NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN QUY TRÌNH ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO TRỨNG BÒ NHẰM NÂNG CAO HIỆU QUẢ TẠO PHÔI TRONG ỐNG NGHIỆM

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
  


NGUYỄN THỊ THƯƠNG HUYỀN


NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN QUY TRÌNH ĐÔNG LẠNH
TẾ BÀO TRỨNG BÒ NHẰM NÂNG CAO HIỆU QUẢ
TẠO PHÔI TRONG ỐNG NGHIỆM
Chuyên ngành: Sinh lý học Người và Động vật
Mã số chuyên ngành: 62 42 30 01


TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC




Thành phố Hồ Chí Minh – 2014

Công trình này được hoàn thành tại: Phòng thí nghiệm Tế bào gốc, Trường Đại học khoa
học Tự Nhiên TP. HCM.


Người hướng dẫn khoa học: TS. Hoàng Nghĩa Sơn
TS. Nguyễn Quốc Đạt

Phản biện 1: PGS.TS. Bùi Hồng Thủy
Phản biện 2: PGS.TS. Lê Xuân Cương
Phản biện 3: TS. Lê Văn Ty
Phản biện độc lập 1: PGS.TS. Mai Văn Sánh
Phản biện độc lập 2: TS. Nguyễn Văn Hạnh



Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án họp tại
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
vào lúc giờ ngày tháng năm






Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
- Thư viện Khoa học Tổng hợp Tp.HCM
- Thư viện Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên





- 1 -
PHẦN MỞ ĐẦU

1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiệu quả thụ tinh trong ống nghiệm (In Vitro Fertilization - IVF) từ nguồn tế
bào trứng (TBT) động vật có vú nói chung và TBT nói riêng cho kết quả còn rất
thấp hơn so với TBT tươi. Vì vậy, việc cải tiến quy trình đông lạnh và giải đông
nhằm nâng cao hiệu quả IVF từ TBT bò đông lạnh là một yêu cầu cấp thiết hiện nay.
Nghiên cứu IVF từ TBT bò đông lạnh ở Việt Nam mới chỉ có một số ít tác giả
thực hiện gần đây, tỉ lệ thụ tinh khá thấp (11,67%, 3,72% phát triển lên phôi nang),
tỉ lệ TBT sống sau đông lạnh mới đạt 14% và tỉ lệ tạo phôi dâu, phôi nang từ TBT
đông lạnh chỉ đạt 2,5%. Những công trình nghiên cứu theo hướng này ở nước ta còn
rất ít, cũng như tỉ lệ thành công còn thấp hơn nhiều so với các nghiên cứu trên thế
giới. Để nâng cao tỉ lệ TBT sống sau đông lạnh, giải đông và góp phần nâng cao tỉ lệ
tạo phôi trong ống nghiệm từ TBT đông lạnh, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên
cứu cải tiến quy trình đông lạnh tế bào trứng bò nhằm nâng cao hiệu quả tạo
phôi trong ống nghiệm”
2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
Cải tiến được quy trình đông lạnh TBT bò bằng phương pháp thủy tinh hóa
phù hợp với điều kiện Việt Nam, góp phần nâng cao hiệu quả thụ tinh trong ống
nghiệm từ TBT bò đông lạnh.
3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
1/. Nuôi chín TBT tươi trong ống nghiệm
2/. Đông lạnh, giải đông TBT chín (TBT MII)
3/. Thụ tinh trong ống nghiệm từ các TBT MII đông lạnh
4/. Thử nghiệm cấy truyền phôi tạo ra từ các TBT MII đông lạnh
5/. Đông lạnh, giải đông TBT giai đoạn túi mầm (TBT GV)
6/. Nuôi chín TBT GV sau khi được bảo quản lạnh
7/. Thụ tinh trong ống nghiệm từ các TBT GV đông lạnh được nuôi chín in vitro
4. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
 Nâng cao được tỉ lệ sống của TBT bò sau đông lạnh, giải đông góp phần nâng
cao hiệu quả tạo phôi trong ống nghiệm từ TBT bò đông lạnh;
 Góp phần trong việc thành lập ngân hàng tế bào sinh sản gia súc, từ đó làm cơ

sở để nghiên cứu đông lạnh TBT của các động vật khác và các nghiên cứu cơ
bản như chuyển nhân, chuyển gen, cloning, tạo phôi trong ống nghiệm;
 Các kết quả của luận án là tài liệu tham khảo cho các nhà nghiên cứu, nhà giáo
giảng dạy và học sinh, sinh viên trong lĩnh vực công nghệ sinh học sinh sản
gia súc.
5. TÍNH MỚI CỦA ĐỀ TÀI
1. Nghiên cứu thành công bảo quản lạnh TBT bò giai đoạn chín (MII) dùng cọng
rạ, TBT bò giai đoạn túi mầm (GV) dùng cọng rạ và vi giọt theo phương pháp
thủy tinh hóa;
2. Nâng cao tỉ lệ sống của TBT MII sau khi đông lạnh, giải đông bằng phương
pháp thủy tinh hóa cải tiến;


- 2 -
3. Nuôi chín TBT bò trong ống nghiệm từ nguồn TBT GV đông lạnh bằng
phương pháp thủy tinh hóa;
4. Tạo được phôi bò trong ống nghiệm từ các TBT MII và GV đông lạnh bằng
phương pháp thủy tinh hóa.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO TRỨNG BÒ
1.1.1. Những nghiên cứu trên thế giới
1.1.1.1. Đông lạnh tế bào trứng chín (MII)
Năm 1998, Vajta và cs. đã nghiên cứu đông lạnh TBT bò MII bằng phương
pháp thủy tinh hóa hai bước, tỉ lệ thụ tinh đạt 50%, tỉ lệ phôi nang đạt 13%.
Năm 2008, Morato và cs. bảo quản lạnh TBT bò MII, sử dụng cọng rạ kéo mở
và cryotop làm vật mang, tỉ lệ TBT sống sau giải đông tương ứng là 88,4% và
94,5% (P < 0,05); tỉ lệ thụ tinh lần lượt là 31,5% và 41,6% (P < 0,05); tỉ lệ phôi nang
lần lượt là 0,0% và 2,4%. Cũng trong năm này, nhóm tiến hành nghiên cứu bảo quản
lạnh TBT MII bằng phương pháp thủy tinh hóa, bổ sung 1µM Taxol vào dung dịch

cân bằng và dung dịch thủy tinh hóa, tỉ lệ TBT có thoi vô sắc bình thường theo
phương pháp nhuộm DAPI sau đông lạnh giải đông đạt 50,00% (TBT bò) và 57,7%
(TBT bê), P < 0,05. Tỉ lệ thụ tinh được cải thiện đáng kể khi xử lí với Taxol trước
khi thủy tinh hóa: 33,7% so với 23,5% (TBT bê); 41,9% so với 34,00% (TBT bò).
Chỉ riêng nhóm được xử lí trước với Taxol có phôi phát triển đến giai đoạn phôi
nang (3,2%), còn nhóm không xử lí với Taxol chưa ghi nhận được phôi nào đạt đến
giai đoạn phôi nang. Một công bố khác của nhóm này về đông lạnh TBT MII khi
được xử lí trước với Taxol cho thấy Taxol đã có vai trò tích cực trong việc cải thiện
tỉ lệ bình thường của thoi vô sắc, tỉ lệ thụ tinh và tỉ lệ phát triển phôi nang đối với
TBT bò MII khi được thủy tinh hóa: 45,8% so với 29,9%; 42,8% so với 16,2% và
2,3% so với 0,00% (P < 0,05) [104].
Năm 2010, nhóm nghiên cứu do Zhou và cs. tiến hành bảo quản lạnh TBT bò
MII, tỉ lệ sống sau đông lạnh giải đông đạt 93,00% (chưa loại bỏ cumulus) so với
91,8% (đã loại bỏ một phần cumulus); tỉ lệ thụ tinh và phát triển đến giai đoạn phôi
nang ở nhóm để nguyên cumulus so với nhóm được loại bỏ một phần cumulus lần
lượt là 35,2% so với 36,8%; 5,00% so với 4,4%. Cũng trong năm này, Prentice
(Canada) thu được tỉ lệ thụ tinh và phát triển phôi nang khi tiến hành IVF từ nguồn
TBT bò MII được thủy tinh hóa lần lượt là 42% và 0,4% so với lô đối chứng là 93%
và 31% [117].
1.1.1.2. Đông lạnh tế bào trứng túi mầm (GV)
Năm 2006, Cetin Yunus và Ayhan Bastan bảo quản TBT bò GV bằng phương
pháp đông lạnh cực nhanh với các chất bảo vệ khác nhau, tỉ lệ chín trên 20,7% so
với nhóm đối chứng là 79,6% [39]. Gupta và cs. thử nghiệm quy trình thủy tinh hóa
bằng cách sử dụng kết hợp EG và DMSO đối với TBT heo GV, chỉ 3,4% phát triển đến
phôi nang so với lô TBT tươi là 20,1% [62]. Yamada và cs. bảo quản lạnh TBT bò


- 3 -
GV bằng phương pháp thủy tinh hóa, tỉ lệ chín khi nuôi các TBT GV sau khi đông
lạnh và giải đông đạt 11,7% (lô 1) và 29,2% (lô 2).

