phát triển quy trình mpcr phát hiện mbv ( monodon baculovirus), wssv (white spot syndrome virus) và gen beta-actin trên tôm sú (penaeus monodon)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN





TRẦN VIẾT TOÀN







PHÁT TRIỂN QUY TRÌNH mPCR PHÁT HIỆN MBV
( Monodon baculovirus), WSSV (White spot syndrome virus)
VÀ GEN BETA-ACTIN TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon)








LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGHÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

2009




PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN






TRẦN VIẾT TOÀN







PHÁT TRIỂN QUY TRÌNH mPCR PHÁT HIỆN MBV
( Monodon baculovirus), WSSV (White spot syndrome virus)
VÀ GEN BETA-ACTIN TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGHÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN



CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
BÙI THỊ BÍCH HẰNG





2009
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
i
LỜI CẢM TẠ
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với cô Bùi Thị Bích Hằng đã tận tâm
hướng dẫn, chỉ bảo, cung cấp tài liệu cũng như những kinh nghiệm giúp tôi
hoàn thành được đề tài.
Tôi xin chân thành cám ơn toàn thể quý thầy cô, anh chị Bộ môn Sinh Học và
Bệnh Thủy Sản – Khoa Thủy Sản, Trường Đại Học Cần Thơ đã giúp đỡ và tạo
mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành tốt đề tài luận văn tốt nghiệp.
Chân thành cám ơn các bạn lớp Bệnh học thủy sản K31 đã động viên và ủng
hộ tôi thực hiện được đề tài này.

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
ii
TÓM TẮT
Đề tài được thực hiện nhằm phát triển và ứng dụng quy trình mPCR phát hiện
đồng thời MBV và WSSV trên tôm sú (Penaeus monodon). Sau khi thực hiện
quy trình mPCR của (Karlo et al., 2006) với mẫu dương tính với MBV cho
kết quả ở vị trí 361bp. Sau đó tiếp tục phát triển quy trình mPCR phát hiện
đồng thời MBV và gen β-actin cho kết quả hiện hai vạch ở vị trí 361bp (MBV)
và 216 (β-actin). Trên cơ sở kết quả đạt được, thực hiện quy trình mPCR phát

hiện MBV và WSSV kết quả cho thấy hiện vạch 1441bp (WSSV) ở bước 1,
hiện đồng thời hai vạch 941bp (WSSV) và 361bp (MBV) ở bước 2. Thực hiện
tiếp quy trình phát hiện MBV, WSSV và gen β-actin nhưng kết quả ở hai bước
chỉ hiện vạch của WSSV (1441bp, 941bp).




















PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
iii
MỤC LỤC
LỜI CẢM TẠ i
TÓM TẮT ii
MỤC LỤC iii

DANH SÁCH BẢNG v
DANH SÁCH HÌNH vii
CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU 1
CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2
2.1 Tình hình chung về tôm 3
2.1.1. Tình hình nuôi tôm trên thới giới 3
2.1.2. Tình hình ở Việt Nam 4
2.2. Tổng quang về tình hình dịch bệnh trên tôm 5
2.2.1. Trên thới giới 5
2.2.2. Ở Việt Nam 7
2.3. Bệnh Monodon Baculovirus (MBV) 8
2.3.1 Tác nhân gây bệnh 8
2.3.2 Vật chủ cảm nhiễm 8
2.3.3 Dấu hiệu bệnh lý 8
2.3.4 Kiểu lan truyền 9
2.3.5 Phương pháp chuẩn đoán 9
2.3.6 Các biện pháp kiểm soát bệnh 10
2.4. Bệnh đốm trắng WSSV 11
2.4.1 Tác nhân gây bệnh 11
2.4.2 Vật chủ cảm nhiễm 11
2.4.3 Dấu hiệu bệnh lý 12
2.4.4 Kiểu lan truyền 12
2.4.5 Phương pháp chuẩn đoán 13
2.4.6 Các biện pháp kiểm soát bệnh 14
2.5.Sơ lược về gen β-actin 14
2.6. Kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR) 14
2.6.1 Một số nhân tố chính ảnh hưởng đến phản ứng PCR 16
2.6.2 Ứng dụng của phương pháp PCR Thủy sản 17
CHƯƠNG III: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19
3.1. Thời gian và địa điễm nghiên cứu 19

3.2. Dụng cụ và hóa chất 19
3.3. Phương pháp nghiên cứu 20
3.3.1. Vật liệu nghiên cứu 20
3.3.2. Ly trích DNA 20
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
iv
3.3.3. Đo hàm lượng DNA 21
3.3.4. Quy trình PCR phát hiện MBV (Karlo et al.,2006) 21
3.3.5. Phương pháp mPCR phát hiện MBV và gen β – actin 22
3.3.6. Phương pháp mPCR phát hiện MBV và WSSV 23
3.3.7. Phương pháp mPCR phát hiện MBV, WSSV và gen β –
actin 25
CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26
4.1. Thực hiện quy trình PCR phát hiện MBV (Karlo et al.,2006) 27
4.2. Thực hiện quy trình mPCR phát hiện MBV và gen β – actin 29
4.3. Thực hiện quy trình mPCR phát hiện MBV và WSSV 31
4.4. Thực hiện quy trình mPCR phát hiệnMBV,WSSVvà β–actin 34
4.5.Ứng dụng quy trình mPCR phát hiện MBV và β –actin 36
4.6.Ứng dụng quy trình mPCR phát hiện MBV và WSSV 39
CHƯƠNG V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 40
5.1. Kết luận 40
5.2.Đề xuất 41

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
v
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 2.1: Sản lượng tôm nuôi trên thế giới qua một số năm (nghìn tấn) (Bộ
Thủy Sản số 4 năm 2003) 3
Bảng 2.2: Tình hình nuôi tôm sú ở VN qua một số năm (Bộ Thủy Sản số 4
năm 2003) 5
Bảng 3.3 Trình tự mồi sử dụng trong qui trình PCR phát hiện MBV (Belcher
and Young, 1998) , β-actin (Oanh, 2007), WSSV (OIE, 2006) 20
Bảng 3.4. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy
trình PCR phát hiện MBV 21
Bảng 3.5. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy
trình mPCR phát hiện MBV và β – actin 22
Bảng 3.6. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy
trình mPCR phát hiện MBV, WSSV (bước 1) 23
Bảng 3.7. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy
trình mPCR phát hiện MBV, WSSV (bước 2) 24
Bảng 3.8. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy
trình mPCR phát hiện MBV, WSSV và β – actin (bước 1) 25
Bảng 3.9. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy
trình mPCR phát hiện MBV, WSSV và β – actin (bước 2) 25
Bảng 4.10. Hàm lượng ADN của mẫu tôm sú 27
Bảng 4.11. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy
trình PCR phát hiện MBV 28
Bảng 4.12. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy
trình mPCR phát hiện MBV và β – actin 30

