công nghệ adn tái tổ hợp

PHẦN I: MỞ ĐẦU
Khoa học kỹ thuật ngày càng phát triển, không như cách đây hàng trăm
năm người ta chỉ biết đến những gì mắt thấy tai nghe, thì giờ đây con người với
những bộ óc tuyệt vời của các nhà khoa học nghiên cứu họ đã tìm ra được những
thứ mà không thể nhìn thấy bằng mắt thường như là vi khuẩn, những thành phần
cấu tạo vi mô của các chất, các nguyên tử, phân tử … đó là những thành công
lớn mà nhân loại có được. Đặc biệt là công nghệ sinh học - một lĩnh vực khoa
học công nghệ vĩ đại.
Công nghệ sinh học (CNSH) là một lĩnh vực công nghệ cao, công nghệ
của thế kỷ XXI. Ít năm trước đây, trước thềm của thế kỷ XXI, đã có nhiều ý kiến
nhận định, phán đoán của các nhà khoa học, các nhà nghiên cứu chiến lược, các
nhà hoạch định chính sách,… về một ngành khoa học mũi nhọn có thế sẽ được
phát triển trong tương lai.
Thực vậy, công nghệ sinh học là một bước tiến mới nhất trong nỗ lực lâu
dài chinh phục tự nhiên để nâng cao điều kiện sống của con người. CNSH đã
được phát triển và ứng dụng trong nhiều ngành, nhiều lĩnh vực của cuộc sống.
Người ta đã sử dụng CNSH trong lĩnh vực nông-lâm - ngư nghiệp, lĩnh vực y-
dược, bảo vệ môi trường,…thậm chí là cả trong lĩnh vực thể thao. Trong mỗi
lĩnh vực, CNSH đều đã mở ra được các cách thức, phương thức làm cho
cuộc sống an toàn hơn, mạnh khoẻ hơn và năng suất cao hơn.
Từ xa xưa, công nghệ sinh học (CNSH cổ truyền và CNSH cận đại) đã
được loài người ứng dụng phục vụ nhiều nhu cầu cuộc sống. Từ những thao
tác rất nhỏ trong cuộc sống như muối dưa, muối cà đến việc sản xuất ở qui
mô công nghiệp các sản phẩm của công nghệ lên men, công nghệ vi sinh như
các đồ uống có cồn (rượu, bia ), các dung môi hữu cơ, các vitamin, các loại
vaccine, thuốc trừ sâu sinh học, phân bón sinh học, … Vài thập kỷ gần đây,
với sự ra đời của CNSH hiện đại ( gồm: Công nghệ di truyền, công nghệ tế
bào, công nghệ vi sinh vật/ công nghệ lên men , công nghệ enzym/ protein và
CNSH môi trường), loài người đã và đang có thể sửa chữa, trao đổi, cải tạo,
tạo mới vật chất di chuyền ở cấp độ phân tử. Thực tế phát triển và ứng
dụng CNSH hiện đại trên cơ sở kế thừa và phát huy CNSH cổ truyền và cận

đại, những năm gần đây, loài người đã có thể tuyển chọn và dần tạo thêm
được nhiều giống cây trồng, vật nuôi mới có năng suất, chất lượng cao, sức
chống chịu tốt; Đã và đang có thể chuẩn đoán, phòng ngừa hay cứu chữa
các bệnh hiểm nghèo, bệnh di truyền như bệnh tiểu đường, khối u, ung thư,
lùn bẩm sinh, thiếu máu; các bệnh nhiễm sắc thể thường và nhiễm sắc thể
giới tính; viêm gan B, viêm não Nhật Bản, bại liệt, sốt rét, …; Đã có thể tạo
ra ngày một nhiều các chủng, loài vi sinh vật mới hoặc chỉ định các vi sinh
vật này tạo ra các protein, enzim có hoạt tính cao hơn hay các sản phẩm
khác mà vốn dĩ trước đây chúng ta không làm được…
Trong đó ADN tái tổ hợp là kỹ thuật đầu tiên của hàng loại kỹ thuật Công
nghệ sinh học hiện đại khác, tập hợp lại gọi là Công nghệ di truyền.
PHẦN II: NỘI DUNG
1. Khái niệm về ADN tái tổ hợp:
ADN tái tổ hợp: Là một phân tử AND nhỏ được ráp láp từ các đoạn ADN
lấy từ các tế bào khác nhau (thể truyền và gen cần chuyển) mà thể truyền là một
phân tử ADN nhỏ có khả năng nhân đôi một cách độc lập đối với hệ gen của tế
bào cũng như có thể gắn vào hệ gen của tế bào
Công nghệ di truyền cũng gọi là công nghệ gen hay kỹ thuật tái tổ hợp
ADN thực hiện việc chuyển gen để tạo ra các tế bào hoặc có thể mang các gen
mới nhằm tạo ra những vật chất cần thiết.
2. Các bước tiến hành kỹ thuật ADN tái tổ hợp:
2.1. Phân lập đoạn ADN/gen bằng PCR
Có nhiều phương pháp để phân lập một đoạn ADN/gen như: sàng lọc gen
từ thư viện genome hoặc thư viện cADN, bằng phương pháp PCR
Phương pháp PCR là phương pháp phổ biến hiện nay được dùng để phân
lập một trình tự nucleotide (gen) từ genome của sinh vật dựa trên các primer đặc
hiệu cho trình tự đó. Phương pháp PCR đơn giản và ít tốn thời gian hơn hai
phương pháp trên, mà hiệu quả vẫn rất cao.
PCR là một kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong công nghệ sinh học hiện
đại và đã đóng góp rất lớn cho những tiến bộ về sinh học phân tử, đánh dấu một