Năm 2007, Dong-Hoon Kim và cs. bảo quản lạnh TBT bò GV bằng phương
pháp thủy tinh hóa trong vi giọt, tỉ lệ sống sau giải đông là 84% và tỉ lệ chín đạt
44,4% [77]. Cũng trong măm này, Yamada và cs. thu được tỉ lệ chín sau khi IVM
TBT GV đông lạnh đạt 29,2% [149].
Năm 2008, Vieira và cs. bảo quản lạnh TBT bò giai đoạn GV bằng phương
pháp thủy tinh hóa qua 2 bước, tỉ lệ chín sau khi IVM từ nguồn TBT GV đông lạnh
đạt 60,2%; tỉ lệ thụ tinh và phôi đạt 47,5% và 5,86%.
Năm 2010, Zhou và cs. thực hiện bảo quản lạnh TBT bò GV, tỉ lệ sống sau
đông lạnh giải đông đạt 93,8% (chưa loại bỏ cumulus) và 81,3% (đã loại bỏ một
phần cumulus); tỉ lệ thụ tinh và phát triển đến giai đoạn phôi nang ở nhóm để
nguyên cumulus so với nhóm được loại bỏ một phần cumulus lần lượt là 65,8% so
với 47,3%; 11,3% so với 4,00% [155]. Cũng trong năm này, Prentice thu được tỉ lệ
chín khi nuôi chín TBT GV sau khi bảo quản lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa
đạt 24% (cryotop) và 9% (cọng rạ) [117].
Năm 2011, Hajarian và cs. thu được tỉ lệ chín khi nuôi TBT GV sau khi bảo
quản lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa 2 bước đạt 36,2% (cryotop) và 29,5%
(cọng rạ) [63].
Nhìn chung các nghiên cứu về đông lạnh TBT bò đang được các nhà khoa học
trên thế giới rất quan tâm. Họ vẫn đang tiếp tục nghiên cứu để nâng cao tỉ lệ IVF từ
nguồn TBT này.
1.1.2. Những nghiên cứu ở Việt Nam
Việc nghiên cứu bảo quản lạnh đối với TBT gia súc nói chung và TBT bò nói
riêng, kết quả thu được còn rất khiêm tốn, chỉ mang tính khởi đầu.
Năm 2008, Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. HCM đã bảo quản thành công TBT
bò bằng phương pháp đông lạnh cực nhanh trong cọng rạ với tỉ lệ sống so với tổng
số TBT đem đông lạnh sau giải đông 58,83%.
Tháng 5/2009, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. HCM bảo quản TBT bò
GV bằng phương pháp đông lạnh cực nhanh với tỉ lệ sống sau giải đông theo quan
sát hình thái là 53,7% (trong vi giọt) và 47,16% (trong cọng rạ), tỉ lệ thụ tinh là
11,67%, 3,72% phát triển lên phôi nang.

Năm 2010, Viện chăn nuôi quốc gia Hà Nội đã tiến hành giải đông TBT bò
bằng phương pháp thủy tinh hóa trong vi giọt, tỉ lệ sống sau giải đông là 14%, đã tạo
được phôi từ TBT bò sau đông lạnh giải đông, tỉ lệ phôi nang từ TBT đông lạnh đạt
2,5%.
Hiện nay các nhà khoa học vẫn đang tiếp tục nghiên cứu về việc bảo quản TBT
ở động vật có vú, nhằm mục đích tạo ngân hàng bảo quản giao tử cái (TBT) để phục
vụ cho các nghiên cứu sâu hơn: IVF, ICSI, cloning, chuyển gen, thu nhận tế bào gốc
phôi…


- 4 -
1.2. CƠ SỞ KHOA HỌC ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO TRỨNG BÒ
1.2.1. Những biến đổi trong quá trình đông lạnh
Sự hình thành tinh thể đá
Sự hình thành tinh thể nước đá trong và ngoài tế bào là yếu tố ảnh hưởng rất lớn
đến sức sống của tế bào sau đông lạnh. Tốc độ làm lạnh chính là yếu tố quyết định
dạng tinh thể nước đá hình thành. Khi làm lạnh với tốc độ thích hợp thì tinh thể
nước đá hình thành có dạng sáu cạnh. Khi tốc độ làm lạnh được đẩy lên thì hình dạng
của nó sẽ là hình cây thông không đồng dạng và hình cầu [12, 102, 111]. Khi tốc độ làm
lạnh đạt đến 20000
o
C/giây, nước nguyên chất tạo băng vô định hình mà không có
dạng tinh thể. Tuy nhiên, quá trình làm ấm trong giải đông sẽ xảy ra quá trình tái tạo
tinh thể nước đá từ nhỏ đến lớn. Vì vậy, tốc độ nâng nhiệt chậm trong quá trình giải
đông sẽ gây bất lợi cho tế bào [12, 102, 111].
Sự khử nước
Một khi tế bào không được khử nước thì cấu trúc đá nội bào sẽ hình thành nếu
nhiệt độ xuống dưới 0
o
C. Tốc độ khử nước của tế bào phụ thuộc vào tính thấm nước

của màng, năng lượng hoạt hóa của tính thấm và tỉ lệ diện tích bề mặt/thể tích tế bào
(S/V). Những yếu tố này thay đổi tùy thuộc vào loại tế bào, vì vậy, chúng đóng vai
trò quyết định trong việc xác định quá trình đông lạnh thích hợp nhất [12, 117].
1.2.2.Những tổn thương trong quá trình đông lạnh
Các TBT sau khi giải đông thường bị đứt gãy màng trong suốt và màng tế bào
trứng. Khi TBT được làm lạnh từ 37
o
C xuống 20
o
C hoặc dưới 20
o
C thường dẫn đến
có nhiều biến đổi về cấu trúc tế bào và nhiễm sắc thể, nhưng trong một số trường
hợp, tế bào có khả năng tự sửa chữa toàn bộ hoặc một phần [94, 138]. Những tác
dụng ngược chủ yếu trong suốt quá trình bảo quản lạnh là do sự hình thành tinh thể
nước đá, tổn thương thẩm thấu, các hiệu ứng độc của các chất bảo vệ lạnh, các chất
điện giải bên trong tế bào cô đặc, tổn thương lạnh, đứt gãy màng và những biến đổi
của các bào quan bên trong tế bào, sự tiếp xúc giữa tế bào với tế bào [93, 136].
1.2.3. Các phương pháp đông lạnh tế bào trứng
Có hai phương pháp đông lạnh hiện nay được sử dụng là: đông lạnh và đông
lạnh cực nhanh (thủy tinh hóa, vitrification). Sự lựa chọn phương pháp đông lạnh
phụ thuộc vào một số yêu cầu như: (1) tính hiệu quả, (2) tính an toàn, (3) tính tiện
lợi [7, 24].
1.2.4. Các chất bảo vệ lạnh
Chất bảo vệ ngoại bào: không có khả năng thấm qua màng tế bào (non-
permeable CPA). Chúng kết hợp vào dung dịch thủy tinh hóa giúp loại nước ra khỏi
tế bào nhanh hơn và giảm bớt thời gian tế bào tiếp xúc với những chất bảo vệ gây
độc.
Chất bảo vệ n
ội bào: phân tử lượng thấp, có khả năng thẩm thấu qua màng tế

bào (permeable CPA), có khả năng hòa tan do hình thành những liên kết hydro với
các phân tử nước và có độc tính thấp đối với tế bào. Ethylene glycol (EG) là chất
bảo vệ phổ biến nhất và đã được sử dụng trong quy trình thủy tinh hóa. Chất này ít
ảnh hưởng bởi nhiệt trong cơ chế vận chuyển qua màng, độc tính của nó sẽ xuất hiện


- 5 -
vào khoảng 38
o
C. Dimethyl sulfoxide (DMSO) có khả năng hòa tan nhiều loại chất
hữu cơ khác nhau: carbohydrate, polymer, peptid, các muối vô cơ và khí. DMSO
được sử dụng khá rộng rãi để bảo vệ các bào quan, mô và tế bào.
Một số chất bảo vệ lạnh khác: Các đại phân tử (polyvinylpirrolidone,
Polyethylene glycol, hydroxyethyl starch (HES), Ficoll, Bovine Serum Albumin
(BSA), Fetal Bovine Serum (FBS)); Taxol ổn định các vi ống nhờ các liên kết bền
vững giữa các dimer α-tubulin và ß-tubulin. Với liều lượng thấp hơn, Taxol ổn định
sự vận động của các vi ống ở thoi vô sắc.
1.2.5. Những khó khăn khi bảo quản lạnh tế bào trứng so với các tế bào khác
TBT dễ bị tổn thương do thay đổi môi trường hơn so với phôi trước khi cấy -
chứa nhiều tế bào [86]. TBT là một tế bào đặc biệt, có màng trong suốt bao quanh,
nên tính thấm nước và chất bảo vệ lạnh của nó giảm. Tỉ lệ diện tích bề mặt trên thể
tích của TBT thấp hơn so với các loại tế bào khác, gây khó khăn cho sự vận chuyển
nước và chất bảo vệ qua màng nguyên sinh chất, tăng nguy cơ hình thành tinh thể đá
ngoại bào trong quá trình đông lạnh. TBT phải duy trì tính nguyên vẹn của vài cấu trúc
đặc thù của nó cần cho sự thụ tinh và phát triển sau đó [70, 117].
CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU
TBT bò thu nhận từ buồng trứng bò cái tại lò giết mổ gia súc thuộc công ty Kỹ
nghệ Vissan và cơ sở giết mổ gia súc Thành Vinh. Tinh trùng sử dụng trong thí
nghiệm là tinh trùng đông lạnh trong cọng rạ, giống Holstein Friesian (Mỹ) và giống