Bảng 4.13. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy
trình mPCR phát hiện MBV, WSSV (bước 1) 31
Bảng 4.14. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy
trình mPCR phát hiện MBV, WSSV (bước 2) 31
Bảng 4.15. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy
trình mPCR phát hiện MBV, WSSV (bước 2) đã được điều chỉnh. 33
Bảng 4.16. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy
trình mPCR phát hiện MBV, WSSV và β – actin (bước 1) . 35
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
vi
Bảng 4 .17. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy
trình mPCR phát hiện MBV, WSSV và β – actin (bước 2) . 35

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
vii
DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1. Sản lượng tôm sú thế giới năm 2001 (Bộ Thủy Sản số 4 năm 2003)
4
Hình 2.2. Sản lượng tôm nuôi tính theo khu vực ( Nguồn tổng cục thống kê,
2008) 5
Hình 2.3: Tôm sú nhiễm bệnh MBV chậm lớn, màu xanh xẫm (Bùi Quang Tề,
2004) . 9
Hình 2.4: Tiêu bản ép mô gan tụy của hậu ấu trùng tôm P. monodon bị nhiễm
MBV nhuôm malachite green (700X). (Bondad-Reantaso, M.G et al.,
2001)…… 10
Hình 2.5 Gan tụy tôm sú bị nhiễm MBV, nhuộm H&E (Bùi Quang Tề, 2004)
10
Hình 2.6. Tôm sú bị bệnh đốm trắng WSSV, có các đốm trắng dưới vỏ (Bùi
Quang Tề, 2004) 12
Hình 2.7. Tôm sú bị nhiễm đốm trắng, nhân tế bào biểu bị dạ dày trương to có
thể vùi màu hồng, mẫu nhuộm H&E (Bùi Quang Tề, 2004) 13
Hình 4.8. Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV 27
Hình 4.9. Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV. 29
Hình 4.10. Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV và β – actin 30

Hình 4.11. Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV và WSSV 32
Hình 4.12. Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV và WSSV sao khi
chuẩn hóa 34
Hình 4.13. Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV, WSSV và β –
actin 36
Hình 4.14. Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV và β – actin 37
Hình 4.15. Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV và β – actin 38
Hình 4.16. Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV và WSSV 39

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
- 1 -

CHƯƠNG I
GIỚI THIỆU
Việt Nam có diện tích mặt nước lớn, kể cả nước ngọt, lợ và mặn, đây là
một lợi thế cho việc phát triển nuôi trồng thủy sản và cũng là một trong những
lý do dẫn tới sự thành công của ngành trong thời gian qua. Việt Nam đã trở
thành nước nuôi trồng thủy sản lớn thứ 3 và là một trong 10 nước xuất khẩu
thủy sản lớn nhất thế giới. Theo bộ thủy sản 2006, sản lượng thủy sản nuôi
trồng của Việt Nam đạt 1,67 triệu tấn với giá trị xuất khẩu đạt 1,7 tỷ USD,
tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản toàn ngành đạt 3,35 tỷ USD. Đồng bằng
Sông Cửu Long có diện tích tự nhiên khoảng 39.747 km
2
, chiếm 12% diện
tích cả nước. Trên thực tế, nuôi trồng thủy sản (NTTS) ở ĐBSCL đã trở thành
một nghề truyền thống và không ngừng thay đổi. Theo tính toán, tổng diện
tích có khả năng NTTS ở ĐBSCL hơn 1.200.000 ha, bằng gần 60% của cả
nước. Trong đó, diện tích có khả năng NTTS vùng triều khoảng 750.300 ha,
chiếm trên 26% tổng diện tích đất tự nhiên của 8 tỉnh ven biển của vùng và
chiếm 74% tổng diện tích có khả năng NTTS trên vùng triều toàn quốc. Năm

2006, sản lượng NTTS vùng ĐBSCL đạt khoảng 1.200.000 tấn, bằng trên 70%
sản lượng NTTS toàn quốc.
Trong đó Tôm sú (Penaeus monodon) là đối tượng thuỷ sản có giá trị thương
phẩm cao là đối tượng nuôi quan trọng ở Việt Nam cũng như một số nước
đang phát triển ở Châu Á như Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan, Philippines, Việt
Nam và Nam Mỹ (Ecuador). Nghề nuôi tôm không chỉ góp phần lớn làm
tăng kim ngạch xuất khẩu thủy sản cho các nước nêu trên mà còn có tác động
tích cực đến quá trình phát triển kinh tế xã hội, cải thiện đời sống cho người
nuôi thủy sản. Tuy nhiên, khi nghề nuôi tôm được thâm canh hóa nhất là nuôi
với mật độ cao thì phải đương đầu với tình trạng dịch bệnh bùng nổ ngày càng
thường xuyên và nghiêm trọng do sự suy thoái về môi trường và sự lây lan
mầm bệnh. Đặt biệt là bệnh do virus trên tôm sú như: bệnh đốm trắng (white
spot syndrome virus – WSSV), bệnh MBV (monodon baculovirus), bệnh đầu
vàng (yellow head virus – YHV),…đã và đang gây thiệt hại nặng nề cho người
nuôi. Do đó, việc phát hiện phát hiện sớm bệnh để giảm thiệt hại cho người
nuôi, đồng thời nâng cao chất lượng và sản lượng tôm nuôi là vấn đề quan tâm
hàng đầu của ngành thủy sản và của người nuôi tôm.
Có nhiều phương pháp chẩn đoán bệnh như: phương pháp chẩn đoán truyền
thống bằng cách quan sát dấu hiệu bệnh hay phương pháp mô bệnh học nhưng
nó lại không cho phép phát hiện sớm và chính xác tác nhân gây bệnh. Nhiều
phương pháp phân tử như lai in situ, western blot, PCR, RT-PCR được phát
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
- 2 -

triển nhằm khắc phục những nhược điểm trên. Phương pháp PCR hiện đang
được sử dụng rất rộng rải và hiệu quả trong việc xét nghiệm tôm giống. Trong
đó phương pháp được xem là hiệu quả nhất là phương pháp PCR (Polymerase
Chain Reaction) nên nó được cải tiến không ngừng để có thể phát hiện sớm,
phát hiện đồng thời và chính xác tác nhân gây bệnh. Từ đó, đề tài: “ Phát
triển qui trình mPCR (multiplex Polymerase Chain Reaction) phát hiện

