Phân lập và xác định gen độc tố của vi khuẩn vibrio parahaemolyticus trong hải sản tươi sống tại các chợ ở thành phố nha trang

i
LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Văn Duy và
TS. Phạm Thu Thủy đã tận tình hướng dẫn, chỉ dạy, truyền đạt kinh nghiệm và giúp
đỡ tôi từng bước tiếp cận và hoàn thành luận văn.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô giáo trong Viện Công nghệ sinh học
và môi trường. Thầy cô đã tận tình giúp đỡ, giảng dạy và truyền đạt kiến thức quý
báu, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập để tôi có được nền
tảng kiến thức bước tiếp những chặng đường tiếp theo.
Con xin gửi lòng biết ơn đến ba mẹ và anh chị đã luôn bên cạnh động viên,
ủng hộ và dành cho con tất cả tình yêu thương, con sẽ luôn cố gắng sống và phấn
đấu với niềm tin yêu này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các bạn lớp 48 CNSH, đã đồng hành
và chia sẽ buồn vui với tôi trong những năm tháng sinh viên, trong suốt khóa học
cũng như quá trình thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến chị Minh Nhật và nhóm G8-50SH đã
quan tâm và nhiệt tình giúp đỡ để bài luận văn được hoàn thành.
Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn tất cả mọi người đã dành cho tôi tình
cảm quý báu này!


Nha Trang, tháng 07 năm 2010
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Cẩm Ly

ii

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i
MỤC LỤC ii
DANH MỤC TỪ, KÍ TỰ VIẾT TẮT iv
DANH MỤC BẢNG v
DANH MỤC HÌNH vi
LỜI NÓI ĐẦU 1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN 2
1.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm hải sản 2
1.1.1. Trên thế giới 2
1.1.2. Ở Việt Nam 6
1.2. Tổng quan về vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 7
1.2.1. Phân loại chi Vibrio 7
1.2.2. Đặc điểm của V. parahaemolyticus 9
1.2.3. Các phương pháp kiểm tra sự có mặt của V. parahaemolyticus 12
1.2.4. Khả năng gây bệnh của V. parahaemolyticus 13
1.2.5. Gen độc tố của V. parahaemolyticus 14
1.3. Mục tiêu và tính cấp thiết của đề tài 18
1.3.1. Mục tiêu 18
1.3.2. Tính cấp thiết 18
CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19
2.1. Vật liệu 19
2.1.1. Mẫu 19
2.1.2. Thiết bị chuyên dụng 19

2.1.3. Hóa chất, môi trường và thuốc thử 20
2.2. Nội dung nghiên cứu 24
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 25


iii
2.3.1. Phân lập vi khuẩn V. parahaemolyticus 25
2.3.2. Xác định đặc điểm hình thái của vi khuẩn Vibrio 26
2.3.3. Xác định khả năng sinh trưởng 27
2.3.4. Xác định một số đặc tính sinh hóa của các chủng Vibrio 28
2.3.5. Bảo quản chủng vi khuẩn. 30
2.3.6. Tách chiết DNA hệ gen từ tế bào vi khuẩn V. parahaemolyticus 30
2.3.7. Xác định gen độc tố bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 31
2.3.8. Điện di trên gel agarose và đọc kết quả điện di 33
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35
3.1. Phân lập vi khuẩn vi khuẩn Vibrio từ thực phẩm hải sản 35
3.2. Đặc điểm hình thái tế bào của các chủng Vibrio 39
3.3. Đƣờng cong sinh trƣởng của các chủng Vibrio 41
3.4. Một số đặc tính sinh hóa của V. parahaemolyticus 42
3.5. Xác định gen độc tố của các chủng Vibrio bằng kỹ thuật PCR 46
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO 53



iv
DANH MỤC TỪ, KÍ TỰ VIẾT TẮT

Base pair bp
Deoxynucleotide triphosphate dNTP

Deoxyribonucleotide Acid DNA
Polymerase Chain Reaction PCR
Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose TCBS
Food and Drug Adimistration FDA
Thermostable direct hemolysin tdh (TDH)
Tdh-related hemolysin trh (TRH)
V. parahaemolyticus toxRS Vp-toxRS
Random Amplification of Polymorphic DNA RAPD
Loop mediated isothermal amplification LAMP
Reverse Transcription PCR RT- PCR
Ethylenediaminetetraacetic Acid EDTA
Optical Density OD
Type III Secretion System T3SS












v
DANH MỤC BẢNG


Bảng 1.1. Các nhóm thực phẩm V. parahaemolyticus gây ngộ độc thực phẩm 4

Bảng 1.2. Ngộ độc thực phẩm gây ra bởi V. parahaemolyticus do tiêu thụ thực phẩm
hải sản 1993 -2000 Hồng Kông 5
Bảng 1.3. Các triệu chứng lâm sàng viêm dạ dày ruột gây ra bởi Vibrio
parahaemolyticus 5
Bảng 1.4. Các đặc tính khác nhau của các loài thường gây bệnh trên người liên quan
đến việc tiêu thụ hải sản 8
Bảng 1.5. Các kháng nguyên của V. parahaemolyticus (1986) 11
Bảng 2.1. Các mẫu hải sản thu mua từ một số chợ ở thành phố Nha Trang dùng để
phân lập vi khuẩn Vibrio 19
Bảng 2.2. Đặc điểm các mồi sử dụng cho phản ứng PCR: 32
Bảng 2.3. Các thành phần sử dụng trong phản ứng PCR 32
Bảng 3.1. Mật độ tế bào và đặc điểm hình thái của các chủng Vibrio được phân lập từ
các mẫu hải sản ở chợ Vĩnh Hải, Vĩnh Thọ, chợ biển (Bãi Dương) 36
Bảng 3.2. Khả năng chịu muối của các chủng Vibrio 43
Bảng 3.3. Khả năng lên men đường của các chủng vi khuẩn Vibrio 44
Bảng 3.4. Khả năng sử dụng lysin của các chủng vi khuẩn 45











