Xây dựng qui trình phát hiện đồng thời yeallow head virus(YHV), taura syndrome virus(TSV) và gill associated virus(GAV) trên tôm bằng kỹ thuật multiplex reverse transcription polymerase chain reaction

1
LỜI CẢM ƠN
Con xin cám ơn bố mẹ và những người thân yêu trong gia đình đã luôn bên con.
Tôi xin chân thành cảm ơn quí thầy cô Viện CNSH& MT trường Đại học
Nha Trang đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quí báu trong những năm qua.
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Công ty cổ phần công nghệ Việt Á đã giúp
đỡ tôi hoàn thành đề tài.
Tôi xin cảm ơn Ths. Nguyễn Thị Hải Thanh - Viện CNSH&MT Đại học Nha
Trang, anh Nguyễn Trọng Hiếu công ty CPCN Việt Á, đã hướng dẫn tôi tận tình
trong quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các anh chị phòng R&D và phòng Dịch vụ công ty
cổ phần công nghệ Việt Á đã giúp đỡ tôi về mặt tài liệu và thực nghiệm để tôi có
thể hoàn thành tốt đề tài.
Ngoài ra, tôi cũng xin được cảm ơn tất cả những người đã chia sẻ và giúp đỡ
tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Sinh viên thực hiện


Nguyễn Thành Trang






2
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN 1

MỤC LỤC 2
DANH MỤC CÁC BẢNG 5
DANH MỤC CÁC HÌNH 6
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 8
1.1.1. Tình hình nuôi tôm và dịch bệnh trên thế giới 11
1.1.2. Tình hình nuôi tôm và dịch bệnh tại Việt Nam 12
1.2. Tác nhân gây bệnh 13
1.2.1. Yellow head virus (YHV) 13
1.2.1.1. Hình thái cấu trúc 13
1.2.1.2. Cách thức lan truyền 13
1.2.1.3. Dấu hiệu bệnh lý 14
1.2.2. Taura syndrome virus (TSV) 15
1.2.2.1. Hình thái cấu trúc 15
1.2.2.2. Cách thức lan truyền 16
1.2.2.3. Dấu hiệu bệnh lý 16
1.2.3.1. Hình thái cấu trúc 17
1.2.3.2. Cách thức lan truyền 17
1.2.3.3. Dấu hiệu bệnh lý 17
1.3. Các phƣơng pháp phát hiện bệnh 18
1.3.1. Phương pháp mô bệnh học 18
1.3.2. Phương pháp lai tại chỗ (in situ hybridization) 20
1.3.3. Phương pháp sinh học phân tử 20
1.3.3.1.Phương pháp RT – PCR (Reverse – transcription polymerase chain reaction) 20


3
1.3.3.3. Các thành phần trong phản ứng PCR 23
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27
2.1. Vật liệu 27
2.1.1. Chủng virus 27

2.1.2. Mẫu thí nghiệm 27
2.1.3. Mồi cho phản ứng 27
2.1.4. Hóa chất tách chiết RNA 28
2.1.5. Hóa chất cho phản ứng RT 28
2.1.6. Hóa chất cho phản ứng PCR 28
2.1.7. Hóa chất cho điện di 28
2.1.8. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 29
2.2. PHUƠNG PHÁP 30
2.2.1. Chuẩn bị mẫu 30
2.2.2. Tách chiết RNA 30
2.2.2.1. Nguyên tắc 30
2.2.2.2. Tiến hành 30
2.2.3. Phản ứng RT 31
2.2.3.1. Nguyên tắc 31
2.2.3.2. Tiến hành 31
2.2.4. Khuếch đại bằng phản ứng PCR 31
2.2.4.1. Nguyên tắc 31
2.2.4.2. Tiến hành 32
1. Thành phần phản ứng PCR 32
2.2.5. Điện di trên gel agarose 32
2.2.5.1. Nguyên tắc 32


4
2.2.5.2. Tiến hành 32
1. Chuẩn bị dung dịch nạp mẫu 32
2.2.6. Phương pháp đánh giá mồi trên lý thuyết 33
2.2.6.1. Các tiêu chuẩn thiết kế mồi 33
2.2.6.2. Phương pháp đánh giá mồi. 33
2.2.7. Phương pháp xác định nhiệt độ lai tối ưu của mồi. 33

2.2.8. Phƣơng pháp xác định độ nhạy của qui trình 34
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35
Kết quả xây dựng qui trình Multiplex RT-PCR phát hiện đồng thời Yellow head virus(YHV),
Taura syndrome virus (TSV), và Gill-associated virus (GAV) Error! Bookmark not defined.
3.1. Kết quả khảo sát các đặc tính của mồi 35
3.2. Khảo sát độ đặc hiệu và khả năng nhân bản của mồi của mồi trên lý thuyết. 39
3.3. Kết quả xây dựng qui trình Multiplex RT- PCR bằng thực nghiệm 45
3.3.1. Kết quả khảo sát sự hoạt động của hệ Primer 45
3.3.2. Khảo sát tỉ lệ nồng độ giữa ba cặp mồi 47
3.3.3. Khảo sát nhiệt độ lai(Ta) cho 3 cặp mồi. 48
3.3.3. Kết quả khảo sát độ đặc hiệu cho ba cặp mồi 49
3.3.4. Kết quả khảo sát độ nhạy cho 3 cặp mồi 51
3.3.5. Kết quả ứng dụng qui trên mẫu tôm nghi ngờ mắc bệnh. 52
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56
1. Kết luận 56
2. Đề nghị 56
TÀI LIỆU THAM KHẢO 57




5
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1: Trình tự các mồi 27
Bảng 2: Kích thƣớc của thang DNA 100bp 29
Bảng 3: Khảo sát đặc tính của mồi 35