đồng thời MBV (M onodon baculovirus), WSSV (White spot syndrome
virus) và gen beta – actin của tôm sú (Penaeus monodon)” được thực hiện.
Mục tiêu của đề tài
Phát triển và ứng dụng quy trình mPCR phát hiện đồng thời MBV, WSSV trên
tôm sú (Penaeus monodon) và kiểm soát kết quả âm tính giả.
Nội dung đề tài
Thực hiện quy trình PCR phát hiện MBV (Karlo et al., 2006)
Thực hiện quy trình mPCR phát hiện MBV và nội chuẩn β – actin
Thực hiện quy trình mPCR phát hiện WSSV, MBV và nội chuẩn β – actin
















PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
- 3 -

CHƯƠNG II
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1. Tình chung về tôm
2.1.1. Tình hình nuôi tôm trên thới giới
Tổng sản lượng tôm của thế giới là 1,6 triệu tấn năm 2003 và có giá trị tương
đương 9000 triệu đôla. Khoảng 75% là từ các nước châu Á, như Trung Quốc,
Thái Lan, Ấn Độ , 25% còn lại là từ nước Nam Mỹ. Trung Quốc hiện là nhà
xuất khẩu lớn nhất. (FAO, 2004)
Các loài tôm được nuôi nhiều nhất là tôm sú (P. monodon), tôm thẻ Trung
quốc (P. chinensis) và tôm chân trắng (P. vannamei). Riêng 3 loài tôm này
chiếm trên 86% sản lượng tôm nuôi của thế giới. Nếu tính về sản lượng thì
tôm sú chỉ xếp thứ 20 trong số các loài thuỷ sản nuôi nhưng về giá trị thì
chúng đứng đầu với 4.046 tỷ USD trong năm 2000. (Bộ Thủy Sản số 4 năm
2003)
Bảng 2.1: Sản lượng tôm nuôi trên thế giới qua một số năm (nghìn tấn) (Bộ
Thủy Sản số 4 năm 2003)
Năm 1995 1996 1997 1998 1999 2000
Trung
Quốc
78 126 146 205 210
Thái Lan 278 259 233 115 230 250
Việt Nam 53 58 105 148 128 105
Indonesia 121 125 126 81 118 110
Ấn Độ

97

95

65

130

114



Ecuador 96 98 119 66 108
Philippine 90 76 40 34 40

Tôm sú đã được nuôi ở rất nhiều quốc gia trên thế giới, tính đến nay có hơn 65
nước và vùng lãnh thổ đang tiến hành nuôi, tập trung ở hai khu vực chính là
Châu Á Thái Bình Dương chiếm 72% và Mỹ La Tinh chiếm 28% tổng sản
lượng tôm nuôi. (Bộ Thủy Sản số 4 năm 2003)
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
- 4 -

Hình 2.1: Sản lượng tôm sú thế giới năm 2001 (Bộ Thủy Sản số 4 năm 2003)
2.1.2. Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam
Bờ biển Việt Nam trãi dài 3.260 km suốt từ Bắc vào Nam là tiềm năng to lớn
cho nuôi trồng thủy sản nước mặn và nước lợ. Diện tích nuôi tôm gia tăng
nhanh chóng từ 250.000ha năm 2000 lên đến 959.000 ha năm 2005 (Tạp chí
thủy sản, 2006). Tính đến hết năm 2005 cả nước có 4.281 trại giống sản xuất
được 28,8 tỷ con tôm giống tăng 151,64% so với năm 2000. Theo số liệu hiện
có, Việt Nam là nước có diện tích nuôi tôm vào loại lớn trên thế giới, vượt xa
Indonesia, nước có diện tích nuôi tôm lớn nhất vào năm 1996, khoảng 360.000
ha. Phần lớn diện tích nuôi tôm ở Việt Nam tập trung ở ĐBSCL, rải rác dọc
các cửa sông, kênh, rạch ven biển miền Trung và ở đồng bằng sông Hồng,
sông Thái Bình ở miền Bắc (


276

103.603
97.1
50
40.698
26.352
2.459
0
50
100
150
200
250
300
T
h
ái
L
an
Ph
i
l
i
ppi
n
Malaixi
a

Ð
ài
loan

Quốc gia
Sản lượng (tấn)
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
- 5 -

Hình 2.2: Sản lượng tôm nuôi tính theo khu vực. (Nguồn: tổng cục thống kê,
2008 )
Các loài tôm nuôi chính ở Việt Nam gồm tôm sú (P. monodon), tôm he (P.
merguiensis), tôm nương (P. orientalis), tôm đất/rảo (metapenaeus ensis),
trong đó tôm sú là loài nuôi chủ đạo, đóng góp sản lượng cao nhất. Việt Nam
tồn tại 3 hình thức nuôi tôm là quãng canh (cải tiến), bán thâm canh và nuôi
thâm canh.
Bảng 2.2: Tình hình nuôi tôm sú ở VN qua một số năm (Bộ Thủy Sản số 4
năm 2003)
Năm Diện Tích (ha) Sản lượng ( 1000
tấn)
Năng
Suất(kg/ha/năm)
1995 260.000 53 200
1996 200.000 58 290
1997 195.000 105 538
1998 265.000 115 433
1999 295.000 128 433
2000

326.407

105

487

2001 446.208 159 356
2002 478.785 193 403
2.2. Tổng quan về tình hình dịch bệnh trên tôm
2.2.1. Tình hình bệnh tôm trên thế giới
Tác nhân gây bệnh virus hiện nay được xem là một trong những tác nhân gây
bệnh nghiêm trọng nhất làm thiệt hại đáng kể cho nghề nuôi tôm thế giới. Việc
chữa trị bệnh không có hiệu quả vì hiện nay chưa có một loại thuốc hay loại
1
10
100
1000
10000
100000
1000000
1995
1996
1997
1998
1999
2
000
2
0
0
1
2
0
0
2

