nghiên cứu cải tiến quy trình gây miễn dịch ngựa để sản xuất huyết thanh thô kháng nọc rắn hổ đất

Đồ án tốt nghiệp Đại Học Nha Trang

SVTH: Phan Thanh Quang - 50SH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG



ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Đề tài : NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN QUY TRÌNH GÂY
MIỄN DỊCH NGỰA ĐỂ SẢN XUẤT HUYẾT THANH
THÔ KHÁNG NỌC RẮN HỔ ĐẤT.


Giảng viên hướng dẫn : Th.s LÊ NHÃ UYÊN.
Sinh viên thực hiện : PHAN THANH QUANG.
Lớp : 50CNSH
Khoá : 50

Nha Trang, tháng 7 năm 2012
Đồ án tốt nghiệp Đại Học Nha Trang

SVTH: Phan Thanh Quang - 50SH

i

LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực tập hoàn thành luận văn tốt nghiệp, em đã nhận được sự

giúp đỡ, hướng dẫn, động viên quý báu của nhiều đơn vị và cá nhân.
Trước tiên, em xin chân thành cảm ơn:
- Ban lãnh đạo Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi trường - Đại Học Nha
Trang đã giới thiệu em đến thực tập tại Viện Vắc Xin và Sinh Phẩm Y Tế.
- Em xin chân thành cảm ơn cô Lê Nhã Uyên đã rất tận tình hướng dẫn,giúp
đỡ, tạo mọi điều kiện để em hoàn thành bài luận văn tốt nghiệp của mình.
- Em cũng gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban lãnh đạo Viện Vắc Xin và
Sinh Phẩm Y Tế nói chung và Cơ sở Suối Dầu nói riêng đã sắp xếp và tạo điều kiện
cho em được thực tập tại Cơ Sở Suối Dầu của Viện Vắc Xin và Sinh Phẩm Y Tế.
Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn K.s Lê Bá Bút cùng toàn thể cô, chú,
anh,chị trong Tổ Chăn Nuôi I Suối Dầu, những người đã hết lòng giúp đỡ và hướng
dẫn tận tình trong thời gian em thực tập tại Viện.
Dù đã có nhiều cố gắng trong quá trình thực hiện, song chắc chắn rằng luận
văn này sẽ không thể tránh khỏi một vài thiếu sót. Em rất mong nhận được sự đóng
góp ý kiến của quý Thầy Cô.
Cuối cùng em xin gửi tới tất cả các thầy cô, các cô chú, anh chị những lời
chúc tốt đẹp nhất trong cuộc sống và trong công tác !


Nha Trang , ngày….tháng….năm
Sinh viên
Phan Thanh Quang
Đồ án tốt nghiệp Đại Học Nha Trang
SVTH: Phan Thanh Quang- 50SH ii
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN i
LỜI MỞ ĐẦU 1
Chương 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1
1.1. Những đặc điểm cơ bản về hình thái của rắn hổ đất . 1
1.1.1. Da rắn 1

1.1.2. Cấu tạo hàm rắn 2
1.1.3. Cấu tạo răng độc và nọc độc. 2
1.1.4. Các cơ quan cảm giác 3
1.2. Một số đặc điểm dịch tễ học ở Việt Nam. 4
1.2.1 Rắn độc ở Việt Nam. 4
1.2.2. Triệu chứng khi bị rắn cắn. 6
1.3. Bản chất sinh hóa và các tác động của nọc rắn lên cơ thể con người 7
1.3.1. Thành phần hóa học của nọc rắn 7
1.3.2. Tính độc của nọc rắn 7
1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới tính độc của nọc rắn 8
1.3.4. Tính độc của nọc rắn thay đổi theo mùa và vùng địa lí 10
1.3.5. Các tác động của nọc rắn lên cơ thể con người 10
1.4. Hệ thống miễn dịch của cơ thể 11
1.4.1. Khái niệm 11
1.4.2. Phân loại miễn dịch. 11
1.4.3. Huyết thanh. 12
1.4.4. Kháng thể. 15
Đồ án tốt nghiệp Đại Học Nha Trang
SVTH: Phan Thanh Quang- 50SH iii
1.4.5. Huyết thanh phòng và chữa bệnh. 16
1.4.6. Súc vật để gây miễn dịch. 17
1.5. Tá chất gây miễn dịch 17
1.5.1. Định nghĩa tá chất 17
1.5.2 Cơ chế hoạt động của tá chất. 17
1.5.3 Vai trò của tá chất 18
1.5.4. Tính an toàn của tá chất. 18
1.5.5. Tá chất Montanide ISA 50 V2 19
1.6.1. Lịch sử 22
1.6.2. Hiện trạng sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn hổ đất và điều trị nạn nhân bị
rắn cắn ở Việt Nam 23

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25
2.1. Vật liệu 25
2.1.1. Động vật thí nghiệm và các vật liệu khác 25
2.1.2. Máy móc, thiết bị và dụng cụ 26
2.1.3. Hóa chất. 27
2.2. Phương pháp 27
2.2.1. Sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn hổ đất thô theo phương pháp cũ 27
2.2.2 Sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn hổ đất thô đã cải tiến 30
2.2.3 Phương pháp xác định hiệu giá huyết thanh 33
2.2.4. Phương pháp lấy huyết tương. 37
2.2.5. Phương pháp xử lí số liệu. 38
Chương 3 : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 39
Đồ án tốt nghiệp Đại Học Nha Trang
SVTH: Phan Thanh Quang- 50SH iv
3.1. Kết quả hiệu giá huyết thanh của 2 lô ngựa miễn dịch. 39
3.2. Kết quả đáp ứng miễn dịch chu kỳ cao độ 41
3.3. Kết quả đáp ứng miễn dịch chu kỳ nhắc lại 2, 3, 4 43
3.4. So sánh hiệu giá hai lô ngựa qua các chu kỳ khai thác 46
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49
Kết luận 49
Kiến nghị 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

