nghiên cứu sản xuất pectinase bằng phương pháp nuôi cấy asp.niger trên môi trường bã thải cà rốt

i

LỜI CẢM ƠN
Đào tạo đội ngũ kỹ sư, cử nhân có trình độ chuyên môn cao, khả năng
nhạy bén tiếp thu kỹ thuật công nghệ mới là phương châm đào tạo hàng đầu của
trường Đại học Nha Trang.
Nhằm giúp sinh viên hệ thống lại kiến thức đã tiếp thu được ở nhà trường
và thực tế, tiếp cận các công nghệ mới và vận dụng chúng một cách có hiệu quả
trong nghiên cứu cũng như trong sản xuất thì việc tổ chức cho sinh viên thực tập
tốt nghiệp là khâu quan trọng trong quá trình đạo tạo của trường.
Được sự phân công của Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Ban chủ nhiệm
Khoa Chế biến – Trường Đại học Nha Trang cho phép tôi thực hiện đề tài
“
NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT PECTINASE BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY
ASP.NIGER TRÊN MÔI TRƯỜNG BÃ THẢI CÀ RỐT
” trong thời gian từ ngày
31/07/2008 – 31/10/2008.
Nhân đây tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô GS.TS Trần
Thị Luyến là người đã trực tiếp hướng dẫn tôi hoàn thành đề tài này cũng như
dìu dắt tôi từ những bước đi đầu tiên trên con đường nghiên cứu khoa học. Tôi
xin chân thành cảm ơn tới các Thầy cô giáo trong Bộ môn Công nghệ thực phẩm,
các Thầy cô trong Khoa Chế biến, cùng toàn thể quý Thầy cô trong trường Đại
học Nha Trang đã dạy dỗ và truyền đạt kiến thức. Gia đình và bạn bè luôn là
nguồn động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài này.
Do bước đầu làm quen với công tác nghiên cứu khoa học, kiến thức cũng
như kinh nghiệm còn hạn chế nên không thể tránh khỏi những thiếu sót. Kính
mong nhận được những ý kiến đóng góp của quý Thầy cô giáo, cùng quý độc giả!
Nha Trang, 11/2008.
Sinh viên thực hiện
Đinh Thị Tâm

ii

MỤC LỤC
TRANG BÌA PHỤ
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG, HÌNH
Trang
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 3
1.1. GIỚI THIỆU VỀ ENZYME VÀ SINH TỔNG HỢP ENZYME CỦA VI
SINH VẬT 3
1.1.1. Giới thiệu về enzyme 3
1.1.2. Sự sinh tổng hợp enzyme cảm ứng của vi sinh vật 8
1.2. GIỚI THIỆU VỀ PHẾ LIỆU CÀ RỐT 12
1.3. PECTINASE VÀ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PECTINASE CỦA VI
SINH VẬT 13
1.3.1. Giới thiệu về pectin và pectinase vi sinh vật 13
1.3.2. Khả năng sinh tổng hợp pectinase của vi sinh vật 19
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG – NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
21
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 21
2.1.1. Asp.niger 21
2.1.2. Vật liệu nghiên cứu 22
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 22
2.2.1. Xác định một số thành phần hóa học cơ bản của phế liệu cà rốt 22
2.2.2. Xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình nuôi cấy, sản xuất
pectinase: độ ẩm môi trường ban đầu, nhiệt độ môi trường, thời gian nuôi cấy,

hàm lượng cám, (NH
4
)
2
SO
4
, tỷ lệ giống 22
iii
2.2.3. Tối ưu các điều kiện thu nhận pectinase kỹ thuật từ canh trường thô
(hay chế phẩm enzyme thô) sau khi nuôi cấy 22
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23
2.3.1. Phương pháp chuẩn bị môi trường dinh dưỡng 23
2.3.2. Phương pháp xác định các thành phần 23
2.3.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm 23
Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 24
1. Bố trí thí nghiệm xác định độ ẩm môi trường ban đầu tối ưu 25
2. Bố trí thí nghiệm xác định hàm lượng cám 26
3. Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ giống cho vào môi trường 26
4. Bố trí thí nghiệm xác định hàm lượng (NH
4
)
2
SO
4
bổ sung 27
5. Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ môi trường tối ưu 28
6. Bố trí thí nghiệm xác định thời gian nuôi cấy tối ưu 28
7. Bố trí thí nghiệm xác định dung môi chiết enzyme thích hợp 29
8. Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ dung môi chiết enzyme/chế phẩm thô 30
9. Bố trí thí nghiệm xác định thời gian chiết thích hợp 30

10. Bố trí thí nghiệm xác định dung môi kết tủa enzyme thích hợp 31
11. Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ dung môi kết tủa/dịch chiết enzyme 31
12. Bố trí thí nghiệm xác định thời gian kết tủa enzyme thích hợp 32
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 33
3.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CƠ BẢN
CỦA PHẾ LIỆU CÀ RỐT 33
3.2. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN VÀ THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG
THÍCH HỢP CHO QUÁ TRÌNH NUÔI CẤY, SẢN XUẤT PECTINASE TỪ
ASP.NIGER TRÊN MÔI TRƯỜNG CƠ BẢN LÀ BÃ THẢI CÀ RỐT 33
3.2.1. Kết quả xác định độ ẩm môi trường ban đầu thích hợp cho quá trình
nuôi cấy 34
3.2.2. Kết quả xác định hàm lượng cám bổ sung vào môi trường nuôi cấy 36
3.2.3. Kết quả xác định tỷ lệ giống cho vào môi trường nuôi cấy 37
iv

3.2.4. Kết quả xác định hàm lượng (NH
4
)
2
SO
4
bổ sung vào môi trường nuôi
cấy 39
3.2.5. Kết quả xác định nhiệt độ môi trường tối ưu 41
3.2.6. Kết quả xác định thời gian nuôi cấy tối ưu 42
3.3. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CÁC ĐIỀU KIỆN THU PECTINASE KỸ THUẬT
TỪ CANH TRƯỜNG THÔ (HAY CHẾ PHẨM THÔ) SAU KHI NUÔI CẤY 44
3.2.1. Kết quả xác định chế độ chiết pectinase từ canh trường nấm mốc 44
1. Kết quả xác định dung môi chiết enzyme thích hợp 44
2. Kết quả xác định tỷ lệ nước cất/chế phẩm thô 44