6

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1: Tế bào mang tôm bị nhiễm virus YHV 14
Hình 2: Biểu đồ tổ chức của bộ gen TSV. 15
Hình 3: Hội chứng Taura 16
Hình 4: Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR 22
Hình 5 : Các dạng cấu trúc self-dimer của các mồi 36
Hình 6: Các dạng cấu trúc hetrodimer của các mồi 38
Hình 7: Khảo sát mồi YHVf trên BLAST 39
Hình 8: Khảo sát độ dặc hiệu của mồi YHVr 40
Hình 9: Khảo sát độ dặc hiệu trên BLAST của GAVf 40
Hinh 10: Khảo sát độ đặc hiệu của mồi GAVr trên BLAST 41
Hình 11: Khảo sát dộ đặc hiệu của mồi TSVf trên BLAST 41
Hình 12: Khảo sát độ đặc hiệu của TSVr trên BLAST 42
Hình 13: Kết quả sắp gióng mồi YHVf 42
Hình 14: Kết quả sắp gióng của mồi YHVr 43
Hình 15: Kết quả sắp gióng mồi GAVf 43
Hình 16: Kết quả sắp gióng của mồi GAVr 44
Hình 17: Kết quả sắp gióng của mồi TSVf 44
Hình 18: Kết quả sắp gióng của mồi TSVr 45
Hình 19: Kết quả khảo sát sự hoạt động của hệ Primer 46
Hình 20: Kết quả khảo sát tỉ lệ mồi 48
Hình 21: Khảo sát nhiệt độ lai 49
Hình 22 : Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của 3 cặp mồi 50


7
Hình 23: Kết quả khảo sát độ nhạy cho 3 cặp mồi 51
Hình 24 : Kết quả ứng dụng qui trên mẫu tôm nghi ngờ mắc bệnh 53

8
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
YHV: Yeallow heat virus
TSV: Taura syndrome virus
GAV: Gill-associated virus
CTV: Cộng tác viên
ARN: Acid ribonucleic
DNA: Acid deoxyribonucleic
PCR: Transcription polymerase chain reaction
dNTP: Deoxynucleotide triphotphat
DMSO: Dimethylsulfoxide
dATP: Deoxy adenosine triphosphate
dTTP: Thymedine triphosphate
dCTP: Deoxycytidine triphosphate
UTRs: Untranslated regions
RT-PCR: Reverse transcription polymerase chain reaction
kDa: kilo dalton
H&E: Hematoxylin EoSin








9
LỜI MỞ ĐẦU
Ngày nay việc khai thác các nguồn lợi thủy sản biển đã làm cho trữ lượng
của các đối tượng thủy sản có giá trị kinh tế cao ngày càng trở nên cạn kiệt. Do đó

nghề nuôi trồng thủy sản ven bờ trong những năm gần đây phát triển mạnh là một
thực tế khách quan và là nhu cầu cần thiết. Ở nước ta, mặc dù nghề nuôi tôm mới
thực sự phát triển từ năm 1988 nhưng do lợi nhuận cao và do sự ưu đãi của thiên
nhiên, nghề nuôi tôm phát triển khá nhanh ở một số tỉnh ven biển miền Trung và
các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long, nhất là các tỉnh Long An, Tiền Giang, Bến Tre,
Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng… Diện tích nuôi tôm ngày càng được mở rộng với
khoảng 260.000 ha với nhiều hình thức nuôi khác nhau. Khoa học kỹ thuật đã được
áp dụng rộng rãi nhằm đáp ứng nhu cầu về con giống, nuôi tôm tăng sản…với mục
tiêu đạt sản lượng cao nhất trong thời gian ngắn nhất. Khi phát triển các hình thức
nuôi tôm công nghiệp thì tôm được nuôi với mật độ cao. Do đó nếu kỹ thuật nuôi
chưa được đảm bảo. Hơn nữa việc áp dụng khoa học kỹ thuật trong các công đoạn
nuôi chưa được đồng bộ thì vấn đề ô nhiễm môi trường nước, phá vỡ môi trường
sinh thái, bùng nổ dịch bệnh…là một thực tế không thể tránh khỏi và đã gây ra
nhiều thiệt hại lớn cho người nuôi và cho nền kinh tế. Dịch bệnh vào cuối năm 1993
đầu 1994 lan rộng khắp các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long, gây thiệt hại gần 294 tỷ
đồng (Nguyễn Việt Thắng, 1994 và Bùi Quang Tề, 1995) là một minh chứng cụ thể.
Nghề nuôi tôm hiện đang phải đương đầu với nhiều loại bệnh xuất hiện trong
quá trình nuôi tôm, nhất là bệnh do virus gây ra như virus gây hội chứng Taura
(Taura syndrome virus -TSV), virus gây bệnh đầu vàng (yellow head virus - YHV)
và virus gây bệnh mang (gillassociated virus - GAV). Đặc trưng của bệnh là tỷ lệ
chết cao và chết hàng loạt trong một thời gian rất ngắn trên các ao nuôi. Hiện nay,
ba loại virus này đang gây nhiều trở ngại cho ngành nuôi tôm và gây thiệt hại lớn
trong nuôi trồng thủy sản vì chưa có biện pháp chữa trị đặc hiệu. Do đó, ngoài biện
pháp kỹ thuật nuôi tốt, còn phải có phương pháp chẩn đoán nhanh hiệu quả nhằm
giám sát ba mầm bệnh này từ lúc thả giống cho đến khi thu hoạch, phát hiện kịp
thời tôm bị nhiễm bệnh để có biện pháp xử lý thích hợp. Việc ứng dụng các phương


10
pháp sinh học phân tử trong đó có phương pháp multiplex RT-PCR để chẩn đoán

mầm bệnh trên tôm là nguồn công cụ rất hữu ích và đem lại nhiều hiệu quả cao.
Đề tài “Xây dựng qui trình phát hiện đồng thời Yeallow head
virus(YHV), Taura syndrome virus(TSV) và Gill-associated virus(GAV) trên
tôm bằng kỹ thuật Multiplex Reverse transcription polymerase chain
reaction” được thực hiện nhằm mục đích trên.
















