nghiên cứu chiết rút chitinase từ lá khoai lang và bước đầu thử nghiệm thủy phân chitin để sản xuất olygo-chitin

1


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
=====***=====







ĐẶNG TRUNG THÀNH

NGHIÊN CỨU CHIẾT RÚT CHITINASE
TỪ LÁ KHOAI LANG VÀ BƯỚC ĐẦU THỬ NGHIỆM
THỦY PHÂN CHITIN ĐỂ SẢN XUẤT OLYGO-CHITIN

LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT


Chuyên ngành: Công nghệ Sau thu hoạch
Mã số: 60.54.10
Người hướng dẫn khoa học: GS. TS. Trần Thị Luyến





Nha Trang, tháng 06/2008

2

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan là thực hiện đề tài nghiêm túc, trung thực. Các số liệu thu
được trong đề tài là kết quả nghiên cứu của bản thân, không sao chép số liệu của các
tác giả khác.

Người cam đoan

3


LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được đề tài thạc sỹ, cũng như bản thân trưởng thành như ngày
hôm nay, cho tôi xin được gửi lời cảm ơn tới bố mẹ tôi đã sinh thành và dưỡng dục,
động viên giúp đỡ tôi những lúc khó khăn, chia sẻ niềm vui nỗi buồn trong suốt
cuộc đời.
Cho tôi được cảm ơn tới các thầy cô giáo đã dạy dỗ tận tình, trang bị những
kiến thức cần thiết để tôi trưởng thành như ngày hôm nay.
Tôi xin cảm ơn tới Ban Chủ nhiệm khoa Chế biến, các thành viên trong bộ
môn Công nghệ Chế biến, các thành viên trong khoa Chế biến đã giúp đỡ tôi rất
nhiều trong công việc, giúp tôi hoàn thành đề tài cũng như động viên tinh thần
những lúc khó khăn.
Đặc biệt, tôi xin cảm ơn tới GS.TS. Trần Thị Luyến. Cô không chỉ là người
hướng dẫn thực hiện đề tài cho tôi mà còn hướng cho tôi đi theo con đường nghiên
cứu khoa học tuy gian khổ nhưng cũng có nhiều vinh quang.
Tôi cũng xin cảm ơn tới các bạn cùng học lớp cao học 2004 và bạn bè đã
giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.

4

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT



CPE: Chế phẩm enzyme chitinase
DC: Dịch chiết
COS: chitoolygosaccharide

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1: Một số thành phần trong lá khoai lang trong 100 g lá 19
Bảng 2: Nồng độ glucosamine chuẩn trong dung dịch. (phụ lục 2)
Bảng 3: Mối tương quan giữa hàm lượng glucosamine và độ hấp phụ: (phụ lục 2)


5

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC HÌNH
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
MỞ ĐẦU 1
Chương 1 : TỔNG QUAN ĐỀ TÀI 10
1.1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ ENZYME 10
1.1.1.Giới thiệu chung về enzyme 10
1.1.2.Giới thiệu enzyme chitinase 17
1.1.3. Giới thiệu về cây khoai lang 19
1.1.4.Giới thiệu về chitin và một số dẫn xuất của chitin 21
1.2.CÁC NGHIÊN CỨU VỀ CHITINASE 25
1.2.1. Các công trình nghiên cứu ngoài nước. 25
1.2.2. Các công trình nghiên cứu trong nước. 29

Chương 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 31
2.1.1.Nguồn thu nhận enzyme chitinase 31
2.1.2. Vật liệu sử dụng để sản xuất olygo-chitin 31
2.2.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32
2.2.1.Phương pháp thu nhận và bảo quản nguyên liệu thu chitinase: 33
2.2.2. Bố trí thí nghiệm lựa chọn giống khoai lang thích hợp 33
2.2.3. Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng tình trạng sâu bệnh của cây, vị trí
chiết rút đến hoạt độ chitinase. 34
2.2.4. Bố trí thí nghiệm xác định phương pháp tách chiết enzyme chitinase 35
2.2.5. Bố trí thí nghiệm thu nhận chế phẩm enzyme (CPE) 36
2.2.6. Xác định hoạt độ của enzyme chitinase theo phương pháp NELSON 38
2.2.7. Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ, pH đến hoạt độ
chitinase DC và CPE. 38
2.2.8. Bố trí thí nghiệm xác định độ bền nhiệt của chitinase DC và CPE. 39
2.2.9.Xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân chitin bằng chế
phẩm chitinase (CPE). 39

6

2.2.10. Các phương pháp phân tích. 41
2.2.11. Các thiết bị thí nghiệm đã sử dụng. 42
2.2.12. Phương pháp xử lý số liệu 42
Chương 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 43
3.1.XÁC ĐỊNH LOẠI KHOAI LANG SỬ DỤNG CHIẾT CHITINASE. 43
3.1.1. Kết quả chọn giống khoai lang sử dụng chiết rút chitinase. 43
3.1.2. Kết quả nghiên cứu hoạt độ chitinase từ các phần khác nhau của cây
khoai lang. 44
3.1.3. Kết quả nghiên cứu tình trạng sâu bệnh của cây ảnh hưởng đến hoạt độ
chitinase 45

3.2. XÁC ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN CHITINASE DC, CPE
3.2.1.Kết quả nghiên cứu tách chiết chitinase DC 47
3.2.2. Kết quả nghiên cứu thu nhận CPE 50
3.3. NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT ĐỘ
CHITINASE DC VÀ CPE. 55
3.3.1. Kết quả xác định nhiệt độ thích hợp đối với hoạt độ chitinase. 55
3.3.2. Kết quả xác định độ bền nhiệt của chitinase. 57
3.3.3. Kết quả xác định pH thích hợp đối với hoạt độ chitinase 58
3.4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN CHITIN BẰNG
ENZYME CHITINASE. 59
3.4.1. Kết quả nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân chitin
bằng chitinase. 59
3.4.2. Hiệu suất thủy phân chitin của chitinase 67
Kết luận và đề xuất ý kiến 73
1.Kết luận: 73
2.Đề xuất ý kiến 74
TÀI LIỆU THAM KHẢO 75
PHỤ LỤC

Hình 3.1. Ảnh hưởng của giống khoai lang khác nhau đến hoạt độ chitinase. 43
Hình 3.2. Ảnh hưởng từng phần khác nhau của cây đến hoạt độ chitinase. 44
Hình 3.3. Ảnh hưởng tình trạng bệnh đến hoạt độ enzyme thu được. 46


7

Hình 3.4.Ảnh hưởng của dung môi chiết rút đến hoạt độ của chitinase. 47
Hình 3.5. Ảnh hưởng tỉ lệ dung môi/nguyên liệu đến hoạt độ chitinase. 48
Hình 3.6. Ảnh hưởng thời gian chiết đến hoạt độ chitinase. 49
Hình 3.7.Ảnh hưởng của các tác nhân kết tủa đến hoạt độ của chitinase. 50