Clovis (Pháp). Các thí nghiệm IVM, đông lạnh TBT, IVF được thực hiện tại Phòng
thí nghiệm Tế bào gốc, Trường Đại học khoa học Tự Nhiên TP. HCM.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp thu buồng trứng và tế bào trứng
Buồng trứng được thu nhận theo phương pháp của Gordon (2003) [60], Cetin (2006)
[39], Kim (2007) [77]. TBT được thu nhận bằng phương pháp chọc hút; TBT được
phân loại theo phương pháp của các tác giả Mario Mayes (2002) [98] và De Loos và
cs. (1989) [47], gồm 3 loại A, B, C. Dùng các TBT loại A và B cho các thì nghiệm.
2.2.2. Phương pháp nuôi chín tế bào trứng
Môi trường nuôi chín TBT trong ống nghiệm được pha theo công thức của
Rizos và cs. (2002) và Checura và cs. (2007), có biến đổi. Nuôi chín tế bào trứng
tươi (chưa qua đông lạnh) trong 3 môi trường khảo sát IVM1, IVM2, IVM3. Nuôi
chín tế bào trứng đông lạnh trong 2 môi trường N1 và N2. Sau 22 - 24h nuôi cấy,
đánh giá sự chín của TBT dưới kính hiển vi đảo ngược theo độ giãn nở và màu sắc
của các lớp tế bào cumulus, sự đồng đều của tế bào chất.
2.2.3. Phương pháp đông lạnh tế bào trứng
Môi trường đông lạnh TBT được pha dựa theo phương pháp của Cetin (2006),
Kim (2007) và Morato (2008), có sự biến đổi. Đối với TBT MII, đông lạnh theo 3
quy trình: quy trình 1 (cơ bản); quy trình 2 (cải tiến 1); quy trình 3 (cải tiến 2), dùng
cọng rạ làm vật mang. Đối với TBT GV, quy trình đông lạnh với môi trường cân bằng
NV2 và môi trường thủy tinh hóa; dùng vật mang là cọng rạ hoặc vi giọt.


- 6 -
2.2.4. Phương pháp giải đông
Môi trường giải đông TBT được pha dựa theo phương pháp của Cetin (2006),
Kim (2007) và Morato (2008a), có sự biến đổi. Đối với các TBT MII đông lạnh theo
quy trình 1, giải đông qua 3 bước: với môi trường rã đông 1 (TCM–199 + 10% FBS
+ 0,25M Sucrose), môi trường rã đông 2 (TCM–199 + 10% FBS + 0,15M Sucrose)
và môi trường rã đông 3 (TCM–199 + 10% FBS). Đối với các TBT MII đông lạnh

theo quy trình 2, quy trình 3 và các TBT GV đông lạnh, quy trình giải đông qua 3
bước: với môi trường rã đông 1 (TCM–199 + 10% FBS + 5% FCS + 0,25M
Sucrose), môi trường rã đông 2 (TCM–199 + 10% FBS + 5% FCS + 0,15M Sucrose)
và môi trường rã đông 3 (TCM–199 + 10% FBS + 5% FCS). Các TBT sau khi được rã
đông sẽ được đánh giá theo quan sát hình thái dựa trên 3 chỉ tiêu: tỉ lệ thu hồi; tỉ lệ
TBT sống trên tổng số TBT đem đông lạnh; tỉ lệ TBT sống trên tổng số TBT thu
hồi. Riêng TN2 và TN3 của TBT MII đông lạnh, ngoài 3 chỉ tiêu trên còn khảo sát
thêm chỉ tiêu 4 - tỉ lệ TBT có nhiễm sắc thể không bị tổn thương trên các TBT được
đánh giá sống theo hình thái theo nhuộm PI; TBT GV đông lạnh khảo sát thêm chỉ
tiêu đánh giá theo phương pháp nhuộm AO/PI.
2.2.5. Phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm
Thụ tinh trong ống nghiệm được thực hiện theo phương pháp của các nhà khoa học
Nhật Bản (Japan Livestock Technology Association [74], có cải biến.
Dùng môi trường BO để hoạt hóa và pha loãng tinh trùng (dùng tinh đông
lạnh), điều chỉnh mật độ đạt 5-6x10
6
tinh trùng/ml (Otoi, 1998). Dịch huyền phù này
dùng để tạo vi giọt thụ tinh trong đĩa 4 giếng (100 µl/giọt), phủ dầu khoáng một
phần vi giọt thụ tinh, giữ trong tủ ấm 38,5
o
C, 5% CO
2
. Chuyển 15-20 TBT thí
nghiệm vào vi giọt thụ tinh, đặt vào tủ nuôi ở 38,5
o
C; 5% CO
2
trong 5-6 giờ. Sau đó,
quan sát đánh giá kết quả thụ tinh.
2.2.6. Phương pháp nuôi phôi

Dùng môi trường CR1aa bổ sung 5% FBS (100 µl/giọt) nuôi phôi, quan sát và
đánh giá sự phát triển của phôi tại các mốc thời gian: 3-4 ngày nuôi cấy (phôi 8-16
tế bào); 5-6 ngày nuôi cấy (phôi dâu); 7-8 ngày nuôi cấy (phôi nang).
2.2.7. Phương pháp đông lạnh phôi
Phôi được đông lạnh chậm theo quy trình của Hasler (2002), có cải biến bằng
máy đông lạnh tự động (Cryochamber, CC5S, Úc). Chỉ đông lạnh những phôi được
tạo ra từ nguồn TBT MII bảo quản lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa.
2.2.8. Phương pháp cấy truyền phôi
Phôi được cung cấp trong các cọng rạ (0,25ml), và chuyển giao cho cán bộ của
Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp. HCM, tổ chức thử nghiệm cấy truyền.
2.2.9. Phương pháp xử lí số liệu
Tất cả số liệu của luận án được xử lý theo các thuật toán xác suất thống kê trên
máy vi tính bằng phần mềm Minitab 16, R và Analysis Toolpak trong MS-Excel
2010. Xác định giá trị trung bình và sai số trung bình của các kết quả thu được ở
mức ý nghĩa α < 0,05. Dùng hàm Chi – square test để kiểm định các tỉ lệ giữa các
nghiệm thức.


- 7 -

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ - BÀN LUẬN
3.1. KẾT QUẢ NUÔI CHÍN TẾ BÀO TRỨNG TƯƠI TRONG ỐNG NGHIỆM
Bảng 3.1. Kết quả nuôi chín TBT trong ống nghiệm
Các loại môi
trường nuôi
Số đợt TN
Tổng số TBT
đem nuôi

Tỉ lệ (%) TBT

chín
IVM 1 10 2557
82,42 ± 0,73
a

(2085)
IVM 2 10 980
82,24 ± 1,22
a

(806)
IVM 3 6 2756
83,09 ± 0,71
a
(2290)
a: không có sự khác biệt theo chiều dọc ở độ tin cậy 95%
Tỉ lệ chín của TBT ở các môi trường IVM1 đạt 82,42 ± 0,73% (2085/2557);
IVM2 đạt 82,24 ± 1,22% (806/980); IVM3 đạt 83,09 ± 0,71% (2290/2756). Nhìn
chung tỉ lệ chín đạt từ 82-83% và tương đối ổn định ở những lần thí nghiệm của cả
3 môi trường khảo sát. Tỉ lệ chín của TBT khi nuôi ở 3 môi trường là tương đương
nhau và chưa thấy ảnh hưởng của FCS và hCG lên kết quả nuôi chín TBT tươi (P >
0,05). Có 154/190 TBT ở môi trường IVM1 có thể cực, đạt tỉ lệ 81,05 ± 2,84%. Tỉ lệ
chín theo thể cực không có sự khác biệt so với tỉ lệ chín theo độ giãn nở cumulus (P
> 0,05). Như vậy, kết quả của chúng tôi đánh giá tỉ lệ chín của TBT bò theo độ giãn
nở cumulus và theo sự xuất hiện thể cực thứ nhất là tương đương, và tỉ lệ chín như
vậy tương đối cao (> 80%). Kết quả này đã khẳng định sự thành công trong việc
nuôi trưởng thành TBT bò trong ống nghiệm.
3.2. K
ẾT QUẢ ĐÔNG LẠNH, GIẢI ĐÔNG TẾ BÀO TRỨNG MII (ND2)
Bảng 3.2. Kết quả đông lạnh TBT MII

Quy
trình
Số đợt
TN
Tổng số
TBT
đông lạnh
Tỉ lệ (%) các chỉ tiêu sau đông lạnh
CT1 CT2 CT3
1 10 1404
81,84 ± 1,03
(1149 TBT)
62,89 ± 1,29
ab
(883 TBT)
76,85 ± 1,24
a
2 16 1350
87,85 ± 0,89
(1186 TBT)

59,63 ± 1,34
b

(805 TBT)

67,88 ±
1,36
b
3 16 1285

88,33 ± 0,90
(1135 TBT)
64,51 ± 1,33
ac
(829 TBT)
73,04 ± 1,32
c
a, b, c: khác nhau theo cột, có ý nghĩa về mặt thống kê
CT1-Tỉ lệ thu hồi TBT sau khi giải đông; CT2 – Tỉ lệ TBT sống sau giải đông
trên tổng số TBT đem đông lạnh; CT3- Tỉ lệ TBT sống sau giải đông trên
tổng số TBT thu hồi
Kết quả thu hồi TBT sau khi giải đông nhìn chung đạt trên 80% (P < 0,001).