2
0
0
3
2
0
0
4
2
0
0
5
2
0
0
6
2
0
0
7
Năm
Sản Lượng (tấn)
Đồng bằng sông Hồng
Đông Bắc
Tây Bắc
Bắc Trung Bộ
Duyên hải Nam Trung
Bộ
Tây Nguyên
Đông Nam Bộ

Đồng bằng sông Cửu
Long
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
- 6 -

hóa chất nào có thể chữa bệnh virus. Một số bệnh do virus gây ra làm bùng nổ
dịch bệnh ở các trại nuôi tôm trên thế giới như: bệnh đốm trắng (WSSV), bệnh
Monodon Type baculovirus (MBV), bệnh đầu vàng (YHV), Năm 1989 lần
đầu tiên ở Thái Lan tìm thấy một số lượng lớn thể ẩn polyhedral của MBV
trong cơ quan gan tụy của postlarvae ở tôm sú (đây là loài tôm nuôi chủ yếu ở
Thái Lan và các nước châu Á). Loài virus này được công bố là loài gây bệnh
trên tôm nuôi công nghiệp ở Đài Loan năm 1987 - 1988. MBV cũng được xem
là tác nhân gây bệnh làm ảnh hưởng đến năng suất thu hoạch ở Úc. MBV hiện
diện phổ biến ở các Châu lục, gây bệnh cho tôm nuôi và tôm tự nhiên. Virus
gây tỷ lệ chết cao cho ấu trùng và đối với tôm trưởng thành sự nhiễm ít
nghiêm trọng hơn. Tuy nhiên khả năng gây bệnh của MBV còn tùy thuộc vào
độc lực của từng chủng virus ở từng vùng địa lý khác nhau (Lightner và
Redman, 1981)
Bệnh đốm trắng (WSSV) là một trong những bệnh nguy hiểm nhất đối với tôm
nuôi hiện nay. Bệnh xảy ra khắp nơi trên thế giới và ảnh hưởng phần lớn đến
nghề nuôi tôm công nghiệp. Bệnh đốm trắng gây tỉ lệ chết cao và gây thiệt hại
rất lớn cho nghề nuôi tôm công nghiệp ở Trung Quốc, Nhật Bản, Indonesia và
Ấn Độ. Trong khoảng thời gian 1994 – 1995, bệnh đốm trắng đã gây chết hầu
hết tôm nuôi dọc theo bờ biển phía Đông Ấn Độ và phía Tây Ấn Độ (Thông
tin KH & CNTS, số 4/2004). Bênh cạnh đó nghề nuôi tôm ở Ecuador hầu như
bị phá sản do dịch bệnh đốm trắng, sản lượng tôm nuôi giảm sút nghiêm trọng,
từ tháng 4/1999 đến 4/2000 thiệt hại do bệnh đốm trắng đã lên đến 600 triệu
USD. Cũng như Ecuador, bệnh đốm trắng đã gây thiệt hại 80% sản lượng nuôi
tôm của Peru, tổng lượng tôm xuất khẩu từ 57 triệu USD năm 1997 và 71 triệu
USD năm 1998 đến năm 1999 chỉ còn 32,66 triệu USD. Ngoài ra, nghề nuôi

tôm ở Ấn Độ cũng bị thiệt hại đến 95% do dịch bệnh đốm trắng gây ra. Sự
thiệt hại do bệnh đốm trắng gây ra rất nghiêm trọng, nhiều trại tôm bị thiệt hại
đến 60% hoặc mất trắng (Thông tin KH & CNTS, số 10/2001). Ở Thái Lan
bệnh WSSV làm giảm sản lượng tôm nuôi từ 225.000 tấn năm1995 xuống
160.000 tấn năm 1996 làm thiệt hại trên dưới 500 triệu USD. Ở các nước châu
Á bệnh gây thiệt hại khoảng 3 tỷ USD mỗi năm (Nguyễn Văn Hảo, 2003)
Theo Chanratchakool et all. (1999). YHV là virus gây thảm khốc và làm suy
giảm nền kinh tế châu Á. Bệnh được phát hiện đầu tiên ở Thái Lan vào năm
1990. Làm thất thoát hơn 30,6 triệu USD năm 1992 và 650 triệu USD vào năm
1994.


PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
- 7 -

2.2.2.Tình hình bệnh tôm ở Việt Nam
Ở Việt Nam ngay từ những năm đầu thập niên 90, cùng với sự phát triển của
nghề nuôi tôm công nghiệp thì dịch bệnh bắt đầu xuất hiện. Từ năm 1993 –
1995 dịch bệnh tôm đã báo động trên toàn quốc, làm thiệt hại hàng ngàn tỷ
đồng. Trong năm 1994 tổng diện tích nuôi tôm có dịch bệnh là 84.558 ha với
sản lượng thiệt hại ước tính là 5.225 tấn (Bộ thủy sản, 1995). Theo Nguyễn
Văn Hảo (2003) đợt dịch bệnh thứ nhất năm 2001 xảy ra vào tháng 2 và tháng
3 rộng khắp trên tôm nuôi ở các tỉnh Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Tiềng
Giang, riêng ở Bạc Liêu thiệt hại khoảng 10.212 ha. Dịch bệnh đợt hai xảy ra
vào tháng 7 cùng năm cũng làm tỉnh thiệt hại 47.333 ha
Theo điều tra của Nguyễn Văn Hậu năm 2006 thì tôm giống tới tay người nuôi
ở Đồng bằng sông Cửu Long có tới 23% tôm giống bị nhiễm WSSV và 43,8%
nhiễm MBV. Tính đến 9/2003, cả nước có 546.757 ha nuôi tôm nước lợ
thương phẩm, trong đó diện tích có tôm nuôi bị bệnh và chết là 30.083 ha. Các
tỉnh, thành ven biển từ Đà Nẵng đến Kiên Giang có tới 29.200 ha nuôi tôm bị

