộ Phòng thí nghiệm trọng điểm Công
nghệ tế bào thực vật - Viện Di truyền nông nghiệp về sự giúp đỡ nhiệt tình trong
suốt thời gian tôi thực hiện khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo khoa Công nghệ sinh học và
Công nghệ thực phẩm, trờng ĐH Nông Lâm Thái Nguyên đã giúp đỡ nhiệt tình và
đã tạo mọi điều kiện thuận lợi trong thời gian học tập cũng nh khi hoàn thành khóa
luận tốt nghiệp.
Cuối cùng, tôi xin gửi tới bố mẹ, anh chị cùng bạn bè, những ngời mà đã luôn
quan tâm, ủng hộ và là chỗ dựa cho tôi trong suốt thời gian tôi làm khóa luận này,
cũng nh trong cuộc sống.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đối với những giúp đỡ quý báu đó.
Hà Nội, ngày 30 tháng 05 năm 2010
Sinh viên

Nguyễn Kim Oanh
danh mục bảng biểu
Trang
Bảng 2.1. Các quốc gia sản xuất đậu tơng nhiều nhất thế giới năm 2008 5
Bảng 2.2. Diện tích canh tác, năng suất và sản lợng của đậu tơng 6
ở Việt Nam từ năm 2004 2009 6
Bảng 2.3. Số liệu thống kê sản xuất đậu tơng qua các vùng khác nhau 6
ở Việt Nam năm 2008 6
Bảng 4.1. Biểu hiện tạm thời của gen gus khi biến nạp các chủng
Agrobacterium khác nhau vào nốt lá mầm giống đậu tơng ĐVN9 38
Bảng 4.2. ảnh hởng của mật độ vi khuẩn tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen
gus ở giống đậu tơng ĐVN9 40
Bảng 4.3. ảnh hởng của hàm lợng AS (Acetosyringone) tới sự biểu hiện tạm
thời của gen gus 42
Bảng 4.4. ảnh hởng của thời gian đồng nuôi cấy đến sự biểu hiện tạm thời của
gen gus 44
Bảng 4.5. Hiệu quả của việc gây tổn thơng nốt lá mầm đến sự biểu hiện tạm
thời của gen gus 46
Bảng 4.6. Kết quả biến nạp, chọn lọc và tái sinh cây đậu tơng chuyển gen 47
danh mục các hình
Trang
Hình 2.1. Bản đồ Ti-plasmid 9
Hình 2.2. Cấu trúc T-DNA 10
Hình 2.3. Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A. tumefaciens 11
Hình 2.4. Sơ đồ cấu trúc vector hai nguồn 14
Hình 2.5. Sơ đồ cấu trúc vector liên hợp 15
Hình 2.6. Phản ứng tạo ra sản phẩm 5,5-dibromo-4,4-dicloro-indigo có màu
xanh 27
Hình 3.1. Cấu trúc vector pBI 29
Hình 3.2. Cấu trúc vector dựa trên nền vector pBI 30

Hình 4.1. Biểu hiện tạm thời của gen gus trên đậu tơng 39
sau lây khi nhiễm với các chủng khuẩn 39
Hình 4.2. ảnh hởng của mật độ vi khuẩn đến biểu hiện gen gus trên ĐVN9. .41
Hình 4.3. ảnh hởng của nồng độ AS đến biểu hiện tạm thời 43
của gen gus trên ĐVN9 43
Hình 4.4. ảnh hởng của thời gian đồng nuôi cấy lên biểu hiện tạm thời 45
của gen gus trên ĐVN9 45
Hình 4.5. ảnh hởng của việc gây tổn thơng nốt lá mầm đến 47
tỷ lệ sống và tần số chuyển gen 47
Hình 4.6. Một số hình ảnh quy trình chuyển gen GmNAC 48
vào giống đậu tơng ĐVN9 48
Hình 4.7. Mức độ kháng hygromycin sau 12 giờ. Lá của cây đối chứng (không
chuyển gen) (1, 2). Lá của cây đã đợc chuyển gen hpt (3, 4) 49
Hình 4.8. Điện di DNA tổng số từ mẫu lá cây thí nghiệm qua xử lý RNase 49
Hình 4.9. ảnh điện di sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen Hpt 50
(kháng hygromycin) 50
kÝ hiÖu viÕt t¾t
AS : Acetosyringone
(3,5-dimethoxy-4-hydrroxy Acetophenone)
BAP : 6-benzylaminopurin
Bar : Gen m· hãa tæng hîp phosphinothricin acetyl transferase
CaMV : Cailiflower Mosaic Virus
Car : Carbenicillin
DNA : Deoxirionucleic Acid
FAO : Food and Agriculture Organization
GFP : Green Fluorescent Protein
Gus : β-1,4-Glucuronidase
HPT : Hygromycin Phosphotransferase
IAA : β-indol acetic acid
IBA : Indol-3-butyric acid

ISAAA : International Services for the Acquisition of Agri-Biotech
Ka : Kanamycin
LB : Luria Bertani
L-Cys : L-Cystein
MS : Murashige and Skoog, 1962
NAA : Napthalene acetic acid
NPT II : Neomycin Phosphotransferase II
PCR : Polymerase Chain Reaction
Ti-plasmid : Tumor-Including Plasmid
T-DNA : Transfer-DNA
Vir : virulence
mục lục
Trang
Phần 1 1
Mở ĐầU 1
1.1. Tính cấp thiết của đề tài
1.2. Mục tiêu của đề tài
1.3. Yêu cầu của đề tài
1.4. ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Phần 2 3
TổNG QUAN TàI LIệU 3
2.1. Nguồn gốc, vai trò và vị trí của cây đậu tơng trong hệ thống cây trồng
2.1.1. Nguồn gốc và phân loại 3
2.1.2. Tầm quan trọng của cây đậu tơng 3
2.1.3. Tình hình sản xuất đậu tơng trên thế giới và Việt Nam 5
2.1.3.1. Tình hình sản xuất đậu tơng trên thế giới 5
2.1.3.2. Tình hình sản xuất đậu tơng ở Việt Nam 5
2.1.4. Giống đậu tơng ĐVN9 7
2.1.5. Khái quát tình hình chịu hạn ở thực vật và ở cây đậu tơng 7
2.1.5.1. Khái niệm về hạn 7

2.1.5.2. Đặc tính chịu nóng, chịu hạn của cây đậu tơng 7
2.2. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và hiện tợng biến nạp gen ở thực vật

2.2.1. Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid 9
2.2.2. Cấu trúc và chức năng của đoạn T-DNA 10
2.2.3. Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A. tumefaciens10
2.2.4. Biến nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 11
2.2.4.1. Hệ thống chuyển gen in vitro 11
2.2.4.2. Hệ thống chuyển gen in vivo 12
2.3. Hệ thống vectơ chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens
2.4. Các yếu tố ảnh hởng đến hiệu quả biến nạp gen thông qua A. tumefaciens