3. Kết quả xác định thời gian chiết thích hợp 46
3.2.2. Kết quả xác định điều kiện kết tủa pectinase từ dịch chiết 48
1. Kết quả xác định dung môi kết tủa enzyme thích hợp 48
2. Kết quả xác định tỷ lệ acetone/dịch chiết enzyme 50
3. Kết quả xác định thời gian kết tủa enzyme thích hợp 51
3.4. ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH NUÔI CẤY ASP.NIGER SINH PECTINASE
TRÊN MÔI TRƯỜNG CƠ BẢN LÀ BÃ THẢI CÀ RỐT 53
3.5. ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH THU NHẬN CHẾ PHẨM PECTINASE KỸ
THUẬT TỪ CANH TRƯỜNG THÔ CỦA ASP.NIGER 56
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 58
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC








v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

CP Chế phẩm
CPKT Chế phẩm kỹ thuật
HđPE Hoạt độ riêng của enzyme pectinesterase
KLMTTN Khối lượng môi trường tự nhiên
KT Kỹ thuật
MT Môi trường

PE Pectinesterase
PG Polygalacturonase
PL Phụ lục
PMG Polymetylgalacturonase
Tr Trang
VSV Vi sinh vật















vi

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
STT TÊN BẢNG TRANG

01
Bảng 1.1. Giới thiệu sự tạo thành enzyme của nấm mốc phụ thuộc v
ào
thành phần môi trường và phương pháp nuôi cấy

9
02
Bảng 1.2. Sinh tổng hợp enzyme của nấm mốc và x
ạ khuẩn phụ thuộc
vào các chất cảm ứng
11
03 Bảng 1.3. Thành phần cơ bản của phế liệu cà rốt 12
04 Bảng 2.1. Tỷ lệ khối lượng các thành phần môi trường 25
05
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của độ ẩm môi trư
ờng ban đầu tới khả năng
sinh tổng hợp pectinase của Asp.niger
PL1
06
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của hàm lượng cám tới kh
ả năng sinh tổng hợp
pectinase của Asp.niger
PL1
07

Bảng 3.3a. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống Asp.niger trên môi trư
ờng nuôi
cấy tới khả năng sinh tổng hợp pectinesterase của Asp.niger
PL1
08
Bảng 3.3b. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống Asp.niger trên môi trư
ờng nuôi
cấy tới khả năng sinh tổng hợp polygalacturonase của Asp.niger
PL1
09

Bảng 3.4a. Ảnh hưởng của hàm lượng (NH
4
)
2
SO
4
tới kh
ả năng sinh
tổng hợp polygalacturonase của Asp.niger
PL1
10
Bảng 3.4b. Ảnh hưởng của hàm lượng (NH
4
)
2
SO
4
tới kh
ả năng sinh
tổng hợp pectinesterase của Asp.niger
PL1
11
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường t
ới khả năng sinh tổng
hợp pectinase của Asp.niger
PL1
12
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy t
ới khả năng sinh tổng
hợp pectinase của Asp.niger

PL1
13
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của các loại dung môi khác nhau tới hoạt độ

pectinase trong quá trình chiết pectinase
PL1
14
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước cất/CP thô tới hoạt độ pectinase
trong quá trình chiết pectinase
PL1
15
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hoạt độ pectinase trong
quá trình chiết pectinase
PL1
16
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của các loại dung môi khác nhau tới hoạt độ
pectinase trong quá trình kết tủa pectinase
PL1
17
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của tỷ lệ acetone/dịch chiết enzyme đến hoạt
độ pectinase trong quá trình kết tủa pectinase
PL1
18
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của thời gian kết tủa đến hoạt độ pectinase

trong quá trình kết tủa pectinase
PL1

vii

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
STT TÊN HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ TRANG

01 Hình 1.1. Mô hình giả thuyết của protopectin 14
02 Hình 1.2. Mối quan hệ giữa cơ chất pectin và enzyme pectinase 18
03
Hình 2.1. Hình ảnh tế bào Asp.niger trên môi trường dịch thể khoai
tây
21
04 Hình 2.2. Hình ảnh khuẩn lạc Asp.niger trên môi trường khoai tây 22
05
Hình 3.1. Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường ban đầu t
ới khả năng sinh
tổng hợp pectinase của Asp.niger
35
06
Hình 3.2. Ảnh hưởng của hàm lượng cám t
ới khả năng sinh tổng hợp
pectinase của Asp.niger
37
07

Hình 3.3a. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống Asp.niger trên môi trư
ờng nuôi
cấy tới khả năng sinh tổng hợp pectinesterase của Asp.niger
38

08
Hình 3.3b. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống Asp.niger trên môi trườn
g nuôi

cấy tới khả năng sinh tổng hợp polygalacturonase của Asp.niger
38

09
Hình 3.4a. Ảnh hưởng của hàm lượng (NH
4
)
2
SO
4
t
ới khả năng sinh
tổng hợp polygalacturonase của Asp.niger
40
10
Hình 3.4b. Ảnh hưởng của hàm lượng (NH
4
)
2
SO
4
t
ới khả năng sinh
tổng hợp pectinesterase của Asp.niger
40
11
Hình 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường tới khả năng sinh tổng
hợp pectinase của Asp.niger
41
12

Hình 3.6. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tới khả năng sinh tổng
hợp pectinase của Asp.niger
42
13
Hình 3.7. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước cất/CP thô tới hoạt độ
pectinase
trong quá trình chiết pectinase
45
14
Hình 3.8. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hoạt độ pectinase
trong
quá trình chiết pectinase
47
15
Hình 3.9. Ảnh hưởng của tỷ lệ acetone/dịch chiết enzyme đến ho
ạt độ
pectinase trong quá trình kết tủa pectinase
50
16
Hình 3.10. Ảnh hưởng của thời gian kết tủa đến hoạt độ pectinase

trong quá trình kết tủa pectinase
52
viii

MỞ ĐẦU
Hiện nay ở nước ta, việc sử dụng enzyme khá phổ biến nhất là trong các
ngành công nghệ thực phẩm nhưng thường phải nhập khẩu enzyme với giá thành
cao do chưa tự sản xuất trong nước. Trong số các enzyme được ứng dụng rộng
rãi thì pectinase là nhóm enzyme có ứng dụng lớn thứ ba sau amylase và protease

trong công nghiệp đặc biệt là trong công nghiệp thực phẩm. Nó làm tăng hiệu
suất ép và làm trong nước, rượu quả, nó còn góp phần chiết rút các chất màu và
những chất hoà tan. Tuy nhiên giá thành các chế phẩm pectinase còn khá cao,
điều này sẽ hạn chế khả năng ứng dụng của enzyme này vào thực tế.

Trong khi
đó việc thu enzyme có rất nhiều nguồn, một nguồn phong phú nhất là vi sinh vật,
cộng với việc chúng ta có thể tận dụng được từ các nguyên liệu rẻ tiền như: cám
gạo, bã ép cà rốt, Do đó có thể làm giảm giá thành của enzyme phù hợp với
nhu cầu xã hội, nâng cao hiệu quả khi sử dụng enzyme.