chết nhiều, chiếm 97% diện tích có tôm bị chết trong cả nước, Cà Mau bị hơn
232 ha. (Theo báo lao động, 2003)
Ở Bạc Liêu, thiệt hại do dịch bệnh ở các mô hình nuôi tôm quãng canh cải tiến
kết hợp với đối tượng khác, quãng canh cải tiến chuyên tôm, bán thâm canh và
thâm canh lần lượt chiếm 9,6%, 28,8% và 53,1% (Sở thủy sản Bạc Liêu,
2006). Theo báo cáo của sở thủy sản Bình Định và Viện Nghiên cứu Nuôi
trồng Thuỷ sản I, 6/2006 toàn tỉnh Bình Định có diện tích nuôi tôm là 3666,3
ha. Tổng thiệt hại do bệnh đốm trắng làm tôm chết trên toàn tỉnh là 306 ha
(165 ha mất trắng)
(
Theo báo cáo của ngành thủy sản Bến Tre, 2006 toàn tỉnh đã thả nuôi trên
3.600 ha tôm sú thâm canh, bán thâm canh, đạt 57% diện tích. Diện tích nuôi
thâm canh, bán thâm canh thả nuôi bị thiệt hại do dịch bệnh là 436 ha, chiếm
12,07% diện tích thả nuôi, trong đó thiệt hại nặng nhất là huyện Bình Đại
367,75 ha. Nếu so với năm 2005, tình hình dịch bệnh xảy ra nghiêm trọng
hơn. (
Theo số liệu thống kê của Sở NN-PTNT Kiên Giang 5/2008, đã có 43.058 ha
trong tổng số 80.563 ha tôm nuôi của tỉnh bị thiệt hại do dịch bệnh. Tập trung
chủ yếu ở các huyện vùng U Minh Thượng và Gò Quao, trong đó riêng hai
huyện An Minh và Vĩnh Thuận đã có trên 35.000 ha tôm bị chết .
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
- 8 -

Không riêng gì Kiên Giang mà các tỉnh khác như Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc
Trăng, Trà Vinh, Long An nhiều nông dân cũng đang phải đối mặt với tình
trạng tôm chết hàng loạt một cách bất thường như vậy. Hiện tỉnh Cà Mau cũng
đã có trên 38.800 ha tôm sú nuôi bị chết với các triệu chứng như: đốm đỏ, đầu
vàng, đốm trắng ( />05-21.html)
2.3. Bệnh Monodon Baculovirus (MBV)
Bệnh MBV được phát hiện đầu tiên bởi Lightner và Redman (1981) trên tôm

sú (Penaeus monodon) tại Đài Loan. Năm 1989 ở Thái Lan tìm thấy một số
lượng lớn thể ẩn polyhedral của MBV trong cơ quan gan tụy của postlarvae ở
tôm sú (đây là loài tôm nuôi chủ yếu ở Thái Lan và các nước châu Á). MBV
hiện diện phổ biến ở các Châu lục, gây bệnh cho tôm nuôi và tôm tự nhiên.
Virus gây tỷ lệ chết cao cho ấu trùng và ít nghiêm trọng hơn đối với tôm
trưởng thành. Tuy nhiên khả năng gây bệnh của MBV còn tùy thuộc vào độc
lực của từng chủng virus ở từng vùng địa lý khác nhau. (Bùi Quang Tề và ctv,
2004)
2.3.1 Tác nhân gây bệnh.
Tác nhân gây bệnh MBV (Monodon Baculovirus) là virus type A Baculovirus
monodon, cấu trúc nhân là ADN, có lớp vỏ bao, dạng hình que. Theo Mari
(1993) thì chủng MBV của tôm sú từ Ấn Độ Thái Bình Dương có kích thước
nhân 42 ± 3 x 246 ± 15 nm, kích thước vỏ bao 75 ± 4 x 324 ± 33 nm.
Virus cảm nhiễm trên nhân gan tụy và nhân của biểu mô ruột giữa. Sự lây
nhiễm bệnh MBV còn xảy ra trong cơ quan bạch huyết. (Bondad-Reantaso,
M.G et al., 2001)
2.3.2. Vật chủ cảm nhiễm
MBV có thể nhiễm ở nhiều loài tôm he khác nhau: Penaeus monodon, P.
merguiensis, P. semisulcatus, P. kerathurus, P. plebejus, P. indicus, P.
penicillatus, P. esculentus, P. Vannamei. Trong đó, tôm sú (P. monodon)
thường bị nhiễm nặng và phổ biến nhất. (K.K. Vijayan et al., 1995)
2.3.3. Dấu hiệu bệnh lý
Đối với tôm Postlarvae khi nhiễm nhẹ không có dấu hiệu rõ ràng, khi nhiễm
nặng thể hiện một số dấu hiệu như: yếu, bơi lội lờ đờ, cơ thể đổi màu xanh lơ
hay xanh đen, chuyển giai đoạn chậm không đều. Tỷ lệ chết tích lũy đến 90%
nếu môi trường không ổn định. (Bùi Quang Tề và ctv, 2004)
Cũng theo Bùi Quang Tề và ctv, (2004) tôm thịt khi bị nhiễm MBV thường
có màu đen tối, kém ăn còi cọc, chậm lớn, chu kỳ lột xác kéo dài, nên trên
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
- 9 -

mang và bề mặt cơ thể bị cảm nhiễm rất nhiều các tác nhân cơ hội như vi
khuẩn dạng sợi, động vật đơn bào (Protozoa), tảo đơn hay đa bào và các tác
nhân khác. Có thể sau 3-4 tháng nuôi, tôm vẫn có kích thước rất nhỏ thường
gọi là ”tôm kim”.

2.3.4. Kiểu lan truyền
MBV lây truyền qua đường miệng do virus có trong phân của tôm bị nhiễm
bệnh, hoặc do tôm ăn thịt tôm đã chết hoặc vừa chết. Tôm trưởng thành bị
nhiễm bệnh cũng có khả năng truyền sang con của chúng thông qua làm bẩn
khối trứng đã đẻ ra do phân. (Bondad-Reantaso, M.G et al., 2001)
2.3.5. Phương pháp chẩn đoán
Theo tài liệu FAO về hướng dẫn chẩn đoán bệnh trên động vật thủy sản Châu
Á thì có các phương pháp chẩn đoán sau: dựa vào dấu hiệu bên ngoài, tôm bị
nhiễm MBV cấp tính có biểu hiện yếu, bơi lội lờ đờ kém ăn, cơ thể đổi sang
màu xanh lơ hay xanh đen, tôm còi cọc chậm lớn. Tuy nhiên các dấu hiệu này
cũng không đặc trưng cho bệnh MBV. Có thể áp dụng phương pháp kiểm tra
nhanh các mô gan tụy ép tươi không nhuộm hay có nhuộm bằng malachite
green, dưới kính hiển vi có độ phóng đại lớn hơn hoặc bằng 40X. Thông qua
sự tồn tại của các thể ẩn hình cầu bắt màu xanh đậm mà xác định MBV trên
tôm.