Hình 3.8.Ảnh hưởng nồng độ ethanol (%) đến hoạt độ chitinase 52
Hình 3.9. Ảnh hưởng thời gian kết tủa đến hoạt độ CPE. 54
Hình 3.10.Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của chitinase DC và CPE. 55
Hình 3.11.Độ bền nhiệt của chitinase trong DC và CPE. 57
Hình 3.12.Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của chitinase trong DC và CPE. 58
Hình 3.13.Ảnh hưởng của nồng độ CPE và thời gian đến lượng olygo-chitin thu được. . 60
Hình 3.14.Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến lượng olygo-chitin thu được. 62
Hình 3.15.Ảnh hưởng của pH và thời gian đến lượng olygo-chitin thu được. 64
Hình 3.16.Ảnh hưởng của nồng độ huyền phù chitin và thời gian đến lượng olygo-
chitin thu được. 65
Hình 3.17.Ảnh hưởng của nồng độ ethanol và thời gian đến lượng olygo-chitin thu được. 67
Hình 3.18: Ảnh hưởng của nồng độ CPE đến hiệu suất thủy phân chitin. 68
Hình 3.19: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân chitin 69
Hình 3. 20: Ảnh hưởng của pH đến hiệu suất thủy phân. 70
Hình 3. 21: Ảnh hưởng của nồng độ chitin đến hiệu suất thủy phân 70
Hình 3.22: Đường chuẩn glucosamine (Phụ lục 2)

8

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, ngành công nghệ sinh học đang có bước phát
triển mạnh mẽ. Nhiều ứng dụng công nghệ sinh học trong sản xuất và đời sống ngày
càng được chú trọng. Phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học là một xu thế tất
yếu trong điều kiện các ngành sản xuất truyền thống đang gây ô nhiễm môi trường
nghiêm trọng. Các chế phẩm sản xuất bằng con đường sinh học không chỉ thân
thiện với môi trường sống, mang lại giá trị kinh tế cao mà còn ứng dụng rất hiệu
quả trong nhiều lĩnh vực đời sống. Enzyme là một phần không thể thiếu được của
công nghệ sinh học. Hiện nay, có rất nhiều loại enzyme được nghiên cứu và ứng
dụng của chúng ngày càng được mở rộng. Trước đây các nghiên cứu tập trung

nhiều vào enzyme protease thì ngày nay nhiều loại enzyme khác như cellulase,
lipase, chitinase, deacetylase, collagenase, pectinase cũng đã được nghiên cứu và
phát triển rộng rãi.
Việt Nam có nguồn lợi thủy sản rất dồi dào, ngành công nghệ chế biến phát
triển mạnh vì vậy các phế liệu từ chế biến thủy sản rất lớn. Một trong các dạng phế
liệu là nguồn chitin từ vỏ loài giáp xác như tôm, cua. Tận dụng nguồn phế liệu này
không những giải quyết triệt để vấn đề ô nhiễm môi trường mà còn tạo ra các chế
phẩm mới có giá trị, làm tăng giá trị kinh tế cho ngành thủy sản.
Chitin đã được nghiên cứu ứng dụng nhiều trong y học, thực phẩm và công
nghiệp. Chitin và dẫn xuất chitosan là hai chất được ứng dụng nhiều nhất. Nhưng
do chúng có đặc điểm không hòa tan trong nước nên ứng dụng vẫn có những hạn
chế. Vì vậy, nghiên cứu các chế phẩm từ chitin như olygo-chitin, olygo-chitosan,
glucosamine, N-acetyl-β-D-glucosamine để khắc phục nhược điểm trên, khám phá
thêm nhiều đặc tính mới cũng như mở rộng ứng dụng của polymer này là xu hướng
nghiên cứu trong thời gian tới.
Để tạo ra các chế phẩm có khả năng hòa tan trong nước từ chitin, chitosan có
thể dùng phương pháp hóa học, dùng các tia mang năng lượng cao và một số
phương pháp khác để cắt đứt mạch polymer của chúng. Các phương pháp trên thu
được sản phẩm với hiệu suất cao nhưng có nhược điểm lớn là hoạt tính các chế
phẩm thấp, nhiều tạp chất, gây ô nhiễm môi trường và gây độc cho người trực tiếp
sản xuất.

9

Sử dụng các enzyme chitinase, chitosanase thủy phân chitin, chitosan tạo ra
các chế phẩm olygo-chitin, olygo-glucosamine có hoạt tính sinh học cao, điều kiện
sản xuất nhẹ nhàng, không gây ô nhiễm môi trường và ít ảnh hưởng đến sức khỏe
người lao động là hướng đi tốt. Có thể sử dụng nguồn enzyme chitinase, chitosanase
từ thực vật, động vật và vi sinh vật.
Từ yêu cầu cấp thiết của thực tế trên, tôi đã thực hiện đề tài: Nghiên cứu

chiết rút chitinase từ lá khoai lang và bước đầu thử nghiệm thủy phân chitin
để sản xuất olygo-chitin.
Mục đích của luận văn:
Bước đầu nghiên cứu về tính chất của enzyme chitinase từ thực vật (lá khoai
lang), tìm các điều kiện thích hợp để thu nhận enzyme chitinase và sử dụng enzyme
để thủy phân chitin tạo olygo-chitin qua đó mở rộng ứng dụng của chitin và thay thế
phương pháp hóa học sản xuất olygo-chitin gây ô nhiễm môi trường và chất lượng
sản phẩm thấp.
Nội dung nghiên cứu của luận văn:
- Nghiên cứu thu nhận enzyme chitinase từ lá khoai lang và các yếu tố ảnh
hưởng đến hoạt tính của enzyme này.
- Bước đầu nghiên cứu sử dụng chitinase thủy phân chitin thu olygo-chitin.
Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận văn:
Kết quả nghiên cứu của luận văn góp phần hiểu biết thêm về enzyme
chitinase từ lá khoai lang nói riêng và chitinase từ thực vật nói chung.
Nghiên cứu đưa ra được các điều kiện thích hợp cho quá trình chiết rút
enzyme chitinase từ lá khoai lang, các yếu tố ảnh hưởng chitinase và bước đầu
nghiên cứu sử dụng chitinase chiết rút được vào quá trình thủy phân chitin thu chế
phẩm olygo-chitin. Kết quả thu được là cơ sở để đánh giá hiệu quả và khả năng ứng
dụng của chitinase thực vật vào sản xuất olygo-chitin, từ đó cải thiện được chất
lượng và hiệu quả sản phẩm so với phương pháp hóa học có nhiều nhược điểm.




10

Chương 1
TỔNG QUAN ĐỀ TÀI

1.1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ ENZYME
1.1.1.Giới thiệu chung về enzyme
Enzyme là những chất hữu cơ có phân tử lượng lớn (đa số các enzyme có
phân tử lượng từ 6.000 đến 1.000.000 dalton). Qua quá trình nghiên cứu cấu trúc,
tính chất đã khẳng định bản chất của enzyme là protein. Các kết quả nghiên cứu cho
thấy enzyme được cấu tạo từ các L-α-acid amin kết hợp với nhau bằng liên kết
peptit [6].
Người ta đã phát hiện ra rằng, các enzyme đã xúc tác cho hầu hết các phản
ứng hóa học xảy ra bên trong cơ thể sống, đảm bảo cho các quá trình chuyển hóa
các chất trong cơ thể sống được thực hiện một cách nhịp nhàng, cân đối và theo
những chiều hướng xác định. Chúng không chỉ có khả năng xúc tác cho các phản
ứng xảy ra trong tế bào sống mà sau khi được tách ra khỏi tế bào sống chúng vẫn có
khả năng xúc tác cho các phản ứng xảy ra.
Sự khác biệt giữa xúc tác bằng enzyme so với các chất xúc tác vô cơ, hữu cơ
là ở chỗ xúc tác bằng enzyme có hiệu suất xúc tác cực kỳ lớn. Nó có thể gấp hàng
trăm, hàng ngàn, hàng triệu lần so với xúc tác bằng các chất vô hoặc hữu cơ.
Ví dụ: trong phản ứng thủy phân sacaroza, nếu dùng chất xúc tác là sacaraza
thì tốc độ của phản ứng tăng nhanh gấp 2.10
2
lần so với dùng acid làm chất xúc tác
[6].
Đặc điểm ưu việt của enzyme so với các chất xúc tác khác là khi sử dụng
enzyme làm chất xúc tác có thể thực hiện hoạt động xúc tác trong điều kiện nhẹ
nhàng như ở áp suất và nhiệt độ bình thường của cơ thể hay ở môi trường bên
ngoài, pH thích hợp của enzyme gần pH sinh lý. Ngoài ra enzyme còn có khả năng
lựa chọn cao đối với kiểu phản ứng mà nó xúc tác cũng như đối với chất mà nó tác
dụng. Đó là tính đặc hiệu của enzyme [6], [8].
Ví dụ: Chất xúc tác là acid không có tính đặc hiệu. Nó có thể xúc tác thủy
phân cắt đứt liên kết peptid của protein, liên kết glucosid của tinh bột, của agar,
11