vi
DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Tế bào vi khuẩn V. parahaemolyticus được quan sát dưới kính hiển vi 9
Hình 1.2. Hai nhiễm sắc thể dạng vòng của V. parahaemolyticus 17
Hình 2.1. Sơ đồ cách tiếp cận các nội dung nghiên cứu của đề tài 24
Hình 2.2. Sơ đồ chu trình luân nhiệt của phản ứng PCR 33
Hình 3.1. Các khuẩn lạc của vi khuẩn Vibrio sau một ngày (24 giờ) nuôi trên môi
trường thạch TCBS ở điều kiện pH 8,5, nhiệt độ 37
0
C 35
Hình 3.2. Các khuẩn lạc chủng C2 màu xanh (A) và khuẩn lạc chủng C13 màu vàng
sữa (B) 35
Hình 3.3. Tế bào chủng vi khuẩn C2 được soi tươi 39
Hình 3.4. Tế bào của chủng vi khuẩn Vibrio C7 sau khi nhuộm Gram 40
Hình 3.5. Đường cong sinh trưởng của các chủng Vibrio (C1, C2, C7, C15, C23) nuôi
trên môi trường APW, ở pH 8,5 ± 0,2, nhiệt độ phòng và lắc ở 150 vòng/phút 41
Hình 3.6. Thí nghiệm lên men đường của chủng vi khuẩn C15 (A) và C2 (B) 44
Hình 3.7. Thí nghiệm sử dụng lysin của các chủng Vibrio 45
Hình 3.8. DNA tổng số của các chủng vi khuẩn được điện di và soi dưới tia UV 46
Hình 3.9. Sản phẩm khuếch đại gen toxR được điện di và soi dưới tia UV 47

1
LỜI NÓI ĐẦU

Trong những năm trở lại đây, nhiều địa phương trên cả nước thường xuyên
phải đối mặt với tình trạng ngộ độc thực phẩm, có nơi ngộ độc thực phẩm đã xảy ra
hàng loạt. Có nhiều nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm trong đó tiêu thụ hải sản là
một trong những nguyên nhân chính yếu. Các món ăn hải sản ngày càng phong phú
và là thực phẩm bổ dưỡng hàng đầu, đi kèm đó cũng chứa đựng nhiều nguy cơ tiềm
ẩn gây hại cho sức khỏe của con người.
Khi ăn các món ăn sống như ăn gỏi, ăn tái người ăn rất dễ bị nhiễm các bệnh
về hệ tiêu hóa. Dù mang lại nguồn dinh dưỡng cao nhưng phải sử dụng nguồn hải
sản tươi, đun nấu chín, hợp vệ sinh, tuyệt đối không được ăn tái nếu không sẽ bị
nhiễm khuẩn, nhiễm độc, làm lây truyền dịch bệnh tiêu chảy cấp và các bệnh truyền
nhiễm đường tiêu hoá.
Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus là vi khuẩn thường sống kí sinh trên các
đối tượng hải sản như tôm, mực, cua, cá,… chúng được coi là nguyên nhân chính
gây ra các vụ ngộ độc thức ăn nên cần nghiên cứu khả năng gây bệnh của chúng.
Đề tài “Phân lập và xác định gen độc tố của vi khuẩn Vibrio
parahaemolyticus trong hải sản tƣơi sống tại các chợ ở thành phố Nha Trang”
được tiến hành với mục tiêu:
Phân lập và định danh loài V. parahaemolyticus ở các chợ thành phố
Nha Trang có mặt trong một số hải sản tươi sống (tôm, mực, cá, cua…).
Xác định gen độc tố của vi khuẩn gây bệnh bằng kỹ thuật PCR, tạo cơ
sở khoa học cho việc chẩn đoán và điều trị bệnh sớm.

2
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm hải sản
1.1.1. Trên thế giới
Ngộ độc thực phẩm là một vấn đề nghiêm trọng ảnh hưởng đến sức khoẻ
con người, có thể gây ra nguy hiểm, thậm chí tử vong. Triệu chứng của ngộ độc thực
phẩm bao gồm buồn nôn, co thắt dạ dày, tiêu chảy, nôn, sốt và đau đầu. Triệu chứng
có thể xảy ra trong vòng 30 phút sau khi ăn trong một vài giờ, hoặc vài ngày sau đó
và ở mức độ nặng, nhẹ khác nhau.
Vi khuẩn V. parahaemolyticus là nguyên nhân phổ biến gây ngộ độc thực
phẩm ở nhiều nước châu Á, bao gồm Trung Quốc (31,1% vụ dịch ngộ độc thực
phẩm được báo cáo giữa năm 1991 và 2001), Nhật Bản (chiếm 20-30% các trường
hợp từ 1981 đến 1993) và Đài Loan (69% trường hợp được báo cáo giữa năm 1981
và 2003). Ngoài ra, dịch còn xảy ra ở các nước châu Âu như Tây Ban Nha (1989,
1999, 2004), Pháp (1997) và cả Châu Mỹ, điển hình là Hoa Kỳ (Norinaga và cộng
sự, 2005).
Nhật Bản: Trước năm 1994, tỷ lệ mắc bệnh do V. parahaemolyticus được
công bố còn ít. Thời kì 1994-1995 đã có 1.280 vụ về nhiễm bệnh do V.
parahaemolyticus được báo cáo, còn nhiều hơn các vụ ngộ độc thực phẩm do
Salmonella. Phần lớn các trường hợp ngộ độc xảy ra trong mùa hè, số lượng ca ngộ
độc lớn nhất xuất hiện trong tháng tám. Từ 1996-1998, đã có 496 ổ dịch, với 24.373
trường hợp do V. parahaemolyticus gây ra. Số lượng các trường hợp ngộ độc thực
phẩm V. parahaemolyticus tăng gấp đôi vào năm 1998 so với năm 1997.
Ấn Độ: Thời kì 1994-1996, xác định được 146 bệnh nhân bị ngộ độc do vi
khuẩn V. parahaemolyticus (Okuda và cộng sự, 1997). Tỷ lệ này tăng đột ngột vào
tháng hai năm 1996 và vẫn còn cao cho đến tháng tám. Tỷ lệ của bệnh do V.
parahaemolyticus tăng lên liên quan đến tăng sự lưu hành của chủng O3: K6. Tỷ lệ
mắc tiêu chảy do chủng O3: K6 chiếm 63% các chủng phân lập từ bệnh nhân ở

Calcutta giữa tháng 9 năm 1996 và tháng 4 năm 1997.