Đồ án tốt nghiệp Đại Học Nha Trang
SVTH: Phan Thanh Quang- 50SH v
DANH MỤC BẢNG
Bảng1.1: Danh sách các loài rắn độc ở Việt Nam . 5
Bảng 1.2: Tính chất của các chất dùng để lọc và hấp phụ nọc rắn 9
Bảng 1.3: Tính chất vật lý của MONTANIDE ISA 50V2 19
Bảng 1.4: Tính chất hoá học của MONTANIDE ISA 50V2 20

Bảng 1.5: Tính chất tạo nhũ dịch của Montanide ISA 50 V2 20
Bảng 2.1: Phác đồ gây miễn dịch dự phòng bệnh uốn ván 26
Bảng 2.2: Phác đồ gây miễn dịch cao độ cho lô A 29
Bảng 2.3: Phác đồ gây miễn dịch nhắc lại cho lô A. 30
Bảng 2.5: Phác đồ gây miễn dịch nhắc lại cho lô B 33
Bảng 2.6: Pha loãng nọc rắn dùng trung hòa huyết thanh 34
Bảng 3.1: Kết quả hiệu giá huyết thanh của lô A (hồi cứu) 40
Bảng 3.2: Kết quả hiệu giá huyết thanh của lô B ( thí nghiệm ) 40
Bảng 3.3: Kết quả đáp ứng miễn dịch chu kỳ cao độ 41
Bảng 3.4: Kết quả phân tích phương sai hàm lượng kháng thể ở giai đoạn miễn dịch
cao độ (chép nguyên gốc từ phần mềm thống kê Excell ) 42
Bảng 3.5: Kết quả đáp ứng miễn dịch nhắc lại chu kì 2, 3, 4 43
Bảng 3.6: Kết quả phân tích phương sai hàm lượng kháng thể ở giai đoạn miễn dịch
nhắc lại 2, 3, 4 (chép nguyên gốc từ phần mềm thống kê Excell ) 45
Bảng 3.7: Hiệu giá trung bình của 4 chu kì miễn dịch của 2 lô 46
Bảng 3.8: Hiệu giá trung bình của 4 chu kì miễn dịch của 2 lô ngựa A và B 48

Đồ án tốt nghiệp Đại Học Nha Trang
SVTH: Phan Thanh Quang- 50SH vi
DANH MỤC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ
Hình 1.1: Rắn hổ đất (Naja kaouthia) 1
Hình 1.2: Cấu tạo xương hàm của rắn 2
Hình 1.3: Móc độc và nọc độc của rắn 2
Hình 1.4: Cấu trúc kháng thể 15
Hình 1.5: Thành phần và các dạng nhũ dịch của tá chất Montanide ISA 50 V2 19
Bảng 2.4: Phác đồ gây miễn dịch cao độ cho lô B 32
Hình 3.1: Biểu đồ biểu diễn kết quả đáp ứng miễn dịch ở giai đoạn cao độ của 2 lô
A và B 42
Hình 3.2: Biểu đồ biểu diễn kết quả đáp ứng miễn dịch chu kỳ nhắc lại 2, 3, 4 của 2
lô A và B 45

Hình 3.3: Biểu đồ thể hiện hiệu giá trung bình của 4 chu kì miễn dịch của 2 lô ngựa
47

Đồ án tốt nghiệp Đại Học Nha Trang
SVTH: Phan Thanh Quang- 50SH vii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

APC Antigen presenting cells (Tế bào trình diện kháng nguyên)
Ck Chu kì
IgG Immunoglobulin G (Globulin miễn dịch loại G)
IgA Immunoglobulin A (Globulin miễn dịch loại A)
IgD Immunoglobulin D (Globulin miễn dịch loại D)
IgE Immunoglobulin E (Globulin miễn dịch loại E)
IgG Immunoglobulin G (Globulin miễn dịch loại G)
IgM Immunoglobulin M (Globulin miễn dịch loại M)
IVAC Viện Vacxin và sinh phẩm y tế
KN - KT Kháng nguyên – Kháng thể
KN - MHC Kháng nguyên – Phức hợp chủ yếu hòa hợp mô
KT Khai thác
LD
50
Liều gây chết 50%
Lf Limit of floculation (Đơn vị lên bông)
M Mũi tiêm
MD Miễn dịch
MDCĐ Miễn dịch cao độ
MHC Major histocompatibility complex (Phức hợp chủ yếu hòa hợp mô)
ml mili lit
NL Nhắc lại
O/W Oil in water (Nhũ dịch dầu trong nước)