2.5. Tình hình về nuôi cấy mô và chuyển gen ở đậu tơng
2.5.1. Một số nghiên cứu môi trờng tái sinh ở thực vật và cây đậu tơng
17
2.5.2. Một số nghiên cứu về chuyển gen ở đậu tơng 19
2.6. Một số đặc tính đã đợc cải thiện ở cây đậu tơng bằng kỹ thuật di truyền
2.7. Tình hình sản xuất đậu tơng chuyển gen trên thế giới và trong nớc
2.7.1. Tình hình sản xuất đậu tơng chuyển gen trên thế giới 22
2.7.2. Tình hình sản xuất đậu tơng chuyển gen ở Việt Nam 23
2.8. Những nghiên cứu về gen GmNAC
2.9. Gen gus
2.10. Các gen chỉ thị chọn lọc và các gen thông báo trong hệ thống vectơ biến
nạp
Phần 3 29
VậT LIệU, NộI DUNG Và PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU 29
3.1. Vật liệu và phạm vi nghiên cứu
3.1.1. Vật liệu thực vật 29
3.1.2. Vật liệu vi khuẩn 29

3.1.3. Hoá chất và dụng cụ thí nghiệm 30
3.1.3.1. Hoá chất 30
3.1.3.2. Máy móc và thiết bị 30
3.1.4. Phạm vi nghiên cứu 30
3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành
3.2.1. Địa điểm 30
3.2.2. Thời gian tiến hành 30
3.3. Nội dung nghiên cứu
3.4. Phơng pháp nghiên cứu
3.4.1. Thí nghiệm 1: Lựa chọn chủng vi khuẩn thích hợp cho việc
chuyển gen vào ĐVN9 31
3.4.2. Thí nghiệm 2: Đánh giá ảnh hởng của mật độ vi khuẩn
(OD600nm) lên khả năng biến nạp gen vào đậu tơng thông qua tỷ lệ
biểu hiện tạm thời của gen gus vào ĐVN9 31
3.4.3. Thí nghiệm 3: Đánh giá ảnh hởng của hàm lợng chất dẫn dụ
Acetosyringone (AS) lên khả năng biến nạp vào đậu tơng thông qua
biểu hiện tạm thời của gen gus trên ĐVN9 31
3.4. 4. Thí nghiệm 4: Đánh giá ảnh hởng của thời gian đồng nuôi cấy
đến khả năng biến nạp gen vào đậu tơng thông qua tỷ lệ biểu hiện tạm
thời của gen gus trên ĐVN9 32
3.4.5. Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hởng của việc gây tổn thơng nốt
lá mầm đến sự biểu hiện của gen gus trên ĐVN9 32
3.4.6. Thí nghiệm 6: Chuyển gen chịu hạn GmNAC vào đậu tơng
ĐVN9 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (theo quy trình
nêu trên) 34
* Phân tích các cây đậu tơng chuyển gen sau tái sinh bằng kỹ thuật
PCR với cặp mồi đặc hiệu của gen Hpt (kháng hygromycin) 35
3.5. Các chỉ tiêu đánh giá
3.6. Các phơng pháp đánh giá
Phần 4 38

KếT QUả NGHIÊN CứU Và THảO LUậN 38
4.1. Kết quả lựa chọn chủng vi khuẩn A. tumefaciens thích hợp cho chuyển
gen vào giống đậu tơng ĐVN9 thông qua biêu hiện tạm thời của gen gus

4.2. ảnh hởng của mật độ vi khuẩn (OD600nm) lên tỉ lệ biểu hiện tạm thời của
gen gus
4.3. ảnh hởng của hàm lợng Acetosyringone (AS) lên tỷ lệ biểu hiện tạm thời
của gen gus
Acetosyringon (AS) là một hợp chất của phenol đợc tiết ra tại vùng bị thơng
của cây. AS đóng vai trò dẫn dụ vi khuẩn Agrobacterium tới mô lây
nhiễm và kích hoạt các gen vùng vir hoạt động để hoạt hóa cơ chế
chuyển T-DNA vào tế bào thực vật
4.4. ảnh hởng của thời gian đồng nuôi cấy đến khả năng biến nạp gen vào đậu
tơng ĐVN9 thông qua tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus
4.5. ảnh hởng của việc gây tổn thơng nốt là mầm trên giống ĐVN9 đến sự biểu
hiện tạm thời của gen gus
4.6. Kết quả chuyển gen GmNAC giống đậu tơng ĐVN9 sử dụng
Agrobacterium tumefaciens
4.7. Kết quả phân tích, đánh giá các cây đậu tơng sau khi chuyển gen chịu hạn
gmNAC
* Kết quả khảo sát sự có mặt tạm thời của gen chọn lọc hpt (kháng
hygromycin)
* Tách DNA tổng số đậu tơng chuyển gen
* Kết quả phân tích các cây đậu tơng chuyển gen bằng kỹ thuật PCR
Phần 5 51
KếT LUậN Và Đề NGHị 51
5.1. Kết luận
5.2. Đề nghị
TàI LIệU THAM KHảO 52
Phần 1

Mở ĐầU
1.1. Tính cấp thiết của đề tài
Đậu tơng [Glycine max (L.) Merrill.] còn gọi là đậu nành là một cây trồng cạn
ngắn ngày có giá trị kinh tế cao. Khó có thể tìm thấy một cây trồng nào có tác dụng
nhiều mặt nh cây đậu tơng. Sản phẩm của nó làm thực phẩm cho con ngời, thức ăn
cho gia súc nguyên liệu cho công nghiệp và hàng xuất khẩu. Vì thế cây đậu tơng đợc
gọi là "Ông Hoàng trong các loại cây họ đậu". Ngoài ra, đậu tơng là cây trồng lý tởng
trong hệ thống luân canh do khả năng cải tạo đất tốt (Ngô Thế Dân và cs, 1999)[2],
(Trần Văn Điền, 2007)[4]. Diện tích đậu tơng ở nớc ta hiện nay đạt khoảng 200.000
ha với năng suất bình quân 1,5 tấn/ha (Clive James, 2008)[15], (FAO Statistic
Database, 2007)[16]. Để tăng sản lợng đậu tơng, ngoài mở rộng thêm diện tích trong
cơ cấu luân canh thì tăng năng suất là giải pháp chính.
Sử dụng đậu tơng biến đổi gen là một tiến bộ quan trọng trong nghành trồng
đậu tơng của trên toàn thế giới hiện nay. Hiện diện tích trồng đậu tơng biến đổi gen
trên thế giới năm 2008 lên đến 125 triệu ha (Clive Jame, 2008)[15]. Vì vậy, ở nớc ta,
cần thiết nhanh chóng tiếp cận và ứng dụng công nghệ này để tăng năng suất đậu t-
ơng. Việc tạo giống đậu tơng biến đổi gen từ các giống đậu tơng trồng ở Việt Nam
đòi hỏi các nghiên cứu tiến hành có hệ thống. ở Việt Nam đã xây dựng thành công
hệ thống tái sinh và bớc đầu nghiên cứu đánh giá khả năng đáp ứng chuyển nạp gen
của các giống đậu tơng địa phơng (Trần Thị Cúc Hoà, 2007)[8], (Trần Thị Cúc Hoà,
2008)[9].
Mặt khác, đậu tơng là một cây trồng cạn, ngắn ngày có giá trị kinh tế cao. Là
một nguồn quan trọng của dầu thực vật và protein. Những yêu cầu dành cho dầu đậu
tơng và protein đợc tăng lên, sự cải thiện về chất lợng và sản xuất đậu tơng thông
qua sự biến nạp gen và chức năng di truyền học đã trở thành một vấn đề quan trọng
trên khắp thế giới.
Để nâng cao năng suất đậu tơng, vấn đề đặt ra là phải nhanh chóng tạo đợc
bộ giống đậu tơng năng suất cao, chống chịu tốt với sâu bệnh và các yếu tố bất
thuận của môi trờng, trong đó tạo giống đậu tơng chịu hạn là mục tiêu hàng đầu của
giai đoạn 2007-2011, đồng thời đó cũng là yêu cầu bức xúc hiện nay của sản xuất.