Ở các nước, người ta có thể thu pectinase từ các chủng vi sinh vật khác
nhau (vi khuẩn, nấm mốc) trong đó một số nước đã sản xuất pectinase từ chủng
Asp.niger trên nhiều môi trường khác nhau cho hoạt tính pectinase khá tốt như:
Bungari (bistrin), Pháp (rapidase), Ba Lan (pectinol), …. Hãng Novo cũng có
hàng loạt chế phẩm pectinase sản xuất từ nấm mốc được sử dụng trong các ngành
công nghiệp như: rượu, nước trái cây, trong nước giải khát không có rượu, …
Tuy nhiên, chỉ có pectinase của Asp.niger được ứng dụng nhiều trong công
nghiệp thực phẩm. Các nhà khoa học đã nghiên cứu so sánh khả năng sinh
polygalacturonase giữa Asp.niger và Asp.oryzae, môi trường và nguồn nitơ
không ảnh hưởng tới hoạt tính polygalacturonase, sự thông gió ảnh hưởng rất lớn
tới hoạt động của polygalacturonase và polymetylgalacturonase. Ở nước ta, cũng
có một số nghiên cứu về pectinase và về Asp.niger. Đã phân lập nhiều chủng
nấm mốc có hoạt tính pectinase từ các nguồn khác nhau và chọn được một số
chủng Asp.niger có hoạt tính pectinase cao, trong đó đáng chú ý là chủng
Asp.niger 72 - 32. Đã phân lập và tuyển chọn một số chủng nấm Asp.niger sinh
enzyme pectinase cao từ một số phế phụ phẩm nông sản. Nghiên cứu các điều
ix

kiện tối ưu cho Asp.niger phân giải cellulose có trong phế liệu dứa nhằm xử lý

phế liệu dứa từ nhà máy đồ hộp dứa, nghiên cứu đã tìm được các điều kiện tối ưu
cho quá trình phân giải cellulose của Asp.niger như: tỷ lệ giống (6%), độ ẩm
(65%), nhiệt độ nuôi cấy (30
0
C), thời gian lên men (7 ngày). Nghiên cứu sinh
tổng hợp enzyme pectinase và cellulase từ Asp.niger và ứng dụng để xử lý vỏ cà
phê trong sản xuất phân hữu cơ.
Tuy nhiên, chưa có đề tài nào nghiên cứu, sản xuất pectinase từ bã thải cà
rốt. Vì thế, đề tài “
NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT PECTINASE BẰNG PHƯƠNG
PHÁP NUÔI CẤY
ASP.NIGER
TRÊN MÔI TRƯỜNG BÃ THẢI CÀ RỐT
” là
cần thiết nhằm giải quyết một lượng lớn bã thải cà rốt từ các nhà máy sản xuất
nước quả, đồ hộp cà rốt, cải thiện môi trường và tạo sản phẩm có giá trị, giảm giá
thành chế phẩm enzyme thu được, đáp ứng nhu cầu xã hội. Đồng thời, kết quả
nghiên cứu sẽ góp phần phong phú thêm nguồn cơ chất để thu nhận pectinase và
đẩy nhanh việc ứng dụng enzyme này.

3
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN VỀ CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. GIỚI THIỆU VỀ ENZYME VÀ SINH TỔNG HỢP ENZYME CỦA VI
SINH VẬT
1.1.1. Giới thiệu về enzyme [2, 7]
Enzyme là protein có hoạt tính xúc tác. Hầu hết các phản ứng hóa học xảy
ra trong cơ thể sống đều do enzyme xúc tác, chúng điều hòa quá trình chuyển hóa
các chất trong cơ thể sống, đảm bảo sự trao đổi thường xuyên giữa cơ thể sống và
môi trường bên ngoài, nghĩa là đảm bảo cho sự tồn tại của cơ thể sống.
* Các loại enzyme đều có đặc tính sinh học chung như sau:
a. Enzyme được tạo ra trong tế bào sinh vật: quá trình tổng hợp enzyme rất
phức tạp và được kiểm soát chặt chẽ.
b. Enzyme tham gia phản ứng trong tế bào sống và khi tách ra khỏi tế bào
sống.
c. Enzyme tham gia phản ứng trong điều kiện nhiệt độ ôn hòa. Vì trong quá
trình sống của tế bào, enzyme được tổng hợp và hoạt động trong điều
kiện nhiệt độ của tế bào và nhiệt độ của cơ thể. Nhiệt độ của cơ thể và
của tế bào sinh vật thường thấp (khoảng 30 - 40
0
C).
d. Enzyme có thể tham gia xúc tác các phản ứng trong và ngoài cơ thể từ
giai đoạn đầu đến giai đoạn giải phóng hoàn toàn năng lượng dự trữ
trong các hợp chất hóa học. Quá trình này được thực hiện theo chuỗi
phản ứng, mỗi chuỗi phản ứng được xúc tác bởi một loại enzyme, cuối
cùng tạo thành CO

2
, H
2
O, một số chất khác và giải phóng năng lượng.
Trong mỗi chuỗi phản ứng, sản phẩm của phản ứng trước là cơ chất cho
phản ứng sau.
e. Enzyme có thể thực hiện một phản ứng. Các phản ứng này xảy ra ở
ngoài tế bào.
4
f. Phản ứng enzyme là phản ứng tiêu hao năng lượng rất ít. Trong khi đó,
các phản ứng hóa học được xúc tác bởi các chất xúc tác hóa học đòi hỏi
năng lượng rất lớn.
Ví dụ: trong quá trình thủy phân Sucrose
Sucrose > Fructose + Glucose
Năng lượng hoạt hóa: Không có xúc tác : 32000 cal/ptg
Acid : 25000 cal/ptg
Enzyme Invertase: 9000 cal/ptg
g. Enzyme chịu sự điều khiển bởi gen và các điều kiện phản ứng. Gen
quyết định tổng hợp ra một loại enzyme. Mỗi một enzyme quyết định
một phản ứng sinh hóa.
Một gen → một enzyme → một phản ứng
Gen quyết định bản chất sinh học và bản chất hóa học của enzyme.
− Enzyme có thể hòa tan trong nước, trong dung dịch muối loãng nhưng
không tan trong các dung môi không phân cực. Dung dịch enzyme có
tính chất của dung dịch keo ưa nước. Khi hòa tan enzyme vào nước, các
phân tử lưỡng cực nước sẽ kết hợp với các ion, các nhóm ion hoặc các
nhóm phân cực trong phân tử enzyme tạo thành lớp vỏ hydrate. Lượng
nước hydrate khá lớn và có vai trò quan trọng trong các phản ứng sinh
hóa.
− Enzyme dễ bị kết tủa bởi các yếu tố vật lí và hóa học vốn làm kết tủa