carrageennan, chitin vv… trong khi đó enzyme protease chỉ xúc tác thủy phân cắt
đứt các liên kết peptid mà không xúc tác để cắt được liên kết glucosid.
Do là chất xúc tác đặc biệt, có nhiều ưu việt hơn so với các chất xúc tác khác
nên enzyme đang được nghiên cứu và ứng dụng rất mạnh mẽ trong đời sống con
người.
Enzyme bao gồm hai loại là enzyme một thành phần và enzyme hai thành
phần. Enzyme một thành phần (apoenzyme) là enzyme khi bị thủy phân thì sản
phẩm của quá trình thủy phân chỉ bao gồm các acid amin. Enzym hai thành phần,
phân tử enzyme gồm phần protein (apoenzyme) kết hợp với nhóm khác không phải
protein gọi là nhóm ngoại hay coenzyme. Apoenzyme quyết định tính đặc hiệu cao
của enzyme và làm tăng hoạt tính xúc tác của coenzyme. Coenzyme quyết định kiểu
phản ứng mà enzyme xác tác, trực tiếp tham gia phản ứng và làm tăng độ bền của
apoenzyme đối với các yếu tố gây biến tính [6], [8], [32].
Tính chất của enzyme: Bản chất của enzyme là protein nên enzyme không
bền với nhiệt. Dưới tác dụng của nhiệt độ cao, enzyme bị biến tính mất khả năng
xúc tác. Môi trường acid, kiềm mạnh hay muối kim loại nặng cũng làm mất hoạt
tính của enzyme.
Enzyme có hai dạng biến tính là biến tính thuận nghịch và không thuận
nghịch. Nếu bị biến tính thuận nghịch, enzyme có khả năng phục hồi lại khả năng
xúc tác khi loại bỏ các tác nhân gây biến tính. Khi bị biến tính không thuận nghịch,
enzyme không thể phục hồi lại khả năng xúc tác khi loại bỏ các tác nhân gây biến
tính.
Do có kích thước lớn nên enzyme không đi qua màng bán thấm. Đây cũng là
một tính chất mà người ta sử dụng để tinh sạch enzyme.
Enzyme có tính chất lưỡng tính. Trong môi trường điện ly có thể tồn tại ở
dạng anion, cation hay dạng trung hòa về điện. Người ta lợi dụng tính chất trên để
phân tách cũng như tinh sạch enzyme (phương pháp điện di).
Cũng giống như protein, các enzyme đều có thể hòa tan trong nước, trong
dung dịch muối loãng nhưng không hòa tan trong dung môi không phân cực

(aceton, ete vv…). Dung dịch chứa enzyme có tính chất của dung dịch keo ưa nước.
Khi hòa tan enzyme vào trong nước, do phân tử nước có tính chất lưỡng cực sẽ kết
12

hợp với các ion, các nhóm ion hoặc các nhóm phân cực trong phân tử enzyme tạo
thành lớp vỏ hydrat và có vai trò quan trọng làm môi trường cho các phản ứng sinh
hóa.
Trước đây mỗi loại enzyme đều được đặt tên tùy theo tác giả vì vậy không có
sự thống nhất. Từ năm 1960 Hội hóa sinh quốc tế (IUB) đã thống nhất phân loại
enzyme thành 6 lớp dựa trên tính đặc hiệu phản ứng của enzyme:
1. Oxydoreductaza : các enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa khử.
2. Transferaza: các enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển vị.
3. Hydrolaza: các enzyme xúc tác phản ứng thủy phân.
4. Liaza: các enzyme xúc tác phản ứng phân cắt không cần nước, loại nước tạo
thành liên kết đôi hoặc kết hợp phân tử nước vào liên kết đôi.
5. Izomeraza: các enzyme xúc tác cho phản ứng đồng phân hóa.
6. Ligaza: các enzyme xúc tác cho phản ứng tổng hợp có sử dụng liên kết giàu
năng lượng của ATP…
Mỗi lớp chia thành nhiều tổ. Mỗi tổ chia thành nhiều nhóm. Ký hiệu của mỗi
enzyme bao gồm 4 số, số đầu chỉ lớp, số thứ 2 chỉ tổ, số thứ 3 chỉ nhóm và số thứ 4
chỉ enzyme [32].
Cơ chế tác dụng của enzyme: Trong quá trình xúc tác, chỉ một phần nhỏ
của phân tử enzyme tham gia kết hợp đặc biệt với cơ chất và phần này gọi là trung
tâm hoạt động của enzyme.
Đối với enzyme một thành phần thì trung tâm hoạt động được hình thành là
do sự phối hợp giữa các nhóm chức tự do của acid amin. Ví dụ: nhóm SH
(sunfidryl) của cystein, nhóm NH
2
(amin) của lysin, nhóm OH (hydroxyl) của serin,
treonin, tyrosin, nhóm COOH (cacboxyl) của aspactic, glutamic, vòng imidazol của

histidin, indol của triptophan, guanilic của arginin.
Enzyme hai thành phần, trung tâm hoạt động của enzyme được hình thành
ngoài các nhóm chức của các acid amin còn có sự tham gia của coenzyme. Ví dụ:
vitamin, ion kim loại vv…
Yêu cầu của phản ứng hóa học xảy ra là các chất tham gia phản ứng phải va
chạm với nhau tại vị trí xảy ra phản ứng và các chất trên phải ở trạng thái hoạt động
13

tức là đã được hoạt hóa. Để hoạt hóa các phân tử thì cần cung cấp năng lượng cho
chúng, năng lượng này gọi là năng lượng hoạt hóa.
Các chất xúc tác nói chung đều có khả năng làm giảm năng lượng hoạt hóa
mà phản ứng đòi hỏi bằng cách tiến hành qua các phản ứng tạo phức trung gian.
Qua đó tổng số năng lượng hoạt hóa của chúng sẽ nhỏ hơn so với trường hợp không
có chất xúc tác. Năng lượng hoạt hóa thường nhỏ đối với xúc tác bằng enzyme và
nhỏ hơn cả trường hợp có các chất xúc tác thông thường.
Ví dụ: Trong phản ứng thủy phân H
2
O
2
tạo thành H
2
O và O
2
nếu không có
xúc tác thì năng lượng hoạt hóa là 18 Kcal/mol, xúc tác là keo platin thì năng lượng
hoạt hóa là 11.7 Kcal/mol trong khi đó sử dụng enzyme catalase thì năng lượng hoạt
hóa chỉ là 5.5 Kcal/mol.
Phương trình phản ứng được biểu diễn như sau:
E + S ES P + E
E : enzyme.