1
Trong hàng loạt các yêu cầu cần phải có để tạo đợc giống cây trồng chuyển
gen thì việc xây dựng quy trình biến nạp thuận lợi và có hiệu quả là một trong
những đòi hỏi cần thiết.
Do phạm vi nghiên cứu của đề tài quá rộng và đậu tơng là đối tợng khó nuôi
cấy, vì vậy với mong muốn góp phần hoàn thiện quy trình chuyển gen ở đậu tơng
nên chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: "Bớc đầu khảo sát quy trình chuyển
gen chịu hạn GmNAC vào giống đậu tơng ĐVN9 thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens".
1.2. Mục tiêu của đề tài
- Bớc đầu khảo sát quy trình chuyển gen vào đậu tơng nhờ vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens.
- Xây dựng quy trình chuyển gen vào một số giống đậu tơng và phân tích
các cây chuyển gen chịu hạn GmNAC sau tái sinh.
- Trên cơ sở đó xác định đợc phơng pháp chuyển gen thích hợp vào đậu tơng,
góp phần phát triển lĩnh vực chọn tạo giống đậu tơng bằng công nghệ sinh học.
1.3. Yêu cầu của đề tài
- Tối u hoá quá trình chuyển gen vào giống đậu tơng ĐVN9 sử dụng
Agrobacterium tumefaciens.
- Xây dựng quy trình chuyển gen GmNAC vào giống đậu tơng ĐVN9 sử
dụng vector dựa trên nền vector pBI.
- Phân tích các cây chuyển gen GmNAC sau tái sinh.
1.4. ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
- ý nghĩa trong học tập và nghiên cứu khoa học
Thực hiện đề tài giúp sinh viên có thêm kinh nghiệm, kiến thức bổ ích và
tiếp cận với công tác nghiên cứu khoa học để phục vụ cho nghiên cứu và công tác
sau này.
- ý nghĩa trong thực tiễn sản xuất
Kết quả nghiên cứu đã góp phần hoàn thiện quy trình chuyển gen tạo giống
cây đậu tơng chịu hạn tốt để phục vụ sản xuất. Bổ sung thêm nguồn gen quý vào

công nghệ chuyển gen và công tác chọn tạo giống.
2
Phần 2
TổNG QUAN TàI LIệU
2.1. Nguồn gốc, vai trò và vị trí của cây đậu tơng trong hệ thống cây trồng
2.1.1. Nguồn gốc và phân loại
Đậu tơng có tên khoa học là Glycine max (L.) Merrill, là loại cây trồng thuộc
họ đậu (Fabaceae), họ phụ cánh bớm (Papilionoi dea) có nguồn gốc từ Trung Quốc
là loại cây trồng hàng năm không thấy xuất hiện ở loài hoang dại. Các giống đậu t-
ơng địa phơng của nớc ta hiện nay đợc du nhập từ Trung Quốc đã từ lâu (Trần Văn
Điền, 2007)[4], (FAO Statistic Database, 2007)[16]. Cây đậu tơng là cây thân thảo,
ít phân cành dạng bụi, lá đậu tơng là lá kép với 3 lá chét, nhng đôi khi còn có 4-5 lá
chét. Hoa màu trắng hay tím, quả thẳng hay quả cong có nhiều lông. Vỏ của hạt đậu
tơng có màu nâu, đen, vàng, xanh. Khối lợng hạt rất đa dạng từ 20-400 mg/hạt. Cây
đậu tơng có 2 đặc tính sinh trởng: sinh trởng hữu hạn và sinh trởng vô hạn, thời gian
sinh trởng có 3 loại: chín sớm (75-85 ngày), trung bình (80-100 ngày), muộn (110-
120 ngày). Thời gian sinh trởng là một yếu tố rất quan trọng để lựa chọn cây trồng
luân canh xen vụ. Một đặc điểm nổi bật là ở rễ cây đậu tơng thờng có nốt sần chứa
vi khuẩn có khả năng cố định nitơ tự do, cho nên trồng cây đậu tơng còn có tác dụng
cải tạo đất (Trần Văn Điền, 2007)[4], (Gamborg O. L. và cs, 1986)[18]. Các công
trình nghiên cứu cho thấy những giống có khả năng cộng sinh và có đủ nốt sần th-
ờng làm cho hàm lợng protein cao. Đậu tơng là cây tơng đối mẫn cảm với điều kiện
ngoại cảnh. Trong tập đoàn giống đậu tơng có những giống chỉ trồng vào vụ hè, có
những giống chỉ trồng vào vụ đông (Gamborg O. L. và cs, 1986)[18].
Hệ thống phân loại đã căn cứ vào đặc điểm về hình thái, sự phân bố địa lý và
số lợng nhiễm sắc thể. Theo hệ thống này ngoài chi Glycine còn có thêm chi phụ
Soja. Chi Glycine đợc chia thành 7 loài hoang dại lâu năm bao gồm: Glycine
clandestina wendl; Glycine falcata Benth; Glycine latifolia (Benth) Newell và
Hymowitz; Glycine tatrobeana (Meissn) Benth; Glycine tabacina; Glycine
canescens F.J.Ham ; Glycine tomentella Hyayata, và chi phụ Soja đợc chia ra làm 2