11
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình nuôi tôm và dịch bệnh
1.1.1. Tình hình nuôi tôm và dịch bệnh trên thế giới
Lịch sử phát triển nghề nuôi tôm ở nhiều nước, nhất là ở vùng Trung Quốc
và Đông Nam Á cho thấy vấn đề thiệt hại do dịch bệnh trong nghề nuôi tôm là điều
không thể tránh khỏi. Các mô hình nuôi tôm, sau một thời gian khai thác thì nhất
định bệnh sẽ xuất hiện [Nguyễn Mạnh Hùng, 1994]. Trung Quốc là nước có sản
lượng tôm cao nhất thế giới, năm 1992 là 150.000 tấn; năm 1993 do dịch bệnh thiệt

hại 50% tổng sản lượng. Đài Loan năm 1987 với đỉnh cao sản xuất 45.000 tấn tôm
sú nuôi, năm liền sau đó sản lượng giảm xuống còn 30.000 tấn do tôm bị dịch bệnh.
Indonesia cũng đang bị thiệt hại nặng do môi trường xấu và do dịch bệnh. Trong
quý ba năm 1994, sản lượng tôm xuất khẩu của Indonesia sang Hoa Kỳ giảm 38%.
Thái Lan năm 1990, thiệt hại hơn 20.000 ha nuôi thâm canh tôm sú vì nước bị ô
nhiễm bởi chất thải công nghiệp và bị bệnh. Năm 1994, tôm nuôi ở Thái Lan bị chết
gần 30.000 ha, mức thiệt hại lên đến 40 triệu USD [Nguyễn Mạnh Hùng, 1994].
Bệnh đầu vàng gây chết tôm sú nuôi ở miền Trung và miền nam Thái lan,
đặc biệt nguy hiểm cho các vùng nuôi thâm canh [Boonyaratpalin và CTV, 1992].
Virus đầu vàng có thể liên quan đến đợt dịch bệnh của tôm sú nuôi ở Đài loan năm
1987-1988. Những nơi khác thuộc Đông Nam Á như: Indonesia, Malaysia, Trung
quốc, Philippine gặp ít nhưng nguy hiểm cho tôm sú nuôi [Linhtner, 1996]. Với khả
năng lây nhiễm và gây chết nhanh, bệnh gây ảnh hưởng không nhỏ đến nền kinh tế
của những quốc gia có nghề nuôi tôm phát triển.
Bệnh do Taura syndrome virus (TSV) gây chết trên tôm thẻ chân trắng được
phát hiện lần đầu tiên ở khu vực cửa sông Taura tỉnh Guayas, Ecuador, do nhà khoa
học Jimenez công bố, sau đó lây lan khắp lãnh thổ nước này. Nạn nhân tiếp theo
của dịch bệnh này là các nước Peru, Columbia, Honduras, Guatemala, El Salvador,
vùng đông bắc Brazil, Nicaragua, Mexico và các bang ở miền bắc nước Mỹ cùng
với quần đảo Hawaii… gây nên đại dịch đã làm thiệt hại nặng về kịnh tế: năm


12
1993-1994 Châu Mỹ thiệt hại 132.000 tấn, năm 1998-1999 có đến 90% ao nuôi tôm
thẻ chân trắng ở Đài Loan bị nhiễm bệnh khi nhập giống từ Ecuador.
Virus GAV được phát hiện ở Úc liên quan đến phức hợp bệnh đầu vàng.
Virus tồn tại cục bộ trong quần thể tôm sú ở Queensland - Úc, Malaysia và Thái
Lan Lây nhiễm tự nhiên với GAV chỉ được tìm thấy ở tôm Penaeus monodon,
nhưng lây nhiễm thực nghiệm đã gây ra tử vong ở tôm P. esculentus, P.merguiensis
và P.japonicus. Với tôm P.japonicus tính kháng bệnh có liên quan đến tuổi và kích

cỡ tôm. Bệnh đã gây những thiệt hại rất lớn.
1.1.2. Tình hình nuôi tôm và dịch bệnh tại Việt Nam
Hơn 10 năm trở lại đây, nghề nuôi tôm ở nước ta phát triển mạnh. Năm
2001, diện tích nuôi tôm thương phẩm đạt hơn 230.000ha, năng suất bình quân
462kg/ha, cá biệt có mô hình đạt 9-11tấn/ha, tổng sản lượng tôm nuôi 155.000 tấn.
Ðồng bằng sông Cửu Long là khu vực có phong trào nuôi tôm phát triển mạnh, tỷ lệ
sản lượng tôm nuôi chiếm hơn 50% của cả nước. Diện tích nuôi tôm nước lợ đạt
546.757 ha (2003), trong đó diện tích nuôi thâm canh là trên 15.534 ha (chiếm
khoảng 2,84 % tổng diện tích nuôi tôm), nuôi bán thâm canh trên 20.116 ha (chiếm
3,67 %), còn lại là nuôi quảng canh cải tiến và quảng canh. Từ năm 1997 đã phát
triển những mô hình nuôi tôm công nghiệp (thâm canh) đưa năng suất lên trung
bình 5 tấn/ha/vụ. Các tỉnh duyên hải Nam Bộ có tổng diện tích nuôi lớn nhất, chiếm
87,17 % của cả nước với 476.528 ha. Năm 2003 sản lượng nuôi tôm nước lợ đạt
hơn 200.000 tấn.
Tuy nhiên, cùng với việc tăng nhanh diện tích nuôi tôm, tình hình dịch bệnh
cũng phát triển. Theo thống kê của Bộ Thuỷ Sản (1995), từ năm 1993 - 1995 báo
động trên toàn quốc dịch bệnh tôm đã làm thiệt hại hàng trăm tỷ đồng. Trong đó,
dịch đầu vàng (YHV), đỏ đuôi (TSV), bệnh trên mang (GAV) gây ra những thiệt
hại lớn với tỉ lệ tôm chết rất cao. Trong năm 1994, tổng diện tích nuôi tôm có dịch
bệnh là 84.558 ha với sản lượng thiệt hại ước tính là 5.225 tấn, trị giá khoảng 294 tỷ
đồng. Đến nay dịch bệnh vẫn tồn tại và lây lan ngày càng rộng gây tổn thất nghiêm