protein. Ví dụ: enzyme bị kết tủa bởi amon sulphate, ethanol, acetone ở
nhiệt độ thấp.
− Apoenzyme quyết định tính đặc hiệu cao của enzyme và làm tăng hoạt
tính xúc tác của coenzyme.
− Coenzyme quyết định kiểu phản ứng mà enzyme xúc tác, trực tiếp tham
gia trong phản ứng và làm tăng độ bền của apoenzyme đối với các yếu tố
gây biến tính.
5
Bản chất của enzyme là protein có hoạt tính xúc tác, enzyme có đầy đủ
tính chất của một protein.
Enzyme có khối lượng phân tử bé nhất là 12700 Dalton, đa số chúng có
khối lượng phân tử 20000 – 90000 Dalton hoặc lớn hơn.
Enzyme có khả năng hòa tan trong nước hoặc trong dung dịch muối loãng,
do kích thước phân tử lớn nên cũng không qua được màng bán thấm.
Tất cả các yếu tố làm biến tính protein như acid đặc, kiềm đặc, muối kim
loại nặng đều có thể làm cho enzyme bị biến tính và mất hoạt lực xúc tác.
Enzyme cũng thường bị kết tủa và biến tính bởi các dung môi hữu cơ như rượu,
este, acetone, …. Các chất gây kết tủa thuận nghịch đối với enzyme như
(NH
4
)
2
SO
4
, NaCl và các dung môi hữu cơ ở nhiệt độ thấp cũng có tác dụng
tương tự với các chế phẩm enzyme. Khi kết hợp với một số chất như: cơ chất,
coenzyme, ion kim loại hoặc một số chất hữu cơ đặc biệt khác thì tính chất hóa lý
của enzyme cũng thay đổi. Ví dụ: độ bền nhiệt, tính hoạt quang, …
Enzyme cũng bị ảnh hưởng của các nhiều tác nhân như: nồng độ enzyme,
nồng độ cơ chất, nhiệt độ, pH, các chất kìm hãm (chất kìm hãm cạnh tranh, chất

kìm hãm không cạnh tranh), các chất hoạt hóa (ví dụ: ion kim loại, một số chất
hữu cơ).
Enzyme có hoạt lực xúc tác rất lớn. Ở điều kiện thích hợp hầu hết các
phản ứng xảy ra với tốc độ nhanh gấp 10
8
– 10
12
lần so với những phản ứng cùng
loại mà không có sự xúc tác tác của enzyme.
Hầu hết các enzyme đều có tính đặc hiệu cao đối với bản chất hóa học của
phản ứng được xúc tác và đối với cơ chất được sử dụng trong phản ứng.
Các phản ứng enzyme xúc tác gồm nhiều loại: phản ứng oxy hóa - khử,
các phản ứng vận chuyển, các phản ứng thủy phân, các loại phản ứng phân cắt,
các loại phản ứng đồng phân, các phản ứng tổng hợp.
Enzyme do tế bào tổng hợp và hoạt động trong môi trường cơ thể sống,
cho nên bản thân enzyme chịu sự kiểm soát và điều khiển của tế bào.
6
Apoenzyme quyết định tính đặc hiệu cao của enzyme và làm tăng tính xúc
tác của enzyme.
Coenzym quyết định kiểu phản ứng mà enzyme xúc tác trực tiếp tham gia
trong phản ứng và tăng độ bền của apoenzyme đối với các yếu tố gây biến tính.
Cơ chế tác dụng của enzyme trải qua ba giai đoạn:
− Giai đoạn I: enzyme kết hợp với cơ chất tạo thành phức hợp enzyme - cơ
chất (ES) không bền, phản ứng xảy ra nhanh và đòi hỏi năng lượng thấp.
− Giai đoạn II: là giai đoạn tạo phức chất hoạt hóa, đây là giai đoạn xảy ra
sự biến đổi cơ chất dưới tác dụng của một số nhóm chức trong trung tâm
hoạt động của enzyme và làm cho cơ chất từ chỗ không hoạt động trở
thành hoạt động, một số liên kết trong cơ chất bị kéo căng ra và mật độ
electron trong cơ chất bị thay đổi.
− Giai đoạn III: là giai đoạn tạo ra sản phẩm và giải phóng enzyme, đây là

giai đoạn cuối của quá trình phản ứng. Từ cơ chất sẽ hình thành sản phẩm
và enzyme được giải phóng dưới dạng tự do như ban đầu.
Sự tạo thành phức enzyme - cơ chất (ES) và biến đổi phức này thành sản
phẩm trải qua ba giai đoạn:

Trong đó E: enzyme; S: cơ chất; ES: phức hợp enzyme - cơ chất; P: sản
phẩm.
Nguồn nguyên liệu thu enzyme có thể từ động vật, thực vật và vi sinh vật.
− Từ thực vật: nhựa đu đủ tách papain, hạt đậu tương tách urease, thân và
quả dứa tách bromelin,
− Từ động vật: từ một số mô và cơ quan động vật người ta có thể thu nhận
nhiều enzyme khác nhau như từ dạ dày có thể thu được pepsin, từ tụy tạng
thu được trypsin, chymotrypsin,
− Từ vi sinh vật: vi sinh vật thường dùng để sản xuất chế phẩm enzyme gồm
nhiều loại: Aspergillus, Bacillus, Pencillium, Clostridium, Streptomyces
và nấm men.
E + S
→
ES
→
P + E
7
Mặc dù enzyme có trong tất cả các cơ quan, mô của động vật, thực vật
cũng như trong tế bào vi sinh vật, song việc tách enzyme nhất là tách với quy mô
công nghiệp thuận lợi về kinh tế chỉ có thể tiến hành trong những trường hợp mà
vật liệu có chứa một lượng lớn enzyme cũng như cho phép thu được enzyme với
hiệu suất cao. Vì thế enzyme từ vi sinh vật được sử dụng rộng rãi trong công
nghiệp và đời sống vì những ưu điểm như: tốc độ sinh sản nhanh, kích thước tế
bào bé, khối lượng nhỏ nên có thể thu được một khối lượng enzyme lớn trong thời
gian ngắn. Ngoài ra, các enzyme của vi sinh vật còn có hoạt tính cao mà nguyên