loài: loài đậu tơng trồng Glycine (L) Merr và loài hoang dại hàng năm G. Soja Sieb
và Zucc (Trần Văn Điền, 2007)[4].
2.1.2. Tầm quan trọng của cây đậu tơng
3
Cây đậu tơng là nguồn thực phẩm có giá trị kinh tế cao, giàu đạm, giàu chất
béo, giàu các chất khoáng và các vitamin. Ngoài ra, đậu tơng còn là nguyên liệu tốt
cho ngành công nghiệp thực phẩm, công nghệ ép dầu, thức ăn gia súc và cây làm tốt
đất (nhờ hoạt động cố định N
2
của loại vi khuẩn Rhizobium cộng sinh trên rễ cây họ
đậu), đồng thời cũng là những loài xuất khẩu có giá trị đối với nhiều thị trờng trên
thế giới (Ngô Thế Dân và cs, 1999)[2].
Giá trị về mặt thực phẩm
Trong hạt đậu tơng chứa 38-40% protein, trong khi đó sắn, gạo, ngô chỉ chứa
từ 2-14,9% và hydrat cacbon từ 15-16%. Hơn nữa, đậu tơng còn chứa nhiều axit
amin cơ bản cần thiết nh: isoleucin, leucin, metionin, lysin, phenylamin, tryptophan,
valnhu, nhiều loại vitamin A, B
1
, B
2
, C,và chất khoáng (Ngô Thế Dân và cs, 1999)
[2]. Hạt đậu tơng đợc coi là nguồn cung cấp protein hoàn chỉnh vì chứa một lợng
đáng kể các amino acid không thay thế. Khi thiếu protein trong thành phần thức ăn
thì sẽ hạn chế sự sinh trởng và phát triển trí tuệ của trẻ em và giảm mức độ đề kháng
đối với các bệnh truyền nhiễm.
Giá trị về mặt công nghiệp
Đậu tơng là nguyên liệu của nhiều ngành công nghiệp khác nhau nh: chế
biến cao su nhân tạo, sơn, mực in, xà phòng, chất dẻo, tơ nhân tạo, chất đốt lỏng,
dầu bôi trơn trong ngành hàng không, nhng chủ yếu đậu tơng đợc dùng để ép dầu.
Hiện nay trên thế giới đậu tơng là cây đứng đầu về cung cấp nguyên liệu cho ép dầu,

dầu đậu tơng chiếm 50% tổng lợng dầu thực vật.
Giá trị về mặt nông nghiệp
Làm thức ăn cho gia súc: Đậu tơng là nguồn thức ăn tốt cho gia súc, 1 kg hạt
đậu tơng đơng với 1,38 đơn vị thức ăn chăn nuôi. Toàn cây đậu tơng (thân, lá, quả,
hạt) có hàm lợng đạm khá cao cho nên các sản phẩm phụ nh thân lá tơi có thể làm
thức ăn cho gia súc rất tốt, hoặc nghiền khô làm thức ăn tổng hợp của gia súc. Sản
phẩm phụ công nghiệp nh khô dầu có thành phần dinh dỡng khá cao: N:6,2%, P
2
O
5
:
0,7%, K
2
O: 2,4%, vì thế làm thức ăn cho gia súc rất tốt (Ngô Thế Dân và cs, 1999)
[2].
Cải tạo đất: Đậu tơng là cây luân canh cải tạo đất tốt. 1 ha trồng đậu tơng
nếu sinh trởng phát triển tốt để lại trong đất từ 30-60 kg N. Trong hệ thống luân
canh, nếu bố trí cây đậu tơng vào cơ cấu cây trồng hợp lý sẽ có tác dụng tốt đối với
cây trồng sau, góp phần tăng năng suất cả hệ thống cây trồng mà giảm chi phí cho
4
việc bón phân N. Thân lá đậu tơng dùng bón ruộng thay phân hữu cơ rất tốt bởi lợng
N trong thân chiếm 0,05%, trong lá: 0,19% (Ngô Thế Dân và cs, 1999)[2].
2.1.3. Tình hình sản xuất đậu tơng trên thế giới và Việt Nam
2.1.3.1. Tình hình sản xuất đậu tơng trên thế giới
Đậu tơng là cây trồng lấy hạt, cây có dầu quan trọng bậc nhất trên thế giới,
đứng hàng thứ 4 sau cây lúa mì, lúa nớc và ngô. Do khả năng thích ứng rộng nên nó
đợc trồng ở khắp năm châu lục, nhng tập trung nhiều nhất ở châu Mỹ trên 70%, tiếp
đến là châu á. Hàng năm trên thế giới trồng khoảng hơn 91 triệu ha với năng suất
bình quân khá cao 22 - 25 tạ/ha đã tạo ra một sản lợng đậu tơng lớn gấp hơn hai lần
so với 20 năm về trớc. Các nớc trồng đậu tơng đứng hàng đầu trên thế giới về diện

tích gieo trồng và sản lợng là Mỹ 25,96 triệu ha, Brazil 20,565 triệu ha, Argentina
15,98 triệu ha và Trung Quốc 8,9 triệu ha. Theo Oil World cỏc nc sn xut u
tng hng u th gii u gim sn lng u tng trong niờn v 2006 2007,
Brazin gim 7,5%, Argentina gim 6%, cũn M gim hn 10% so vi v trc.
Bảng 2.1. Các quốc gia sản xuất đậu tơng nhiều nhất thế giới năm 2008
TT Quốc gia
Diện tích
(Triệu ha)
Sản lợng
(Triệu tấn)
1 Mỹ 30,206 80,536
2 Brazil 21,272 59,917
3 Argentina 16,380 46,232
4 Trung Quốc 9,127 15,545
5 ấn Độ 9,600 9,045
6 Paraguay 2,645 6,808
7 Canada 1,195 3,336
8 Bolivia 0,958 1,596
Tổng số trên toàn thế giới 96,870 230,953
(Nguồn: UN Food & Agriculute Organisation, FAO)
2.1.3.2. Tình hình sản xuất đậu tơng ở Việt Nam
5
Theo kết quả điều tra của tổng cục thống kê Việt Nam về sản xuất đậu tơng
trong 5 năm gần đây (từ năm 2004 đến 2009) cho thấy khuynh hớng gia tăng chậm
về diện tích sản xuất, năng suất và sản lợng của đậu tơng tại Việt Nam. Định hớng
đến năm 2015 diện tích đậu tơng của cả nớc đạt khoảng 700 nghìn ha. Kết quả điều
tra cho thấy đậu tơng là cây công nghiệp ngắn ngày đợc sản xuất trên diện tích lớn
sau lúa, bắp (ngô), khoai lang, mía, sắn và đậu phộng (lạc).
Bảng 2.2. Diện tích canh tác, năng suất và sản lợng của đậu tơng
ở Việt Nam từ năm 2004 2009

Số liệu thu thập 2004 2005 2006 2007 2008 2009
Diện tích (nghìn ha) 183,8 204,1 185,6 187,4 191,5 146,4
Năng suất (kg/ha) 1340,0 1430,0 1390,0 1470,0 1400,0 1459,0
Tống sản lợng (nghìn tấn) 245,9 292,7 258,1 275,2 268,6 213,6
(Nguồn: Niêm giám thống kê 2009, Nhà Xuất Bản Thống Kê Hà Nội, 2010)[13]
Bảng 2.3. Số liệu thống kê sản xuất đậu tơng qua các vùng khác nhau
ở Việt Nam năm 2008
TT Vùng canh tác
Diện tích
(nghìn ha)
Năng suất
(kg/ha)
Sản lợng
(nghìn tấn/năm)
1
Vùng Trung du và miền núi phía
Bắc
64,1 1200 74,9
2 Vùng Đồng Bằng Sông Hồng 73,1 1400 100,0
3
Vùng Bắc Trung bộ và Duyên hải
miền Trung
4,4 1400 6,3
4 Vùng Tây Nguyên 28,0 1800 44,2
5 Vùng Đông Nam Bộ 1,8 1200 2,1
6 Vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long 6,9 2200 15,5
Tổng số 192,1 1400 267,6
(Nguồn: Niêm giám thống kê 2008, Nhà Xuất Bản Thống Kê Hà Nội, 2009)
6
ở Việt Nam, dựa vào dạng đất canh tác, điều kiện tự nhiên và tập quán canh