S : cơ chất.
ES : phức hợp enzyme – cơ chất.
P : sản phẩm.
Quá trình xúc tác bằng enzyme trải qua 3 giai đoạn:
Giai đoạn 1: enzym kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo thành phức
enzyme-cơ chất (ES) không bền. Phản ứng này xảy ra nhanh và đòi hỏi năng lượng
hoạt hóa thấp.
Giai đoạn 2 : xảy ra sự biến đổi cơ chất dẫn đến sự kéo căng và phá vỡ các
liên kết đồng hóa trị tham gia phản ứng làm cho cơ chất được hoạt hóa, dễ dàng
tham gia phản ứng hơn.
Giai đoạn 3: sản phẩm được tạo ra và enzyme được giải phóng ở dạng tự do.
Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động xúc tác của enzyme. Dưới đây
là một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng xúc tác của chúng:
Ảnh hưởng của nồng độ enzyme: Trong điều kiện thừa cơ chất, tốc độ phản
ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzyme. Khi tăng nồng độ của enzyme, tốc
độ phản ứng sẽ tăng nhưng mức độ tăng nồng độ enzyme cũng có giới hạn vì khi
14

tăng nồng độ enzyme quá lớn vận tốc phản ứng tăng chậm sẽ không có hiệu quả
trong thực tế sản xuất.
Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất: Như chúng ta đã thấy, trong các phản ứng
có xúc tác là enzyme, có sự hình thành phức chất trung gian giữa enzyme và cơ chất
(ES), tiếp đó mới có sự chuyển hóa trong phức chất để tạo ra sản phẩm và giải
phóng enzyme ở dạng tự do. Tốc độ phản ứng thủy phân tỷ lệ với nồng độ của phức
chất trung gian vì vậy nồng độ cơ chất có ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ của phản
ứng có enzyme xúc tác. Theo phương trình Michaelis-Menten, khi nồng độ cơ chất
rất thấp vận tốc phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ cơ chất. Khi nồng độ cơ chất đã
đủ lớn, nếu tăng lượng cơ chất vận tốc phản ứng sẽ không tăng.
Ảnh hưởng của các chất hoạt hóa: Các chất hoạt hóa có thể làm tăng hoạt
độ của enzyme có thể theo các cách khác nhau. Chúng có thể loại trừ các chất kìm

hãm ra khỏi phản ứng hoặc tác dụng trực tiếp vào trung tâm hoạt động của enzyme
hoặc làm biến đổi cấu hình không gian của enzyme tạo thuận lợi cho quá trình xúc
tác.
Ảnh hưởng của các chất kìm hãm: Vì enzyme có bản chất là protein nên
tất cả các yếu tố làm biến tính protein đều là các yếu tố kìm hãm hoạt động của
enzyme. Ngoài ra còn các yếu tố kìm hãm khác tuy không trực tiếp làm biến tính
protein nhưng có thể thế chỗ cơ chất, kết hợp vào ngay trung tâm hoạt động của
enzyme tạo thành phức chất trung gian (chất kìm hãm cạnh tranh) hoặc kết hợp vào
một vị trí nào đó của enzyme, làm thay đổi cấu trúc không gian của enzyme theo
chiều hướng không có lợi cho hoạt động xúc tác (chất kìm hãm không cạnh tranh).
Có những trường hợp sản phẩm phản ứng hay dư thừa cơ chất cũng làm kìm hãm
phản ứng.
Ảnh hưởng của nhiệt độ: Nhiệt độ là yếu tố quan trọng, ảnh hưởng trực tiếp
tới vận tốc phản ứng của enzyme. Nhiệt độ càng tăng thì vận tốc của phản ứng có
xúc tác enzyme càng tăng. Nhưng vì enzyme có bản chất protein nên nhiệt độ chỉ
tăng đến một mức độ giới hạn. Nếu vượt quá giới hạn này thì phản ứng sẽ giảm
hoặc dừng lại do bản thân enzyme bị biến tính. Nhiệt độ mà ở đó tốc độ phản ứng
đạt cực đại gọi là nhiệt độ tối thích.
15

Nhiệt độ tới hạn là nhiệt độ làm mất hoàn toàn hoạt tính xúc tác của enzyme.
Nhiệt độ tối thích của các enzyme không giống nhau, phụ thuộc vào nguồn gốc của
enzyme từ thực vật, động vật hay vi sinh vật. Nhiệt độ tối thích của enzyme không
phải là hằng số mà nó còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác như:cơ chất, pH môi
trường, nồng độ enzyme, nguồn enzyme. Khi thời gian tác dụng của enzyme càng
dài thì nhiệt độ tối thích càng giảm.
Ảnh hưởng của pH: Mỗi loại enzyme sẽ có hoạt tính cao nhất ở một pH xác
định gọi là pH tối thích của enzyme. pH ảnh hưởng tới hoạt tính xác tác của enzyme
có thể do nó làm thay đổi trạng thái ion hóa các nhóm định chức trong trung tâm
hoạt động của enzyme, có thể làm thay đổi cấu trúc trung tâm hoạt động của

enzyme. Nó cũng có thể làm thay đổi trạng thái ion hóa của cơ chất làm ảnh hưởng
tới khả năng hình thành hợp chất trung gian. Đa số enzyme có pH tối thích ở vùng
acid yếu, kiềm yếu hay trung tính.
Ảnh hưởng của lượng nước: Nước là chất trực tiếp tham gia vào phản ứng
thủy phân. Nước cũng là môi trường tạo điều kiện thuận lợi cho tiếp xúc của
enzyme và cơ chất nên cũng ảnh hưởng nhiều đến tốc độ thủy phân.
Ảnh hưởng của thời gian thủy phân: Để phản ứng thủy phân được thực
hiện cần có yếu tố thời gian. Thời gian dài hay ngắn tùy thuộc vào các yếu tố
enzyme, cơ chất, nhiệt độ, pH, các yếu tố hoạt hóa cũng như kìm hãm…
Nguồn thu nhận enzyme: Enzyme có trong tất các các cơ thể động vật, thực
vật và vi sinh vật. Tùy theo loại và lượng enzyme tồn tại trong các nguồn trên mà ta
chọn đối tượng thích hợp để thu enzyme, ứng dụng chúng trong sản xuất và một số
lĩnh vực của đời sống.
Các phương pháp tinh sạch enzyme: Có nhiều loại enzyme với các tính
chất khác nhau. Vì vậy, hiện nay chưa có phương pháp chung nào có thể tách và
làm sạch cho mọi enzyme. Khi nghiên cứu một loại enzyme cụ thể cần phải có thực
nghiệm để xác định phương pháp tách chiết và tinh sạch phù hợp nhất. Việc phân
tách và làm sạch enzyme rất phức tạp do lượng enzyme chiếm một tỉ lệ rất nhỏ,
luôn tồn tại đồng thời với các loại protein khác có tính chất hóa lý tương tự như
enzyme. Ngoài ra enzyme bản chất là protein nên cũng rất dễ biến tính, mất khả
năng xúc tác khi bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài.
16