- 8 -
Tỉ lệ TBT sống sau giải đông trên tổng số TBT đem đông lạnh trung bình ở
quy trình 1 đạt 62,89 ± 1,29%; ở quy trình 2 đạt 59,63 ± 1,34% và ở quy trình 3 đạt
64,51 ± 1,33 (P < 0,05). Kết quả này không khác nhau giữa quy trình 1 và quy trình
2, quy trình 1 và quy trình 3 (P > 0,05); nhưng ở quy trình 3 có tỉ lệ TBT sống trên
tổng số TBT đem đông lạnh cao hơn quy trình 2 là 4,88% (P < 0,01).
Tỉ lệ TBT sống sau giải đông trên tổng số TBT thu hồi được ở quy trình 1 đạt
76,85 ± 1,24%; ở quy trình 2 đạt 67,88 ± 1,36% và ở quy trình 3 đạt 73,04 ± 1,32%
(P < 0,01). Kết quả so sánh riêng từng cặp về chỉ tiêu này (CT3) ở cả 3 cặp đều có
sự khác biệt: ở quy trình 1 và quy trình 2 (P < 0,001); ở quy trình 1 và quy trình 3 (P
< 0,05); ở quy trình 2 và quy trình 3 (P < 0,01). Qua phân tích trên cho thấy, tỉ lệ sống
của TBT MII sau khi bảo quản lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa ở quy trình 3
cao nhất, kế đến là quy trình 1 và cuối cùng là quy trình 2. Đây chỉ là kết quả đánh
giá tỉ lệ sống của TBT sau giải đông theo quan sát hình thái.
Kết quả theo đánh giá nhuộm PI được thể hiện trong Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Chất lượng TBT MII sau đông lạnh theo phương pháp

nhuộm PI
Lô TN
Số lần
TN
Số TBT
đem
nhuộm
Số TBT
sống theo
nhuộm
Tỉ lệ (%) TBT sống
theo nhuộm PI
(CT4)
QT2(1) 10 245 187 76,33 ± 2,72
a
QT3(1) 10 209 166 79,43 ± 2,80
a
a: các giá trị không khác nhau theo cột ở độ tin cậy 95%
Chất lượng TBT MII sau đông lạnh được đánh giá theo phương pháp nhuộm PI
đạt 76,33 ± 2,72% ở QT2(1) và 79,43 ± 2,80% ở QT3(1). Tỉ lệ này không khác biệt
ở độ tin cậy 95% (P > 0,05). Như vậy, tỉ lệ sống theo hình thái và theo quan sát sự
tổn thương NST ở thí nghiệm có bổ sung Taxol và thí nghiệm không được bổ sung
Taxol chưa khác biệt nhau. Các kết quả đạt được đã chứng minh rằng các TBT bò
khi được nuôi chín trong ống nghiệm có thể được bảo quản bằng phương pháp thủy
tinh hóa dùng cọng rạ làm vật mang và hỗn hợp chất bảo quản là DMSO và EG. Vì
đây là một trong số ít nghiên cứu đầu tiên về đông lạnh TBT bò giai đoạn MII bằng
phương pháp thủy tinh hóa ở nước ta, nên kết quả đạt được là một điều khích lệ.
Tuy nhiên kết quả đạt được vẫn còn thấp hơn so với các nghiên cứu được công bố
trên thế giới.

- 9 -
3.3. KẾT QUẢ THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM TỪ CÁC TẾ BÀO
TRỨNG MII ĐÔNG LẠNH
3.3.1. Thụ tinh trong ống nghiệm từ tế bào trứng MII đông lạnh theo quy trình 1
Bảng 3.4. Kết quả IVF từ TBT MII đông lạnh theo quy trình 1
Lô
Số
TBT
đem
thụ
tinh
Tỉ lệ các giai đoạn phát triển của phôi (%)
Phôi 2 TB
Phôi 8-16
TB
Phôi dâu Phôi nang
TN 781
12,93 ± 1,2
a
(101)
11,01 ±
1,12
a

(86)
5,76 ± 0,83
a

(45)

3,71 ± 0,68
a
(29)
ĐC 316
53,48 ±
2,81
b
(169)
46,84 ±
2,81
b

(148)
35,44 ±
2,69
b

(112)
26,27 ±
2,48
b

(83)
a,b: các giá trị khác nhau theo cột ở độ tin cậy 95%
Tiến hành thụ tinh cho 781 TBT MII sống tốt sau khi giải đông qua 10 lần thí
nghiệm, chỉ có 101 TBT được thụ tinh-giai đoạn phôi 2 tế bào, đạt tỉ lệ 12,93 ±
1,2%. Trong khi đó, có tới 169/316 TBT thụ tinh ở lô đối chứng (TBT không trải
qua bảo quản lạnh), đạt tỉ lệ 53,48 ± 2,81%. Tỉ lệ thụ tinh ở lô đối chứng cao hơn lô
thí nghiệm 40,55% (P < 0,001). Tỉ lệ phôi phát triển đến giai đoạn 8-16 tế bào, phôi
dâu, phôi nang ở lô thí nghiệm và lô đối chứng lần lượt là 11,01 ± 1,12% so với

46,84 ± 2,81%; 5,76 ± 0,83% so với 35,44 ± 2,69% và 3,71 ± 0,68% so với 26,27 ±
2,48%, sự khác biệt này đều có ý nghĩa về mặt thống kê (P < 0,001).
Xét sự chuyển tiếp của phôi từ giai đoạn phôi 8-16 tế bào lên phôi dâu và từ
phôi dâu lên phôi nang ở từng lô, kết quả thể hiện ở Bảng 3.5.

Bảng 3.5. So sánh sự chuyển tiếp của phôi 8-16 TBT lên phôi dâu và
từ phôi dâu lên phôi nang
Lô
Số phôi các giai đoạn
Tỉ lệ chuyển tiếp
của phôi (%)

Phôi 8-
16 TB
Phôi
dâu
Phôi
nang
Phôi 8-16
TBT lên
phôi dâu
Phôi dâu
lên phôi
nang
Chỉ số P
theo
hàng
TN 86 45 29 52,33 64,44 0,092
ĐC 148 112 83 75,68 74,11 0,614
Chỉ số P theo cột 0,00025 0,226

Sự chuyển tiếp từ giai đoạn phôi 8-16 tế bào lên phôi dâu ở lô đối chứng cao
gấp 1,45 lần lô thí nghiệm (P < 0,001); trong khi sự chuyển tiếp từ giai đoạn phôi
dâu lên phôi nang sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05). Kết quả này
cho thấy, các TBT MII sau khi trải qua bảo quản lạnh và giải đông đem IVF bị


- 10 -
“block” ở giai đoạn 8-16 tế bào chuyển lên phôi dâu nhiều hơn so với các TBT MII
chưa trải qua bảo quản lạnh.
3.3.2. Thụ tinh trong ống nghiệm từ TBT MII đông lạnh theo quy trình 2 và quy
trình 3
Bảng 3.6. Kết quả IVF từ TBT MII đông lạnh theo QT2 và QT3
Lô
Số TBT
đem
thụ tinh
Tỉ lệ (%) các giai đoạn phát triển của phôi
Phôi 2 TB Phôi 4-8 TB Phôi dâu Phôi nang
TN2 578
23,18 ±
1,76
a
(134)
14,71 ±
1,47
a
(85)
7,44 ± 1,09
a