tác, có 6 vùng canh tác cây đậu tơng chính.
Việt Nam đã đặt ra mục tiêu tăng sản lợng đậu tơng lên đến 500 triệu
tấn/năm vào năm 2010. Tuy nhiên, sản lợng đậu tơng khó tăng nhanh trong những
năm tới do năng suất còn thấp, chi phí cho hoá chất trừ sâu hại cao, làm hạn chế khả
năng tăng năng suất và tăng mùa vụ và diện tích gieo trồng của đậu tơng.
2.1.4. Giống đậu tơng ĐVN9
Giống đậu tơng ĐVN9 do nhóm các nhà khoa học của Viện Nghiên cứu Ngô
lai tạo và chọn lọc từ tổ hợp lai ĐT-12 x VN20-5. Giống đợc công nhận cho sản xuất
thử nghiệm năm 2007 và hiện đang đợc nhân ra diện rộng. ĐVN9 là giống đậu tơng
chín sớm: vụ xuân 88-90 ngày, vụ hè 75-77 ngày, vụ đông 78-80 ngày; dạng cây
đứng, lá hình trứng nhọn, hoa tím, vỏ quả chín màu vàng rơm, hạt vàng, rốn hạt nâu
nhạt. Chiều cao cây trung bình 27,3-56,5cm; phân cành mạnh (1,7-3,1 cành cấp
1/cây); cỡ hạt trung bình (148,5 -171,8g/1000 hạt); sai quả (22,9 - 49,5 quả/cây).
Năng suất trung bình ở vụ xuân đạt 17 tạ/ha, vụ hè 21 tạ/ha.
2.1.5. Khái quát tình hình chịu hạn ở thực vật và ở cây đậu tơng
2.1.5.1. Khái niệm về hạn
Hạn là hiện tợng thờng xuyên xảy ra trong tự nhiên và liên quan trực tiếp
đến vấn đề nớc trong cơ thể thực vật. Hạn cũng nh những yếu tố ngoại cảnh khác khi
tác động lên cơ thể, gây ra các phản ứng của cơ thể, tuỳ theo từng loài, giống mà
mức độ phản ứng của cơ thể cũng nh thiệt hại do khô hạn gây ra khác nhau, một số
bị chết một số bị tổn thơng, một số khác bị ảnh hởng còn số khác có thể không bị
ảnh hởng.
2.1.5.2. Đặc tính chịu nóng, chịu hạn của cây đậu tơng
Các cây họ đậu nói chung, cây đậu tơng nói riêng là cây có nhu cầu về nớc
cao hơn các loại cây khác. đó chính là do trong hạt và cây đậu tơng có hàm lợng
protein và lipit rất cao, để tổng hợp 1 kg chất khô cần 500-530 kg nớc. Trong quá
trình nảy mầm thì nhu cầu về nớc của đậu tơng cũng khá cao - 50%, trong khi đó ở
ngô chỉ là 30%, lúa là 26% (Trần Văn Điền, 2007)[4].
Khi nghiên cứu về các đặc tính chịu hạn của cây đậu tơng về phơng diện sinh
lý và di truyền đã cho thấy rằng các đặc tính này liên quan chặt chẽ đến đặc điểm

7
hoá keo của nguyên sinh chất, đặc điểm của quá trình trao đổi chất. Tính chịu hạn
của cây đậu tơng mang tính đa gen. Chúng thể hiện ở nhiều khía cạnh khác nhau:
nh sự phát triển nhanh của bộ rễ, tính chín sớm tơng đối, cũng nh bản chất di truyền
của từng giống có khả năng sử dụng nớc tiết kiệm trong quá trình sinh trởng và phát
triển của cây. Căn cứ vào đặc điểm này, đậu tơng đợc chia thành hai nhóm:
- Nhóm chịu đợc sự mất nớc trong từng giai đoạn phát triển của cây.
- Nhóm chịu đợc sự thiếu nớc trong tất cả giai đoạn phát triển của cây.
ở giai đoạn cây con khi gặp hạn đậu tơng có thể vợt qua hơn, còn ở những
giai đoạn sau nh giai đoạn ra hoa, kết quả, hạt chín sữa mà gặp hạn thì sẽ dẫn đến
năng suất giảm đáng kể.
ở Việt Nam đã có một số tác giả nghiên cứu khả năng chịu nóng, chịụ hạn
của cây đậu tơng, tiêu biểu là công trình đánh giá khả năng chịu hạn của các giống
đậu tơng nhập nội, nghiên cứu phân lập, xác định trình tự gen chaperonin tế bào chất
từ giống đậu tơng đột biến M103 (Trần Thị Cúc Hoà, 2007)[8], phân lập gen
dehydrin liên quan đến khả năng chịu hạn của cây đậu tơng, nâng cao tính chịu hạn
của cây đậu tơng bằng phơng pháp đột biến thực nghiệm
2.2. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và hiện tợng biến nạp gen ở thực vật
Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn gây bệnh sống trong đất, có khả năng
xâm nhiễm thực vật, kích thích tạo khối u ngay tại các vết thơng của cây chủ. Trong
tự nhiên, Agrobacterium tumefacines chủ yếu tấn công cây hai lá mầm, đặc biệt là
nhóm thực vật có hoa. Hoàn toàn khác với mô tế bào thực vật bình thờng, khối u do
Agrobacterium tumefaciens sinh ra phát triển mạnh ngay trong điều kiện thiếu
hoocmon sinh trởng (auxin và cytokinin). Đó là do Agrobacterium tumefaciens đã
chuyển một đoạn T-DNA (Transfer DNA) sang tế bào thực vật và T-DNA điều khiển
quá trình sinh tổng hợp các chất đó. Ngoài ra, các khối u cũng sinh tổng hợp các
opin là các axit amin (amino acid-aa) đặc biệt là các dẫn xuất của đờng. Dạng opin
đợc tổng hợp có thể là nopalin, octopin, agrocinopin, mannozapin và agropin phụ
thuộc vào từng chủng Agrobacterium tumefaciens. Trong đó, octopin và nopalin là
hai dạng opin phổ biến. Opin đợc vi khuẩn sử dụng thay cho nguồn cácbon và nitơ