3
Mexico: Tổng số 266 mẫu nước biển, nhuyễn thể và cá thu thập từ 12 điểm
khác nhau trong đầm phá Pueblo Viejo, Mexico vào các tháng khác nhau trong năm
cho thấy: V. parahaemolyticus được tìm thấy ở 11 trong 12 điểm trên. Các chủng đã
được kiểm tra kiểu huyết thanh cho mục đích dịch tễ học và O3 là nhóm huyết thanh
thường gặp nhất. Nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng nhân tố tác động đến phân bố V.
parahaemolyticus trong môi trường bao gồm nhiệt độ nước, muối, nồng độ oxy, sự
tương tác với thực vật nổi, sự có mặt của các trầm tích, chất hữu cơ trong huyền phù,
cá và hải sản cũng như sự lên xuống của thủy triều ở cửa sông (Maria và cộng sự,
2004).
Chile: Tóm tắt dịch bệnh tiêu chảy liên quan đến tiêu thụ hải sản và V.
parahaemolyticus xảy ra trong mùa hè năm 2004 và 2005 ở các vùng quanh của
Puerto Montt, Chile. V. parahaemolyticus thu được từ động vật có vỏ và mẫu lâm
sàng trong thời gian dịch bệnh chủ yếu thuộc nhóm O3: K6 (Loreto và cộng sự,
2005).
Đài Loan : Từ năm 1983 đến 1993, có 786 chủng Vibrio parahaemolyticus đã
được thu thập từ các dịch bệnh truyền qua thực phẩm và một số các trường hợp tiêu
chảy ở miền bắc Đài Loan, gồm 42 kiểu huyết thanh. Năm kiểu huyết thanh thường
gặp là K8 (36,8%), K15 (10,8%), K12 (8,7%), K56 (7,9%) và K63 (4,7%). Đa số
chủng gây ra bệnh có kiểu huyết thanh là O3:K6 (Wong và cộng sự, 2000).
Gần đây, bệnh tiêu chảy do V. parahaemolyticus đã được báo cáo từ Việt
Nam, Úc, Hoa Kỳ, Trung Mỹ và Anh. Tại châu Phi, V. parahaemolyticus lần đầu
tiên được xác định trong các dịch bệnh tại Togo. Do triệu chứng phát bệnh tương tự
với tả nên người ta đẩy mạnh về công tác y tế công cộng (Bockemuhl và Triemer,
1974).
V. parahaemolyticus là nguyên nhân chính gây ngộ độc thực phẩm như viêm
dạ dày ruột ở người thông qua tiêu thụ hải sản nấu chưa chín hoặc vết thương tiếp xúc

với động vật biển hoặc vùng nước ấm ven biển đặc biệt là ở Đông Nam Á (Wong và
cộng sự, 2000). Khi nhiệt độ tăng lên trong một khoảng thời gian ngắn là đủ cho vi


4
khuẩn V. parahaemolyticus phát triển cho đến khi đạt đến mức độ nhiễm độc (10
6
vi
khuẩn) (Daniels và cộng sự, 2000).
Trong những năm gần đây, Sở Y tế Hồng Kông nghiên cứu cho biết Vibrio
parahaemolyticus đã liên tục gây ngộ độc và được xếp vào nguyên nhân hàng đầu
do ăn thực phẩm hải sản.
Bảng 1.1. Các nhóm thực phẩm V. parahaemolyticus gây ngộ độc thực phẩm
(từ 1999 đến 2003)
Nhóm thực phẩm
Số ca xác nhận
Số ngƣời mắc phải
Hải sản
313 (56,7%)
1465 (53,8%)
Món ăn hỗn hợp
68 (12,3%)
449 (16,5%)
Thịt, sản phẩm từ thịt và cá tạp
54 (9,8%)
314 (11,5%)
Ngũ cốc và sản phẩm từ ngũ cốc
39 (7,1%)
89 (3,3%)
Gia cầm và sản phẩm từ gia cầm

29 (5,3%)
187 (6,9%)
Trái cây, rau và sản phẩm từ chúng
25 (4,5%)
98 (3,6%)
Nhóm khác (chƣa rõ)
33 (4,3%)
123 (4,6%)
Tổng
552 (100%)
2725 (100%)
(Nguồn: Risk Assessment Studies, Report No.20, 2005 )


5
Bảng 1.2. Ngộ độc thực phẩm gây ra bởi V. parahaemolyticus do tiêu thụ thực
phẩm hải sản 1993 -2000 Hồng Kông
Nhóm thực phẩm
Loại thực phẩm
Số ca mắc bệnh
Số ngƣời mắc phải

Giáp xác

Cua
46 (14,7%)
180 (12,3%)
Tôm
43 (13,7%)
299 (20,4%)

Tôm Hùm
1 (0,3%)
2 (0,1%)
Tổng
90 (28,7%)
481 (32,8%)
Chân bụng
Mực
82 (26,2%)
371 (25,3%)
Thân mềm




Trai
15 (4,8%)
49 (3,3%)
Hàu
12 (3,8%)
41 (2,8%)
Hến
12 (3,8%)
45 (3,1%)
Sò , điệp
6 (1,9%)
24 (1,6%)
Các loại thân mềm khác
4 (1,3%)
29 (2,0%)

Tổng
49 (15,7%)
188 (12,8%)
Các sản phẩm khác
từ biển

49 (15,7%)
255 (17,4%)
Cá

43 (13,7%)
170 (11,6%)
Tổng

313 (100%)
1465 (100%)
(Nguồn: Risk Assessment Studies, Report No.20, 2005 )
Bảng 1.3. Các triệu chứng lâm sàng viêm dạ dày ruột gây ra bởi Vibrio
parahaemolyticus
Triệu chứng
Tỷ lệ của triệu chứng
Trung bình
Phạm vi (khoảng)
Tiêu chảy
98%
80 - 100%
Đau thắt bụng
82%
68 - 100%
Nôn

71%
40 - 100%
Buồn nôn
52%
17 – 79%
Đau đầu
42%
13- 56%
Sốt
27%
21 – 33%
Ớn lạnh
24%
4 – 56%
(Nguồn Barker và Gangarosa, 1974; Levine và cộng sự, 1993)


6
V. parahaemolyticus là một loại vi khuẩn ưa mặn, có khả năng gây ngộ độc
thực phẩm và viêm dạ dày ruột, vết thương nhiễm trùng, và nhiễm trùng huyết ở
người. Nhiễm trùng huyết là mối đe dọa nghiêm trọng vì sinh vật gây bệnh lây lan
nhanh hoặc sự hiện diện và tồn tại lâu dài của các độc tố do chúng sản xuất ra lưu
thông trong máu. Dấu hiệu đặc trưng là sốt hoặc hạ huyết áp và khả năng phân tách
các vi sinh vật từ máu. Trong trường hợp nhiễm trùng huyết, các triệu chứng có thể
bao gồm sưng, đau đớn tứ chi với xuất huyết (Hlady, 1997; Klontz, 1990). Tử vong
cũng có thể xảy ra tiếp theo khi có sự xuất hiện của nhiễm trùng huyết. Thời gian ủ
bệnh có thể từ 2 giờ đến 10 ngày (Barker và Gangarosa, 1974).
1.1.2. Ở Việt Nam
Tại Việt Nam từ năm 1999 đến 2008 đã có khoảng 1.000 vụ ngộ độc thực
phẩm được báo cáo với trên 25.000 người mắc, trong đó có 300 người tử vong.