PD50 Liều bảo vệ 50%
PBS Photphate buffered saline (Đệm muối photphate)
SAD Serum Anti Diphtheria (Huyết thanh kháng bạch hầu)
SAR Serum Anti Rabique (Huyết thanh kháng dại)
SAT Serum Anti Tetanus (Huyết thanh kháng uốn ván)
TB Tế bào
WHO World Health Organization (Tổ chức y tế thế giới)
W/O Water in oil (Nhũ dịch nước trong dầu)
W/O/W Water in oil in water (Nhũ dịch nước trong dầu trong nước)
Đồ án tốt nghiệp Đại Học Nha Trang
SVTH: Phan Thanh Quang- 50SH
LỜI MỞ ĐẦU
Từ bao đời nay, rắn độc và nạn nhân của rắn độc luôn là mối quan tâm của
nhiều người trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng. Hằng năm, trên thế giới
có hàng ngàn người chết vì bị rắn cắn. Thống kê sơ bộ cho thấy, mỗi năm Việt Nam
có khoảng 300.000 bệnh nhân bị rắn cắn nhập viện. Trong số những người được
cứu sống, có đến 13-14% phải cắt chi hoặc một phần chi.
Trước đây, ở Việt Nam người ta thường dùng các biện pháp điều trị Đông Y
không đặc hiệu kết quả lành bệnh rất hạn chế, tỉ lệ tử vong cao.
Phương pháp sử dụng huyết thanh để điều trị nạn nhân bị rắn độc cắn đã có
từ cuối thế kỷ XIX. Đây được xem là phương pháp điều trị có hiệu quả và phổ biến
nhất, tính đặc hiệu trong kháng nọc của nó giúp giảm tỷ lệ tử vong khoảng 7 - 10
lần, và trở thành thường qui của các nước tiên tiến dùng trong công tác điều trị, và
cấp cứu nạn nhân do rắn độc cắn.
Ở Việt Nam, sau 8 năm nghiên cứu, vào đầu tháng 4/2004 Viện Vắc-Xin
Nha Trang được sự cho phép của Bộ Y Tế đã sản xuất đại trà hai loại huyết thanh
kháng nọc rắn hổ đất và rắn lục tre.
Tuy nhiên, huyết thanh kháng nọc rắn hổ đất sản xuất được vẫn chưa tối ưu
về chất lượng. Vì vậy, Viện Vắc Xin hiện nay đã và đang nghiên cứu áp dụng quy
trình miễn dịch mới để cải tiến phương pháp sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn hổ

đất nâng cao chất lượng và số lượng đồng thời giảm giá thành. Vì vậy chúng tôi
thực hiện đề tài : Nghiên cứu cải tiến quy trình gây miễn dịch ngựa để sản xuất
huyết thanh thô kháng nọc rắn hổ đất.
Mục tiêu nghiên cứu:
 Hoàn thiện, cải tiến quy trình miễn dịch ngựa sản xuất huyết thanh thô kháng
nọc rắn hổ đất để sản xuất huyết thanh tinh chế có chất lượng và hiệu quả tốt nhất.
 Đề xuất phác đồ tiêm miễn dịch cho ngựa sản xuất huyết thanh thô có đáp ứng
miễn dịch cao.
Đồ án tốt nghiệp Đại Học Nha Trang
SVTH: Phan Thanh Quang Trang 1
Chương 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Việt Nam là nước nhiệt đới gió mùa, khí hậu nóng ẩm quanh năm. Có hơn
3.200 km bờ biển và 2/3 diện tích đất đai là rừng núi, sình lầy. Do đó, động vật nói
chung và rắn nói riêng rất dễ phát triển. Rắn có thể sống ở khắp nơi từ vùng cao,
vùng đồng bằng đến các hải đảo xa xôi, rắn sống trên cây, trên mặt đất, trong hang
hốc…rắn sống ở sông suối, ao, hồ và cả biển nữa.
Một trong những loài rắn độc nguy hiểm thường cắn người ở nước ta là loài
rắn hổ đất (Naja kaouthia). Vì vậy, cần phải có biện pháp phòng ngừa và chữa trị
hiệu quả.
1.1. Những đặc điểm cơ bản về hình thái của rắn hổ đất [4].

Hình 1.1: Rắn hổ đất (Naja kaouthia).
Rắn hổ đất có tên khoa học là Naja kaouthia.
Rắn hổ đất là rắn độc cạn, thân màu đen, nâu đen, nâu vàng, gáy chúng có
vòng tròn sáng màu và có tâm đen.
1.1 .1. Da rắn.
Rắn có “bộ áo” được kết bằng vẩy, xếp kề bên nhau hoặc tỳ lên nhau như
ngói lợp. Những lớp vẩy này do lớp da bên ngoài ngấm chất sừng dày lên mà thành.
Đồ án tốt nghiệp Đại Học Nha Trang
SVTH: Phan Thanh Quang Trang 2

Lớp da mỏng ở dưới có tính đàn hồi làm cho thân rắn cử động rất linh hoạt. Số vẩy
và vị trí của các vẩy ở đầu và ở thân của rắn không thay đổi trong quá trình lớn lên.
1.1.2. Cấu tạo hàm rắn.

Hình 1.2: Cấu tạo xương hàm của rắn.
Cấu tạo cung xương hàm của rắn rất đặc biệt. Các cấu xương cấu tạo thành
bộ hàm rắn đều khớp động với nhau bằng những dây chằng đàn hồi. Đặc biệt,
xương vuông của rắn dài nên nó có tác dụng như chiếc đòn bẩy cho hàm dưới há
rộng ra dễ dàng. Các xương hàm dưới của rắn lại không gắn với nhau mà chỉ nối
với nhau bằng dây chằng. Nó có thể bửa ra hết cỡ theo chiều ngang để tạo ra một
khoảng miệng rộng. Nhờ có cấu tạo đặc biệt này mà rắn có thể nuốt được con mồi
to gấp nhiều lần miệng rắn.
1.1.3. Cấu tạo răng độc và nọc độc.

Hình 1.3: Móc độc và nọc độc của rắn
Đồ án tốt nghiệp Đại Học Nha Trang
SVTH: Phan Thanh Quang Trang 3
Nọc độc của rắn chứa trong hai tuyến độc nằm dưới da, sau mắt và do tuyến
nước bọt (tuyến thái dương) biến đổi thành. Tuyến này có ống dẫn thẳng đến răng
độc nằm ở phía trước hàm hoặc sau hàm của rắn. Các răng độc hình ống hoặc sẻ
rãnh. Khi cắn con mồi, các cơ thái dương co lại ép tuyến độc tiết ra nọc độc; nọc
chảy vào ống dẫn rồi vào răng độc và bơm thẳng vào con mồi.
Trong lợi của nhóm rắn độc có một số răng độc dự trữ. Nếu rắn bị gãy răng
độc chính thí răng độc dự trữ sẽ phát triển thành răng độc mới, thay thế răng độc
chính một cách nhanh chóng.
Khi rắn cắn, nọc qua răng độc được chích sâu dưới da con mồi, vào cơ và lập
tức được dẫn vào máu, tác động tới hệ thần kinh. Trong nọc rắn có hơn 20 thành
phần khác nhau, chủ yếu là protein chứa các men và độc tố polypetid. Thành phần
nọc gây nên hậu quả lâm sàng:
- Độc tố tế bào và hoại tử (men thủy phân proteolytic enzim và