(43)
5,71 ± 0,97
a

(33)
ĐC2 528
14,58 ±
1,54
b
(77)
12,69 ±
1,45
a
(67)
4,92 ± 0,94
a

(26)
3,79 ± 0,83
a

(20)
ĐC2’ 183
55,74 ±
3,67
c
(102)
47,54 ±
3,69
b

(87)
35,52 ±
3,54
b
(65)
26,78 ±
3,27
b
(49)
a, b, c: khác nhau theo cột, có ý nghĩa về mặt thống kê
TN2 – đông lạnh theo QT3 (có Taxol); ĐC2 – đông lạnh theo QT2 (không có
Taxol); ĐC2’- TBT tươi
Tỉ lệ thụ tinh đối với các TBT được xử lí trước với Taxol đã cải thiện đáng kể
so với các TBT không được xử lí trước với Taxol (23,18% so với 14,58%, P <
0,001). Tức là các TBT MII được bảo quản lạnh trong môi trường có bổ sung Taxol
cho tỉ lệ thụ tinh gấp 1,59 lần so với các TBT MII bảo quản lạnh trong môi trường
không được bổ sung Taxol. Như vậy, nhóm TBT được xử lí trước với Taxol trước
khi bảo quản bằng phương pháp thủy tinh hóa đã được cải tiến về tỉ lệ thụ tinh.
Xét sự chuyển tiếp của phôi từ giai đoạn phôi 8-16 tế bào lên phôi dâu và từ
phôi dâu lên phôi nang ở từng lô, kết quả thể hiện ở Bảng 3.7.
Bảng 3.7. So sánh sự chuyển tiếp của phôi ở các giai đoạn liền kề
Lô
Tỉ lệ chuyển tiếp của phôi (%)
Chỉ số P
theo hàng
Phôi 2 tế bào
lên phôi 8-16
tế bào
Phôi 8-16 tế
bào lên phôi

dâu
Phôi dâu
lên phôi
nang
TN2
63,43 ± 4,16
(85/134 phôi)
50,59 ± 5,42
(43/85 phôi)
76,74 ± 6,44
(33/43 phôi)
0,0129
ĐC2
87,01 ± 3,83
(67/77 phôi)
38,81 ± 5,95
(26/67 phôi)
76,92 ± 8,26
(20/26 phôi)
3.642e-
09

ĐC2’
85,29 ± 3,51
(87/102 phôi)
74,71 ± 4,66
(65/87 phôi)
75,38 ± 5,34
(49/65 phôi)
0,1403

Chỉ số P theo
cột
1,888e-
05
2,443e-
05
0,9813

Khi so sánh theo cột, giữa lô có bổ sung Taxol và không bổ sung Taxol, tỉ lệ
chuyển tiếp của giai đoạn phôi 2 tế bào lên phôi 8-16 tế bào khác biệt nhau rất có ý
nghĩa (63,43% so với 87,01%; P < 0,001), nhưng từ 8-16 tế bào lên phôi dâu và từ
phôi dâu lên phôi nang sự khác biệt nhau không có ý nghĩa (50,59% so với 38,81%;


- 11 -
76,74% so với 76,92%; P > 0,05), nhưng cả ba tỉ lệ này cách biệt rất có ý nghĩa
thống kê so với lô đối chứng không trải qua bảo quản lạnh (P < 0,001). Kết quả này
cho thấy phôi chủ yếu bị “block” ở giai đoạn 8-16 tế bào, khi vượt qua được giai
đoạn này, tỉ lệ phát triển đến giai đoạn phôi nang cao hơn (76,74%; 76,92% và
75,38%, tương ứng).
Tỉ lệ phát triển các giai đoạn tiếp theo của phôi (8-16 tế bào, phôi dâu, phôi
nang) tăng lên, và cao hơn so với nhóm TBT không được xử lí trước với Taxol
(14,71% so với 12,69%; 7,44% so với 4,92%; 5,71% so với 3,79%, tương ứng), sự
khác biệt này không có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95%, P > 0,05). Tuy nhiên, tỉ
lệ chuyển tiếp của phôi 2 tế bào lên phôi 8-16 tế bào ở TN2 thấp hơn ĐC2 (63,43%
so với 87,01%; P < 0,001), nhưng tỉ lệ chuyển tiếp từ phôi 8-16 tế bào lên phôi dâu
ở TN2 lại cao hơn ĐC2, có ý nghĩa về mặt thống kê ở độ tin cậy 86% (50,59% so
với 38,81%). Tỉ lệ phôi dâu ở TN2 cao hơn ĐC2 với độ tin cậy 91,6%; tỉ lệ phôi
nang ở TN2 cao hơn ĐC2 với độ tin cậy 86,5%. Tất nhiên, tỉ lệ này ở cả hai nhóm
TBT (xử lí và không xử lí trước với Taxol) đều thấp hơn so với nhóm TBT chưa qua

đông lạnh (47,54%; 35,52% và 26,78%, tương ứng, P < 0,001). Như vậy, Taxol có
xu hướng giúp tăng tỉ lệ thụ tinh, tỉ lệ chuyển tiếp từ phôi 8-16 tế bào lên phôi dâu,
nhưng lại làm giảm tỉ lệ chuyển tiếp từ phôi 2 tế bào lên phôi 8-16 tế bào.
Trong thí nghiệm của chúng tôi, ở quy trình giải đông, sau khi thực hiện qua 3
bước giải đông, chúng tôi có để các TBT này vào môi trường nuôi có bổ sung 10%
dung dịch acid Tyrode trong 20 giây. Đây là một khảo sát thăm dò nồng độ và thời
gian tiếp xúc với dung dịch này nhằm giúp màng trong suốt bớt tính cứng sau khi
bảo quản lạnh. Từ đó giúp tăng tỉ lệ thụ tinh và phát triển về sau của phôi. Kết quả
cho thấy tỉ lệ phát triển đến giai đoạn phôi nang đã cải thiện rõ rệt.
3.3.3. So sánh hiệu quả thụ tinh trong ống nghiệm từ TBT MII đông lạnh
Bảng 3.8. Kết quả IVF từ TBT MII đông lạnh ở hai lô TN
Lô
Số
TBT
đem
thụ
tinh
Tỉ lệ các giai đoạn phát triển của phôi (%)
Phôi 2 TB
Phôi 8-16
TB
Phôi dâu Phôi nang
TN1
781
12,93 ± 1,2
a
(101)
11,01 ±
1,12
a

(86)
5,76 ± 0,83
a

(45)
3,71 ± 0,68
a
(29)
TN2
578
23,18 ±
1,76
b
(134)
14,71 ±
1,47
b
(85)
7,44 ± 1,09
a

(43)
5,71 ± 0,97
a

(33)
a, b: khác nhau theo cột, có ý nghĩa về mặt thống kê
TN1- đông lạnh theo quy trình 1; TN2 – đông lạnh theo quy trình 3 (có
Taxol)

Tỉ lệ thụ tinh ở lô TN2 cao gấp 1,79 lần so với lô TN1; tỉ lệ phát triển phôi ở
giai đoạn 8-16 tế bào ở lô TN2 cao gấp 1,33 lần so với lô TN1; tỉ lệ phôi dâu ở hai lô
thí nghiệm không khác biệt về mặt thống kê. Riêng tỉ lệ phôi nang ở hai lô thí


- 12 -
nghiệm cho thấy không khác biệt về mặt thống kê với α = 0,05 (3,71% so với 5,71%,
P = 0,081), nhưng có sự khác biệt với độ tin cậy 91,9%. Cụ thể, tỉ lệ phôi nang trong
TN2 cao gấp 1,54 lần so với tỉ lệ phôi nang trong TN1 (độ tin cậy 91,9%). Như vậy,
những TBT được xử lí trước với 1µM Taxol kết hợp 5% FCS có xu hướng cho tỉ lệ
thụ tinh và phát triển đến giai đoạn phôi nang cao hơn hẳn so với nhóm chưa được
xử lí với Taxol kết hợp 5% FCS.
3.4. KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM CẤY TRUYỀN PHÔI TẠO RA TỪ CÁC TBT
MII QUA ĐÔNG LẠNH
Bảng 3.9. Các giai đoạn của phôi trước khi đông lạnh
Loại phôi (giai đoạn
phôi)
Số l
ư
ợng Tổng số
Phôi dâu 8
45
Phôi nang 37
Cấy được 32/45 phôi cho 23 bò nhận phôi ở các địa chỉ khác nhau. Kết quả có 2
bê con ra đời, đều là bê cái, khỏe mạnh, có kiểu hình khác với kiểu hình bò mẹ mang
thai.
3.5. KẾT QUẢ ĐÔNG LẠNH, GIẢI ĐÔNG TẾ BÀO TRỨNG GV
Đánh giá theo hình thái
Bảng 3.10. Kết quả đông lạnh TBT GV
Vật

mang
Số TBT
đem đông
lạnh
Tỉ lệ TBT thu
hồi (%)
Tỉ lệ TBT
sống/ĐL (%)
Tỉ lệ TBT
sống/thu hồi
(%)
Cọng rạ 2288
95,54 ± 0,43
a
(2186 TBT)
66,22 ± 0,99
a
(1515 TBT)
69,30 ± 0,99
a
Vi giọt 2151
97,49 ± 0,34
b
(2097 TBT)
73,18 ± 0,96
b
(1574 TBT)
75,06 ± 0,94
b
a,b: khác nhau theo cột, có ý nghĩa về mặt thống kê

Ở thí nghiệm bảo quản TBT bằng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ: có
2.288 TBT được bảo quản lạnh qua hai đợt thí nghiệm. Sau khi giải đông đã thu hồi
được 2.186 TBT, đạt tỉ lệ 95,54 ± 0,43%. Có 1515 TBT sống theo hình thái sau giải
đông.
Ở thí nghiệm bảo quản trong vi giọt, đã tiến hành trên 2151 TBT (đợt 1: 8 lần
lặp lại với tổng cộng 723 TBT; đợt 2: có 6 lần lặp lại với tổng cộng 1428 TBT). Sau
khi giải đông đã thu hồi được 2.097 TBT, đạt tỉ lệ 97,49 ± 0,34%. Trong đó có 1.574
TBT sống theo hình thái, đạt tỉ lệ 73,18 ± 0,96% so với tổng số TBT đem đông lạnh
và 75,06 ± 0,94% so với tổng số TBT thu hồi.