Riêng tại tỉnh Khánh Hòa, tình hình ngộ độc thực phẩm xảy ra tính từ năm 2001 đến
2008 có 215 ca ngộ độc, trong đó có 7 ca tử vong. Nguyên nhân của các vụ ngộ độc
thực phẩm là do cá nóc (25 ca), vi sinh vật (48 ca), nấm dại (46 ca). Thời điểm trong
năm hay xảy ra ngộ độc thực phẩm là từ tháng 7 đến tháng 12. Loại thực phẩm gây
ngộ độc thực phẩm thường gặp là rau, thịt, nhưng hải sản cũng chiếm 11,11% các ca
ngộ độc.
Theo báo cáo của Tuyet và cộng sự (2002) đã có 548 ca nhiễm bệnh do V.
parahaemolyticus gây ra được xác định giữa 1/1995 đến 9/2001 ở Khánh Hòa.
Trong thời gian này, các nhà nghiên cứu ghi nhận trong số này có 471 người lớn và
có 57 trẻ em. Phân tích vi sinh cho thấy trong số 548 trường hợp tiêu chảy, có 53%
dương tính với vi khuẩn V. parahaemolyticus. Nhiều địa phương trên cả nước hiện
phải đối mặt với tình trạng ngộ độc thực phẩm ngày càng tăng do nhu cầu ăn hải sản
ngày càng nhiều, có nơi ngộ độc thực phẩm đã xảy ra hàng loạt. Điều kiện để dịch
bệnh xuất hiện là do tình trạng vệ sinh môi trường, nước, thực phẩm kém, đặc biệt là
thói quen, sở thích ăn gỏi, ăn tái hải sản.
Tuy các phương tiện truyền thông đưa tin về ngộ độc thực phẩm do loài này
gây ra rất nhiều do chúng gây bệnh trên các loài hải sản như tôm, cá (Võ Văn Nha


7
và cộng sự, 2006) nhưng ở nước ta còn có ít nghiên cứu cơ bản về gen độc tố của vi
khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh. Đề tài được thực hiện để đáp ứng tình hình
thực tế ấy, làm cơ sở cho nghiên cứu chẩn đoán và điều trị bệnh kịp thời.
1.2 . Tổng quan về vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
1.2.1. Phân loại chi Vibrio
Vibrio thuộc chi vi khuẩn Gram âm, hình dấu phẩy và di động bằng tiêm mao
đơn cực dinh dưỡng theo phương thức dị dưỡng hữu cơ (Thompson và cộng sự,
2004). Chúng là loài lên men tùy tiện (facultative) và hầu hết dương tính với phản
ứng oxydase. Chi Vibrio được chia ra thành các loài không ưa mặn (V. cholerae) và
các loài ưa mặn (V. parahaemolyticus, V. alginolyticus). Chúng khác nhau về kích

cỡ, có thể là dài và mảnh hoặc ngắn và mập, dễ dàng sống trên môi trường chứa
dinh dưỡng và sống tốt khi môi trường giàu oxy. Hầu hết các loài Vibrio sống ở
30
o
C nhưng có một số loài ưa mặn sinh trưởng ở 37
o
C và các loài V.
parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. cholerae có thể sinh trưởng ở 42
o
C. Các loài
Vibrio hầu hết sống trong môi trường trung tính nhưng chúng cũng có khả năng chịu
được môi trường kiềm, còn kém phát triển trong môi trường chứa acid. Chúng sinh
trưởng tốt trong khoảng pH từ 7,4 – 9,6, ức chế ở pH 6,8 và 10,2 (Rujiwat, 2007).
Các loài Vibrio chủ yếu sống ở nước và phân bố dựa vào nhiệt độ, nồng độ
Na
+
, hàm lượng dinh dưỡng có trong nước và sự có mặt của các loài thực vật và
động vật (McCarter, 1999). Chúng thường sống ở biển hoặc cửa sông, trên bề mặt
và trong ruột động vật biển. Người ta thường phân lập chúng từ các cặn trầm tích,
nước, thực vật và hải sản. Các loài hải sản là nơi an toàn cho các loài Vibrio sinh
sống, bao gồm các loài như trai, sò, cua, tôm, mực. Đối với các loài không ưa mặn,
chúng có thể được phân lập từ mẫu nước ngọt (Rujiwat, 2007).
Hầu hết các loài Vibrio phân lập từ các mẫu lâm sàng của người đều gây bệnh
ngoại trừ V. vurnissi. Vibrio spp. thường gây tiêu chảy hoặc nhiễm độc ngoài ruột
(extraintestinal infection), riêng V. cholerae có thể gây ra cả hai hiện tượng. Gần đây
các loài V. fluvialis, V. hollisae, V. minicus cũng liên quan đến gây bệnh ở người,
nhưng ít phổ biến. Các loài khác thuộc họ Vibrionaceae, gồm V. vulnificus,


8

AliiVibrio salmonicida và V. harveyi, là tác nhân gây bệnh trên các loài hải sản và
chúng gây ra thiệt hại lớn về kinh tế. Photobacterium profundum, đại diện cho một
chi khác trong họ Vibrionaceae, cũng được kể đến trong danh sách các loài gây
bệnh trên hải sản (Rujiwat, 2007).
Bảng 1.4. Các đặc tính khác nhau của các loài thƣờng gây bệnh trên ngƣời liên
quan đến việc tiêu thụ hải sản










**
**
TCBS agar
V
V
V
V
Km
V
X
X
X
V
X

mCPC agar
Km
Ti
Km
Km
Km
Km
Km
Km
V
Km
Km
CC agar
Km
Ti
Km
Km
Km
Km
Km
Km
V
Km
Km
AGS
KA
Ka
KK
KK
Ka

KK
KA
KA
KA
KK
0
Oxidase
+
+
+
+
+
−
+
+
+
+
+
Arginine dihydrolase
−
−
+
+
−
+
−
−
−
+
+

Ornithine
decarboxylase
+
+
−
−
−
−
+
+
+
−
+
Lysine decarboxylase
+
+
−
−
−
+
+
+
+
T
+
Khả
năng
chịu
muối
0% NaCl