phospholypase A2) làm tăng tính thấm của màng tế bào, gây nên sưng nề cục bộ
dẫn tới phá hủy màng tế bào và mô.
- Độc tố tiền synapse và hậu synapse thần kinh: Đó là phootspholylpase A2
làm tổn thương tận cùng thần kinh nơi dẫn chuyền acetylcholin vừa được giải
phóng và can thiệp vào quá trình này. Đó là polypepid tranh chấp thụ thể
acetylcholin tại khớp thần kinh cơ, dẫn tới liệt cơ.
Số lượng nọc vào người hoặc con mồi khi bị cắn phụ thuộc vào kích thước
của rắn và ảnh hưởng cơ học của vết cắn khi có 1 hoặc 2 răng độc xâm nhập qua da
hoặc bị cắn nhiều lần vào một lúc. Rắn không vắt kiệt nọc độc dự trữ, nên các lần
cắn tiếp theo vẫn nguy hiểm.
1.1.4. Các cơ quan cảm giác
Mắt rắn có hai mi trong suốt, khép kín và dính liền với nhau như cặp kính
trắng. Rắn hổ mang là rắn hoạt động về đêm và hoàng hôn nên mắt rắn có con
Đồ án tốt nghiệp Đại Học Nha Trang
SVTH: Phan Thanh Quang Trang 4
ngươi dọc. Để bù lại khả năng nhìn chưa hoàn thiện của mắt rắn và khả năng khứu
giác kém của mũi, rắn có lưỡi để phục vụ cho các chức năng ngửi, nếm, sờ.
Rắn có thính giác rất kém. Những bộ phận tai ngoài như vành tai, lỗ tai,
màng nhĩ của rắn đã hoàn toàn tiêu biến.
Để bù lại, rắn có thể nhận được tiếng động truyền qua đất. Những tiếng động
truyền qua mình rắn, đi tới hộp sọ rồi tác động vào tai trong của rắn, khiến rắn có
thể phát hiện những động tác nhỏ.
1.2. Một số đặc điểm dịch tễ học ở Việt Nam.
1.2.1 Rắn độc ở Việt Nam.
Theo Trần Kiên và Nguyễn Quốc Thắng [1] , nước ta có 18 loài rắn độc sống
trên cạn và 13 loài sống ở biển, tổng số có 31 loài rắn độc. Nguyễn Lê Trang-
Nguyễn Thị Nguyệt Thu và cộng sự danh sách các loài rắn độc ở Việt Nam và sự
phân bố các loài rắn độc nguy hiểm theo từng vùng như bảng sau:

Đồ án tốt nghiệp Đại Học Nha Trang
SVTH: Phan Thanh Quang Trang 5
Bảng1.1: Danh sách các loài rắn độc ở Việt Nam [1].
Dòng
Family
Họ
Subfamily
Tông
Tribe
Giống
Genus
Loài
Species
Tên việt
1. Colubridae Natricinae “ Rhabdophis R. callichroma Có ở Ba Vì
“ “ “ “ R. Nuchalis
“ “ “ “ R. subminiatus
“ “ “ “ R.tigrinus
5. Elapidae Bungarinae Bungarini Bungarus B.candidus Cạp nia, mai gầm bạc
“ “ “ “ B.fasciatus Cạp nong, mai gầm

“
Najini Naja N.kaouthia Hổ mang đất
“ “ “ “ N.atra Hổ mang bành
“ “ “ Ophiophagus O.hannah
Hymadryas hannah
Hổ mang chúa
10. “ Elapinae Elapini Calliophis C maclellandi
maclellandi
Hoa cân, xe điếu
“ “ “ “ C.maculiceps atro
frontalis
Vú nàng
Hydrophiidae Hydrophiinae Aipysurini Aipisurs A.etdouxi Đẹn đuôi gai
“ “ Hydrophiini Enhydrina E.schistosa Đẹn mỏ
“ “ “ Hydrophis H.brooki Đẹn khoang cổ mảnh
15. “ “ “ “ H.cyanocinctus Đẹn khoang
“ “ “ “ H.fasciatus fasciatus Đẹn cạp nong kim
“ “ “ “ H.fasciatus atriceps Đẹn cạp nong đầu nhỏ
“ “ “ “ H.gracilis Đẹn đầu nhỏ
“ “ “ “ H.ornaus ornatus Đẹn vết
20. “ “ “ Kerilia K.jerdoni siamensis Đẹn mõm nhọn
“ “ “ Kolpophis K.annadalei Đẹn đầu vẩy phân
“ “ “ Lapemis L.hardwick Đẹn cơm
“ “ “ Pelamis P.platurus Đẹn sọc dưa, đẹn mỏ dài
“ “ “ Thalassophis T.viperinus Đẹn lục
25.Viperidae Crotalinae Crotalini Agkistrodon A.acutus Rắn lục mũi hếch
“ “ “ Calloselasma A.rhodostoma Rắn chàm quạp, lục mã
Lai
“ “ “ Trimeresurus T.albolabris Rắn lục tre
“ “ “ “ T.cornutus Rắn lục sừng