Trong các nguồn thu nhận enzyme, để thu enzyme từ thực vật người ta
thường chọn dung môi thích hợp để chiết rút enzyme ra khỏi nguyên liệu. Enzyme
từ vi sinh vật tồn tại ở hai dạng: enzyme ngoại bào là enzyme được tiết ra môi
trường bên ngoài và enzyme nội bào tồn tại bên trong tế bào. Enzyme ngoại bào có
thể dùng dung môi chiết ngay ra được. Đối với dạng enzyme nội bào, để tách chiết
dạng enzyme này trước hết phải phá vỡ cấu trúc tế bào bằng các biện pháp cơ học
như xay, nghiền. Tiếp đó enzyme được chiết ra bằng các dung môi thích hợp như

nước cất, các dung dịch đệm, dung dịch muối sinh lý vv…
Dịch chiết chứa không chỉ có enzyme mà còn có các protein tạp và các tạp
chất khác. Để tách các tạp chất làm tăng độ sạch, tinh khiết của enzyme phải sử
dụng kết hợp nhiều phương pháp khác nhau. Đối với muối, các tạp chất có phân tử
lượng thấp thường dùng biện pháp thẩm tích hoặc lọc qua cột gel sephadex. Để loại
các protein tạp và các tạp chất có phân tử lượng cao thường dùng kết hợp nhiều biện
pháp khác nhau : Phương pháp biến tính chọn lọc dưới tác dụng của nhiệt độ hay
pH môi trường: phương pháp này thích hợp đối với loại enzyme có tính bền nhiệt
hoặc bền acid. Giữ dịch chứa enzyme ở nhiệt độ cao 50 – 70
0
C hoặc pH = 5 trong
thời gian xác định các protein tạp bị biến tính và được loại bỏ bằng lọc hay ly tâm.
Kết tủa phân đoạn enzyme bằng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ
thích hợp đối với các loại enzyme ít bị biến tính bởi các dung môi, muối trung tính.
Khi đó các protein tạp sẽ bị biến tính và được tách ra khỏi dịch chứa enzyme. Ngoài
ra còn có các phương pháp khác như: Phương pháp sắc ký, điện di hay lọc gel.vv…
Một số yếu tố gây biến tính enzyme như nhiệt độ cao, acid hay kiềm đặc,
muối kim loại nặng thường làm mất hoạt tính xúc tác của enzyme, do đó người ta
thường dùng các yếu tố này để ức chế hoạt độ của enzyme khi cần thiết [2], [6], [8],
[24], [32].
Ứng dụng của enzyme: Enzyme được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh
vực của cuộc sống. Có thể chia ứng dụng của enzyme thành hai hướng chính.
Hướng thứ nhất: điều hòa định hướng tác dụng của enzyme ngay trong bản thân
nguyên liệu có chứa nó. Hướng sử dụng này không phổ biến vì chỉ sử dụng được
khi bản thân nguyên liệu có tồn tại enzyme. Hướng thứ hai là: tách chiết enzyme ra
khỏi nguyên liệu ở dạng chế phẩm và được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực
17

sản xuất. Hướng này có ưu điểm là chủ động được nguồn enzyme, có thể dễ dàng
điều khiển được hoạt động của nó theo các mục đích khác nhau của quá trình sản

xuất [6], [8].
1.1.2.Giới thiệu enzyme chitinase
Chitinase (EC: 3.2.1.14) là enzym xúc tác thủy phân liên kết

-(1,4)-
glucozit của chitin. Do chitin là một polymer giống như cellulose, có cấu trúc tuyến
tính từ các đơn vị cơ sở là N-acetyl-

-D-glucozamine nên sản phẩm thu được khi
thuỷ phân chitin bao gồm olygo-chitin, N-acetyl-

-D- glucozamine.
Khối lượng phân tử chitinase của thực vật nói chung trong khoảng 30 kDa.
Còn một số trường hợp ngoại lệ khác như enzyme chiết rút từ mầm, chồi và lá của
cây khoai lang có khối lượng phân tử khoảng 16 kDa [44], [79].
Chitinase thu được từ các nguồn thực vật khác nhau thì có các giá trị nhiệt
độ, pH tối thích khác nhau, có điểm đẳng điện, khối lượng phân tử khác nhau. Đối
với các loài thực vật có chứa enzyme chitinase, chúng thường tồn tại ở các vị trí
khác nhau của cây như lá, cuống lá, dây, mầm chồi vv…
Chitinase được phân thành hai loại là endochitinase và exochitinase.
Endochitinase xúc tác phản ứng thủy phân cắt đứt ngẫu nhiên các liên kết glucosid
trong mạch polymer của chitin. Exochitinase xúc tác phản ứng thủy phân cắt đứt
liên kết glucosid ngoài cùng chuỗi polymer của chitin. Theo các nghiên cứu của
một số tác giả, đa số các chitinase từ thực vật đều ở dạng endochitinase. Chitinase
được tìm thấy trong lá cây đậu Hà Lan của tác giả J.D.Mikkelsen, D.B.Collinge
(1991), trong lá lúa mạch đen của tác giả Yamaggami, Funatsu (1993), trong lá cây
đậu tương của tác giả Wadsworth, J.P.Zikakis (1984), trong lá cây thuốc lá của các
tác giả Shinshi, J.Ryals (1990), trong lá cây khoai mỡ của các tác giả D.Koga,
T.Ishibashi, K.Yagishita (1984) vv…[37], [44], [75], [80].
Chitinase tồn tại trong thực vật không phải để xúc tác phản ứng thủy phân

chitin vì trong thực vật không chứa chitin. Các tác giả nghiên cứu về chitinase trong
thực vật tin rằng chitinase đóng vai trò là chất kháng thể của thực vật và sự tồn tại
của chúng trong thực vật có thể giải thích đó là sự phản ứng trở lại của cơ thể thực
vật trước sự tấn công của các loài như côn trùng, động vật gây hại hay vi sinh vật
gây bệnh [36], [44], [69], [82].
18

Cũng giống như các enzyme khác, hoạt độ của chitinase phụ thuộc vào các
yếu tố như: nguồn thu nhận enzyme, nhiệt độ, pH môi trường, nồng độ chitinase,
nồng độ chitin, loại chitin, thời gian thủy phân, các chất hoạt hóa, các chất kìm hãm
vv…
Tùy theo nguồn thu chitinase, các chitinase có hoạt độ khác nhau. Chitinase
thu được từ vi sinh vật thường có hoạt độ cao hơn so với chitinase từ động thực vật.
Ngoài ra, có thể điều chỉnh khả năng sinh tổng hợp chitinase của vi sinh vật bằng
cách chọn chủng thích hợp, hoặc điều chỉnh môi trường nuôi cấy. Tùy theo các
dạng dẫn xuất của chitin khác nhau cũng ảnh hưởng đến hoạt độ chitinase. Mỗi loại
chitinase từ các nguồn khác nhau thích hợp xúc tác thủy phân cơ chất chitin khác
nhau. Chitinase có thể thích hợp xúc tác thủy phân các loại cơ chất khác nhau của
chitin như glycol-chitin, colloidal-chitin, swollen-chitin vv…
Nguồn và phương pháp thu nhận enzyme chitinase: Có nhiều nguồn thu
nhận enzyme chitinase. Enzyme chitinase có thể tồn tại trong thực vật, động vật và
vi sinh vật. Từ các nguồn ở trên, các enzyme chitinase sẽ được tách ra và tinh sạch
theo các phương pháp thích hợp.
Chitinase thu từ thực vật: Trong thực vật đã có những nghiên cứu và phát
hiện sự tồn tại của chúng ở một số loại cây như cây đậu Hà Lan, đỗ ván, cải bắp,
khoai lang, khoai tây, khoai mỡ, trong cây lúa, cây thuốc lá, cây lúa mỳ, lúa mạch
vv… [36], [37], [44], [70], [74]….
Chitinase thu từ động vật: Chitinase có tồn tại trong cơ thể một số động
vật. Các nhà khoa học đã nghiên cứu tách chiết và làm sạch chitinase thu được từ
gan mực ống Nhật Bản (squid Todarodes pacificus). Chitinase còn thu được từ