−
+
−
−
−
−
+
−
−
+
+
3% NaCl
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
6% NaCl
+
−
+
+
+
+

−
+
+
+
−
8% NaCl
+
−
T
+
−
T
−
−
−
−
−
10% NaCl
+
−
−
−
−
−
−
−
−
−
−
Phát triển ở 42°C

+
+
T
−
0
T
+
+
+
T
+
Khả
năng
lên
men
Sucrose
+
+
+
+
−
+
−
−
T
T
−
D-cellobiose
−
−

+
−
−
−
−
T
+
+
−
Lactose
−
−
−
−
−
−
−
−
+
T
−
Arabinose
−
−
+
+
+
−
−
+

−
T
−


9
D-Mannose
+
+
+
+
+
+
+
+
+
T
−
D-Mannitol
+
+
+
+
−
+
+
+
T
+
−

ONPG
−
+
+
+
−
+
+
−
+
+
−
Voges-
Proskauer
+
T
−
−
−
+
−
−
−
+
−
Nhạy
với
10 µg O/129
K
N

K
K
0
N
N
K
N
K
N
150 µg O/129
N
N
N
N
0
N
N
N
N
K
N
Gelatinase
+
+
+
+
−
+
+
+

+
+
−
Urease
−
−
−
−
−
−
−
T
−
−
−
** Aeromonas hydrophila, Plesiomonas shigelloides
Các từ viết tắt: V = vàng; Km = không mọc hoặc mọc rất ít; N = nhạy cảm; 0 = không làm;
X = màu xanh; T = tùy chủng (có thể mọc hoặc không mọc); K= kháng; Ti = màu tía (purple);
AGS = Arginine glucose slant; mCPC = Modified cellobiose polymyxin; KK = Slant alkaline
/ Butt alkaline (thạch nghiêng có kiềm); Ka = Slant alkaline/ Butt slightly acidic (sinh hơi);
KA = Slant alkaline /Butt acidic (thạch nghiêng có acid)
Nguồn: www.fda.gov
1.2.2 Đặc điểm của V. parahaemolyticus

Hình 1.1. Tế bào vi khuẩn V. parahaemolyticus đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi
(Tế bào vi khuẩn có hình dấu phẩy, di động bằng lông mao đơn cực)


10
Phân loại khoa học của Vibrio parahaemolyticus:

Giới : Vi khuẩn
Ngành : Proteobacteria
Lớp: Gamma Proteobacteria
Bộ : Vibrionales
Họ: Vibrionaceae
Chi: Vibrio
Loài: V. parahaemolyticus
Theo khóa phân loại của Bergey, V. parahaemolyticus là một loại vi khuẩn
Gram âm, hình dấu phẩy, có tiêm mao ở một đầu, di động, kỵ khí tùy tiện và ưa môi
trường kiềm mặn. Chúng có thời gian thế hệ 8-9 phút (Daniels và cộng sự, 2000),
thường sống ở các cửa sông và ven biển của hầu hết các vùng trên thế giới. Người ta
cũng đã phân lập được chúng trong cát, bùn và nước biển, cũng như ở hải sản
(Maria và cộng sự, 2004).
Các đặc tính sinh hóa đặc trưng cho V. parahaemolyticus theo như mô tả trên
gồm: phản ứng oxydase (+), khả năng sử dụng lysin (+), ornithin (+), arginine (+),
khả năng lên men đường arabinose (+), lactose (-), sucrose (-), mannitol (+),
mannose (+), sống được trong phạm vi muối từ 3-8%, không mọc ở môi trường
không có muối (0%) hoặc muối quá cao (10%).
Các chủng V. parahaemolyticus phân lập có thể phân biệt nhau bằng kiểu
huyết thanh (serotyping). Hệ thống để xác định các kiểu huyết thanh của V.
parahaemolyticus dựa trên các cấu trúc kháng nguyên khác nhau của các nhóm
lipopolysaccharides (gọi tắt là nhóm O) và các loại nang (gọi tắt là các loại K)
(Joseph và cộng sự, 1983). Theo nguồn từ FDA, có 12 nhóm O và 65 loại K đã được
xác định (Bảng 1.5).


11
Bảng 1.5. Các kháng nguyên của V. parahaemolyticus (1986)
Nhóm O
Loại K

1
1,25,26,32,38,41,56,58,64,69
2
3,28
3
4,5,6,7,27,30,31,33,37,43,45,48,54,57,58,59,65
4
4,8,9,10,11,12,13,34,42,49,53,55,63,67
5
5,15,17,30,47,60,61,68
6
6,18,46
7
7,19
8
8,20,21,22,39,70
9
9,23,44
10
l9,24,52,66,71
11
36,40,50,51,61
12
52
Tổng số: 12
65

Các kiểu huyết thanh (O4: K48 và O1: K56, và O3: K6) chiếm ưu thế trong
các dịch bệnh (Nandini và cộng sự, 2000). Các chủng V. parahaemolyticus được
phân lập cùng một kiểu huyết thanh có thể giống nhau hoặc phân biệt với nhau.

Không phải tất cả các chủng V. parahaemolyticus đều gây bệnh ở người. Thực tế,
phần lớn các chủng phân lập từ môi trường hoặc hải sản không gây bệnh. Các chủng
gây bệnh thì sản xuất ra thermostable direct hemolysin (TDH). TDH là một enzyme
có thể làm tan (phá vỡ) các tế bào hồng cầu trên môi trường thạch máu Wagatsuma,
được gọi là hiện tượng Kanagawa. Vai trò của các độc tố trong cơ chế gây bệnh
chưa được biết rõ ( Kozo và cộng sự, 2003).
Dịch bệnh do V. parahaemolyticus gây ra có xu hướng tập trung dọc theo
vùng ven biển trong mùa hè và đầu mùa thu khi nhiệt độ nước cao hơn mức nhiệt độ
bình thường. Các loại thực phẩm liên quan đến các vụ ngộ độc thường là mực ống,
cá thu, cá ngừ, cá mòi, cua, tôm, và các loại động vật hai mảnh vỏ như hàu, sò, trai.