“ “ “ “ T.jerdoni bourreti Rắn lục hoa cải
30. “ “ “ “ T.monticola
meridionalis
Rắn lục núi
“ “ “ “ T.mucrosquamatus Rắn khô mộc
“ “ “ “ T.tonkinensis*
Đồ án tốt nghiệp Đại Học Nha Trang
SVTH: Phan Thanh Quang Trang 6
1.2.2. Triệu chứng khi bị rắn cắn.
Những loài rắn khác nhau khi cắn gây ra các triệu chứng khác nhau. Người
ta dựa vào các triệu chứng này mà tìm cách chữa trị cho phù hợp.
- Khởi đầu thường là rối loạn cảm giác: tê lưỡi, đau họng, khó nuốt (do tổn
thương các dây thần kinh của vùng hầu họng).
- Tiếp theo, bệnh nhân sẽ khó mở mắt (do liệt cơ nâng mi), khó há miệng,
nhìn mờ (do giãn đồng tử).
- Giai đoạn toàn phát, bệnh nhân sẽ dần dần liệt toàn bộ các cơ, đặc biệt nguy
hiểm là liệt cơ hô hấp, đồng tử giãn to. Bệnh nhân thường vẫn tỉnh, trừ trường hợp
tổn thương thần kinh do nhiễm độc quá nặng.
- Một số trường hợp có thể có loạn nhịp tim nặng dẫn tới tử vong.
- Tổn thương tại chỗ cắn:
+ Rắn cạp nia ( thân có khoang đen trắng ), cạp nong ( thân có khoang
đen vàng) thường không có tổn thương gì, nhiều khi rất khó nhìn thấy, nếu không
bị chích rạch.
+ Rắn hổ mang: hoại tử, phù nề lan rộng quanh vùng rắn cắn, có thể phù
nề toàn bộ chi bị cắn.
- Sẽ có rất nhiều biến chứng có thể xuất hiện trong thời gian này: nhiễm
trùng, loét, sốt cao
- Nguyên nhân tử vong chủ yếu của rắn hổ cắn là suy hô hấp do liệt các cơ
hô hấp, và tổn thương các trung tâm sống còn của thân não do tổn thương thần kinh.

Đồ án tốt nghiệp Đại Học Nha Trang
SVTH: Phan Thanh Quang Trang 7
1.3. Bản chất sinh hóa và các tác động của nọc rắn lên cơ thể con người.
Nọc rắn là một chất lỏng, nhờn, không màu hay vàng nhạt, rất dễ tan trong
nước, tỷ trọng từ 1,03 đến 1,05; chứa từ 50% - 70% nước. Nọc lấy từ rắn ra sau 24
giờ thì sẽ biến chất có mùi hôi. Làm khô nọc rắn ở điều kiện lạnh thì nọc rắn kết
tinh dưới dạng tinh thể, màu vàng nhạt, không mùi. Calmette (1902) đã lưu trữ
được nhiều mẫu rắn độc dạng tinh thể, đựng trong các lọ thủy tinh màu, hàn kín và
giữ ở nhiệt độ 4-8
0
C tránh không khí ẩm sau 15 năm mà hoạt tính của nọc rắn độc
vẫn không hề thay đổi.
1.3.1. Thành phần hóa học của nọc rắn .
Các nguyên tố hóa học chính của nọc rắn gồm có C, H, O, N, P, S và một
lượng nhỏ Zn. Bản chất hóa học là một protid – lipid, sắc tố và muối mà ta có thể
phân tích từ nọc của rắn do kết tủa, ly giải, siêu lọc hay điện di.
Theo S.N.Gauguly và M.T.Malkana (1936) [1] nọc rắn hổ mang có 88,12%
protein trong đó có 36,69% albumin, 20,31% globulin và 28,12% proteose.
Nọc rắn độc có chứa
 Enzyme: proteinase transaminase hialuronidase, cholinesterase, L-
minoacitoxydase, phospholipase A,B,C,D; ATP-ase, ribonuclease,
desoxyribonuclease, phosphomonoesterse, phosphodiesterase, 5-nucleotidase,
DNA-ase endonuclase.
 Các độc tố : độc tố cơ (myotoxins), độc tố gây chảy máu (haemorrhagic
toxin), độc tố thần kinh (neuron toxin), độc tố tim (cardiotoxins).
1.3.2. Tính độc của nọc rắn.
a. Tính độc của nọc rắn trên người.

P.Boquet (1948) cho biết những trường hợp người bị rắn độc cắn đau nhức
dữ dội ở chỗ bị cắn, sau đó nọc độc được lan truyền khắp chân hay tay nơi bị cắn.
Da nạn nhân nổi mẫn đỏ lấm tấm hay đỏ bầm nơi chỗ có dấu răng. Lớp biểu bì của
Đồ án tốt nghiệp Đại Học Nha Trang
SVTH: Phan Thanh Quang Trang 8
da sẽ bị khô rồi hoại tử, các mô liên kết xuất huyết. Đồng thời nọc độc được lan
truyền khắp toàn thân, tác động lên các trung khu thần kinh làm hạ thân nhiệt, nôn
mửa, hạ huyết áp, sock, hôn mê sâu rồi tử vong.
A.Calmette[1] mô tả nạn nhân bị rắn hổ mang cắn : không đau nhức lắm, vết
thương lộ rõ nơi bị cắn rồi nọc độc lan truyền nhanh khắp toàn thân, làm trụy tim
mạch, gây khó thở, đi đứng khó khăn, mệt mỏi, thở dồn dập rồi tử vong.
b. Tính độc của nọc rắn độc trên động vật thí nghiệm.
Súc vật nhạy cảm nhất đó là chó, tiếp đến là thỏ, chuột lang, chuột trắng và
bồ câu. Tiêm nọc rắn độc dưới da hay trong da các loài động vật này thì gây nên
hiện tượng hoại tử, nếu đưa nọc rắn vào ổ bụng hay tĩnh mạch, não hay tủy sống thì
ta sẽ thấy xuất huyết đông máu hay hiện tượng co giật thần kinh. A.Calmette đã
quan sát và nhận xét rằng : nếu trộn nọc rắn độc vào thức ăn cho chuột lang với số
lượng thích hợp thí phát hiện có xuất huyết ở bộ phận tiêu hóa.
P.Boquet (1948) [1]đã định nghĩa : liều chết hoàn toàn là liều nhỏ nhất của
rắn độc ở dạng khô có khả năng giết chết động vật thí nghiệm trong điều kiện được
xác định. Theo Slotta và Szyska[1], liều chết hoàn toàn là liều nhỏ nhất của nọc rắn
độc có khả năng giết chết chuột sau 22 giờ qua đường tiêm dưới da.
1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới tính độc của nọc rắn.
a. Nhiệt độ:
Theo Phisalix và Bertrand [1]nọc rắn tươi là một chất nhờn màu vàng, trong.
Đun nóng 60
o
C trong 30 phút thì nọc rắn trở nên đục, ở 80
o
C thì giảm tính độc, ở