huyết thanh của bò. Chitinase thu được từ động vật có hoạt độ tương đối cao [53],
[54], [59].
Chitinase thu từ vi sinh vật: Một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh
tổng hợp chitinase nếu trong môi trường có chitin làm chất cảm ứng. Theo một số
tác giả đã nghiên cứu cho thấy một số chủng có khả năng sinh tổng hợp chitinase
mạnh như: Aeromonas sp, Acinetobacter sp strain CHD 101, Eterobacter sp NRG4,
S. coelicolar A3, Streptomyces griseus, Streptomyces sp J-13-3, Phaseolus
vulgaris, Serratia marcescens E170, Aspergillus fumigatus, Trichoderma viride,
19

Trichoderma reesei-PC-3-7, Vibrio carchariae, Bacillus circulans, Bacillus brevis,
Pseudomonas aeroginose, Serratia plymuthica [41], [55], [56], [68],[73].
Để có thể sinh tổng hợp được chitinase từ vi sinh vật trước hết ta phải phân
lập được chủng có khả năng sinh tổng hợp chitinase cao. Sau khi đã xác định được
chủng thích hợp, tiến hành nghiên cứu xác định các yếu tố ảnh hưởng đến sinh
trưởng và phát triển của chủng trong điều kiện nuôi cấy. Nghiên cứu các yếu tố ảnh
hưởng đến khả năng sinh tổng hợp chitinase và điều kiện thu nhận chitinase.
Các chủng có khả năng sinh tổng hợp chitinase có thể tồn tại ở nhiều nơi
khác nhau. Có thể phân lập các chủng có khả năng sinh tổng hợp chitinase từ các
phần vỏ giáp xác đang phân hủy hoặc từ bùn của các đìa nuôi tôm vv
1.1.3. Giới thiệu về cây khoai lang
Khoai lang (Ipomoea batatas) là loại cây lương thực được trồng từ lâu đời, là
loại hoa màu hằng niên, dễ trồng, nhanh cho thu hái. Khoai lang có thể sử dụng cả
lá và củ làm thực phẩm. Nhiều nơi gọi khoai lang là Potato còn khoai tây gọi là
Irish Potato, khoai lang đỏ có nơi còn gọi là Yam (Yam thường dùng gọi cho khoai
mỡ).
Khoai lang là cây rau lương thực đứng hàng thứ bảy trên thế giới sau lúa mì,
lúa nước, ngô, khoai tây, lúa mạch, sắn. Năm 2004, toàn thế giới đã trồng 9,01 triệu
ha khoai lang, đạt sản lượng 127,53 triệu tấn, sản lượng khoai lang của Việt Nam là
1,65 triệu tấn.

Khoai lang có khối lượng đường bột (cacbonhydrat), vitamin A và năng
lượng cao hơn so với lúa mì, lúa nước, sắn. Khoai lang được sử dụng củ và lá để
làm thức ăn gia súc, chế biến bột, rượu cồn, bánh kẹo và gần đây đang được nghiên
cứu để làm màng phủ sinh học (bioplastic). Tuỳ theo nhu cầu thị trường mà phân
loại củ để chế biến và tiêu thụ phù hợp: củ lớn và củ vừa được dùng để bán tươi và
chế biến thực phẩm, củ nhỏ và dây lá dùng cho chăn nuôi, lá của một số giống
khoai lang chọn lọc hiện được ưa chuộng để làm rau xanh và làm nước sinh tố.
Bảng 1: Một số thành phần trong lá khoai lang trong 100 g lá.
Thành phần
Lá khoai
Năng
lượng (cal)

Protein
(%)
Ca
(mg)
K (mg) Vit A
(mg)
Vit C
(mg)
Lá tươi 53 2,8 107 562 5565 32
20

Lá luộc / 2,6 94 / 3345 5
Nguồn : food composition table.1964. Manila.
Tại Việt Nam, khoai lang là cây lương thực ngắn ngày quan trọng, thường
được trồng với các loại hoa màu khác xen giữa hai vụ lúa chính. Miền Bắc khoai
lang đứng thứ 3 về diện tích canh tác sau lúa và ngô, ở miền Nam nó đứng thứ tư
sau lúa, cao su và dừa. Miền Bắc, khoai lang được trồng nhiều nhất ở các tỉnh Nghệ

An 36,200 ha, Hà Tĩnh 25,500 ha, Thanh Hóa 37,700 ha… trong Nam các tỉnh có
diện tích canh tác nhiều như Bến Tre 1300 ha, Vĩnh Long 1900 ha, Cần Thơ 1300
ha, Trà Vinh 1800 ha, Sóc Trăng 1700 ha. Nguồn: Tổng cục thống kê Việt nam
2004.
Đất trồng: Thích hợp ở vùng đất đỏ và đất xám, đất pha cát ven sông suối,
đất thịt tơi xốp. Đối với vùng đất đồi khô hạn thì nên trồng vào mùa mưa. Cần lên
luống, thoát nước, làm đất tơi xốp, ít phèn mặn, pH> 6. Đất phải được dọn sạch cỏ,
cày một lần, bừa một lượt trước khi lên luống.
Thời vụ: Có thể trồng 4 vụ/năm, thời gian xuống giống tùy theo nông lịch ở
từng địa phương. Hai vụ mùa mưa: vụ khoai lang hè thu (trồng tháng 5 thu hoạch
đầu tháng 8) luân canh với ngô/lạc/đậu nành/đậu xanh/dưa hấu thu đông. Vụ khoai
lang thu đông (trồng đầu tháng 8 thu hoạch cuối tháng 10) luân canh với
ngô/lạc/đậu nành/đậu xanh của vụ hè thu. Hai vụ mùa khô : vụ đông xuân (trồng
tháng 11 thu hoạch tháng 2) luân canh với lúa mùa. Vụ khoai lang xuân hè (trồng
tháng 1 thu hoạch tháng 4) luân canh với lạc/rau/ngô/khoai lang đông xuân. Khoai
lang trồng mùa khô cần phải chủ động tưới nước. Để tăng hiệu quả thu hoạch có thể
bổ sung dưỡng chất bằng bón các loại phân N-P-K.
Giống : Có nhiều giống khoai được trồng ở Việt Nam với mục đích khác
nhau. Các giống khoai được trồng chủ yếu để thu củ với năng suất cao và chất
lượng củ tốt. Nhưng có một số giống khoai được trồng chủ yếu để thu lá sử dụng
làm thực phẩm, có giống trồng để thu cả củ và lá.
Các giống khoai lang có củ, ruột củ với nhiều màu sắc khác nhau, giống vỏ
màu trắng, đỏ, hồng, tím, vàng, cam. Trong ruột có các màu khác nhau như: trắng,
vàng, đỏ, hồng, tím. Một số giống khoai được trồng phổ biến là: Hoàng Long, 143,
21