12
Thời kì ủ bệnh thường là 12 đến 24 giờ, kèm theo các triệu chứng nôn, mửa, đau
bụng, tiêu chảy đôi khi sốt. Các triệu chứng thường kéo dài trong 72 giờ, nhưng có
thể kéo dài đến 10 ngày đối với người có hệ thống miễn dịch suy giảm.
1.2.3. Các phƣơng pháp kiểm tra sự có mặt của V. parahaemolyticus
Có nhiều phương pháp được sử dụng để phát hiện V. parahaemolyticus như
dựa vào quan sát hình thái dưới kính hiển vi, các đặc tính sinh hóa và các kĩ thuật
sinh học phân tử như PCR, RAPD, miễn dịch phân tử.
Khi quan sát dưới kính hiển vi, V. parahaemolyticus có hình dấu phẩy, di
động bằng tiêm mao đơn cực. Về kích cỡ tùy thuộc vào chủng, có chủng thì dài,
mảnh hoặc ngắn, mập. Khi nhuộm Gram, chúng được phát hiện là Gram âm.
Các loài V. parahaemolyticus khi nuôi cấy trên môi trường thạch chọn lọc
Thiosulfate Citrate Bile Salt Sucrose (TCBS) có màu xanh lá cây hoặc màu xanh
đậm trên thạch (Kudo và cộng sự, 2003). Ngoài ra, V. parahaemolyticus còn phát
triển trên môi trường chọn lọc khác là CHROMagar
TM
Vibrio cho thấy các khuẩn lạc
có màu tía hoặc tím.

Cuối cùng, V. parahaemolyticus có thể được phát hiện bằng các kĩ thuật sinh
học phân tử như PCR, RAPD, LAMP, RT- PCR Kỹ thuật PCR được sử dụng để
phát hiện V. parahaemolyticus trong các mẫu khác nhau bao gồm hải sản hoặc mẫu
nước. Phương pháp này thực hiện nhanh, dễ dàng và đáng tin cậy. Chính vì vậy, kỹ
thuật này được ứng dụng để khuếch đại các gen độc tố (toxR, tdh, trh). Gen tdh, trh
là các gen trực tiếp sản xuất ra các protein độc tố TDH, TRH. Còn gen toxR là gen
điều hòa operon độc tố, đoạn gen này là bảo tồn đối với V. parahaemolyticus (Kim
và cộng sự, 1999). Ngoài toxR, gen gyrB cũng là gen bảo tồn nên ta cũng có thể
thực hiện phản ứng PCR đối với đoạn gen này để xác định loài V. parahaemolyticus
(Zulkifli và cộng sự, 2009).


13
1.2.4. Khả năng gây bệnh của V. parahaemolyticus
V. parahaemolyticus là nguyên nhân chính gây ngộ độc thực phẩm, như viêm
dạ dày ruột ở người thông qua tiêu thụ hải sản nấu chưa chín hoặc qua vết thương
tiếp xúc với động vật biển hoặc vùng nước ấm ven biển đặc biệt là ở Đông Nam Á
(Wong và cộng sự, 2000). Loài này có thế hệ thời gian ngắn (8-9 phút). Chúng chỉ
cần một thời gian ngắn có nhiệt độ tăng (khoảng từ 30 - 42
o
C, tối ưu là 37
o
C) là đủ
để phát triển đến mức độ lây nhiễm (10
6
tế bào/ml) (Daniels và cộng sự, 2000).
Hầu hết các kết quả lâm sàng cho thấy bệnh do các chủng có mang gen
thermostable direct hemolysin (tdh), gen tdh - related hemolysin (trh) hoặc mang cả
hai gen. Loài vi khuẩn này gây bệnh không chỉ trên người mà còn là các đối tượng
hải sản như tôm, cá, (Đỗ Thị Hòa và cộng sự, 2004).

Khi gây bệnh trên người, sự lây nhiễm có thể qua đường ăn uống, lây nhiễm
từ người sang người do tiếp xúc với mầm bệnh (chất nôn, phân, dụng cụ, ), người
bệnh không rửa tay kỹ, ăn thực phẩm tươi sống hay chưa nấu chín. Đây là nguyên
nhân chủ yếu gây ra viêm dạ dày ruột (gastroenteritis) cấp tính. Sự lây nhiễm qua
vết thương cũng có, nhưng ít phổ biến hơn ngộ độc do ăn hải sản và thực phẩm bị
nhiễm chéo với các loại thực phẩm hải sản khác. Theo trung tâm an toàn thực phẩm
Hồng Kông, quá trình chế biến bị lây nhiễm hoặc nguồn nước sử dụng bị nhiễm và
xử lý không đúng cách. Ngoài ra, bơi lội hoặc làm việc ở vùng bị ảnh hưởng có thể
dẫn đến nhiễm trùng mắt hoặc tai và các vết thương hở .
Bên cạnh loài V. parahaemolyticus, các loài Vibrio khác cũng gây ra các vấn
đề nghiêm trọng trong hoạt động nuôi tôm và hầu hết là tác nhân gây bệnh trên vật
chủ hải sản. Các loài Vibrio được phân lập từ bệnh tôm là V. parahaemolyticus, V.
harveyi, V. alginolyticus, V.vulnificus, V. damsela, V. anguillarum và V. fluvialis
(Leangphibul và cộng sự, 1985; Lightner, 1988; Ruangpan và Kitao, 1991; Nash và
cộng sự, 1992; Jiravanichpaisal và cộng sự, 1994). Vibrio spp. đều có thể xâm nhập
và gây bệnh khi điều kiện môi trường thuận lợi đến các giai đoạn phát triển của tôm
như ấu trùng, hậu ấu trùng, tiền trưởng thành và trưởng thành.


14
1.2.5. Gen độc tố của V. parahaemolyticus
V. parahaemolyticus được công nhận là nhân tố gây ra viêm dạ dày ruột liên
quan đến sự tiêu thụ hải sản, nhưng không phải chủng nào của loài này cũng gây
bệnh. Một yếu tố độc tính từ lâu đã được coi liên quan đến dịch tễ học liên kết với
bệnh là hemolysin. Hemolysin là ngoại độc tố, tấn công vào màng tế bào máu và
làm tan tế bào. Hemolysin chuyển các ion liên kết với protein như hemolysin,
transferrin, lactoferrin thành dạng tự do. Các ion này (Fe
3+
) sẽ liên kết với các phức
chất dạng chelator ở ngoài tế bào (Zhang và Austin, 1998). Trong nhiều trường hợp,