Hình 2.3: Tôm sú nhiễm bệnh MBV chậm lớn, màu xanh
x
ẫm (
Bùi Quang T
ề, 2004)

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
- 10 -


Có thể dùng phương pháp mô học, để phát hiện các thể ẩn hình cầu bắt màu
hồng của thuốc nhuộm Eosin, nằm trong nhân phình to của tế bào gan tụy, trên
các lát cắt mô gan tụy với thuốc nhuộm H&E, ở độ phóng đại đại lớn hơn hoặc
bằng 40X

Có thể dùng các phương pháp hiện đại để chẩn đoán và nghiên cứu virus này
như dùng kỹ thuật PCR để nhận biết ADN đặt trưng của MBV, dùng phương
pháp kính hiển vi điện tử (TEM) phát hiện các thể MBV trong trong nhân tế
bào biểu mô gan tụy




Hình 2.5: Gan tụy tôm sú bị nhiễm MBV, nhuộm H&E
(Bùi Quang Tề, 2004)

Hình 2.4: Tiêu bản ép mô gan tụy của hậu ấu trùng tôm P. monodon bị nhiễm

MBV nhuôm malachite green

(700X). (Bondad
-
Reantaso, M.G et al., 2001
)

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
- 11 -

2.3.6. Các biện pháp kiểm soát bệnh
Theo Bondad-Reantaso, M.G et al. (2001), mật độ nuôi cao, hóa chất và các
stress do môi trường đã làm tăng tính độc của bệnh MBV ở các loài tôm dễ bị
nhiễm bệnh trong điều kiện nuôi
Việc phòng tránh nhiễm bệnh bằng cách chọn tôm bố mẹ không bị nhiễm
MBV bằng phương pháp kiểm tra phân, tẩy uế bề mặt của ấu trùng nauplius
hoặc các trứng đã thụ tinh bằng formalin, iodophore, và lọc sạch nước biển
Có thể tiệt trùng các dịch bệnh MBV ở một số cơ sở nuôi trồng thủy sản bằng
cách cho tiêu hủy đàn tôm đã bị nhiễm bệnh, khử trùng dụng cụ nuôi, tránh
virus tái nhiễm (từ các phương tiện nuôi khác ở bên cạnh, tôm tự nhiên,vv )
2.4. Bệnh đốm trắng WSSV
Năm 1993, WSSV lần đầu tiên được tìm thấy ở Đài Loan. Từ đó virus này
phân bố rộng và gây thiệt hại đáng kể cho nghề nuôi tôm ở vùng này. Bệnh
đốm trắng (WSSV) vẫn là một trong các bệnh virus nguy hiểm nhất đối với
tôm nuôi hiện nay (Chou et al, 1995 trích dẫn bởi Nguyễn Văn Hảo, 2003)
2.4.1. Tác nhân gây bệnh
Trước năm 2002, có 3 chủng Baculovirus gây bệnh đốm trắng hoặc còn gọi là
virus Trung Quốc. Tuỳ từng nước nghiên cứu chúng có tên gọi và kích thước
như sau: (Bùi Quang Tề, 2004)
Tên virus

Kích thư
ớc virus

Kích thư
ớc nhân

Virus Trung Quốc (HHNBV) 120 x 360 nm
Virus tôm Nhật 1(RVPJ-1) 84 x 226 nm
Virus tôm Nh
ật 2 (RV
-
PJ
-
2)

83 x 275 nm

54 x 216 nm

Virus b
ệnh đốm trắng


Thái Lan
(SEMBV)
121 x 276 nm

89 x 201 nm

Virus bệnh đốm trắng (WSBV) 70-150x350-380nm 58-67x330-350nm
Hội nghị virus học quốc tế lần thứ 12 (Paris, 2002) các tác giả: Just M. Vlak,
Jean-Robert Bonami, Tim W. Flegel, Guang-Hsiung Kou, Donald V. Lightner,
Chu-Fang Lo, Philip C. Loh và Peter J. Walker đã phân loại virus gây hội
chứng đốm trắng là một giống mới Whispovirus thuộc họ mới Nimaviridae.
Virus có dạng hình trứng, kích thước 120 x 275nm, có một đuôi phụ ở một
đầu, kích thước 70 x 300nm. Virus có ít nhất 5 lớp protein, trọng lượng phân

tử từ 15- 28 kilodalton. Vỏ bao có hai lớp protein VP28 và VP19;
nucleocapsid có 3 lớp VP26, VP24, VP15. Nhân cấu trúc ADN. (Bùi Quang
Tề, 2004)

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
- 12 -

2.4.2. Vật chủ cảm nhiễm
Bệnh đốm trắng có số lượng vật chủ khá lớn. Bệnh bùng phát được thông báo
lần đầu tiên từ trại nuôi tôm P.japonicus ở Nhật và sự lây nhiễm tự nhiên sau
đó đã quan sát thấy ở tôm P.chinensis, P.indicus, P. merguiensis, P.monodon,
P. setiferus, P.styliostris và P.vannamei. Trong các nghiên cứu thực nghiệm,
bệnh đốm trắng cũng gây chết cho tôm P.aztecus, P.duodarum và P.setiferus.
(Bondad-Reantaso, M.G et al., 2001).
2.4.3. Dấu hiệu bệnh lý
Bệnh đốm trắng bùng phát thường được đặc trưng bởi việc chết nhiều và
nhanh của đàn tôm bị nhiễm bệnh sau khi có biểu hiện lâm sàng. Tôm nhiễm
bệnh hoạt động yếu bơi lờ đờ và dạt vào bờ. Dấu hiệu đặ trưng là xuất hiện các
đốm trắng tròn dưới lớp võ kiti. Những đốm này ở trong lớp vỏ và không thể
loại bỏ bằng việc chà sát. Tôm sắp chết cũng có thể biến màu từ hồng sang đỏ.
Các loài tôm nhạy cảm khi đã có các biểu hiện lâm sàng thì dễ dàng bị chết
nhiều. Triệu chứng bệnh học kết hợp với sự phá huỷ hệ thống mô ngoại bì và
trung bì của mang và các mô dưới lớp vỏ. (Bùi Quang Tề, 2004)