VX-37, HL4, HL518, HL491, KL1, KL5, K51, KB1, Kokey, Chiêm Dâu, Khoai
gạo vv và đặc điểm nhận dạng của chúng.
Giống khoai lang Hoàng Long: Là giống có thân màu tím đỏ, lá già xanh
tím, gân lá tím, mặt dưới lá tím, lá hình tim. Vỏ củ hồng nhạt, ruột vàng đậm, độ bở

của củ trung bình, độ ngọt khá.
Giống khoai lang VX-37: Giống khoai có thân tím, đốt ngắn, phân nhánh
nhiều, lá xanh, gân lá tím, lá xẻ thùy nông. Củ màu hồng nhạt, ruột vàng nhạt, bở,
ăn ngon. Củ hình thành sớm 15-20 ngày sau trồng, tích lũy nhanh, thời gian sinh
trưởng ngắn ngày 90 ngày thích hợp với vụ thu đông và đông sớm. Khả năng chịu
nóng khá, chịu rét kém.
Giống khoai lang HL4: Giống có thân chính dài, màu xanh. Lá xanh thẫm,
phân thùy 3-5 khía nông, gân lá màu xanh. Vỏ củ màu đỏ, ruột màu cam đậm.
Giống khoai lang 143: Giống khoai sinh trưởng mạnh, thân lá phát triển
sớm, năng suất chất xanh cao. Thân màu xanh sẫm, lá to hình tim, phiến lá mỏng,
dây dài phân nhánh ít.Củ màu hồng nhạt, ruột vàng, dạng củ thuôn dài, ăn ngon, bở.
Khả năng chịu rét khá, tỷ lệ của thương phẩm cao.
Giống khoai lang KL5: Giống khoai sinh trưởng thân lá mạnh, khả năng tái
sinh nhanh. Thân lá mềm ngọt, thích hợp làm thức ăn gia súc. Lá xẻ thùy sâu. Củ to
thuôn dài, vỏ đỏ tươi, ruột củ màu vàng, chất lượng khá.
Giống khoai lang KL1: Giống khoai có lá to hình tim, màu xanh hơi vàng,
cuống lá dài. Dạng củ thuôn dài, vỏ và ruột củ màu vàng, ăn ngon và bở.
Thu hoạch: Đối với các giống khoai lang phổ biến hiện nay thường thu
hoạch sau 90-100 ngày ở mùa mưa, sau 85-95 ngày ở mùa khô.
1.1.4. Giới thiệu về chitin và một số dẫn xuất của chitin
Chitin là một polysaccarit có đạm với khối lượng phân tử lớn. Chitin là
polymer hữu cơ có trữ lượng lớn, đứng thứ hai trong tự nhiên chỉ sau cellulose và
chúng được tạo ra trung bình 20g/năm/m
2
trên bề mặt trái đất. Chitin hiếm khi tồn
tại ở trạng thái tự do mà hầu hết ở trạng thái liên kết với protein, canxi cacbonat và
các hợp chất hữu cơ khác. Ví dụ chitin tồn tại ở dạng liên kết với canxi tạo thành
lớp vỏ cứng của loài vỏ giáp xác, hay côn trùng [20].
22

Từ những nghiên cứu về sự thủy phân chitin bằng enzyme hay acid HCl đậm
đặc đều cho ra một kết quả là chitin có cấu trúc polymer tuyến tính từ các đơn vị cơ
sở là N-acetyl--D-glucosamine liên kết với nhau bằng liên kết -(1,4) – glucozit.
Chitin có công thức phân tử : [C
8
H
13
O
5
N]
n
.
n: phụ thuộc vào nguồn gốc nguyên liệu.
Ví du: Ở tôm hùm n = 700÷800, tôm thẻ n = 400÷500, cua n = 500÷600.
Phân tử lượng của chitin: M = (203,09)
n
.
Công thức cấu tạo chitin:
0
0
0
3
CH OH
2
H
H
H
H
H
OH

NHCOCH
0
3
CH OH
2
H
H
H
H
H
OH
NHCOCH
0
0
0
3
CH OH
2
H
H
H
H
H
OH
NHCOCH
n

Tính chất của chitin: Chitin có màu trắng, không tan trong nước, trong
kiềm, trong acid loãng và các dung môi hữu cơ khác như: ete, rượu…
Chitin hòa tan trong dung dịch đậm đặc, nóng của muối Thioxianat Liti

(LiSCN) và muối Thioxianat Canxi [Ca(SCN)
2
] tạo thành dung dịch keo.
Chitin khó hòa tan trong dung dịch Amoniac (NH
3
), không hòa tan trong
thuốc thử Schweizer – Sacrpamonia. Điều này có thể là do sự thay đổi nhóm
Hydroxyl (-OH) tại vị trí C
2
bằng nhóm Acetamin (-NHCOCH
3
-) đã ngăn cản
sự tạo thành các phức hợp cần thiết.
Chitin ổn định với các chất oxy hóa khử như: KMnO
4
, H
2
O
2
, NaClO,
Ca(ClO)
2
… lợi dụng tính chất này mà người ta sử dụng các chất này để tẩy màu
chitin và chất lượng chitin vẫn được đảm bảo.
Chitin có khả năng hấp thụ tia hồng ngoại có bước sóng trong khoảng
884÷890 nm.
Khi đun nóng chitin trong dung dịch NaOH đặc thì chitin sẽ bị khử gốc
acetyl tạo thành chitosan.
Chitin khi đun nóng trong dung dịch acid HCl đậm đặc sẽ bị thủy phân tạo
thành glucosamine và acid acetic. Quá trình thủy phân bắt đầu xảy ra ở các cầu nối

glucosid, tiếp theo là sự loại bỏ nhóm acetyl [20], [23], [35].
23

Ứng dụng của chitin: Do tính chất của chitin không hòa tan trong nước vì
vậy ứng dụng chitin có phần bị hạn chế hơn so với các dẫn xuất của nó.
Chitin được sử dụng để sản xuất da nhân tạo, sản xuất băng, gạc y tế điều trị
các vết thương, đặc biệt rất hiệu quả đối với các bệnh nhân bị bỏng. Chitin cũng
được sử dụng để sản xuất chỉ khâu tự tiêu trong phẫu thuật, ứng dụng trong xử lý
nước thải do khả năng hấp thu một số kim loại nặng, ứng dụng trong công nghệ sinh
học, công nghệ nano, nông nghiệp, trong công nghiệp, mỹ phẩm vv…
Từ chitin có thể tạo ra rất nhiều loại dẫn xuất bằng các phương pháp khác
nhau. Mỗi dẫn xuất đều có các tính chất khác nhau, vì vậy việc tạo ra ngày càng
nhiều các dẫn xuất sẽ tạo ra nhiều tính chất mới và ứng dụng của chitin ngày càng
được mở rộng. Từ chitin có thể tạo rất nhiều dẫn xuất khác nhau với nhiều tính chất
và ứng dụng mới. Dưới đây là một số dẫn xuất của chitin:
Carboxymethylchitin, Colloidal

chitin, Regenerated chitin, Glycol chitin (O-
hydroxyethylated

chitin ), Ethylene glycol chitin, Flake (bông, tuyết) chitin, Swollen
chitin, N-acetyl-beta-D-glucosamine, chitobiose (GlcN
2
), chitotriose (GlcN
3
),
chitotetraose(GlcN
4
),