- 13 -
Đánh giá theo nhuộm
Bảng 3.11. Kết quả đánh giá theo phương pháp nhuộm
AO/PI
Nguồn TBT
từ
Số TBT
đem nhuộm
Số TBT
sống
Tỉ lệ sống
Cọng rạ 186 98 52,69 ± 3,66%
ab
Vi giọt 180 87 48,33 ± 3,72%
a
Đối chứng 182 131 71,98 ± 3,3%
c
a, b, c: khác nhau theo cột có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy
95%

Tỉ lệ sống theo phương pháp nhuộm giữa nguồn TBT được bảo quản lạnh bằng
cọng rạ và vi giọt không có sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05), nhưng cả hai
nhóm thí nghiệm đều thấp so lô đối chứng, khác biệt có nghĩa thống kê (P < 0,001).
Tỉ lệ thu hồi khi thủy tinh hóa bằng cọng rạ thấp hơn so với vi giọt.
Tỉ lệ TBT sống theo hình thái sau giải đông ở phương pháp thủy tinh hóa bằng
vi giọt cao hơn thủy tinh hóa trong cọng rạ (P < 0,001).
Tỉ lệ sống theo phương pháp nhuộm AO/PI khi dùng cọng rạ hay vi giọt đều
khác biệt so với lô đối chứng. Khi so sánh riêng từng cặp cho thấy tỉ lệ sống theo
hình thái và theo phương pháp nhuộm ở lô cọng rạ, ở lô vi giọt đều có sự cách biệt
đáng kể: 52,69% so với 66,22% và 48,33% so với 71,18%, P < 0,001, tương ứng;
riêng cặp thí nghiệm (ở lô cọng rạ và lô vi giọt) sự khác biệt này không có ý nghĩa
thống kê (P > 0,05). Hiện nay, trong nước chưa có công trình nghiên cứu nào về bảo
quản lạnh TBT bò sử dụng phương pháp đánh giá này. Vì vậy, kết quả đánh giá chỉ
mang tính khởi đầu.
Tóm lại, tỉ lệ thu hồi và tỉ lệ sống của TBT sau giải đông ở giai đoạn GV trong
thí nghiệm này nằm trong khoảng tương đối cao.


- 14 -
3.6. KẾT QUẢ NUÔI CHÍN TBT GV SAU KHI BẢO QUẢN LẠNH
3.6.1. Kết quả nuôi chín TBT GV đông lạnh đợt 1
Bảng 3.12. Kết quả nuôi chín TBT GV đông lạnh ở đợt 1
Môi
trường
nuôi
Lô
Số
TBT
đem
nuôi

Tiêu chí so sánh
TC1 TC2 TC3 TC4
N1
CR 235
34,47 ±
3,1%
(81/235
TBT)
5,11 ±
0,44%
(12/235
TBT)
14,81 ±
3,95%
(12/81
TBT)
42,86 ±
9,35%
(12/28
TBT)
VG 261
32,95 ±
2,91%
(86/261
TBT)
00,00
(00 TBT)
00,00
(00 TBT)
00,00

(00 TBT)
ĐC1 139
95,68 ±
1,72%
(133/139
TBT)
52,52 ±
4,24%
(73/139
TBT)
54,89 ±
4,31%
(73/133
TBT)
76,84 ±
4,33%
(73/95
TBT)
N2
CR 233
48,93 ±
3,27%
(114/233
TBT)
13,30 ±
2,22%
(31/233
TBT)
27,19 ±
4,17%

(31/114
TBT)
54,39 ±
6,60%
(31/57
TBT)
VG 263
52,47 ±
3,08%
(138/263
TBT)
6,08 ±
1,47%
(16/263
TBT)
11,59 ±
2,73%
(16/138
TBT)
42,11 ±
8,01%
(16/38
TBT)
ĐC2 136
96,31 ±
1,61%
(131/136
TBT)
62,50 ±
4,15%

(85/136
TBT)
64,89 ±
4,17%
(85/131
TBT)
81,73 ±
3,79%
(85/104
TBT)
a, b, c: khác nhau theo cột có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95%
TC1: Tỉ lệ TBT sống sau nuôi; TC2: tỉ lệ TBT có thể cực/tổng TBT đem
nuôi;
TC3: tỉ lệ TBT có thể cực/tổng số TBT sống sau nuôi; TC4: tỉ lệ TBT có
thể cực/tổng số TBT chín theo cumulus
Môi trường N2 cho kết quả chín tốt hơn môi trường N1. Tiến hành kiểm định
kết quả nuôi chín TBT GV đông lạnh trong hai môi trường nuôi (N1 và N2) và hai
vật mang (cọng rạ và vi giọt) ở cả 4 tiêu chí, như vậy cần xem xét hai vấn đề chính:
(i) đánh giá ảnh hưởng của môi trường, vật mang và sự tương tác giữa môi trường
và vật mang lên kết quả nuôi chín in vitro; (ii) so sánh ảnh hưởng của từng cặp yếu
tố môi trường - vật mang lên kết quả nuôi chín in vitro.


- 15 -
Kết quả nuôi chín TBT GV đông lạnh đợt 1 sau khi kiểm định cho thấy môi
trường N2 cho kết quả chín cao hơn môi trường N1. Chúng tôi dùng môi trường N2
để nuôi TBT đợt 2 phục vụ cho việc thụ tinh trong ống nghiệm.
3.6.2. Kết quả nuôi chín TBT GV đông lạnh đợt 2
Bảng 3.18. Kết quả nuôi chín TBT GV đông lạnh ở đợt 2
Vật

mang
Số TBT
đem
nuôi
Tỉ lệ sống sau
nuôi (%)
Tỉ lệ TBT chín
trên số TBT
đem nuôi (%)
Tỉ lệ TBT
chín trên số
TBT sống sau
nuôi (%)
Cọng rạ 861
51,80 ± 1,70
a
(446 TBT)
20,79 ± 1,38
a
(179 TBT)
40,13 ± 2,32
a
Vi giọt 868
50,81 ± 1,70
a
(441 TBT)
12,79 ± 1,13
b
(111 TBT)
25,17 ± 2,07

b

Đối
chứng
180
95,00 ± 1,62
b
(171 TBT)
68,33 ± 3,47
c
(123 TBT)
71,93 ± 3,44c
a, b, c: khác nhau theo cột có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95%
Tỉ lệ sống sau khi nuôi ở lô cọng rạ và lô vi giọt có sự khác biệt nhau và thấp
hơn 1,8 lần so với lô đối chứng, sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê, P < 0,001. Ở
đợt thí nghiệm này, nguồn TBT được giải đông từ cọng rạ và vi giọt đều có TBT đạt
đến giai đoạn chín và cả hai nguồn đều có tỉ lệ sống sau đông lạnh tương đương
nhau (P > 0,05). Nguồn TBT giải đông từ cọng ra cho tỉ lệ chín cao hơn gấp 1,6 lần
so với nguồn TBT giải đông từ vi giọt (20,79% so với 12,79%, P < 0,001), tuy
nhiên, cả hai nguồn TBT này đều có tỉ lệ chín thấp hơn rất nhiều so với lô đối chứng
(68,33%, P < 0,001).
Ở đợt thí nghiệm 1, khi nuôi chín in vitro TBT từ nguồn TBT GV đông lạnh
trong môi trường N2 cho tỉ lệ chín cao hơn so với môi trường N1 (P < 0,001). Kết
quả của chúng tôi thấp hơn có thể là do một số thể cực không được phát hiện khi
đánh giá bằng quan sát hình thái, từ đó dẫn đến việc bỏ sót trong quá trình đánh giá
sự trưởng thành của TBT. Ở trong nước, cho đến thời điểm này chưa có công trình
nào công bố về kết nuôi chín in vitro TBT bò từ nguồn TBT GV đông lạnh. Do đó, có
thể coi đây là kết quả khởi đầu cho nghiên cứu về hướng này.
Ở đợt thí nghiệm thứ 2: dựa trên kết quả của TN1, nên chỉ tiến hành nuôi TBT
được đông lạnh trong môi trường N2. Tỉ lệ sống của TBT theo hình thái sau khi nuôi

22-24giờ trong thí nghiệm đạt 50-51%. Tỉ lệ này còn thấp hơn rất nhiều so với công
bố của Kim và cs. (2007). Tỉ lệ TBT chín trong thí nghiệm của chúng tôi chỉ đạt ở
mức 20,79% (từ cọng rạ) và 12,79% (từ vi giọt). Tỉ lệ này thấp hơn lô đối chứng rất
nhiều (3,29 lần và 5,34 lần, từ cọng rạ và từ vi giọt, tương ứng). Tuy nhiên tỉ lệ này
có cải thiện hơn so với các thí nghiệm ở đợt 1: 20,79% so với 13,30% (từ cọng rạ, P
< 0,05) và 12,79% so với 6,08% (từ vi giọt, P < 0,001). Kết quả này có phần cao
hơn so với một số tác giả đã công bố.
Tóm lại, cùng nuôi trong môi trường N2 nhưng ở đợt thí nghiệm 2 đã cho tỉ lệ
chín cao hơn so với trong đợt 1. Kết quả này đã phần nào khẳng định được kỹ thuật,