phạm vi tấn công của hemolysin không dừng ở các tế bào hồng cầu mà còn mở rộng
phạm vi đến các tế bào biểu mô, tế bào thần kinh và các tế bào nhân đa hình
(polymorphonuclear) làm tăng cường độc tố và gây phá hủy các mô. Kết quả của sự
phân giải này là giải phóng beta-hemolysin (phân hủy hoàn toàn hemoglobin) và
alpha-hemolysin (phân hủy không hoàn toàn hemoglobin). Hemolysin được sản xuất
bởi nhiều loài vi khuẩn khác nhau, bao gồm: Escherchia coli, Pseudomonas
aeruginosa và các loài Vibrio (Zhang và Austin, 1998). Với mỗi loài, hemolysin có
thể có cơ chế giống nhau hoặc khác nhau trong xâm nhiễm và gây độc.
V. parahaemolyticus trên môi trường thạch máu Wagatsumar đã sản xuất ra
beta-hemolysin. Hầu hết các chủng V. parahaemolyticus phân lập từ các mẫu lâm
sàng đều cho thấy hoạt tính tán huyết (hemolytic), hoạt tính này được gọi là hiện
tượng Kanagawa (KP) nhưng chỉ có 1-5% các chủng không từ nguồn lâm sàng lại
cho dương tính KP. Do vậy, hemolysin được xem là yếu tố độc tố quan trọng và
phản ứng KP được dùng để đánh dấu nhận biết cho các chủng độc hại. Hemolysin
này có tên là TDH (thermostable direct hemolysin), cấu trúc của nó không có lipid
hay carbonhydrat mà là một dimer, bao gồm hai tiểu đơn vị và mỗi tiểu đơn vị có
khối lượng 21 kDa (Takeda và cộng sự, 1978). Nó rất bền nhiệt, khi đun nóng ở
100
o
C trong 10 phút thì protein bị phân giải còn lại 165 amino acid với một cầu nối
disulfua gần nhóm carboxyl (–COOH) ở cuối cùng (Tsunasawa và cộng sự, 1987),
hoạt tính hemolysin tác động trực tiếp lên tế bào hồng cầu, ly giải phá vỡ hồng cầu.
TDH gây tiết chất dịch trong ruột cũng như gây ra độc tố cho một vài loại tế bào.


15
Honda và cộng sự (1992) đã chứng tỏ TDH phá vỡ tế bào eucaryote theo ba bước,
đầu tiên chúng liên kết với màng tế bào hồng cầu sau đó chúng tham gia tạo ra các
kênh lỗ màng (porin channel) ở tế bào ruột có đường kính khoảng 2 nm, cho phép
nhiều loại ion tràn vào như Na

+
, Mg
+
, Ca
+
. Khi TDH tăng lên thì cũng tăng lên các
kênh này làm cho các ion này tràn vào tự do và tế bào căng lên hết mức và phá vỡ tế
bào do mất cân bằng thẩm thấu.
Năm 1988, Honda và các đồng nghiệp phát hiện ra một hemolysin mới trong
khi phân lập các chủng lâm sàng KP dương tính (Honda và cộng sự, 1988).
Hemolysin này được gọi là TDH-related haemolysin (TRH), có tính chất hóa lý,
miễn dịch và sinh học tương tự như TDH. TDH và TRH được mã hóa bởi gen tdh và
trh tương ứng, chúng được coi là yếu tố độc tính quan trọng trong gây bệnh của V.
parahaemolyticus (Nishibuchi và cộng sự, 1992; Honda và Iida, 1993; Xu và cộng
sự, 1994). Gen tdh, trh lần lượt có kích thước 250 và 251bp. Giữa các chủng V.
parahaemolyticus có các gen độc tố khác nhau. Hầu như tất cả các mẫu lâm sàng có
tdh hoặc trh, hoặc cả hai, trong khi gần như tất cả các mẫu từ môi trường không có
(Shirai và cộng sự, 1990; Suthienkul và cộng sự, 1995; Iida và cộng sự, 1997) hoặc
có với tỉ lệ thấp 1-5% (Nishibuchi và Kaper, 1995, Robert và cộng sự, 2004).
Các chủng V. parahaemolyticus gây bệnh là các chủng KP dương tính, có
chứa gen tdh và gen trh mã hóa các protein độc tố TDH, TRH nằm trên operon độc
tố V. parahaemolyticus toxRS (Vp-toxRS), được điều hòa bởi gen toxR. Operon Vp-
toxRS có tên này là do cấu trúc và chức năng của nó tương tự với operon của V.
cholerae là toxRS, là bộ mã hóa cho gen nội độc tố tả. Giữa hai operon của hai loài
V. parahaemolyticus và V. cholerae chiếm lần lượt 52% và 62% trình tự tương
đồng. Giống operon toxRS của V. cholerae, operon Vp-toxRS không chỉ điều khiển
sự phiên mã của gen độc tố ruột tdh mà còn các gen khác nữa. Trình tự của operon
Vp-toxRS còn được phát hiện có trong tất cả các chủng V. parahaemolyticus
(Nishibuchi và cộng sự, 1995).
Ở các loài V. mimicus, V. cholerae, V. hollisae (Nishibuchi và Kaper, 1995)

có trình tự gen độc tố tdh, trh giống với gen độc tố tdh, trh ở chủng V.


16
parahaemolyticus gây bệnh nên trong nghiên cứu, Sujeewa và cộng sự (2009)
không chỉ xác định mỗi gen tdh, trh mà còn xác định gen toxR để chỉ ra chính xác
đây là loài V. parahaemolyticus. Gen toxR là gen điều hòa kiểm soát sự biểu hiện
của các gen mã hóa cho các nhân tố độc lực ngoại bào quan trọng và các gen liên
quan đến các độc tố khác. Gen toxR có kích thước 368 bp là gen điều hòa cho
operon Vp- toxRS (Zulkifli và cộng sự, 2009), tồn tại ở tất cả các chủng V.
parahaemolyticus.
Ở loài V. cholerae, gen toxR được biết là gen điều hòa dịch mã của gen ctx-
mã hóa cho độc tố tả. Các nghiên cứu sau đó cũng chỉ ra gen toxR là gen mã hóa
protein màng đóng vai trò chủ chốt trong điều hòa gen ctx và nhiều gen khác, bao
gồm gen tcp mã hóa độc tố lông mao (toxin-coregulated pili) và gen ompU, ompT
mã hóa các protein màng phía ngoài (OMPs) ở V. cholerae. Theo thống kê, gen toxR
biểu hiện đồng thời gen phá hủy tế bào máu và điều hòa biểu hiện OMP ở loài V.
vulnificus. Trình tự nucleotide được xác định tương đồng giữa ba gen toxR của ba
loài V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus là 52- 63%. Những điều này chỉ
ra rằng gen toxR là gen điều hòa kiểm soát sự biểu hiện của nhiều gen mã hóa cuả
nhiều loài trong chi Vibrio (Jun và cộng sự, 2001).
Chủng V. parahaemolyticus có hai nhiễm sắc thể I và II lần lượt có kích
thước 3,2 và 1,9 Mb, hoàn thành giải trình tự vào ngày 10 tháng 3 năm 2003, so
sánh với bộ gen của V. cholerae đã chỉ ra nhiều điểm tái sắp xếp trong mỗi nhiễm
sắc thể và giữa hai nhiễm sắc thể (Kozo và cộng sự, 2003).
Nhiễm sắc thể I dạng vòng có 3223 gen, chiều dài gồm 3.288.558 nucleotide,
mã hóa 3080 protein, hàm lượng GC 45%, số gen mã hóa là 86%.
Nhiễm sắc thể II có 1769 gen mã hóa nên 1752 protein, chiều dài gồm
1.877.212 nucleotide hàm lượng GC trong nhiễm sắc thể là 45%. Nhiễm sắc thể II
có chứa các gen độc tố tdh, trh.