2.4.4. Kiểu lan truyền
Bệnh đốm trắng lây truyền qua đường nằm ngang là chính. Virus lây từ các
giáp xác khác (tôm cua, chân chèo) nhiễm bệnh đốm trắng từ môi trường bên
ngoài ao hoặc ngay trong ao nuôi tôm. Khi các loài tôm bị bệnh đốm trắng
trong ao sức khoẻ chúng yếu hoặc chết, các con tôm khoẻ ăn chúng dẫn đến
bệnh lây lan càng nhanh hơn. Có thể một số loài chim nước đã ăn tôm bị bệnh

đốm trắng từ ao khác và bay đến ao nuôi đã mang theo các mẩu thừa rơi vào
ao nuôi. Ngòai ra bệnh đốm trắng còn có khả năng lây truyền qua đường thẳng
Hình2.6: Tôm sú bị bệnh đốm trắng có các đốm trắng dưới vỏ (Bùi
Quang T
ề, 2004
)

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
- 13 -

đứng, virus đốm trắng có thể lây lan theo chiều dọc khi gây cảm nhiễm từ tôm
bố mẹ mang mầm bệnh đốm trắng đã chuyển sang thế hệ con (Lo et al. 1997,
trích dẫn Trần Việt Tiên, 2007)
2.4.5. Phương pháp chẩn đoán
Theo tài liệu của FAO (2001) hướng dẫn chẩn đoán bệnh trên động vật thủy
sản Châu Á thì có các phương pháp chẩn đoán sau:
Quan sát chung: Bệnh đốm trắng thường được báo hiệu trước bằng việc tôm
ngừng ăn trong một vài ngày, tôm sắp chết bơi gần mặt nước ở bờ ao nuôi.
Những con tôm này sẽ có các thể vùi màu trắng lẫn trong biểu bì và thân tôm
thường hơi biến đỏ. Các thể vùi ở lớp vỏ thay đổi từ những chấm nhỏ thành
những đĩa có đường kính vài mm và chúng có thể liên kết lại với nhau thành
những mảng lớn. Chúng rất dễ nhận thấy nhờ việc bóc lớp vỏ cutin khỏi giáp
đầu ngực, loại bỏ các mô bám và vỏ cutine soi ra ngoài ánh sáng. Sự xuất hiện
những đốm trắng trong lớp vỏ cutin có thể do một vài nguyên nhân khác tạo
ra.
Làm tiêu bản ép nhanh: Hai kiểu làm tiêu bản ép nhanh có thể dùng để dự
chẩn bệnh đốm trắng: (i) mẫu tôm tươi, không nhuộm màu, được cố định
trong Formalin 10%, và soi trên nền tối của kính hiển vi với kính tụ quang ướt,
và (ii) các mô đã cố định được nhuộm màu bằng Haematoxylin và Eosin
(H&E).

Mô bệnh học: Tôm nghi bị bệnh đốm trắng sắp chết được cố định trong dung
dịch Davidson và nhuộm màu bằng H&E. Với phương pháp này ta có thể quan
sát được thể vùi WSSV phì đại trong nhân của tế bào bị nhiễm nó bắt màu của
thuốc nhuộm H&E. Những mô biểu hiện rõ nhất để xét nghiệm là dưới mô ở
lớp biểu bì và mang.
Hình 2.7: Tôm bị nhiễm đốm trắng, nhân tế bào biểu bì dạ dày trương to
có thể vùi màu hồng, mẫu mô nhuộm H&E. (Bùi Quang Tề, 2004)
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
- 14 -

Việc chẩn đoán bệnh trọn vẹn có thể được hoàn thành bằng kỹ thuật PCR, kỹ
thuật lai tại chỗ, lai Western hoặc kính hiển vi điện tử (TEM).
2.4.6. Các biện pháp kiểm soát bệnh
Theo Bondad-Reantaso, M.G et al., 2001 hiện vẫn chưa có biện pháp chữa trị
tôm bị nhiễm virus đốm trắng, tuy nhiên đã có nhiều biện pháp phòng ngừa để
hạn chế việc lây lan:
Với các cơ sở sản xuất tôm PL người ta đề nghị là tôm bố mẹ tự nhiên cần
được kiểm tra sơ bộ bệnh đốm trắng bằng kỹ thuật Nested-PCR
Trong quá trình nuôi việc thay đổi nhanh nhiệt độ nước, độ cứng và độ mặn
hoặc giảm mức oxy (<2ppm) trong giai đoạn dài có thể gây ra bùng phát bệnh
đốm trắng ở tôm đã nhiễm cận lâm sàng. Không nên dùng thức ăn có nguồn
gốc động vật thủy sản tươi hoặc qua ướp đông để nuôi tôm thịt, nuôi thành
thục và ương ấp trừ khi thức ăn đó đã được tiệt trùng bằng tia gama hoặc
thanh trùng (giữ ở 70oC trong 10 phút).
Bất cứ ao nuôi nào bị bệnh cũng cần phải được xử lý ngay bằng Chlorin 30
ppm để diệt tôm bệnh và tất cả các vật mang bệnh khác. Tôm và các động vật
chết khác cần được dọn sạch và chôn vùi hoặc thiêu huỷ. Nước phải được lưu
giữ ít nhất 4 ngày trước khi thải đi. Các chủ ao bên cạnh cần được thông báo
ngay và không được thay nước ít nhất 4 ngày sau khi nước được tháo khỏi ao
có tôm bệnh nếu như có liên quan đến nguồn nước cấp riêng.