- 16 -
thao tác của chúng tôi ngày càng hoàn thiện dần và đây chính là những kết quả khởi
đầu của hướng nghiên cứu này ở nước ta.
3.7. KẾT QUẢ THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM TỪ CÁC TẾ BÀO
TRỨNG GV ĐÔNG LẠNH ĐƯỢC NUÔI CHÍN IN VITRO
Tiến hành IVF từ các TBT GV được đông lạnh bằng cọng rạ (CR), đông lạnh bằng
vi giọt (VG); từ nguồn TBT tươi làm đối chứng (ĐC). Kết quả thể hiện ở Bảng 3.19.
Bảng 3.19. Kết quả IVF từ TBT GV đông lạnh được nuôi chín in vitro
Nguồn
TBT từ
Số
TBT
đem
thụ
tinh
Tỉ lệ (%) các giai đoạn phát triển của phôi
Phôi 2 tế
bào
8-16 tế bào Dâu Nang

CR 179
15,64 ±
2,72
a
(28)
9,50 ± 2,19
a
(17)
3,35 ± 1,35
a
(6)
1,12 ± 0,79
a
(2)
VG 111
12,61 ±
3,15
a
(14)
7,21 ± 2,45
a
(8)
2,70 ± 1,54
a
(3)
00,00

(0)
ĐC 123
51,22 ±

4,51
b
(63)
36,59 ±
4,34
b
(45)
25,20 ±
3,91
b
(31)
18,70 ±
3,52
b
(23)
a, b, c thể hiện sự khác biệt theo cột, có ý nghĩa về mặt thống kê
Tỉ lệ thụ tinh ở lô cọng rạ cao hơn lô vi giọt (15,64% so với 12,61%), sự khác
biệt này không có ý nghĩa thống kê P > 0,05), nhưng cả 2 lô đều thấp hơn rất nhiều
so với lô ĐC từ 3- 4 lần (P < 0,001). Tỉ lệ thụ tinh trong thí nghiệm của chúng tôi
thấp hơn rất nhiều so với kết quả của Vieira và cs. (2002; 49%), Abe và cs. (2005;
37,7%), Kim và cs. (2007; 55,7%), Prentice (2010; 42% ở nhóm không cân bằng và
59% ở nhóm cân bằng). Tuy nhiên, kết quả của chúng tôi cao hơn so kết quả của
Mastumoto và cs. khi dùng vật mang là lưới nylon (2001; 7%).
Sự phát triển của phôi: Ở lô cọng rạ chỉ có 1,12% (2 phôi) phát triển đến giai
đoạn phôi nang. Ở lô vi giọt chưa có phôi nào phát triển đến giai đoạn phôi nang.
Tóm lại, kết quả đã cho thấy nhóm nghiên cứu của chúng tôi đã bước đầu
thành công trong việc bảo quản TBT bò giai đoạn GV bằng phương pháp thủy tinh
hóa trong cọng rạ và trong vi giọt. Các TBT sau khi bảo quản lạnh có thể sống sót,
nuôi chín in vitro và tiến hành thụ tinh trong ống nghiệm, phát triển đến phôi nang.
Đây là kết quả đầu tiên trong nước cho tới thời điểm này. Tuy nhiên cần có nhiều

nghiên cứu được tiếp tục tiến hành nhằm nâng cao tỉ lệ thụ tinh và phát triển của phôi.
3.8. SO SÁNH HIỆU QUẢ ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO TRỨNG Ở HAI GIAI ĐOẠN
Nghiệm thức 1: đông lạnh TBT MII chưa xử lí trước với Taxol (quy trình 1)
Nghiệm thức 2: đông lạnh TBT MII xử lí trước với Taxol (quy trình 3)
Nghiệm thức 3: đông lạnh TBT GV dùng cọng rạ làm vật mang


- 17 -

Bảng 3.20. So sánh hiệu quả đông lạnh TBT ở cả hai giai đoạn
Nghiệm
thức
Số TBT
đem ĐL
Tỉ lệ TBT thu
hồi (%) – TC1
Tỉ lệ TBT
sống/tổng số
TBT ĐL (%) –
TC2
Tỉ lệ TBT
sống/tổng số
TBT thu hồi
(%) – TC3
1 1404
81,84 ± 1,03
a
(1149 TBT)
62,89 ± 1,29
a

(883 TBT)
76,85 ± 1,24
a
2 1285
88,33 ± 0,90
b
(1135 TBT)
64,51 ± 1,33
ab
(829 TBT)
73,04 ± 1,32
b
3 2288
95,54 ± 0,85
c
(2186 TBT)
66,22 ± 1,94
b
(1515 TBT)
69,30 ± 1,93
c
a, b, c: thể hiện sự khác nhau theo cột ở độ tin cậy 95%
Tỉ lệ thu hồi ở 3 nghiệm thức khác biệt nhau, cụ thể: tỉ lệ thu hồi khi đông lạnh
TBT GV cao nhất, đạt 95,54%; kế đến là khi đông lạnh TBT MII được xử lí trước
với Taxol (88,33%) và sau cùng là khi đông lạnh TBT MII theo quy trình cơ bản, sự
khác biệt này rất có ý nghĩa thống kê (P < 0,001). Tỉ lệ sống sau đông lạnh, giải
đông trên tổng số TBT đem đông lạnh không khác biệt theo từng cặp (nghiệm thức
1-2; nghiệm thức 2-3), P > 0,05; chỉ có cặp nghiệm thức 1-3 là khác biệt có ý nghĩa
thống kê (P < 0,05). Tỉ lệ sống sau đông lạnh, giải đông trên tổng số TBT thu hồi có
sự khác biệt nhau ở cả 3 nghiệm thức (P < 0,05). Như vậy, xét tổng thể cho thấy bảo

quản lạnh TBT MII có xử lí trước với Taxol + 5% FCS và sau giải đông xử lí nhanh
với 10% dung dịch acid Tyrode (20 giây) cho hiệu quả nhất trong 3 nghiệm thức.
3.9. SO SÁNH HIỆU QUẢ THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM TỪ TẾ BÀO
TRỨNG ĐÔNG LẠNH Ở HAI GIAI ĐOẠN
Nghiệm thức 1: IVF từ nguồn TBT MII đông lạnh chưa xử lí Taxol
Nghiệm thức 2: IVF từ nguồn TBT MII đông lạnh có xử lí Taxol
Nghiệm thức 3: IVF từ nguồn TBT non đông lạnh dùng vật mang là cọng rạ
Bảng 3.20. So sánh hiệu quả IVF từ TBT đông lạnh
Nghiệm
thức
Số TBT
đem
thụ tinh
Tỉ lệ các giai đoạn phát triển của phôi (%)
Phôi 2 TB Phôi 4-8 TB Phôi dâu Phôi nang
1 781
12,93 ± 1,2
a

(101)
11,01 ± 1,12
a

(86)
5,76 ± 0,83
a

(45)
3,71 ± 0,68
ac

(29)
2 578
23,18 ±
1,76
b
(134)
14,71 ± 1,47
b

(85)
7,44 ± 1,09
a

(43)
5,71 ± 0,97
a

(33)
3 179
15,64 ±
2,72
a
(28)
9,50 ± 2,19
ab
(17)
3,35 ± 1,35
a
(6)
1,12 ± 0,79

bc
(2)
a, b, c thể hiện sự khác biệt theo cột, có ý nghĩa về mặt thống kê
Tỉ lệ thụ tinh ở nghiệm thức 2 cao nhất (23,18%), kế đến là nghiệm thức 3
(15,64%) và sau cùng là nghiệm thức 1 (12,93%). Sự phát triển của phôi qua các