liệu dùng để nuôi cấy chúng thường rẻ tiền nên giá thành của các chế phẩm
enzyme từ vi sinh vật thấp hơn các nguồn khác. Đồng thời, chúng ta có thể định
hướng sinh tổng hợp enzyme ở vi sinh vật theo hướng chọn lọc enzyme với số
lượng lớn, có thể chủ động trong sản xuất.
Enzyme có rất nhiều ứng dụng trong công nghiệp cũng như trong đời sống
như trong hóa phân tích, y học, công nghiệp, thực phẩm.
Định lượng các chất trong hóa phân tích: người ta dùng enzyme có tác
dụng phân giải riêng chất ấy, sau đó dùng một trong các phương pháp phân tích
thông thường để định lượng các chất sau phản ứng. Từ đó suy ra lượng chất cần
phân tích. Nếu chất cần phân tích có tác dụng kìm hãm hoặc kích thích đặc hiệu
một enzyme nào đó ta có thể định lượng bằng cách xác định mức độ ảnh hưởng
của chúng tới hoạt độ enzyme, đối chiếu với bảng hoặc đồ thị chuẩn và suy ra
lượng chất cần phân tích.
Trong y học: có thể sử dụng enzyme để chữa bệnh, để sản xuất các sinh
tố và kháng sinh. Ví dụ: có thể dùng enzyme để tăng thêm lượng enzyme cho cơ
thể, có thể dùng enzyme để chữa các bệnh tiêu hóa kém hoặc dùng chymotrypsin
để nhanh làm lành các vết thương, … Ngoài ra, có thể dùng enzyme để phân giải
thuốc khi cơ thể bị dị ứng mạnh với các thuốc này. Ví dụ: dùng penicillinase khi
cơ thể bị dị ứng với penicillin, …
Trong công nghiệp xà phòng dùng để làm chất tẩy rửa dầu mỡ công
nghiệp, sử dụng enzyme amylase để khử hồ trên vải trong công nghiệp dệt. Sử
8
dụng protease của Asp.oryzae 33 để khử lông trâu bò trong công nghiệp thuộc da,
cho hiệu suất cao hơn so với phương pháp vôi sunfua; ứng dụng cellulase thủy
phân màng cellulose để trích ly các chất keo trong rong biển, trong công nghiệp
bột giấy dùng enzyme để sản xuất bột giấy và giấy.
Trong thực phẩm: sử dụng amylase trong tạo men bánh mì, men bia. Nó
làm cho chất lượng bánh mì tăng cao, bánh xốp hơn, ngọt hơn, màu sắc đẹp hơn.
Dùng amylase để sản xuất glucose từ tinh bột thay cho phương pháp dùng acid
HCl. Sử dụng protease để làm mềm thịt, sản xuất bột cá sản xuất nước mắm, thủy

phân thịt cá và nó còn được ứng dụng trong chế biến đồ hộp cá rán. Dùng
pectinase để làm tăng hiệu suất ép nước quả và làm trong dịch nước quả, chống
hiện tượng kết tủa trắng của nước khi bảo quản, …
Trong nông nghiệp: có thể làm thức ăn cho động vật nhằm tăng giá trị
dinh dưỡng của thức ăn thô, tăng hệ số sử dụng thức ăn. Có thể dùng để xử lý các
hạt trước khi gieo mầm nhằm rút ngắn thời gian nảy mầm và tăng sản lượng thu
hoạch.
1.1.2. Sự sinh tổng hợp enzyme cảm ứng của vi sinh vật
 Sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật [9]
Trong tế bào vi sinh vật thường xuyên xảy ra quá trình sinh tổng hợp
enzyme. Quá trình sinh tổng hợp enzyme là một quá trình rất phức tạp, gắn liền
mật thiết với cấu trúc tế bào và được tiến hành qua nhiều giai đoạn với sự tham
gia của nhiều hệ enzyme và các acid nucleic khác nhau.
Theo thuyết khuôn và dựa trên những quan điểm hiện đại có thể chia quá
trình này một cách ước lệ ra làm 4 giai đoạn chính:
− Giai đoạn 1: hoạt hóa acid amin.
− Giai đoạn 2: vận tải acid amin đã được hoạt hóa đến riboxom là địa điểm
tổng hợp protein mạnh mẽ nhất của tế bào.
− Giai đoạn 3: xếp đặt và phối tác các amin đã được hoạt hóa theo một trật
tự đã cho trên khuôn ARN thông tin và hình thành liên kết peptide.
9
− Giai đoạn 4: giải phóng mạnh polypeptide đã được tổng hợp và thiết lập
cấu trúc không gian của phân tử enzyme đặc hiệu trong không gian ba
chiều.
 Sinh tổng hợp enzyme cảm ứng [9]
Những enzyme được tạo thành do tế bào vi sinh vật không phải chỉ phụ
thuộc vào hoạt tính riêng của từng loại vi sinh vật mà còn phụ thuộc vào thành
phần môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy.
Khi nuôi cấy nấm mốc Asp.oryzae trên môi trường cám mì theo phương
pháp bề mặt có hàng chục enzyme được tạo thành, trong đó có amylase,

proteinase, maltase, pectinase, invectase, ribonuclease, …. Nếu nuôi cấy nấm
mốc này trên môi trường czapek với tinh bột và nitrate thì chỉ có α - amylase
được tạo thành, còn các enzyme khác chỉ có vết. Nhưng nếu thay natri nitrate
bằng casein ở dạng sữa đã tách chất béo thì proteinase được tạo thành cùng với
amylase.
Cũng tương tự như vậy khi nuôi cấy bề mặt nấm mốc Asp.awamori trên
cám cũng thu được một số lớn glucoamylase, α - amylase, proteinase acid,
pectinase, cellulase. Nhưng khi nuôi chìm trên môi trường chứa tinh bột và
nitrate thì chỉ thu được phức hợp amylase. Thay tinh bột bằng xylan tách từ rơm
sẽ thu được xylanase và dùng dầu thực vật làm nguồn cacbon sẽ thấy tạo thành
lipase.
Điều đó ta cũng có thể thấy được trên bảng tổng hợp 1.1.
Bảng 1.1. Giới thiệu sự tạo thành enzyme của nấm mốc phụ thuộc vào
thành phần môi trường và phương pháp nuôi cấy
Giống mốc
Thành phần
môi trường
Phương pháp
nuôi cấy
Enzyme tạo thành
Asp.oryzae Cám mì Bề mặt
α - amylase, proteinase,
xylanase, pectinase,
ribonuclease
Asp.oryzae 3
Môi trường Czapek
với tinh bột và
Chìm
α - amylase và vết của
10

- 9 - 15 nitrate glucoamylase, proteinase
Asp.oryzae 3
- 9 - 15
Sữa tách chất béo Chìm Proteinase
Asp.awamori