100
0
C trong vài giây thì mất tính độc hoàn toàn.
Tính làm đông máu cũng mất ở 80
0
C. Đặc biệt nọc rắn Naja tripudan chỉ
giảm độc lực ở 100
0
C và mất tính độc ở 120
0
C, trái lại nọc rắn hổ mang chịu được ở
100
0
C với pH=5,9 và chỉ phân hủy ở 120
o
C với pH=7,0, cuối cùng nọc rắn hổ mang
không hề bị giảm độc lực sau 9 ngày ở -191
0
C (A.Luminere và J.Nicolas). Dung
Đồ án tốt nghiệp Đại Học Nha Trang
SVTH: Phan Thanh Quang Trang 9
dịch 1% trong nước muối sinh lí, tồn trữ ở 4
0
C, nọc rắn vẫn giữ được tính độc trong
nhiều tuần.
b. Bức xạ:
Dưới tác dụng của ánh nắng mặt trời thì dung dịch nọc rắn giảm dần tính
độc. Nếu thêm vào một ít eosin hay erthyrosens thì sẽ gia tăng thêm sự phân hủy và
làm giảm độc lực nhanh hơn.
c. Lọc và chất hấp phụ.

Bảng 1.2: Tính chất của các chất dùng để lọc và hấp phụ nọc rắn.
Hoạt chất hấp phụ Tính chất
Than hoạt tính, tinh dầu, Hydrat
albumin
- Nọc rắn được hấp phụ nhanh chóng
Acid phenic - Không làm tủa vói nọc rắn
NaOH, KOH - không làm bất hoạt nhanh nọc rắn
NH
4
(SO4)
2
, Na
2
SO
4

-
Làm tủa một phần hoạt tính của nọc rắn
Acid trichloacetic, piric, tanic, chì
acetat, bichlorua, thủy ngân hay chlorua
vàng
- Làm tủa với thành phần của nọc rắn
Formol , các chất oxy hóa khác
- Kết dính các acid amin làm giảm độc
lực của nọc rắn
Các dung môi hữu cơ : aceton,
chloroform …
- Làm mất phần lớn các yếu tố độc của
nọc rắn

Đồ án tốt nghiệp Đại Học Nha Trang
SVTH: Phan Thanh Quang Trang 10
1.3.4. Tính độc của nọc rắn thay đổi theo mùa và vùng địa lí.
Nhiều ý kiến giống nhau cho rằng độc lực của nọc rắn thay đổi theo tuổi tác,
theo loài và theo nơi cư trú của nó.
Từ thế kỷ trước Ambroise Paré[1] đã viết : nơi cư trú và tuổi tác của rắn độc
có ảnh hưởng tới tính độc của loài rắn ấy, rắn độc sinh sống ở những nơi có rừng núi khô
khan thì tính độc cao hơn rắn sống ở nơi gia lạnh và sình lầy. Vết cắn của rắn độc vào
mùa hè thì độc hơn vào mùa đông và rắn độc trẻ cắn ít độc hơn rắn độc già.
1.3.5. Các tác động của nọc rắn lên cơ thể con người.
a. Tác động phân hủy tế bào
Các enzym gọi chung là các thành phần phân hủy protein của nọc rắn
(protease) làm phân cắt các phân tử chondronintin sulfat A và C, thủy phân
hyaluronic acid của màng tế bào, nhờ vậy nọc độc được lan rộng nhanh chóng vào
các tế bào lân cận ở vùng bị cắn của nạn nhân và gây nên phù nề xuất huyết, hoại
tử.
b. Tác động lên cơ
Độc tố nọc rắn làm tổn thương màng tế bào, hoại tử mô,độc cơ tim, độc thần
kinh, ức chế đông máu làm tan hống cầu, làm vỡ màng bào tương của tế bào cơ,các
sợi tơ huyết bó lại thành khối và phân hủy.
c. Tác động gây chảy máu:
Nọc rắn thuộc họ Elapidae có chứa nhiều độc tố thần kinh, dựa vào chiều dài
của các chuỗi polypeptic, người ta phân biệt:
 Độc tố thần kinh chuỗi ngắn có từ 60 - 62 acid amin liên kết với nhau
bởi 4 cầu disulfua.
 Độc tố thần kinh chuỗi dài có từ 66 - 74 acid amin liên kết với nhau bởi 5
cầu disulfua.