13
trọng. Đồng Bằng Sông Cửu Long bị thiệt hại lớn nhất do nơi đây tập trung khoảng
87 % diện tích nuôi tôm của cả nước.
1.2. Tác nhân gây bệnh
1.2.1. Yellow head virus (YHV)
1.2.1.1. Hình thái cấu trúc
Virus YHV hình que, có kích thước 44±6 x 173±13nm. Nhân của virus có

đường kính gần 15 nm, chiều dài có thể tới 800 nm. Cấu trúc nhân là ARN, kích
thước 26.662bp và mã hóa cho 4 tiểu phần protein cấu trúc 170, 135, 67 và 22 kDa.
Hiện nay virus YHV cùng với GAV được coi là thành viên của loài Gill-associated
virus, giống Okavirus, họ Roniviridae trong bộ Nidovirales [Walker và CTV, 2005]
Bộ gen bao gồm bốn khung đọc mở dài (ORFs). ORF1a và ORF1b mã hóa
protein phi cấu trúc là các polyproteins (pp1a và pp1ab). ORF1b là một phần mở
rộng của ORF1a thông qua một frameshift ribosome. ORF2 mã hóa protein
nucleocapsid (P20). ORF3 mã hóa lớp vỏ glycoprotein.
Sử dụng những phương pháp phát hiện gene trên đối tượng là tôm Penaeus
monodon đã tìm ra 6 genenotyp của YHV. Sử dụng mồi kiểm tra giới hạn và mục
tiêu là vùng gene ORF1b đã xác định được trình tự gen được bảo tồn cao trong số
57 chủng trong sáu kiểu gen phát hiện ở P. monodon nguồn gốc từ các vùng khác
nhau của Ấn Độ-Thái Bình Dương [5].
1.2.1.2. Cách thức lan truyền
Bệnh đầu vàng lây truyền theo đường nằm ngang, virus từ tôm nhiễm bệnh
bài tiết ra môi trường hoặc từ một số tôm tự nhiên nhiễm bệnh sẽ lây truyền cho các
tôm trong ao nuôi. Có thể một số loài chim nước đã ăn tôm bị bệnh đầu vàng từ ao
khác và bay đến ao nuôi và mang theo mầm bệnh.




14
1.2.1.3. Dấu hiệu bệnh lý
Theo báo cáo của các nhà khoa học, từ năm 2001 đến nay phát hiện thấy tôm
bị bệnh vàng đầu có độ tuổi từ 25 ngày đến 70 ngày. Nếu là tôm nhỏ từ 25-35 ngày
thì nhiễm bệnh càng nặng và sẽ chết toàn bộ trong vòng 2-3 ngày. Bệnh gây hại chủ
yếu trên tôm sú.
 Biểu hiện đầu tiên tôm phát triển rất nhanh và ăn nhiều hơn mức bình
thường. Tôm đột ngột dừng ăn, sau một hai ngày tôm dạt vào gần bờ và chết.

 Mang và gan tụy có màu vàng nhạt, toàn thân có màu nhợt nhạt
 Bệnh có thể gây ra tỷ lệ chết nghiêm trọng đến 100% trong vòng 3-5 ngày.
 Khi tôm nhiễm bệnh đầu vàng kiểm tra tiêu bản máu thấy có dấu hiệu bất
thường: Nhân tế bào hồng cầu thoái hoá kết đặc lại hoặc bị phá huỷ phân mảnh.
 Kiểm tra mô bệnh học tế bào có hiện tượng hoại tử ở nhiều cơ quan và
xuất hiện các thể vùi trong tế bào chất, nhân thoái hoá kết đặc và thấy phân mảnh
của nhiều tế bào khác nhau: hệ bạch huyết (Lymphoid), tế bào mang, tế bào kẽ gan
tụy, tế bào biểu bì ruột.[Bệnh học thủy sản, 2005].


Hình 1: Tế bào mang tôm bị nhiễm virus YHV




15
1.2.2. Taura syndrome virus (TSV)
1.2.2.1. Hình thái cấu trúc
Tác nhân gây ra hội chứng này là Taura Syndrome Virus (TSV) hay
Picornavirus thuộc họ Picornaviridae. Virus hình cầu có 20 mặt, đường kính 30 –
32 nm, hệ thống gen là RNA mạch đơn có chiều dài 10,205 nucleotit, cấu trúc
capsid có ba phần (55, 40 và 24kD) và một đoạn polypeptide phụ (58kD) tương ứng
với ký hiệu VP1, VP2, VP3 và VP4. [4]. Virus ký sinh tế bào biểu mô và dưới biểu
mô đuôi. Ký chủ chính: P. vannamei, P. setiferus, P. stylirostris [3], các loài tôm
nhiễm thực nghiệm như P. aztecus, P. duorarum [Lightner, 1996; Overstreet và
CTV, 1997].
Cấu trúc gene của TSV được miêu tả có hai khung đọc mở lớn là ORF1 và
ORF2, phân biệt bởi một vùng gồm có 2 gene với 207 nucleotid. ORFs 1 và 2
chiếm đến 92% gene của TSV, 8% còn lại là của vùng không mã hóa. Một khu vực
gồm có hai gene 207 nucleotide phân cách khung đọc mở 1 và 2. ORF1 chứa trình

tự motif của các protein phi cấu trúc như helicase (NTP-binding protein), protease
và RNA polymerase phụ thuộc RNA. ORF2 có chứa trình tự cho các protein cấu
trúc của TSV, trong đó có 3 protein capsid chính là VP1 tới VP3 ( tương ứng có
khối lượng 55, 40, 24 kDa) và một protein phụ là VP0 (58 kDa). Để phát hiện hội
chứng Taura trên tôm người ta thường nghiên cứu trên gene protein capsid hoặc protein áo
(coat protein) nằm trong gene protein capsid (vùng gene VP1) [4].