nhờ hoạt động của gen chuyển hoá opin trên plasmid gây khối u thực vật. Cơ chế
phân tử của sự hình thành khối u đã đợc quan tâm nghiên cứu nhằm tìm ra một ph-
8
ơng thức phòng bệnh cho cây. Khi phát hiện ra Ti-plasmid và khăng năng tự chuyển
T-DNA vào genome thực vật, ngời ta đã đặc biệt chú ý và khai thác khả năng sử
dụng chúng nh một vector tự nhiên để chuyển các gen quan tâm vào thực vật nhằm
tạo cây trồng mang những tính trạng mong muốn (Trần Quốc Dung và cs, 2006)[3].
2.2.1. Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid
Ti-plasmid đợc phát hiện ở tất cả các chủng A. tumefaciens gây nhiễm và tồn
tại bền vững ở nhiệt độ dới 30
o
C. Đây là một phân tử DNA mạch vòng, sợi kép và
tồn tại trong tế bào nh một đơn vị sao chép độc lập.
Hình 2.1. Bản đồ Ti-plasmid
Phân tích di truyền cho thấy, Ti-plasmid dạng octopin và dạng nopalin là hai
dạng phổ biến nhất, có 4 vùng tơng đồng, trong đó có vùng T-DNA và vùng gây độc
(vùng vir), liên quan trực tiếp tới sự hình thành khối u ở thực vật. Hai vùng còn lại
chứa gen mã hoá cho việc sao chép plasmid và chuyển gen.
Trên Ti-plasmid, chỉ có vùng T-DNA đợc chuyển từ vi khuẩn sang genome
của cây bị bệnh và tồn tại bền vững ở đó. Tuy nhiên, vùng này lại không mã hoá
những sản phẩm trung gian cho quá trình chuyển T-DNA mà cần sự trợ giúp đặc biệt
của các gen gây khối u nằm trên vùng VIR và trên nhiễm sắc thể vi khuẩn (gen chv).
Vùng VIR dài khoảng 40kb đảm nhận chức năng gây nhiễm. ở Ti-plasmid dạng
octopin, vùng VIR chứa tới 24 gen gây độc. Sản phẩm protein do các gen này mã
hoá đã kích thích sự tách biệt T-DNA, bao bọc che chở và giúp chúng tiếp cận với
genome của cây chủ. Ngoài các gen vir, các gen trên nhiễm sắc thể của A.
tumefaciens (nh chvA và chvB) cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm
nhập của A. tumefaciens vào thành tế bào thực vật .
9
Vùng gây khối u

Vùng gây khối u
TDNA
T-DN

dddd
ADN
Vùng phân
Vùng phân
giải nopalin
giải nopalin
Vùng tái bản
Vùng tái bản
Vùng tiếp hợp
Vùng tiếp hợp
Vùng gây
Vùng gây
độc
độc
B
C
D
Ti-Plasmid
(Nopalin)
2.2.2. Cấu trúc và chức năng của đoạn T-DNA
Kết quả phân tích trình tự gen trên T-DNA ở các Ti-plasmid khác nhau cho
thấy, T-DNA đợc giới hạn bởi một đoạn trình tự lặp lại gần nh hoàn toàn từ khoảng
25bp và gọi là đoạn biên. Chúng là dấu hiệu nhận biết cho quá trình chuyển T-DNA
và xâm nhập của T-DNa vào tế bào thực vật. ở đoạn biên phải (Righ border-RB) có
yếu tố điều khiển cis cần cho quá trình chuyển T-DNA. Đoạn biên trái (Left border-
LB) gián tiếp tham gia vào quá trình chuyển T-DNA và là dấu hiệu để quá trình này

kết thúc bình thờng (Schmidt M.A. và cs, 2007)[28].
ở Ti-plasmid dạng nopalin, T-DNA xâm nhập vào genome thực vật ở dạng
một đoạn liên tục dài 22kb. Trong khi ở Ti-plasmid dạng octopin, T-DNA là một
đoạn gen liên tục dài 13 kb. T-DNA mang rất nhiều gen nh: (1) Các gen mã hoá
những enzym cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp opin; (2) Các gen gây khối u
nh tms1, tms2, tmr mã hoá cho các enzym liên quan đến quá trình sinh tổng hợp
auxin và cytokinin.
Hình 2.2. Cấu trúc T-DNA
2.2.3. Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A. tumefaciens
Các tế bào cây bị tổn thơng sẽ tiết ra các hợp chất hoá học dẫn dụ vi khuẩn
nh: acetosyringon, hydroxy-acetosyringon Dới tác dụng của hợp chất này, A.
tumefaciens nhận biết rồi bám vào thành tế bào chủ và chuyển T-DNA vào tế bào
thực vật. Quá trình này đợc trợ giúp đặc biệt của gen vir và RB, LB. Cũng chính các
hợp chất này, với vai trò cảm ứng, giúp các gen vùng VIR hoạt động và tăng cờng
biểu hiện. Khi vi khuẩn xâm nhiễm tế bào qua vết thơng, sản phẩm gen vir A sẽ
nhận biết sự có mặt và tơng tác với các phân tử acetosyringon rồi truyền thông tin
ngoại bào này vào trong tế bào dẫn đến sự hoạt động của các protein vir G.
Tiếp theo, vir G lại kích hoạt các gen gây độc khác nh virB, virC, virD và
virE cũng nh tăng cờng mức độ phiên mã của vir G. Sau đó, virD hỗ trợ quá trình
10
TGGCGGATATATATGTGGTGTAAAC
TGACAGGATATATGGCGGGTAAAC
Tms2
1
Tmr
Tms1
2


Vùng gây khối u (Onc)

Vùng gây khối u (Onc)
nos
LB RB
tách T-DNA thành hai sợi đơn. Một sợi sẽ chuyển sang tế bào thực vật với đầu 5' đi
trớc. Sợi đơn còn lại sẽ làm khuôn để tổng hợp nên sợi DNA bổ sung mới. VirD1 và
virD2 chịu trách nhiệm hình thành mạch T, một bản copy mạch đơn của T-DNA,
bằng cách nhận biết và cắt ở vị trí đặc trng ở hai đoạn biên, trong đó đoạn biên phải
là điểm bắt đầu, do vậy quan trọng hơn (Lê Trần Bình và cs, 1997)[1].
Trong quá trình di chuyển, sợi DNA đơn đợc gắn với protein virE để chui qua
rất nhiều màng trớc khi vào đợc đến nhân tế bào thực vật. Protein virB nằm trên
màng tế bào vi khuẩn có nhiệm vụ chuyển trực tiếp T-DNA sợi đơn sang tế bào thực
vật. Sau khi T-DNA qua màng tế bào, chúng đi thẳng vào nhân và kết hợp với hệ gen
thực vật ở những vị trí ngẫu nhiên. Trong quá trình di chuyển, sợi DNA đơn đợc gắn
với protein VirE để chui qua rất nhiều màng trớc khi vào đợc đến nhân tế bào thực
vật. Protein virB nằm trên màng tế bào vi khuẩn có nhiệm vụ chuyển trực tiếp T-
DNA sợi đơn sang tế bào thực vật.
Hình 2.3. Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A. tumefaciens
Tại đó, các gen trên T-DNA, nhờ sự điều khiển của gen thực vật, bắt đầu hoạt
động và sản sinh auxin, cytokinin và opin gây nên sự phát triển tthái quá của hàng
loạt tế bào lân cận dẫn đến sự hình thành khối u (Frame B.R. và cs, 2002)[17].
2.2.4. Biến nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
2.2.4.1. Hệ thống chuyển gen in vitro
Khó khăn chính trong việc xây dựng hệ thống chuyển gen in vivo là phải có
đợc sự kết hợp giữa sự xâm nhiễm của A.tumefaciens và khả năng tái sinh của các tế
bào sau khi lây nhiễm với vi khuẩn (Trần Thị Cúc Hoà , 2007)[8]. Một số trợ giúp
kỹ thuật trong quá trình biến nạp đã cải thiện hiệu quả của hệ thống chuyển gen in
vivo nhờ Agrobacterium bao gồm:
11
- Xử lý sóng siêu âm: Xử lý mô tế bào thực vật với A.tumefaciens trong điều
kiện sóng siêu âm tạo ra các tổn thơng nhỏ, đồng nhất ở mô thực vật, cho phép