chitopentaose (GlcN
5
),GlcN
6
, CM-chitin
(Carboxymethylchitin), Carboxyethyl-chitin, Methyl-chitin, Ethyl-chitin,
Hydroxyethyl-chitin, Hydroxypropyl-chitin, Oxidized chitin, Acetyl-chitin,
Aminoalkyl-chitin, Allyl-chitin.
Olygo-chitin là sản phẩm của quá trình thủy phân chitin theo phương pháp
hóa học hoặc sinh học. Tùy theo từng điều kiện chế độ thủy phân mà các
olygosacharide có khối lượng phân tử khác nhau (số n khác nhau), tính chất khác
nhau. Olylgo-chitin được nghiên cứu và ứng dụng rất nhiều trên thế giới, và ngày
càng xuất hiện nhiều thông tin kỹ thuật, nhiều đặc tính quý của các olygo-chitin
được công bố. Tại Việt Nam các chế phẩm chitosan, olygo-chitin cũng đang được
nghiên cứu tại Đại học Nha Trang. Đặc điểm khác của olygo-chitin so với chitin,
chitosan là nó có khả năng hòa tan trong nước, có hoạt tính sinh học cao nên được
ứng dụng trong nhiều lĩnh vực đời sống.
Trong nông nghiệp, olygo-chitin ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của cải bắp,
đậu cove và một số loại rau khác. Nó có tác dụng tăng năng suất, tăng khả năng
kháng bệnh, hạn chế được sử dụng thuốc bảo vệ thực vật góp phần bảo vệ môi
24

trường. Chế phẩm olygo-chitin ảnh hưởng tích cực đến sinh trưởng và năng suất của
Ngô. Nếu được phun với nồng độ thích hợp khoảng 40ppm, số lần phun là 3 lần/vụ,
liều lượng phun 300l/ha năng suất sau khi sử dụng tăng 20% so với đối chứng. Các
nghiên cứu trên đã được tiến hành tại Đại học Nông Nghiệp I Hà Nội. Chitin,
chitosan và các olygo-chitin có đặc tính miễn dịch do nó kích thích các tế bào giữ
nhiệm vụ bảo vệ miễn dịch với các tế bào khối u và các tác nhân gây bệnh. Đồng
thời olygo-chitin còn được sử dụng làm thuốc để hạ cholesterol trong máu [20],
[21],[22].

Phương pháp sản xuất chitin và các dẫn xuất của chitin: Trong thực tế,
nguồn chitin tồn tại trong côn trùng, các loài giun, trong loài giáp xác. Chitin cũng
có thể được sinh tổng hợp từ vi sinh vật. Tại Việt Nam, phế thải từ ngành chế biến
thủy sản như vỏ tôm, cua và mực là nguồn chính để sản xuất chitin và các dẫn xuất
từ chitin.
Trong thành phần nguyên liệu để sản xuất chitin như vỏ tôm, cua không chỉ
chứa chitin mà còn các thành phần khác như protein, sắc tố, và khoáng… vì vậy để
thu được chitin phải tiến hành tác các tạp chất đó ra khỏi nguyên liệu.
Tách tạp chất là chất khoáng: Sử dụng acid để tách khoáng, trong thành phần
cấu tạo của vỏ tôm cua khoáng chiếm một lượng rất lớn, chủ yếu ở dạng CaCO
3
,
Ca
3
PO
4
… có thể sử dụng các acid mạnh để tách khoáng như acid clohydric, acid
sunfuric. Dùng acid clohydric tốt hơn vì muối có gốc clorua luôn ở dạng hòa tan
nên khoáng dễ hòa tan, tách ra và được rửa trôi.
Tách protein: sử dụng kiềm loãng (5%) để thủy phân protein còn trong
nguyên liệu. Sử dụng kiềm để tách protein ra khỏi nguyên liệu ít nhiều cũng ảnh
hưởng đến chất lượng của chitin thu được. Để tránh ảnh hưởng của môi trường
kiềm đến mạch polymer của chitin có thể thay thế bằng các chế phẩm protease để
tách protein. Phản ứng thủy phân diễn ra nhẹ nhàng, ít ảnh hưởng đến mạch
polymer của chitin, chitin thu được có chất lượng tốt hơn [20], [21], [22].
Có rất nhiều dẫn xuất của chitin trong đó chitosan là dẫn xuất được sản xuất
và ứng dụng nhiều nhất hiện nay:
Sản xuất chitosan từ chitin: người ta sản xuất chitosan bằng cách loại bỏ
nhóm acetyl trong mạch polymer của chitin. Có thể dùng môi trường kiềm đặc để
25

loại bỏ nhóm acetyl. Phương pháp này ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng của chitin
do mạch chitin bị cắt đứt nhiều. Chitosan thu được có độ nhớt thấp, tạp chất nhiều,
quá trình sản xuất gây ô nhiễm môi trường. Hiện nay để nâng cao chất lượng của
chitosan thu được, có thể sử dụng enzyme deacetylase để tách nhóm acetyl ra khỏi
chitin. Như vậy chất lượng của chitin thu được sẽ cao hơn rất nhiều do sử dụng
enzyme được thực hiện trong điều kiện nhẹ nhàng, không cần phải sử dụng kiềm
đặc và nhiệt độ cao.
Sản xuất huyền phù chitin: Chitin tách chiết từ vỏ tôm, cua, mực…được
hòa tan trong HCl đậm đặc, khuấy liên tục trong thời gian 3 phút ở nhiệt độ 40
0
C.
Chitin tạo thành huyền phù bằng cách thêm từ từ nước lạnh có nhiệt độ 5
0
C. Huyền
phù chitin là phần bã thu được bằng cách lọc qua giấy lọc hoặc ly tâm. Huyền phù
chitin được rửa bằng nước cất nhiều lần cho đến khi pH = 5. Huyền phù chitin được
bảo quản lạnh [23].

1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ CHITINASE
1.2.1. Các công trình nghiên cứu ngoài nước.
Theo nghiên cứu của Wen-Chi Hou, Yaw-Huei Lin, Ying-Chou Chen

(1998)

từ Viện Công nghệ Sinh học Đài Loan. Các tác giả đã nghiên cứu về hoạt độ của
enzyme chitinase từ cây khoai lang. Kết quả nghiên cứu cho thấy: Hoạt độ của
chitinase được tìm thấy trong dịch chiết từ các phần khác nhau của cây khoai lang.
Cơ chất sử dụng để xác định hoạt độ của enzyme là glycol chitin. Theo nghiên cứu
thì hoạt độ chitinase chiết được từ các phần khác nhau của cây khoai lang là khác

nhau. Hoạt độ của chitinase giảm dần khi chiết từ các bộ phận từ cây theo thứ tự lá,
chồi (búp), cuống lá, củ. Trong cùng điều kiện thí nghiệm, hoạt độ chitinase từ lá
cao hơn dây khoai. Hoạt độ chitinase từ các lá khoai bị côn trùng cắn sẽ có hoạt độ
cao hơn so với các lá còn nguyên vẹn. Hoạt độ chitinase từ dây khoai có lá bị côn
trùng cắn cũng cao hơn so với dây khoai có lá còn nguyên vẹn. Khối lượng phân tử
enzyme chitinse của lá và chồi của cây khoai lang khoảng 16 kDa mặc dù khối
lượng của hầu hết các chitinase từ thực vật khoảng 30kDa (Boller et al., 1983;
Chang et al., 1992; Molanol et al., 1979; Vad et al., 1991; Wadsworth and Zikakis