Hình 2: Biểu đồ tổ chức của bộ gen TSV.

Số: chỉ vị trí nucleotide. ORFs 1 và 2 được hiển thị như là các hộp mở. ORF1 chứa
gene qui định trình tự của các protein phi cấu trúc như Bir, helicase (H), protease (P)
và RNA phụ thuộc RNA polymerase (RdRp). ORF2 qui định trình tự của các protein
cấu trúc VP1, VP2, VP3. Mũi tên đại diện cho đầu cuối N của protein capsid.



16
1.2.2.2. Cách thức lan truyền
Bệnh TSV có thể lan truyền theo chiều ngang hoặc chiều thẳng đứng. Sự lan
truyền theo đường ngang là do tập tính ăn thịt lẫn nhau của tôm hoặc do nguồn
nước bị nhiễm. Ấu trùng tôm giống ở giai đoạn sớm có thể nhiễm virus nếu bố mẹ
mang mầm bệnh (lây lan theo chiều thẳng đứng).
1.2.2.3. Dấu hiệu bệnh lý
Virus này xuất phát từ trong tế bào chất và sau đó lây sang các biểu mô và
biểu bì con bệnh. Bệnh gây hại trên tôm thẻ ngay trong giai đoạn trưởng thành,
trọng lượng phổ biến từ 0,1-0,5 gram từ 2-4 tuần tuổi. Đây được xác định là loại
virus cực kỳ nguy hiểm, thời gian ủ bệnh dài và khả năng chết lên tới 95%. Bệnh
kéo dài cho tới giai đoạn tôm lột xác và có khả năng cấp tính làm cho tôm èo uột,
mềm vỏ, phá huỷ hệ tiêu hoá và khuếch tán, lan truyền rất nhanh. Tôm sống sót giai
đoạn cấp tính đi qua một giai đoạn chuyển tiếp vào giai đoạn mãn tính. Trong giai

đoạn này, tôm không có triệu chứng, và chỉ bị phát hiện tổn thương mô học là tạng
lymphoid .
Cơ thể và các bộ phận khác có màu đỏ hoặc đen hồng, biếng ăn, bơi lờ đờ
trên mặt nước hoặc rúc vào đìa nuôi. Gan tụy có màu vàng hơn bình thường, mang
có thể bị sưng, thường bị chết lúc lột xác. Trong thời gian đầu không thấy tôm chết
quanh bờ ao nhưng lại có tôm chết dưới đáy, khoảng 2 ngày sau tôm sẽ nổi lên mặt
nước và tìm thấy nhiều tôm chết ở rìa ao[Bệnh học thủy sản,2005].

Hình 3: Hội chứng Taura


17
1.2.3. Gillassociated virus (GAV)
1.2.3.1. Hình thái cấu trúc
GAV được coi là thành viên của loài Gill-associated virus, giống Okavirus,
họ Roniviridae trong bộ Nidovirales [Walker và CTV., 2005] (YHV typ 2) được
phát hiện ở Úc, có khả năng gây bệnh mang trên tôm sú. GAV có quan hệ rất gần
gũi với YHV do những đặc điểm hình thái cấu trúc rất giống nhau. Chúng phân bổ
95.8% trình tự nucleotide và có 85,1% nucleotide giống nhau [Cowley và CTV,
1999]. Với sự đồng nhất 98,5% giữa các nucleotide cho thấy YHV và GAV là biểu
trưng cho một loài chung nguồn gốc nhưng khác biệt di truyền do địa lý gọi là
topotypes. Nadala và cộng sự (1997) đã xác định được 4 cấu trúc protein (170, 135,
67 và 22 kDa) từ YHV tinh khiết và bằng cách suy luận đó đã tìm ra GAV và xác
định rằng protein 135 KDA là qui định cho GAV [18].
Vùng trình tự khuếch đại gen mục tiêu ORF1b được sử dụng để phát hiện
GAV trong các xét nghiệm.
1.2.3.2. Cách thức lan truyền
Dạng lan truyền theo phương nằm ngang có hiệu quả nhất do chúng ăn thịt
lẫn nhau, nhưng việc lan truyền cũng có thể bằng nguồn nước. GAV cũng có thể
truyền theo phương thẳng đứng từ tôm bố mẹ còn khoẻ. Virus có thể lan truyền

hoặc từ bố hoặc từ mẹ hoặc cả hai nhưng không rõ là sự lây nhiễm có ở trong trứng
hay không.
1.2.3.3. Dấu hiệu bệnh lý
Tôm bị nhiễm GAV cấp tính có biểu hiện lờ đờ, kém ăn, bơi lâu trên mặt
nước hoặc quanh bờ ao. Thân tôm biến thành màu đỏ sẫm, đặc biệt ở các phần phụ
bộ, cánh đuôi và phần miệng; mang biến sang vàng-hồng, còn quan sát thấy giun
hình ống và con hà bám trên mang bẩn. Những biểu hiện chung của nhiễm GAV
cấp tính luôn thay đổi và không phải luôn nhận thấy được, vì thế chúng không đáng