Agrobacterium dễ dàng xâm nhập vào tế bào thực vật. Bằng phơng pháp này đã cải
thiện rõ rệt hiệu quả chuyển gen, biểu hiện gus tạm thời đã tăng từ 100-1400 lần ở
các tế bào đậu tơng, đậu đũa, cây vân sam trắng, lúa mì và ngô .
- Ly tâm tế bào: Phơng pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium kết hợp
với ly tâm đã đợc áp dụng thành công khi biến nạp vào huyền phù tế bào phôi hoá
nhận đợc từ hoa chuối đực nuôi cấy in vitro của hai giống chuối thơng mại
Cavendish và Lady Finger. Tần số chuyển gen đã đợc cải thiện đáng kể bằng cách
áp dụng chế độ ly tâm tế bào thực vật trong quá trình nuôi cấy cộng sinh với vi
khuẩn (Khanna H.K. và cs, 2004)[21].
2.2.4.2. Hệ thống chuyển gen in vivo
Phơng pháp này dựa trên cơ sở của việc chuyển gen vào nguyên cây (in
planta) và rất phổ biến đối với loài A. thaliana, một trong những loài cây mô hình
đối với các nghiên cứu về hệ gen học. Phơng pháp chuyển gen này tốn ít thời gian,
bỏ qua công đoạn nuôi cấy mô và tái sinh sau biến nạp, vì thế loại bỏ đợc các biến
dị sôma và số lợng cây chuyển gen thu đợc lớn hơn. Kỹ thuật này đã đợc mô tả ở
các cây trồng khác nhau nh: đậu tơng, Arabidopsis, hoa hớng dơng, hoa rum và cây
lạc (Rohini V.K. và cs, 2000)[26].
- Phơng pháp chuyển gen vào hạt
Hạt Arabidopsis đợc lây nhiễm với Agrobacterium sau đó đem trồng và thu
đợc cây trởng thành với tần số biến nạp 1%. Hạt Arabidopsis chuyển gen đã đợc tạo
thành từ các cụm hoa mới xuất hiện sau khi lây nhiễm Agrobacterium tại những
vùng bị tổn thơng khi cắt bỏ cụm hoa.
- Phơng pháp ngâm cụm hoa
Một số nghiên cứu chuyển gen đã đợc tiến hành ở cây Arabidopsis bằng cách
ngâm các thể giao tử cái của hoa non, cụm hoa trong dịch vi khuẩn Agrobacterium.
Phơng pháp này cũng đã đợc áp dụng với các cây một lá mầm. Chumako và cs,
(2006)[14] đã chuyển đợc gen nptII vào dòng ngô AT-3 bằng cách xử lý râu ngô của
các cây ngô đang sinh trởng trên đồng ruộng với dịch vi khuẩn Agrobacterium
chủng GV3101 (pTd33). Phân tích PCR cho thấy khoảng 6,8% các cây con nảy
12

mầm từ hạt nhận đợc từ các cây ngô sau khi lây nhiễm bằng cách này mang gen
nptII.
- Phơng pháp thấm lọc chân không
Phơng pháp chuyển gen thấm lọc chân không cũng tơng tự nh phơng pháp
ngâm cụm hoa. Phơng pháp này đã đợc áp dụng ở một số cây trồng, đặc biệt là cây
một lá mầm. Trong môi trờng chân không, tế bào thực vật tiếp xúc với
Agrobacterium tốt hơn. Ngời ta đã nhận đợc các cây Medicago truncatula (cây mô
hình thuộc họ đậu) chuyển gen bền vững bằng phơng pháp chuyển gen này
(Tingay .S. và cs, 1997)[29].
Ngoài ra, ngày nay trên thế giới còn sử dung các phơng pháp biến nạp trực
tiếp nh: Biến nạp bằng súng bắn gen, biến nạp bằng hóa chất, biến nạo bằng xung
điện (Sharma K.K. và cs, 2005)[27].
2.3. Hệ thống vectơ chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Ti-plasmid là một đoạn phân tử DNA mạch vòng, sợi kép có trọng lợng phân
tử bằng 3-5% so với trọng lợng phân tử của nhiễm sắc thể vi khuẩn. Với kích thớc
khoảng 200 kb, trong tế bào chúng tồn tại nh một đơn vị sao chép độc lập. Kích thớc
lớn của Ti-plasmid gây không ít khó khăn trong việc sao chép ở mức phân tử cũng
nh không đơn giản để chuyển nạp gen thông qua Agrobacterium. Mặt khác, chúng
lại chứa các gen tổng hợp hoóc môn sinh trởng thực vật và opin không cần thiết và
gây khối u cho cây bị xâm nhiễm nên không đợc dùng trực tiếp làm vector. Các
enzyme giới hạn có thể cắt DNA của Ti-plasmid ở nhiều chỗ khác nhau, trong khi
đó công nghệ gen lại cần có những vị trí cắt duy nhất cho hoạt động của một số
enzyme giới hạn. Ngoài ra, các gen one đợc dùng làm chỉ thị chọn lọc có tính trội,
nhng chúng lại cản trở quá trình tái sinh bình thờng ở thực vật (Phạm Thị Hạnh và
cs, 2005)[6], (Lê Thị Thu Hiền, 2003)[7]. Với những lý do này, Ti-plasmid đã đợc
nghiên cứu cải biến nh cắt bỏ các gen không quan trọng, lắp thêm các gen cần thiết
vào vùng tạo dòng đa năng MCS tạo hai hệ thống vector chuyển gen hiệu quả:
vector hai nguồn binary vector) và vector liên hợp (co-integrate vector). Nhờ vậy,
cây trồng đợc biến nạp Ti-plasmid cải biến vừa mang gen quan tâm, vừa có khả năng
tái sinh và phát triển bình thờng.