17


Hình 1.2. Hai nhiễm sắc thể dạng vòng của V. parahaemolyticus
(Từ ngoài vào trong, mỗi một vòng tròn và mỗi một màu sắc là các vùng gen
quy định các chức năng riêng của gen trong nhiễm sắc thể)
T3SS (Type III Secretion System) là một trong những hệ thống bài tiết ra các
protein của vi khuẩn vào môi trường ngoại bào hoặc vi khuẩn cũng có thể tiêm
những protein này vào tế bào vật chủ eucaryote của chúng. T3SS cần thiết cho phát
sinh bệnh ở các loài vi khuẩn gây bệnh. T3SST không xuất hiện ở bộ gen vi khuẩn
Nhiễm sắc thể số 2
Nhiễm sắc thể số 1


18
V. cholerae. Qua các thí nghiệm phân tích về bộ gen, người ta cho thấy ở loài V.
parahaemolyticus có hai hệ thống T3SS (Thomson và cộng sự, 2004), chúng đóng
vai trò trong phát sinh bệnh của vi khuẩn này (Honda và cộng sự, 2006). Đó là
T3SS1 và T3SS2, mỗi một hệ thống phân bố lần lượt ở hai nhiễm sắc thể I và II. Jun
và cộng sự (2001) đã báo cáo một đảo gen gây bệnh Vp-PAI dài 80 kp trên nhiễm
sắc thể II bảo tồn trong các chủng KP (+) và không có trong KP (-) (Kodama và
cộng sự, 2010). Vp-PAI không chỉ chứa gen tdh mà còn chứa cụm gen T3SS2. Do
vậy, Vp-PAI liên quan đến phát sinh bệnh của V. parahaemolyticus gây ra ở người.
1.3. Mục tiêu và tính cấp thiết của đề tài
1.3.1. Mục tiêu
Phân lập và định danh loài V. parahaemolyticus ở các chợ thành phố Nha
Trang có mặt trong một số hải sản tươi sống (tôm, mực, cá, cua…).

Xác định gen độc tố của vi khuẩn gây bệnh bằng kỹ thuật PCR, tạo cơ sở
khoa học cho việc chẩn đoán và điều trị bệnh sớm.
1.3.2. Tính cấp thiết
Hiện nay hải sản đang là món ăn được nhiều người chú ý đến bởi thành phần
dinh dưỡng và khẩu vị của nó. Người ta cũng đã chế biến ra rất nhiều món hải sản
mới lạ như nướng, tái,… để kích thích nhu cầu đó. Đi đôi với việc tiêu thụ các món
này ngày càng nhiều thì các vụ ngộ độc thực phẩm ngày càng tăng. Tuyet và cộng
sự (2002) báo cáo đã có 548 ca nhiễm bệnh do V. parahaemolyticus gây ra được xác
định giữa 1/1995 đến 9/2001 ở Khánh Hòa. Tình hình ngộ độc thực phẩm do ăn hải
sản tươi sống không được chế biến kĩ đã được các phương tiện truyền thông đưa tin
nhiều, nhưng bản chất sinh học của nó vẫn chưa được quan tâm đầy đủ. Khi ngộ độc
xảy ra, bệnh nhân không được đưa đi cấp cứu kịp thời có thể dẫn tới tử vong. Các
nghiên cứu cơ bản trong nước còn rất ít, vì vậy, việc nghiên cứu về gen độc tố tạo
cơ sở cho việc xây dựng phương pháp chẩn đoán để kiểm soát bệnh và để sản xuất
ra thuốc điều trị kịp thời, tiện dụng là rất cần thiết.
Đề tài tiến hành nghiên cứu ở mức độ phân tử, là bước đầu tạo cơ sở khoa
học để nghiên cứu chẩn đoán và điều trị (sản xuất thuốc) đáp ứng nhu cầu về bệnh
học thực phẩm.


19
CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1. Mẫu
Mẫu hải sản (tôm bạc, tôm sú, cua biển, mực ống) được thu mua từ các chợ ở
Nha Trang: chợ biển (Bãi Dương), chợ Vĩnh Hải, chợ Vĩnh Thọ từ 15/03 đến
15/04.
Bảng 2.1. Các mẫu hải sản thu mua từ một số chợ ở thành phố Nha Trang
dùng để phân lập vi khuẩn Vibrio

STT
Ngày lấy mẫu
Địa điểm
Số lƣợng mẫu lấy
Tôm
Cua
Mực
1
15.03.2010
Vĩnh Hải
3

2
2
08.04.2010
Vĩnh Thọ
3
2

3
15.04.2010
Chợ biển
(Bãi Dương)

3
3
2.1.2. Thiết bị chuyên dụng
Máy ly tâm ( Eppendorf Centrifuge 5417R, Mỹ)
Máy PCR ( IQ
TM

5Biorad, Mỹ)
Tủ lạnh (NANO Silver, Việt Nam)
Thiết bị điện di (Biorad, Mỹ)
Kính hiển vi 3 mắt ngắm có camera và máy tính (Motic BA 300, Mỹ)
Máy định lượng protein bằng quang phổ hấp thụ phân tử (UV/VIS)
(Carry 100 Bio, Úc)
Máy lắc (GFL 3005, Đức)
Tủ cấy (Telstar AV 100, OSI Co, Ltd, Tây Ban Nha)
Tủ sấy (Binder, Đức)
Nồi khử trùng autoclave (Sturdy industrial Co, Ltd, Đài Loan)
Lò vi sóng phá mẫu (LG, Hàn Quốc)