18
tin cậy ngay cả chẩn đoán sơ bộ. Bệnh có thể gây chết 80-90%, hoặc giảm chất
lượng thương phẩm.[Bệnh học thủy sản, 2005].
1.3. Các phƣơng pháp phát hiện bệnh
1.3.1. Phương pháp mô bệnh học
Dựa vào biểu hiện trên các cơ quan của tôm để có thể đánh giá mức độ bệnh
và chủng gây bệnh.Có thể dùng để chuẩn đoán các bệnh do YHV, GAV, TSV gây
ra bằng các biểu hiện mô biểu bì, mang, gan có những dấu hiệu đặc trưng cho từng
loại bệnh. Như:
- Khi tôm nhiễm bệnh đầu vàng, kiểm tra tiêu bản máu thấy có dấu hiệu bất
thường: Nhân tế bào hồng cầu thoái hoá, kết đặc lại hoặc bị phá huỷ phân mảnh.
Mang và gan tuỵ có màu vàng nhạt, toàn thân có màu nhợt nhạt. Cố định tôm nghi
bị bệnh đầu vàng sắp chết trong dung dịch Davidson và xử lý cho nhuộm màu
chuẩn H&E. Hầu hết các mô nõi có huyết tương đều có thể bị nhiễm bệnh, tuy
nhiên những vị trí quan trọng như cơ quan bạch huyết, các tế bào gan tụy trung gian
(không phải các tế bào biểu mô ống), tim, cơ và các mô liên kết (không phải các tế
bào biểu mô), các mô biểu bì dạ dày và mô mang . Bằng kính hiển vi quang học có
thể xác định được một lượng lớn thể vùi tế bào chất hình cầu có đường kính khoảng
2mm (nhỏ hơn đối với mô trung bì và ngoại bì) bắt màu thuốc nhuộm kiềm và khá
đồng màu.

- Việc chẩn đoán hội chứng Taura ở các giai đoạn cấp tính cần đến những
biểu hiện mô học (các tiêu bản nhuộm H&E) của các vùng bị hoại tử ở lớp biểu mô
cutin trên toàn bộ bề mặt cơ thể, phần phụ, mang, ruột sau, thực quản. Mô liên kết ở
dưới lớp cutin và các sợi cơ vân ở dưới hay kề sát với lớp biểu mô cutin cũng có các
dấu hiệu hoại tử. Ðôi khi lớp biểu mô ống của tuyến râu cũng bị ảnh hưởng. Các tổn
thương của lớp cutin có thể chứa các tế bào có tế bào chất bắt màu Eosin không
bình thường (nhuộm màu hồng) và nhân bị ngưng kết (chất nhân cô đặc lại) hoặc bị
vỡ (chất nhân bị chia nhiều mảnh). Trong giai đoạn cấp tính các tổn thương thường
có rất nhiều các mảnh vụn của các tế bào hoại tử và chúng giống như các thể hình


19
cầu sần sùi (đường kính 1-20 µm) có màu nhuộm thay đổi từ bắt màu Eosin sang
bắt màu kiềm sáng (màu xanh da trời). Một đặc tính khác của hội chứng Taura cấp
tính là có sự ngưng kết hồng cầu hoặc các biểu hiện khác do phản ứng tự vệ của vật
chủ. Các đặc tính này phối hợp lại tạo cho các tổn thương hội chứng Taura cấp tính
giống như .rắc hạt tiêu. Điều này coi như để chẩn đoán bệnh và có thể coi là căn cứ
kiểm tra cho các loài mẫn cảm ở các vùng nước bị dịch cục bộ. Với những quan sát
lần đầu về các đặc điểm mô bệnh này, hoặc việc chúng xuất hiện ở loài tôm he
không bình thường hoặc các địa điểm không bình thường thì dùng một kỹ thuật
khác đề kiểm khẳng định là cần thiết. Ở giai đoạn chuyển tiếp của hội chứng Taura,
số lượng và mức độ ác liệt của các tổn thương lớp cutin là đặc trưng cho bệnh ở giai
đoạn cấp tính có giảm đi và bắt đầu có hồng cầu ngưng kết ở các mô bị bệnh. Các
tổn thương này sẽ có màu đen.
Nếu những tổn thương vỏ cutin cấp tính làm thủng lớp mô sừng ngoài,
những mặt ngoài bị tổn thương này có biểu hiện của sự hình thành tập đoàn và xâm
nhập của vi khuẩn Vibrio spp. hoặc các bệnh nhiễm thứ cấp khác. Trong giai đoạn
mãn tính của hội chứng Taura, biểu hiện lây nhiễm chỉ được thể hiện bằng sự có
mặt của các hình cầu trong cơ quan bạch huyết (LOS), nó ứng với việc tích đọng
các hồng cầu trong khoảng giữa các khoảng giữa ống của cơ quan bạch huyết.

- Trong chẩn đoán bệnh do GAV gây ra ta sẽ chú ý tới những biểu hiện mô
học sau: Thân tôm biến thành màu đỏ sẫm, đặc biệt ở các phần phụ bộ,cánh đuôi và
phần miệng; mang biến sang vàng-hồng. Tách giáp đầu ngực của tôm nhiễm bệnh
ra khỏi phần bụng và tách ra theo chiều dọc. Sau đó đem cố định mẫu bằng dung
dịch Davidson và xử lý dùng cho mô học. Nhuộm các lát cắt bằng H&E. Các cơ
quan bạch huyết của tôm bệnh bị mất cấu trúc dạng tiểu quản thông thường. Tại
những nơi bị phá vỡ, không có nhân hoặc tế bào rõ ràng với nhân phình to, ngưng
kết hoặc tạo ra không bào. Foci của các tế bào không bình thường thấy ở trong các
cơ quan bạch huyết và chúng bắt màu Eosin sẫm. Các mang của tôm bệnh có biểu
hiện hư hại về cấu trúc như gắn kết các đầu tơ mang, hoại tử toàn bộ và mất lớp