13
Hệ vector hai nguồn
Trên cơ sở phát hiện vùng vir không cần nằm trên cùng một plasmid với vùng
T-DNA mà vẫn điểu khiển đợc sự chuyển và xâm nhập của T-DNA vào hệ gen thực
vật, ngời ta đã nghiên cứu và hoàn chỉnh hệ thống vector hai nguồn trong đó vùng T-
DNA và vùng vir nằm trên hai plasmid khác nhau nhng trong cùng một chủng
A.tumefaciens. Có hai loại vector đợc sử dụng trong hệ thống vector hai nguồn:
(1) Vector chuyển gen: là Ti-plasmid nhỏ có khả năng tự sao chép và có phổ
vật chủ rộng với đoạn T-DNA đợc cắt bỏ hết các gen không cần thiết ở giữa hai trình
tự biên trái và biên phải, gắn thêm một số thành phần tạo ra cấu trúc mới gồm: i) các
đơn vị sao chép để DNA plasmid có thể vừa tự nhân trong cả E.coli và
Agrobacterium; ii) các gen chọn lọc, gen chỉ thị; iii) vùng có chứa nhiều điểm cắt
của các enzyme giới hạn (vùng tạo ra dòng đa năng) nằm ở giữa hai trình tự biên trái
và biên phải để chèn gen mong muốn.
(2) Vector bổ trợ: nằm trong A.tumefaciens, với toàn bộ vùng vir đợc giữ lại
nhng loại bỏ hoàn toàn vùng T-DNA và RB, LB. Plasmid này đợc cải tiến loại bỏ
gen kích thích tế bào thực vật phát triển thành khối u, nhng vẫn duy trì khả năng
thâm nhập vào tế bào thực vật.
Hai cấu trúc này cùng đợc đa vào Agrobacterium, khi các gen trên vector bổ
trợ hoạt động thì các sản phẩm của nó sẽ tác động tới đoạn T-DNA trên vector
chuyển gen dẫn đến sự chuyển đoạn T-DNA sang tế bào thực vật.
Hình 2.4. Sơ đồ cấu trúc vector hai nguồn
Thực tế cho thấy, plasmid với hai đơn vị sao chép có thể không bền vững
trong E.coli khi cả hai vùng này cùng hoạt động. Tuy nhiên, vector hai nguồn có
14
một số u điểm nh: i) Không xảy ra quá trình tái tổ hợp giữa các plasmid; ii) Kích th-
ớc vector khá nhỏ. Nhờ vậy, hiệu quả quá trình chuyển gen từ E.coli sang
A.tumefaciens đã tăng lên. Hiện nay, vector hai nguồn đợc sử dụng rộng rãi với rất
nhiều loại đợc thiết kế phù hợp với yêu cầu của quá trình chuyển gen (Phạm Thị
Hạnh và cs, 2005)[6].

Hệ thống vector liên hợp
Vector liên hợp đợc xây dựng trên cơ sở tự tái tổ hợp giữa vùng tơng đồng
nằm trên plasmid vi khuẩn ( nh vector của E.coli) với vùng T-DNA trên Ti-plasmid
của A.tumefaciens. Trong đó, ngời ta giữ lại vùng vir, loại bỏ vùng mã hoá chức
năng gây khối u và thay thế bằng những đoạn DNA mới trong Ti-plasmid. Có 3 loại
hệ thống vector tham gia vào hệ thống vector liên hợp:
(i) Ti-plasmid: các gen gây khối u đã bị thay bởi gen kháng kanamycin của vi
khuẩn; (ii) Vector trung gian: có nguồn gốc từ pBR322 với kích thớc nhỏ và đợc sử
dụng để bổ trợ chức năng không u việt của Ti-plasmid (kích thớc lớn và thiếu vùng
MCS). Chúng đợc nhân lên trong E. coli và chuyển sang A. tumefaciens nhờ quá
trình tiếp hợp. Do không thể sao chép trong A. tumefaciens nên chúng mang những
đoạn tơng đồng với T-DNA. (iii) Vector trợ giúp: tồn tại trong E. coli, có kích thớc
nhỏ, chứa gen di động (mob) và gen chuyển (tra) giúp cho quá trình tiếp hợp và
chuyển vào A. tumefaciens.
Hình 2.5. Sơ đồ cấu trúc vector liên hợp
2.4. Các yếu tố ảnh hởng đến hiệu quả biến nạp gen thông qua A. tumefaciens
Sự thành công trong việc tạo ra thực vật chuyển gen phụ thuộc vào một loạt
các yếu tố nh tần số biến nạp, tác nhân chọn lọc hoặc sàng lọc và khả năng tái sinh
15
cây chuyển gen hoàn chỉnh từ các tế bào và mô mang gen chuyển nạp. Đối với ph-
ơng pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium thì tần số biến nạp phụ thuộc vào
các yếu tố liên quan đến vi khuẩn và các yếu tố liên quan đến thực vật. Các yếu tố
liên quan đến vi khuẩn bao gồm: chủng vi khuẩn, mật độ vi khuẩn, thời gian lây
nhiễm, hoạt tính của gen vir, khả năng xâm nhập vào các cây chủ và loại vector. Các
yếu tố liên quan đến thực vật gồm loại cây, kiểu gen, dạng mẫu mô, khả năng phân
bào của các tế bào đích, thành phần môi trờng (Lê Thị Thu Hiền, 2003)[7].
Một số yếu tố chính ảnh hởng đến hiệu quả chuyển gen thông qua
Agrobacterium:
Chủng Agrobacterium và plasmid
Các nghiên cứu chuyển gen thành công thông qua A.tumefaciens cho thấy

hiện tại chỉ có 3 chủng vi khuẩn đợc sử dụng hiệu quả ở các loài cây một lá mầm đó
là LBA4404, C58 đã bị bất hoạt và EHA 101; và các chủng cải biên (EHA105 từ
EHA101, AGL0 &AGL-1 từ EHA101) (Phạm Thị Lý Thu, 2006)[11].
Dạng Ti plasmid của Agrobacterium cũng có vai trò trong quá trình chuyển T-
DNA vào tế bào thực vật. Các nghiên cứu cho thấy, Ti plasmid dang nopalin có hiệu quả
hơn trong việc lây nhiễm Agrobacterium vào ngô so với Ti plasmid dạng octopin.
Thành phần môi trờng lây nhiễm và đồng nuôi cấy
Thành phần môi trờng cũng là những yếu tố quan trọng ảnh hởng đến hiệu
quả chuyển gen. Môi trờng N6 cải tiến có bổ sung 2,4D, casein là môi trờng thích
hợp cho nuôi cấy cộng sinh trong chuyển gen vào lúa. Môi trờng MS hay MS cải
tiến cũng thích hợp cho lây nhiễm và đồng nuôi cấy trong chuyển gen ở một số kiểu
gen lúa khác. Môi trờng với hàm lợng khoáng giảm đã kích thích khả năng chuyển
T-DNA trong biến nạp gen vào mô sẹo phôi hoá ở lúa mỳ, phôi non ở ngô (Phạm Thị
Lý Thu, 2006)[11].
Việc bổ sung acetosyringone (AS) chất kích thích sự hình thành các gen vir,
đã có trong hầu hết các quy trình chuyển gen ỏ cây một lá mầm. Trong trờng hợp
không có AS, mức độ biểu hiện tạm thời của gen gus rất thấp, không tái sinh đợc cây
lúa và cây hành chuyển gen.
16