Cám mì Bề mặt
α - amylase, glucoamylase,
transglucozilase, proteinase
acid, pectinase, xylanase
Asp.awamori

Môi trường Czapek
với tinh bột và
nitrate
Chìm
α - amylase, glucoamylase,
transglucozilase
Asp.awamori

Môi trường Czapek
với xylan
Chìm Xylanase
Asp.awamori

Môi trường Czapek
với dầu thực vật
Chìm Lipase

Điều này chứng tỏ một cách rõ ràng rằng đối với quá trình sinh tổng hợp
các enzyme cảm ứng (chủ yếu là các enzyme ngoại bào) của vi sinh vật phải phụ
thuộc vào các cơ chất có trong môi trường. Ứng với từng cơ chất cụ thể mà có
loại enzyme khác nhau. Hiện tượng này có thể được giải thích bằng lý thuyết
sinh tổng hợp enzyme cảm ứng. Hiện tượng này chỉ xảy ra trong khi nuôi cấy vi
sinh vật mà không thấy ở động vật và thực vật. Những enzyme thủy phân của vi
sinh vật thường đều thuộc hệ enzyme cảm ứng. Khi trong môi trường nuôi cấy có
một chất khó đồng hóa, vi sinh vật phải tiết vào môi trường một hoặc những
enzyme tương ứng để phân hủy nó thành những chất dễ đồng hóa.
Có thể nêu lên một định nghĩa tổng quát về quá trình sinh tổng hợp
enzyme cảm ứng như sau: một quá trình sinh tổng hợp enzyme được gọi là cảm
ứng, nếu như nó chỉ xảy ra với mức độ đáng kể khi trong môi trường có cơ chất
đặc hiệu của enzyme này hoặc các chất trao đổi (metabolit) có cấu trúc tương tự
cơ chất. Các enzyme thuộc loại này được gọi là enzyme cảm ứng, các cơ chất
kích thích quá trình sinh tổng hợp này được gọi là chất cảm ứng.
Muốn tổng hợp được enzyme cảm ứng cần phải có 4 đều kiện:
− Có gen tương ứng trong thể nhiễm sắc của tế bào.
11

− Có đầy đủ các nguyên liệu để xây dựng các phân tử enzyme đó (các acid
amin và các hợp phần của coenzyme nếu enzyme đó gồm hai cấu tử).
− Năng lượng cần thiết dùng cho việc tổng hợp enzyme.
− Chất cảm ứng. Nếu không có chất cảm ứng thì dù đủ ba điều kiện trên cũng
không thể tổng hợp được enzyme.
Như vậy ta có thể coi việc có chất cảm ứng là điều kiện rất cần thiết để thu
được những enzyme mong muốn. Trong công nghiệp sản xuất enzyme cần phải
lựa chọn những chất cảm ứng thích hợp và xác định nồng độ tối ưu của nó trong
môi trường để có hiệu suất sinh tổng hợp enzyme cao nhất.
Bảng 1.2. Sinh tổng hợp enzyme của nấm mốc và xạ khuẩn phụ thuộc vào
các chất cảm ứng

Vi sinh vật Enzyme Chất cảm ứng
Tăng ho
ạt lực của
enzyme (%)
Asp.oryzae 153
α - amylase
Tinh bột
Maltose
100
200

Asp.oryzae
α - amylase
Maltose
Isomaltose
Panose
100
176
176
Asp.niger Proteinase acid
NaNO
3

Peptone
Protide đậu nành
2
100
125
Asp.niger
Pectinase

Pectin
Pectin + lactose
100
250

Từ bảng 1.2 ta thấy tinh bột là chất cảm ứng tốt nhất đối với enzyme α -
amylase. Song, nấm mốc Asp.oryzae có thể sinh ra enzyme này khi có mặt trong
môi trường các chất cảm ứng khác, như maltose hoặc isomaltose, panose. Đối
với pectinase của Asp.niger được tạo thành với số lượng cao khi bổ sung pectin
cùng với lactose vào môi trường.
Đa số các enzyme thủy phân là những enzyme cảm ứng. Vì vậy, khi nuôi
cấy vi sinh vật sinh enzyme theo phương pháp chìm trên môi trường tổng hợp
12

người ta thường xuyên bổ sung vào môi trường các chất cảm ứng. Khi nuôi cấy
nấm mốc trên môi trường tự nhiên phức tạp, như môi trường có cám là chất cảm
ứng cũng cho hiệu quả rõ rệt. Nếu bổ sung bã củ cải đường vào môi trường có
thể làm tăng khả năng sinh tổng hợp pectinase hoặc cellulase vì trong bã này có
chứa pectin và cellulose.
Như vậy, muốn sản xuất pectinase ta phải tiến hành nuôi cấy vi sinh vật
trên môi trường có chứa nhiều pectin.
1.2. GIỚI THIỆU VỀ PHẾ LIỆU CÀ RỐT
Cà rốt là loại rau được sử dụng phổ biến trong các sản phẩm khác nhau
như: nước ép cà rốt, đồ hộp cà rốt, … nên nhu cầu tiêu dùng về loại rau này rất
lớn. Hàng năm nước ta vẫn phải nhập khẩu cà rốt đặc biệt từ Trung Quốc (tháng
8/2007 đạt 2.231 triệu USD, chiếm 30.83% tổng kim ngạch nhập khẩu rau của cả
nước (7.24 triệu USD)) [26].
Tuy nhiên, trong quá trình chế biến các sản phẩm từ cà rốt, lượng phế liệu
chúng ta không tận dụng hết không phải là nhỏ. Chẳng hạn khi sản xuất nước ép

cà rốt thì lượng phế liệu chiếm tới 40%, trong một số sản phẩm khác mặc dù đã
tận dụng tối đa nhưng lượng phế liệu vẫn chiếm ít nhất là 15%. Thông thường
những phế liệu này thường là phần vỏ, dễ, bã ép, …
Như vậy, giả sử hàng năm chúng ta sử dụng khoảng 1 triệu tấn cà rốt thì
lượng phế liệu cà rốt thải ra khoảng 0.15 triệu tấn. Với lượng phế liệu này chúng
ta sẽ xử lý chúng ra sao ? Và chúng ta thường nghĩ ngay đến việc sử dụng chúng
làm thức ăn chăn nuôi hoặc làm phân bón cho nông nghiệp, và hiện tại chúng ta
đang sử dụng chúng theo cách này mặc dù không đem lại hiệu quả kinh tế cao.
Tuy nhiên, trong thành phần của lượng phế liệu này vẫn còn khá nhiều
chất dinh dưỡng như nguồn nitơ, cacbon, vitamin và khoáng chất. Chẳng hạn, khi
đem phân tích thành phần của bã cà rốt sau khi ép ta có kết quả sau:
Bảng 1.3. Thành phần cơ bản của phế liệu cà rốt
Nước Khoáng Nitơ tổng số Pectin
87.77% 0.8% 0.18% 3.5%
13