20
biểu bì của các lá mang sơ cấp và thứ cấp. Cấu trúc tế bào của mang biểu hiện bình
thường tách biệt với foci nhỏ bắt màu kiềm của các tế bào hoại tử.
1.3.2. Phương pháp lai tại chỗ (in situ hybridization)
Lai tại chỗ là một kiểu lai phân tử, trong đó trình tự nucleic acid cần tìm
(trình tự đích) nằm ngay trong tế bào hay trong mô. Lai tại chỗ cho phép nghiên cứu
nucleic acid mà không cần qua giai đoạn tách chiết chúng ra khỏi mô, tế bào.
Phương pháp này được sủ dụng để phát hiện RNA của virus YHV, GAV và
TSV sử dụng tế bào và mô của ký chủ. Vì vậy phải trải qua một loạt các thao tác xử
lý mô (như cố định, khử nước, tẩm paraffin cắt thành những lát mỏng (7-10µ) trải
trên lam kính). Đọc kết quả trực tiếp trên lam kính chứa mẫu mô. Phương pháp lai
acid nucleic giúp hiểu chi tiết hơn về bộ gen, nó là cơ sở của phương pháp chẩn
đoán mới dùng acid nucleic đang sử dụng rộng rãi.
1.3.3. Phương pháp sinh học phân tử
Phương pháp sinh học phân tử tuy là một phương pháp mới nhưng đã thể
hiện độ vượt trội về độ nhạy và tính chính xác trong việc phát hiện các bệnh do
virus YHV, TSV, GAV gây ra so với các phương pháp khác. Đặc biệt là phương
pháp PCR thể hiện sự vượt trội trong chẩn đoán các loại bệnh.

Ưu điểm của phương pháp này là:
- Thời gian chẩn đoán nhanh
- Độ đặc hiệu cao nhờ cặp mồi thiết kế trên vùng bảo tồn của chủng virus cần phát
hiện.
1.3.3.1.Phương pháp RT – PCR (Reverse – transcription polymerase chain reaction)
Phương pháp tạo RT- PCR gồm 5 bước chính:
- Tách chiết RNA từ bệnh phẩm biểu mô
- Tạo cDNA bằng phản ứng sao chép ngược
- Thực hiện phản ứng bằng PCR với các cặp mồi đặc hiệu


21
- Kiểm tra sản phẩm
- Tách dòng và giải trình tự sản phẩm
RT-PCR là nhân một trình tự mục tiêu dựa trên khuôn là RNA. Vì vậy trước
tiên ta phải trải qua bước reverse transcriptase chuyển RNA thành cDNA
nhờ enzyme phiên mã ngược (enzyme reverse transcriptase). Nhưng ngoài enzyme
còn phải có mồi cho phản ứng reverse. Chúng tôi dùng mồi ngẫu nhiên (random
hexamer primers) mà không dùng mồi đặc hiệu để tổng hợp toàn bộ RNA thành
cDNA. Sau đó mới sử dụng cặp mồi đặc hiệu vào thực hiện phản ứng PCR với đoạn
gene cần khuếch đại.
1.3.3.2. Nguyên tắc của phản ứng PCR
Phản ứng PCR bao gồm một chuỗi những chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ
thường gồm 3 bước:
Bước 1: Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết
cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng
chảy (T
m
) của phân tử, thường là 94 - 95
0

C trong vòng 30 giây – 1 phút, làm cho
phân tử DNA mạch kép tách thành hai mạch đơn, chính hai mạch đơn này đóng vai
trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp hai mạch bổ sung mới. Đây là giai đoạn biến
tính (denaturation).
Bước 2: Trong bước này, nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn nhiệt độ nóng
chảy của các primer), cho phép các primer bắt cặp với mạch khuôn. Trong thực
nghiệm, nhiệt độ này tùy thuộc vào T
m
của các primer sử dụng, dao động từ 40 –
70
0
C, kéo dài từ 30 giây đến 1 phút. Đây là giai đoạn lai (hybridization).
Bước 3: Tổng hợp mạch DNA mới nhờ sự hoạt động của DNA
polymerase, nhiệt độ được tăng lên đến 72
0
C, là nhiệt độ tối ưu cho Taq DNA
polymerase hoạt động. Thời gian tổng hợp tùy thuộc độ dài của trình tự DNA cần
khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút. Đây là giai đoạn tổng hợp,
hay kéo dài (elongation).


22
Mỗi chu kỳ bao gồm 3 bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, và mỗi lần
lại làm tăng gấp đôi số lượng mẫu của lần trước. Đây là sự khuếch đại theo cấp số
nhân. Sự khuếch đại này có thể được tính như sau:
Tổng lượng DNA khuếch đại = m
*
2
n
. Trong đó:

- m: là số bản sao của chuỗi mã hóa.
- n: là số chu kỳ khuếch đại.

Hình 4: Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR
Như vậy, qua một chu kỳ nhiệt, một DNA đích sẽ được nhân bản thành hai
bản sao, và nếu chu kỳ này được lặp đi lặp lại liên tục 30 – 40 lần thì từ một DNA
đích sẽ được nhân bản thành 230 - 240 bản sao, tức là đến hàng tỷ bản sao.
Tuy nhiên, trong thực tế, một phản ứng PCR thường không vượt quá 40 chu
kỳ, vì sau 40 chu kỳ hiệu quả khuếch đại giảm hẳn, do các nguyên nhân:
- Sự phân hủy và cạn kiệt dần các thành phần của phản ứng.


23
- Sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng.
- Các bản sao vừa được tổng hợp không kết hợp với mồi mà bắt cặp với nhau
1.3.3.3. Các thành phần trong phản ứng PCR
1. DNA mạch khuôn
Nguồn vật chất ban đầu cho phản ứng PCR là những phân tử DNA mạch đơn
hoặc DNA mạch kép, chúng được tách chiết từ tế bào động vật, thực vật, vi khuẩn
hoặc virus. Ngoài ra, các RNA cũng có thể được sử dụng cho phản ứng PCR một
khi đã được phiên mã ngược thành cDNA.
Về hàm lượng phản ứng, phản ứng PCR cần lượng DNA ban đầu đưa vào
thường không quá cao. Thông thường nồng độ DNA tốt nhất sử dụng trong phản
ứng PCR ở khoảng 10
5
bản sao/ phản ứng.
2. Primer
Primer là một trong những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng trực tiếp đến
hiệu quả cũng như độ chuyên biệt của phản ứng PCR. Do đó, công việc thiết kế
primer sẽ đóng vai trò then chốt quyết định sự thành công của quy trình PCR.