2.5. Sơ lược về gen β-actin
Beta-actin có ở khắp nơi trong cơ thể tôm, Beta-actin là một mRNA, đóng vai
trò rất quan trọng trong chức năng của cơ thể. Nó có vai trò và chức năng cơ
bản trong cơ thể sinh vật như: cấu trúc vỏ, sự phân chia tế bào, sự vận động và
co cơ. Hơn nữa, gen Actin được ứng dụng trong nghiên cứu khoa học như
phân tích sự phát sinh loài. Actin trong cơ thể sinh vật có thể chia làm 2 nhóm:
Actin tế bào chất (β và γ) và 4 Actin cơ (α-skeletal, α-cardiac, α-aortic, α-
enteric). Đối với động vật không xương sống và thực vật hầu hết là Actin tế
bào chất. (Zhu et al., 2004. trích dẫn Trần Nguyên Diễm Tú, 2008)
2.6. Kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR)
PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuyếch đại (tạo ra
nhiều bản sao) một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E.
coli hay nấm men. Kỹ thuật này được phát minh và đặt tên bởi Mullis et al.,
1985. PCR có tính nhạy cao và cho phép tìm ra nhanh chóng, thậm chí chỉ với
một tiểu phần virus. Những virus ẩn, không có các biến đổi về mô học cũng có
thể tìm thấy bằng kỹ thuật này. (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2005)
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
- 15 -

Nguyên tắc của phản ứng PCR
Theo Đặng Thị Hoàng Oanh (2007) thì:
Tất cả các ADN polymerase khi tổng hợp một mạch ADN mới từ mạch khuôn
điều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn ADN
ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn, và ADN
polymerase sễ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Nếu hai mồi chuyên biệt
bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự ADN thì chỉ đoạn ADN nằm giữa
hai mồi được tổng hợp. Hai mồi này gồm một mồi xuôi và một mồi ngược so
với chiều phiên mã của gen
Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm
3 giai đoạn sau:

Giai đoạn biến tính (denaturation): Trong một dung dịch phản ứng bao gồm
các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử ADN được biến tính ở nhiệt
độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của chúng, thường là 94-95oC trong vòng
30 giây đến 1 phút. Đây là giai đoạn mạch đôi tách thành 2 mạch đơn.
Giai đoạn lai (hybridization): Nhiệt độ được hạ thấp hơn Tm của các mồi cho
phép các mồi bắt cặp với khuôn. Trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động
trong khoảng 40-70oC tùy thuộc Tm của mồi sử dụng mà thời gian bắt cặp
khác nhau và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút. Đây là giai đoạn quyết định tính
đặc hiệu của phản ứng.
Giai đoạn tổng hợp (extension): Nhiệt độ được tăng lên đến 72oC. Đó là điều
kiện tốt nhất để cho Taq ADN polymerase hoạt động tổng hợp kéo dài mạch
theo nguyên tắc bổ sung từ 2 đầu sợi khuôn ban đầu. Thời gian tùy thuộc độ
dài của trình tự ADN cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều
phút. Theo Geifand và White (1990), tốc độ tổng hợp của Taq là 150 nucleotit/
giây ở nhiệt độ 75 - 80oC; 60 nucleotit/ giây ở nhiệt độ 70oC; 24 nucleotit/
giây ở 55oC; 1,5 nucleotit/ giây ở 37oC và ở nhiệt độ 22oC chỉ còn 0,25
nucleotit/ giây.
Sau một chu kỳ gồm 3 giai đoạn như trên, một phân tử ADN khuôn được nhân
lên thành hai, các đoạn ADN vừa được nhân trong chu kỳ lại làm khuôn cho
chu kỳ nhân bản tiếp theo vì hai đầu tận cùng của sản phẩm bổ sung với mồi.
Do đó sau mỗi chu kỳ số lượng ADN được tổng hợp tăng lên gấp đôi và như
vậy sau n chu kỳ nhân bản sẽ tạo ra 2n bản ADN từ một khuôn ban đầu. Sau
30 chu kỳ sự khuếch đại sẽ là 106 so với lượng mẫu ban đầu.


PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
- 16 -

2.6.1. Một số nhân tố chính ảnh hưởng đến phản ứng PCR
ADN chiết tách

ADN mẫu có vai trò rất quan trọng và ảnh hưởng rỏ rệt đến kết quả phản ứng
PCR. Hàm lượng ADN mẫu nằm trong khoảng 100ng-1μg. Hàm lượng ADN
quá thấp sẽ tạo ra ít sản phẩm, nhưng với hàm lượng lớn sẽ tạo ra nhiều sản
phẩm phụ. Hàm lượng ADN quá cao phản ứng PCR không xảy ra được.
(Newton và Graham, 1995 trích dẫn bởi Trần Thị Mỹ Duyên, 2006)
Enzyme (Taq ADN polymerase)
Thông thường người ta sử dụng nồng độ 2,5 U/phản ứng. Việc tăng nồng độ
Tap ADN polymerase hơn 2,5 U/ phản ứng đôi khi làm tăng hiệu quả của phản
ứng PCR, nhưng chỉ trong khoảng nhất định. Nếu nồng độ Taq ADN
polymerase quá cao sẽ làm giảm hiệu xuất sản phẩm và sẽ tạo ra nhiều sản
phẩm phụ không mong muốn. Hơn nửa đây là thành phần đắt nhất của phản
ứng PCR nên việc chọn nồng độ thích hợp là rất quan trọng. (Martha et al.,
2001 trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thúy Hằng, 2008)
Mồi và nhiệt độ gắn mồi
Mồi là yếu tố quan trọng quyết định hiệu quả phản ứng PCR, do đó phải tuân
theo một số nguyên tắt sau (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2005):
+ Trình tự mồi được sao cho không thể có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi
xuôi và mồi ngược và giữa các thành phần khác nhau của cùng một
mồi.
+ Nhiệt độ nóng chảy của mồi xuôi và mồi ngược không được quá chênh
lệch nhau (không quá 3°C).
+ Các mồi chọn phải đặc trưng cho trình tự ADN cần khuếch đại, không
trùng với trình tự lặp lại trên gen.
+ Trình tự nằm giữa hai mồi xuôi và mồi ngược không qua lớn, phản ứng
PCR sẽ tối ưu khi trình tự giữa hai mồi nhỏ hơn 1kb. Độ dài mồi tốt
nhất là từ 20-30 nucleotic.
Nồng độ các nucleotide tự do (dNTP)
Nồng độ các dNTP khoảng 200μM cho mỗi phản ứng. Nồng độ thấp hơn tăng
cường độ chính xác của phản ứng nhưng tạo ra ít sản phẩm, còn nồng độ cao
hơn thì làm giảm tính chính xác của phản ứng. Cần phải có 4 loại nucleotide

dạng triphosphat như: dATP, dTTP, dGTP, dCTP. Nồng độ của mỗi dạng
nucleotide phải ở dạng cân bằng, ứng với khoảng 20 - 200 μM cho mỗi loại
nucleotide. Nếu mất trạng thái cân bằng trong thành phần các dNTP thì sẽ gây
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version