Đồ án tốt nghiệp Đại Học Nha Trang
SVTH: Phan Thanh Quang Trang 11
Các độc tính loại này có đặc tính gắn chọn lọc lên những phần tiếp nhận
(post synapse) của tế bào thần kinh hay chính xác hơn là phần tiếp thu nicotinic và
ngăn cản sự lan truyền kích thích thần kinh đến các cơ, do đó làm tê liệt cơ. Tác
động này có thể so sánh như chất curare. Đó là những đặc tính của nọc rắn thuộc họ
Elapidae và Hydrophiidae.
d. Tác động lên hệ thống tim mạch:
Loại độc tố tim (cardiotoxin) là những chuỗi polypeptic có 60-62 acid amin
như độc tố thần kinh chuỗi ngắn, tác động trực tiếp lên tế bào cơ tim và gây nên sự
co cơ kéo dài làm cho cơ tim mất hết khả năng đáp ứng sự kích thích do những
nguyên nhân tác động từ bên ngoài. Trụy tim kéo dài đưa đến hậu quả tác động lên
áp huyết, thành mạch.
1.4. Hệ thống miễn dịch của cơ thể[9].
1.4.1. Khái niệm.
Miễn dịch (hay miễn nhiễm) là tập hợp tất cả các cơ chế sinh học giúp cho
một cơ thể đa bào giữ được sự liên kết giữa các tế bào và các mô, đảm bảo sự toàn
vẹn của cơ thể bằng cách loại bỏ những thành phần bị hư hỏng cũng như các chất và
sinh vật xâm hại.
1.4.2. Phân loại miễn dịch.
Có nhiều cách phân loại khác nhau:
 Liên quan đến quá trình sống.
 Liên quan đến tính đặc hiệu.
 Liên quan đến nơi tạo kháng thể.
 Liên quan đến tính cá thể.
Ở đây ta xét cách phân loại theo nơi tạo kháng thể :

Đồ án tốt nghiệp Đại Học Nha Trang
SVTH: Phan Thanh Quang Trang 12

Huyết thanh kháng nọc rắn độc được sản xuất dựa trên cơ chế của miễn dịch
thụ động nhân tạo.
1.4.3. Huyết thanh.
Sử dụng huyết thanh là phương pháp tạo miễn dịch thụ động rất có hiệu quả.
Có thể điều chế huyết thanh kháng nọc rắn độc từ máu ngựa được gây miễn dịch
với kháng nguyên. Ngoài ra, miễn dịch thụ động còn được tạo ra bởi γ-globulin lấy
từ máu nhau thai. γ-Globulin được tinh chế có ưu điểm đáng kể là giảm hẳn các
phản ứng phụ cho người tiêm, đặc biệt có nồng độ kháng thể cao điều trị rất hữu
hiệu.
a. Tính chất lý hoá của huyết thanh.
Máu là dịch lỏng, nhớt, màu đỏ. Máu toàn phần gồm hai phần:
- Tế bào máu bao gồm các tế bào máu: hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu.
- Huyết tương gồm huyết thanh (serum), các yếu tố đông máu hòa tan trong
đó (protein tạo sợi tơ huyết fibrinogen khi đông máu).
Khi máu để đông tự nhiên thì các tế bào máu và các yếu tố đông máu bị đông
lại. Phần còn lại tách ra khỏi cục máu là chất dịch màu vàng rơm gọi là huyết thanh.
Máu có độ nhớt cao hơn nước:

nước
= 1, :

máu
= 5; :


huyết tương
= 1,7 - 2 ,2. Độ
nhớt của huyết tương thay đổi trong các trường hơp sinh lý và bệnh lý.
MIỄN DỊCH
Mắc phải
Chủ động Thụ động
Tự nhiên Nhân tạo
Tự nhiên
Tự nhiên Nhân tạo
Đồ án tốt nghiệp Đại Học Nha Trang
SVTH: Phan Thanh Quang Trang 13
Độ pH của huyết thanh phụ thuộc chủ yếu vào nồng độ H
+
, OH
–
và có ý
nghĩa rất quan trọng. Khi pH của huyết thanh không phải là hằng số thì pH của máu
cũng thay đổi, do đó các phản ứng trong cơ thể không xảy ra. Bởi vậy pH của huyết
thanh luôn ở khoảng giá trị 7,2 - 7,5.
b. Thành phần hoá học của huyết thanh.
Huyết thanh chiếm tỉ lệ 55 - 60% tổng lượng máu, là dịch trong suốt màu
vàng nhạt. Trong huyết thanh nước chiếm 90 - 91%, chất khô chiếm 9 - 10% gồm
protein, đường, lipit, muối khoáng.
Trong huyết thanh thành phần khí có O
2
và CO
2
. Cứ 100 ml máu động mạch
chứa khoảng 18 - 20 ml O
2

và CO
2
ở dạng hoà tan kết hợp với hemoglobin của
hồng cầu. Khoảng 45 - 50 ml CO
2
có trong huyết tương và hồng cầu.
Các chất vô cơ chính trong huyết thanh gồm cation như Na
+
, K
+
, Ca
2+
, Mg
2+
,
và các anion Cl
–
, HCO
3
–
, SO
4
2–
, PO
4
3–
… Ngoài ra huyết thanh còn chứa các yếu tố
như I, Cu, Fe, Zn…, chúng tồn tại ở dạng ion hoặc kết hợp với protein. Các thành
phần hữu cơ trong máu rất phức tạp, gồm:
 Protein:

Là thành phần hữu cơ quan trọng nhất của huyết thanh động vật. Có nhiều
loại protein huyết thanh, khoảng 100 - 150 loại khác nhau tuỳ theo cấu tạo và nhiệm
vụ của nó: albumin, globulin, fibrinogen, các enzyme… Số lượng và tính chất của
các protein thay đổi tuỳ theo loài.
Bằng phương pháp điện di trên giấy người ta phân tích được protein huyết
thanh gồm 5 thành phần: phần chạy nhanh nhất là albumin,

1
-globulin,

2
-
globulin, chậm nhất là

-globulin.
- Albumin:
Albumin thuộc protein thuần, hoà tan trong nước, bị đông vón bởi nhiệt, bị
kết tủa bởi dung dịch muối bão hoà. Trong các protein của huyết thanh albumin
chiếm một lượng lớn tới 56,6%, vì vậy nó đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì
Đồ án tốt nghiệp Đại Học Nha Trang
SVTH: Phan Thanh Quang Trang 14
áp suất thẩm thấu của huyết tương, ảnh hưởng đến điều hoà nước trong cơ thể, tham
gia vận chuyển các chất không tan trong máu như billirubin tự do, axit béo, …
- Globulin:
Là một protein huyết thanh quan trọng thứ hai, nó thuộc protein thuần.
Globulin hoà tan trong dung dịch muối loãng, không tan trong nước tinh khiết hoặc
trong các dung dịch có nồng độ vừa phải, bị đông vón bởi nhiệt. Có nhiều loại
globulin:
+


1
-,

2
-globulin chiếm khoảng 13% tổng số protein huyết thanh.