Việc lựa chọn primer cần tuân thủ theo một số nguyên tắc sau:
- Bắt cặp đặc hiệu với trình tự nucleotide mục tiêu.
- Bắt cặp đặc hiệu với ít nhất 70% chiều dài primer.
- 5 nucleotide đầu tiên của primer bắt cặp hoàn toàn với trình tự nucleotide mục tiêu.
- Thành phần GC lý tưởng của đoạn primer nằm trong khoảng 40 – 60% để
nhiệt độ bắt cặp của primer là không quá thấp.
- Tránh lặp lại các cặp GC nhiều lần, dễ tạo ra các khuếch đại ký sinh do bắt
cặp với các trình tự khác, dẫn đến việc tổng hợp không chính xác.
- Thành phần nucleotide của primer phải cân bằng.


24
- Nhiệt độ nóng chảy của 2 primer không nên cách nhau quá xa, vì nếu sự
chênh lệch nhiệt độ lớn thì primer có Tm cao hơn sẽ bắt cặp không đặc hiệu, hoặc
primer có Tm thấp hơn sẽ không thể lai được với DNA.
- Tránh sự tạo thành các cấu trúc kẹp tóc do sự bắt cặp bổ sung giữa các
phần khác nhau của một primer.
- Thành phần 5 nucleotide cuối cùng trong đầu 3’ không nên có hơn hai G
hoặc C nhằm tránh hiện tượng nhân bản ký sinh trong phản ứng PCR.
- Trình tự nằm giữa 2 primer “xuôi” và “ngược” không quá lớn; phản ứng
PCR sẽ tối ưu trên những trình tự nhỏ hơn 1kb.
Nồng độ primer sử dụng trong phản ứng PCR phải được tính toán và tối ưu
qua thực nghiệm . Nếu nồng độ primer quá cao sẽ dễ gây khuếch đại “ký sinh”, còn
nếu nồng độ primer quá thấp sẽ làm hiệu quả khuếch đại của phản ứng không cao.
Thông thường nồng độ primer sử dụng nằm trong giới hạn từ 0.1 – 1.0 µM.
3. Nồng độ dNTPs (các deoxynucleotide triphotphat)
Bốn loại nucleotide thường được sử dụng ở nồng độ là 20 – 200 µM/ mỗi
loại nucleotide. Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại “ký sinh”, làm giảm
hiệu quả của phản ứng PCR, còn sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotide
lại làm tăng lỗi sao chép của DNA polymerase.

4. Enzyme
Ngày nay có rất nhiều polymerase chịu nhiệt khác nhau đã được đưa ra thị
trường với nhiều chức năng chuyên biệt hay hoàn thiện hơn. Tùy mục đích của phản
ứng PCR mà sử dụng enzyme cho phù hợp.
Taq polymerase – một DNA polymerase chịu nhiệt được tách chiết từ vi
khuẩn sống ở các suối nước nóng – Thermus aquaticus. Enzyme này không bị phá
hủy ở nhiệt độ biến tính và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng.


25
Với một phản ứng PCR 25µl - 50µl, thông thường Taq polymerase được sử
dụng với một liều lượng nằm trong giới hạn từ 0.5 – 2.5 đơn vị.
5. MgCl
2

Trong phản ứng PCR, MgCl
2
cũng là một nhân tố ảnh hưởng mạnh đến phản
ứng. Mg
2+
rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzyme Taq
polymerase, làm tăng Tm của DNA mạch kép. Mg
2+
là Co – factor của Taq
polymerase nên nếu lượng Mg
2+
quá thấp thì Taq polymerase sẽ không thể hoạt
động bình thường trong giai đoạn kéo dài (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang,
1999), hạn chế quá trình kéo dài. Ngược lại, nếu nồng độ quá cao dễ gây khuếch đại
ký sinh. Do đó, nồng độ MgCl

2
sử dụng cần được tối ưu hóa cho từng hệ thống
PCR cụ thể. Thông thường, MgCl
2
được sử dụng ở nồng độ từ 1.5 mM – 4 mM.
6. Dung dịch đệm (PCR buffer)
Dung dịch đệm có tác dụng cung cấp lực ion (inonic strength) cần thiết cho
phản ứng xảy ra, tăng cường hiệu quả cho phản ứng PCR. Nồng độ, pH của dung
dịch đệm cũng như nồng độ KCl tối ưu thường tùy thuộc vào nguồn DNA
polymerase sử dụng, không có một quy luật chung cho vấn đề này.
7. Các chất tăng cường
Trong phản ứng PCR, ngoài những thành phần cơ bản, đôi khi người ta còn
bổ sung thêm chất tăng cường với mong muốn phản ứng xảy ra hiệu quả hơn. Các
chất thường được sử dụng là betaine, DMSO (dimethylsulfoxide), glycerol… Tuy
nhiên cần thận trọng khi sử dụng các những chất này bởi vì nếu sử dụng ở nồng độ
không thích hợp thì những chất này sẽ gây ức chế phản ứng PCR.
8. Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng PCR
Thực chất một thiết bị dùng để tiến hành phản ứng PCR chỉ cần đáp ứng
được yêu cầu thay đổi nhiệt độ thật nhanh và chính xác. Các thiết bị hiện nay đã
được cải tiến để tránh tối đa sự bốc hơi nước trong quá trình phản ứng, hay cho
phép tiến hành PCR ngay trên mô và tế bào… Tuy nhiên, mỗi kiểu thiết bị có đặc