Các thành phần trong bã sẽ cung cấp nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật:
cung cấp nitơ cho vi sinh vật sinh tổng hợp các acid amin cũng như enzyme,
nguồn khoáng và vitamin sẽ thúc đẩy cũng như cung cấp nhu cầu cần thiết cho vi
sinh vật sinh trưởng và phát triển, cung cấp pectin – đây là cơ chất cảm ứng cho
vi sinh vật sinh tổng hợp pectinase. Vì thế, môi trường có chứa bã cà rốt hoàn
toàn có thể sử dụng làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật.
1.3. PECTINASE VÀ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PECTINASE CỦA
VI SINH VẬT
1.3.1. Giới thiệu về pectin và pectinase vi sinh vật
 Giới thiệu về pectin
Pectin là cơ chất cảm ứng của enzyme pectinase. Pectin rất phổ biến trong
tự nhiên, đặc biệt trong giới thực vật. Pectin có trong thành phần dịch tế bào,
màng tế bào và màng trung gian của mô thực vật. Pectin là hợp chất cao phân tử

mạch thẳng, do các acid galacturonic kết hợp với nhau bằng liên kết α - 1,4 -
glucozide tạo nên.
Trong thực vật, pectin thường tồn tại dưới ba dạng: pectin hòa tan,
protopectin, trong dịch tế bào chứa pectin hòa tan. Các dạng pectin khác nhau
trong nguyên liệu quả thường thay đổi và phụ thuộc nhiều vào tính chất cơ lý của
mô quả. Là một chất sát trùng ưa nước, pectin nâng cao khả năng giữ nước của
mô thực vật. Những tính chất của pectin phụ thuộc vào hàm lượng acid
galacturonic, thường thì acid polygalacturonic chiếm khoảng 40 – 60%, phần còn
lại là araban và galactan liên kết với polygalacturonic acid hoặc bằng liên kết
nguyên tử hoặc liên kết dieste ở dạng phân nhánh bên. Khi thủy phân pectin dễ
tách ra thành hai phần: phần trung hòa – phức chất galacturoaraban và phần acid
– acid pectic bị este hóa một phần.
Protopectin có cấu tạo hóa học rất phức tạp và không hòa tan trong nước.
Protopectin tạo độ cứng nhất định cho quả xanh. Cho đến nay, vẫn chưa có ý
kiến thống nhất về cấu tạo của protopectin. Cái khó khăn ở chỗ không thể tách nó
14

ở trạng thái chưa biến đổi. Theo F.A.Henglêin thì protopectin có cấu tạo như
hình 1.1.







Hình 1.1. Mô hình giả thuyết của protopectin (theo Hengleine)
1. Ion kim loại nối các nhóm cacboxyl của hai đoạn mạch pectin
2. Ion kim loại nối đoạn mạch pectin với gốc acid photphoric
3. Hai đoạn mạch pectin, trong đó mỗi đoạn đều tạo thành este với acid

photphoric bằng nhóm OH của mình
4. Mảnh có chứa các dạng liên kết 2 và 3
5. Mảnh có chứa đoạn mạch và gốc đường (arabinose, galactose, ramnose,
araban)
6. Mảnh có chứa các dạng liên kết 3 và 5
Các đoạn mạch pectin nối với nhau hoặc nối với đoạn mạch cellulose
bằng lực Vandesvan.
Trong thành phần protopectin có các phân tử pectin (trong hình được biểu
diễn bằng các đoạn mạch pectin), các phân tử cellulose (trong hình được chỉ bằng
các đoạn mạch cellulose), các ion Ca, Mg, các gốc acid phosphoric, acid acetic
và đường.
Khi thủy phân protopectin cẩn thận bằng acid sẽ giải phóng ra pectin hòa
tan.
Pectin hay pectin hòa tan là este methylic của acid polygalacturonic cao
phân tử. Pectin trong tự nhiên hầu như chỉ có khoảng 2/3 nhóm cacboxyl của
acid polygalacturonic được este hóa bằng methanol. Pectin được este hóa cao
15

như thế sẽ tạo ra gel đặc khi ở trong dung dịch đường có nồng độ 65% và trong
môi trường acid.
Acid pectinic là acid polygalacturonic cao phân tử đã hoàn toàn giải
phóng khỏi nhóm methoxyl, nghĩa là trong đó có chứa một nhóm cacboxyl tự do
trên một đơn vị acid galacturonic.
Khối lượng phân tử của pectin thường xê dịch từ 20.000 - 200.000 phụ
thuộc vào nguồn pectin.
Pectin không hòa tan trong rượu và các dung môi hữu cơ khác. Pectin hòa
tan trong nước, amoniac, kiềm, carbonate natri, etylendiamine và trong glyxerine
nóng. Pectin dễ dàng bị kết tủa bởi ethanol, isopropanol, acetone, amon sunfate,
clorua nhôm, các muối đồng, muối canxi và bởi acid. Khi tăng mức độ este hóa
bằng methanol cũng như khi giảm khối lượng phân tử thì độ hòa tan của pectin sẽ

tăng lên. Khi đó độ nhớt của dung dịch pectin sẽ tăng lên không tỷ lệ với nồng
độ.
Độ bền vững của pectin trước các enzyme sẽ được tăng lên khi có mặt các
cation, đặc biệt là Al
3+
và Fe
3+
.
 Pectinase vi sinh vật [7]
Pectinase vi sinh vật có những đặc điểm sau:
Theo quan điểm hiện đại, trong phức hệ enzyme pectinase có những
enzyme sau:
− Pectinesterase (pectase – 3.1.1.11) phân cắt liên kết este giữa
methanol và nhóm cacboxyl của acid galacturonic theo sơ đồ:
Pectin + nH
2
O → methanol + acid pectinic
− Polygalacturonase (pectinase 3.2.1.15) thủy phân liên kết α - 1,4 - D -
galactozide giữa các phần tử acid galacturonic trong pectin và trong
acid polygalacturonic khác.
− Protopectinase tách araban và galactan khỏi protopectin để tạo thành
dẫn xuất methyl của acid polygalacturonic (tức là pectin hòa tan).
− Transeliminase phân hủy pectin bằng con đường phi thủy phân.
16