1
-
globulin tham gia cấu tạo glucoprotein, lipoprotein,

2
-globulin

có ceruloplasmin
(protein vận chuyển đồng).
+

-globulin chiếm khoảng 11,7% trong đó có siderophilin (protein chứa sắt).
+

-globulin chiếm khoảng 18,6% protein huyết thanh, bao gồm những
kháng thể.
Những protein miễn dịch là giá đỡ của kháng thể, giữ vai trò quan trọng
trong việc chống lại sự nhiễm trùng của cơ thể. Globulin tăng trong các trường hợp
nhiễm trùng, các quá trình viêm cấp.
 Các enzym:
Có rất nhiều enzym trong huyết thanh như amylase, phosphatase,
transaminase…
 Những chất có nitơ phi protein:
Là những sản phẩm thoái hoá của protein, trong đó đa số là những sản phẩm

thoái hoá cuối cùng được cơ thể đào thải ra ngoài như ure, axit uric, billirubin…
Ngoài ra huyết thanh còn có những sản phẩm thoái hoá trung gian của protein như
polypeptit và các axit amin tự do.


Đồ án tốt nghiệp Đại Học Nha Trang
SVTH: Phan Thanh Quang Trang 15
 Glucose:
Glucose máu dao động trong khoảng cố định. Chỉ số này tăng giảm trong các
trường hợp bệnh lý.
 Lipid:
Lipid trong huyết thanh bao gồm triglycerit, phospholipit, steroit,
cholesterol.
1.4.4. Kháng thể.

Hình 1.4: Cấu trúc kháng thể.
Kháng thể hay là globulin miễn dịch là các protein có trong huyết thanh hoặc
dịch sinh học của cơ thể (nước tiểu, sữa…) có khả năng liên kết đặc hiệu với kháng
nguyên đã kích thích sinh ra chúng.
Kháng thể chính là protein thường được phát hiện ở phần

-globulin của
huyết thanh, dịch bạch huyết và các dịch khác của cơ thể. Về cấu trúc và hoá tính
đó là những

-globulin điển hình, vì vậy không thể phân biệt được chúng với các

-globulin “bình thường” bằng phương pháp hoá học. Chỉ có thể phát hiện kháng
thể bằng “thuốc thử” đặc hiệu là kháng nguyên tương ứng. Kháng thể được phát
Đồ án tốt nghiệp Đại Học Nha Trang

SVTH: Phan Thanh Quang Trang 16
hiện từ những năm đầu của lịch sử miễn dịch. Sự kết hợp đặc biệt giữa kháng
nguyên và kháng thể, với khả năng sản xuất được kháng thể đặc hiệu đã làm cho
kháng thể được dùng rộng rãi vào mục đích chẩn đoán và điều trị.
Các kháng thể còn được gọi là globulin miễn dịch (Ig). Có nhiều lớp globulin
miễn dịch khác nhau nhưng tất cả các lớp đều có đặc điểm cấu trúc giống nhau.
- Phân tử Ig có hai chuỗi polypeptit nặng (H) và hai chuỗi polypeptit nhẹ (L).
- Các chuỗi H và L bao giờ cũng từng đôi và giống nhau hoàn toàn trong
mỗi phân tử Ig.
- Tất cả các chuỗi Ig đều có chuỗi L thuộc type kappa (k) hoặc lamda (λ)
còn chuỗi H của các lớp Ig thì khác nhau. Các lớp Ig ở người bao gồm IgG (γ), IgA
α), IgD (), IgE (ε)và IgM (µ).
1.4.5. Huyết thanh phòng và chữa bệnh.
Huyết thanh chữa bệnh là huyết thanh của động vật đã được gây miễn dịch
bằng những phương pháp khác nhau hay là huyết thanh của người mới lành bệnh.
Các huyết thanh này chứa rất nhiều kháng thể và gây được miễn dịch thụ động cho
người dùng sau vài giờ nhưng thời gian được miễn dịch rất ngắn.
Huyết thanh động vật: được chế từ máu động vật (thường là ngựa hoặc bò,
cừu đã được miễn dịch với những bệnh nhiễm trùng khác nhau) đem loại bỏ các
protein không đặc hiệu, còn kháng thể giữ ở nồng độ cao. Tuỳ theo tác nhân gây
miễn dịch, người ta phân biệt:
- Huyết thanh kháng độc tố: huyết thanh động vật đã được tiêm độc tố vi
khuẩn như huyết thanh chống bạch hầu (SAD), chống uốn ván (SAT).
- Huyết thanh kháng virus: huyết thanh động vật đã được miễn dịch đối với
virus dại dùng để chống bệnh dại (SAR), huyết thanh kháng virut viêm gan B…
- Huyết thanh kháng nọc độc: huyết thanh của động vật đã được tiêm nọc
độc đã làm giảm độc của những loài có nọc độc, chẳng hạn như nọc rắn (SAV).
- Huyết thanh của người mới lành bệnh: hiện nay ít dùng.