- 18 -
giai đoạn chính cũng theo thứ tự như vậy. Tỉ lệ thụ tinh ở nghiệm thức 2 cao gấp 1,8
lần so với nghiệm thức 1 (P < 0,001); cao gấp 1,48 lần so với nghiệm thức 3 (P <
0,05); không khác biệt so với nghiệm thức 1 (P > 0,05). Kết quả này chứng tỏ các
TBT MII khi được bảo quản lạnh cho tỉ lệ thụ tinh tốt hơn so với các TBT GV được
bảo quản lạnh; các TBT MII được bảo lạnh có xử lí trước với Taxol + 5% FCS và
sau giải đông xử lí nhanh với dung dịch acid Tyrode cho tỉ lệ thụ tinh cao hơn so với
nhóm không được xử lí trước với Taxol.
Giai đoạn phôi 8-16 tế bào ở nghiệm thức 2 cao hơn so với nghiệm thức một
1,34 lần (P < 0,05); không khác biệt so với hai nghiệm thức còn lại (P > 0,05),
nhưng nghiệm thức 2 cao hơn nghiệm thức 3 ở độ tin cậy 92,6%. Kết quả này cho
thấy, tỉ lệ phát triển của phôi 2TB lên phôi 8-16 TBT cao hơn khi tiến hành IVF từ
các TBT MII được bảo quản lạnh có xử lí trước với Taxol và 5% FCS.
Giai đoạn phôi dâu, tỉ lệ phân chia của phôi ở cả ba nghiệm thức có khác nhau,
nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05). Như vậy, nguồn TBT
đem IVF không ảnh hưởng đến tỉ lệ phân chia của giai đoạn phôi dâu.
Giai đoạn phôi nang, nghiệm thức 2 cao nhất (5,71%), cao hơn so với nghiệm
thức 3 là 5,55 lần (P < 0,05); không khác biệt so với nghiệm thức 1 ở độ tin cậy 95%
(P > 0,05). Tuy nhiên, tỉ lệ phôi nang ở nghiệm thức 2 và nghiệm thức 1 khác biệt
nhau ở độ tin cậy 91,9%. Cụ thể, tỉ lệ phôi nang trong nghiệm thức 2 cao hơn
nghiệm thức một 1,54 lần. Tỉ lệ phôi nang ở nghiệm thức 1 và nghiệm thức 3 khác
biệt nhau ở độ tin cậy 92,4%. Cụ thể, tỉ lệ phôi nang trong nghiệm thức 1 cao hơn
nghiệm thức ba 3,32 lần.

Như vậy có thể thấy, kết quả nghiệm thức 2 là tối ưu trong cả 3 nghiệm thức.
Điều này có nghĩa là khi bảo quản TBT MII bằng phương pháp thủy tinh hóa có bổ
sung Taxol cho hiệu quả tốt hơn so với không bổ sung Taxol. Ở nghiệm thức 3, do
những lần thí nghiệm đầu không có phôi phát triển đến giai đoạn phôi nang nên tỉ lệ
trung bình về phôi nang thấp, chỉ đạt 1,12%. Tuy nhiên với kết quả đạt được cũng
phần nào khẳng định được sự thành công bước đầu trong việc tạo phôi từ các TBT
MII và GV được bảo quản lạnh. Cần có những nghiên mở rộng hơn, sâu hơn nhằm
tìm ra quy trình tối ưu cho việc thủy tinh hóa TBT bò ở các giai đoạn.
Tóm lại, trong quá trình thí nghiệm cho thấy, việc bảo quản lạnh TBT bò MII
bằng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ cho kết quả tốt hơn so với giai đoạn
GV. Đồng thời, trước khi bảo quản nên xử lí với 1µM Taxol và sau khi giải đông
nên xử lí nhanh với dung dịch acid Tyrode 10% trong 20 giây, cho kết quả tốt hơn
so với nhóm không được xử lí với Taxol.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
Từ kết quả nghiên cứu trên đây, đề tài đã đạt được mục tiêu đề ra, trong đó kết quả
thứ nhất và thứ hai là nổi bật nhất.
1. Đã cải tiến được quy trình đông lạnh tế bào trứng bò giai đoạn MII bằng phương
pháp thủy tinh hóa phù hợp với điều kiện Việt Nam: Bổ sung 1µM Taxol vào môi
trường cân bằng, môi trường thủy tinh hóa và bổ sung 10% dung dịch acid Tyrode


- 19 -
vào môi trường sau khi giải đông bước 3 đã nâng cao tỉ lệ sống, tỉ lệ thụ tinh cũng
như phát triển của phôi sau khi thụ tinh trong ống nghiệm (64,51 ± 1,33%; 23,18 ±
1,76%; 5,71 ± 0,97%, tương ứng);
2. TBT bò ở giai đoạn GV sau khi bảo quản lạnh bằng cọng rạ hoặc vi giọt có thể
nuôi chín in vitro trong môi trường cải tiến (N2 = TCM-199 + 10% FBS + 5%
FCS + 10ng/ml EGF + 10IU/ml hCG + 0,2mM Natri pyruvate + 50µg/ml
Gentamycin bổ sung 10% dịch nang trứng), tỉ lệ chín đạt 20,79 ± 1,38% và 12,79

± 1,13%, tương ứng.
3. Đã thành công trong việc tạo phôi in vitro từ nguồn tế bào trứng giai đoạn GV
đông lạnh bằng cọng rạ và được nuôi chín in vitro, tỉ lệ thụ tinh đạt 15,64 ±
2,72%, có phôi phát triển đến giai đoạn phôi nang.
4. Bước đầu đã thử nghiệm cấy truyền phôi tạo ra từ nguồn TBT MII đông lạnh
thành công, kết quả cho 2 bê con ra đời khỏe mạnh.
KIẾN NGHỊ
1. Trên cơ sở kết quả đạt được của đề tài, cần tiếp tục nghiên cứu đông lạnh tế bào
sinh sản trên đối tượng các động vật khác, đặc biệt là những động vật quý hiếm có
nguy cơ bị tiệt chủng, góp phần bảo tồn đa dạng nguồn gen vật nuôi.
2. Tiến hành thêm các thí nghiệm cấy truyền phôi nhằm chứng minh chất lượng phôi
được tạo ra từ TBT đông lạnh.
3. Đưa kết quả các phương pháp cải tiến đông lạnh TBT bò vào chương trình giảng
dạy và học tập trong lĩnh vực Công nghệ Sinh học về Sinh sản Gia súc ở các trường
đại học, các cơ quan nghiên cứu và ứng dụng ra sản xuất.

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI
ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ
1. Nguyễn Thị Thương Huyền
, Võ Thị Tuyết Nga, Nguyễn Thị Thanh Xuân, Hoàng
Thị Bích Tuyền, Nguyễn Thị Phương Dung, Đặng Thị Thu Thủy, Phan Kim
Ngọc (2008), “Bảo quản trứng bò trưởng thành bằng phương pháp thủy tinh hóa
trong cọng rạ”, Hội nghị khoa học lần thứ 6, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Tp. HCM, trang 224.
2. Nguyễn Thị Thương Huyền
, Phạm Văn Phúc, Hoàng Nghĩa Sơn, Phan Kim Ngọc
(2009), “Tạo phôi bò bằng kỹ thuật thụ tinh In Vitro từ nguồn giao tử đông lạnh”,
Tạp chí Công nghệ Sinh học, ISSN 1811-4989, Tập 7 số 2, trang 161-167.
3. Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc, Nguyễn Thị Thương Huyền, Dương Thị Thư,
Nguyễn Thị Minh Nguyệt (2009). “So sánh kết quả tạo phôi bò bằng kỹ thuật

IVF trứng tươi và trứng đông lạnh với tinh trùng đông lạnh”. Tạp chí Công nghệ
Sinh học, ISSN 1811-4989, Tập 7 số 4 năm 2009, trang 435-441.
4. Nguyen Thi Thuong Huyen
, Pham Van Phuc, Le Thanh Long, Duong Thi Thu,
Chung To Nhi, Phan Kim Ngoc (2009) “Experiment on frozen in vitro bovine
embryo transfer after sexing by LAMP method”. The 6
th
annual conference of the
Asian Reproductive Biotechnology Society, Siem Reap, Cambodia, November 16-
20, 2009, P 108.


- 20 -
5. Võ Thị Tuyết Nga
*
, Nguyễn Thị Thương Huyền
*
, Bùi Thị Thu Trang, Nguyễn
Quốc Đạt, Nguyễn Thị Thoa, Phan Kim Ngọc (2010) “Nghiên cứu cải thiện môi
trường nuôi chín trứng từ nguồn trứng bò đông lạnh ở giai đoạn túi mầm”, Tạp
chí Khoa học Kỹ thuật Chăn nuôi, ISSN 0868-3417, tháng 03/2010, trang 10-16.
6. Nguyễn Thị Thương Huyền, Nguyễn Thành Trung, Nguyễn Vũ Hoàng Linh, Lê
Thành Long, Hoàng Nghĩa Sơn, Phan Kim Ngọc (2012), “Những tác động của
Taxol lên việc bảo quản lạnh tế bào trứng bò bằng phương pháp thủy tinh hóa”,
Tạp chí Sinh học, ISSN 0866-7160, tập 34 - số 3SE, trang 299-305.
7. Nguyen Thi Thuong Huyen, Le Thanh Long, Nguyen Quoc Dat, Hoang Nghia
Son (2013), Effects of Taxol in cryopreservation of mature bovine oocytes by
vitrification. The 10
th
annual conference of the Asian Reproductive Biotechnology

Society, Sea -Links Mui Ne, Phan Thiet, Vietnam, 19-25/8/2013, P8.
8. Nguyễn Thị Thương Huyền, Lâm Sơn Bích Trâm, Nguyễn Quốc Đạt, Hoàng
Nghĩa Sơn, Phan Kim Ngọc (2013), “Bảo quản lạnh tế bào trứng bò giai đoạn túi
mầm bằng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ và vi giọt”. Kỷ yếu Hội nghị
Công nghệ Sinh học toàn quốc khu vực phía Nam lần III, O4-3, trang 184.

àng Nghĩa Sơ
2. TS. Nguyễn Quốc Đạt