• Pectinesterase
Từ canh trường nấm mốc Asp.niger, người ta đã thu được enzyme
pectinesterase ở trạng thái đồng thể. Và người ta cũng đã xác lập được rằng N -
acid cuối cùng trong phân tử enzyme là phenilalanine.
Pectinesterase thủy phân liên kết este trong pectin cũng như trong các acid

pectic để tạo thành methanol và acid pectinic.
Pectinesterase của nấm mốc sẽ thủy phân trước nhất là nhóm methyleste
nằm ở giữa hai nhóm cacboxyl tự do. Và enzyme sẽ thủy phân lần lược các liên
kết este dọc theo phân tử pectin. Người ta cũng thấy rằng pectinesterase của nấm
mốc thủy phân pectin và các este của các acid polygalacturonic sâu sắc hơn
pectinesterase của thực vật. Hoạt độ của pectinesterase phụ thuộc nhiều vào mức
độ este hóa của pectin và tỷ lệ thuận với mức độ este hóa. Chẳng hạn, đối với tác
dụng của pectinesterase từ nấm mốc Asp.niger, cần thiết phải có pectin este hóa ở
mức độ cao không ít hơn 70%.
pH tối ưu của pectinesterase từ nấm mốc là 4.5 – 5.5, còn chế phẩm đã
loại bỏ enzyme polygalacturonase là 2.0 – 6.5. Trái lại, pH tối ưu của
pectinesterase từ thực vật thượng đẳng là 6.0 – 8.
Nhiệt độ tối ưu của pectinesterase từ nấm mốc là 40 – 45
0
C. Từ 55
0
C –
62
0
C thì enzyme bị vô hoạt, trong khi đó nhiệt độ tối ưu của pectinesterase từ
thực vật thượng đẳng cao hơn (từ 55
0
C - 60
0
C).
Ion Na và đặc biệt là ion Ca, cũng như clorua Na, K và Ca sẽ hoạt hóa
pectinesterase từ nấm mốc Conithyrium diplodiella và từ Asp.niger. Trái lại các
cation hóa trị 3 và 4 (nitrate Hg, Pb, sunfate nhôm và clorua sắt) sẽ kìm hãm tác
dụng của pectinesterase.
• Polygalacturonase

Polygalacturonase có tên gọi hệ thống là polygalacturonitglucanhydrolase.
Dựa vào cơ chế tác dụng, có thể chia polygalacturonase thành:
− Endopolygalacturonase phân cắt các liên kết α - 1,4 ở phía trong phân
tử pectin cũng như ở phía trong phân tử acid polygalacturonic.
17

− Exopolygalacturonase có khả năng phân cắt dần dần từng phân tử acid
galacturonic, bắt đầu từ đầu không khử của mạch.
Không những thế, các endo và exopolygalacturonase còn thể hiện tính đặc
hiệu cao hơn. Một số endo và exopolygalacturonase có thể tác dụng trên pectin
đã methyl hóa, do đó có tên là endo hay exopolymetylgalacturonase. Một số khác
chỉ có khả năng phân cắt những cơ chất pectin đã mất hết nhóm methyl, nghĩa là
chỉ tác dụng trên acid pectinic (acid polygalacturonic). Do đó mà có tên gọi là
endo hay exopolygalacturonase.
Endopolygalacturonase cũng có tên nữa là polygalacturonase dịch hóa.
Còn exopolygalacturonase thì có tên là polygalacturonase đường hóa.
Các sản phẩm trung gian của quá trình thủy phân pectin bởi
polygalacturonase có thể là các acid penta, tetra, tri và digalacturonic.
pH tối ưu cuả polygalacturonase dịch hóa khi tác dụng trên acid pectinic
thì nằm trong khoảng 4.0 – 5.5, khi tác dụng trên pectin thì có pH tối ưu trong
khoảng 5.5 – 6. Còn polygalacturonase đường hóa khi tác dụng trên pectin thì có
pH tối ưu cao hơn (4.4 – 4.6).
Các polygalacturonase chủ yếu bền vững ở trong vùng pH = 4.0 – 6.
Polygalacturonase đường hóa từ Asp.niger nếu được hoạt hóa bằng thủy ngân thì
có thể bền vững khi pH = 2.5.
Nhiệt độ tối ưu của đa số polygalacturonase nằm trong khoảng 40 – 45
0
C.
Trong khoảng nhiệt độ đó, chúng thường bền vững, nhưng sẽ bị vô hoạt khi ở
nhiệt độ 50

0
C và 55 – 65
0
C.
Các polygalacturonase cũng như pectinesterase đều được hoạt hóa bởi các
cation của kim loại kiềm cũng như cation amon.
• Transeliminase
Transeliminase có khả năng làm đứt liên kết α - 1,4 của phân tử pectin
bằng con đường khác con đường phi thủy phân, kết quả là tạo ra các đơn phân
galacturonic có chứa nối đôi (4 - dezoxi - 5 - cetogalacturonic).
18

Transeliminase cũng có tính đặc hiệu cao, do đó người ta phân biệt các
transeliminase sau: endopectintranseliminase, exopectintranseliminase,
endopectinic - transeliminase, exopectinic - transeliminase.
Transeliminase từ nguồn khác nhau thì có cơ chế tác dụng và các thuộc
tính khác nhau. Chẳng hạn, transeliminase từ Bac.polymyxa tác dụng được trên
uronit cao, nhưng không tác dụng được trên acid trigalacturonic, transeliminase
từ nấm mốc hoạt động tối ưu ở pH = 5.2 trái lại transeliminase từ vi khuẩn hoạt
động tối ưu ở pH = 7 - 8.5.
Mối quan hệ giữa cơ chất và các enzyme có thể minh họa bằng hình 1.2.

Hình 1.2. Mối quan hệ giữa cơ chất pectin và enzyme pectinase
Người ta thường thu pectinase từ canh trường bề mặt hay bề sâu của nấm
mốc. Các vi khuẩn và nấm men cũng tổng hợp được enzyme này. Asp.niger chủ
yếu tổng hợp pectinesterase còn diplodiella, Pen.citrimin tạo ra chủ yếu là
polygalacturonase. Nấm men Saccharomyces fragilis dường như chỉ tạo ra
endopolygalacturonase, vi khuẩn Bac.polymyxa, Bac.species lại chủ yếu là tạo ra
transeliminase.

Protopectin
Các uronit
trung gian

Pectin
Protopectinase
Araban
Galactan

Acid
digalacturonic
Acid pectinic
Exopolym

-
etylgalactu
- ronase
Acid
Galacturonic

Endopolymety

Pectinesterase

Endopolyga -
lacturonase
Exopol-
ygalact-
ronase
galacturonase