bước tiến vô cùng quan trọng tương đương với việc khám phá ra các enzyme hạn
chế và kỹ thuật Southern blot (phân tích ADN).
PCR dựa trên cơ sở phản ứng mở rộng primer nhờ enzyme Taq
polymerase để khuếch đại in vitro các đoạn ADN đặc trưng. PCR cho phép
khuếch đại theo hàm mũ lên đến hàng triệu lần các đoạn ADN có chiều dài từ
200-3.000 bp. Đoạn ADN được khuếch đại (ADN đích) được nhận dạng nhờ cặp
primer đặc trưng (oligonucleotide) thường có chiều dài khoảng 20 nucleotide.
+ Nguyên tắc của PCR
Taq polymerase là một loại enzyme ADN polymerase chịu nhiệt (có ở vi
khuẩn chịu nhiệt độ cao Thermus aquaticus) được dùng để tổng hợp các đoạn
ADN mới trong môi trường có bốn loại deoxyribonucleotide (dATP, dCTP,
dGTP và dTTP) và hai primer, trên cơ sở khuôn mẫu của một đoạn ADN nhất
định đã biết hoặc chưa biết trình tự. Các đoạn ADN mới hình thành lại được sử
dụng làm khuôn mẫu. Sau nhiều chu kỳ, số lượng đoạn ADN nói trên được nhân
lên gấp nhiều lần, nhờ vậy có thể đủ số lượng để tách ra, phân tích trình tự hoặc
tạo dòng. Primer ở bên trái tác động trên sợi ADN 3’→5’ được gọi là primer
thuận (forward primer-ký hiệu là F). Primer ở bên phải tác động trên sợi ADN
5’→3’ được gọi là primer ngược (reverse primer-ký hiệu là R).
Nguyên tắc của PCR được trình bày trong hình 1. Theo đó, từ chu kỳ
thứ hai Taq polymerase bắt đầu tạo ra các đoạn ADN có chiều dài xác định.
Các primer thường là một oligonucleotide tổng hợp (synthetic
oligonucleotide) có khoảng 10-20 nucleotide. Nếu biết trình tự của đoạn gen
cần khuếch đại thì có thể tổng hợp nhân tạo các primer tương ứng để thực
hiện PCR và tách chúng ra bằng kỹ thuật điện di. PCR thường tiến hành
khoảng 25-35 chu kỳ, qua đó từ 10-6 µg ADN ban đầu có thể khuếch đại
(amplification) lên tới trên 1 µg (khoảng 2 kb). Mỗi chu kỳ PCR bao gồm ba
giai đoạn có nhiệt độ khác nhau:

Hình 1. Sơ đồ phản ứng chuỗi polymerase (PCR)
- Gây biến tính (denaturation) ở 90-95oC. Trong giai đoạn biến tính, phân

tử ADN khuôn mẫu ở dạng xoắn kép được tách thành hai sợi đơn (single
strands). Tất cả các phản ứng enzyme trong giai đoạn này đều bị dừng lại (ví dụ:
phản ứng tổng hợp ADN từ chu kỳ trước đó).
Gen đích
DNA khuôn mẫu
Khuếch đại theo hàm mũ
Chu kỳ 35
2
2
= 4 2
3
= 8 2
4
= 16 2
5
= 32 2
36
= 68 tỷ bản sao
bản sao bản sao bản sao bản sao
Chu kỳ 1
Chu kỳ 2
Chu kỳ 3
Chu kỳ 4
- Gắn mồi (annealing) ở 35-55oC. Trong giai đoạn này các primer gắn vào
các vị trí có trình tự tương đồng ở ADN khuôn mẫu. Các primer bị lắc nhẹ chung
quanh do chuyển động Brown vì thế các liên kết ion được tạo thành và bị đứt
gãy liên tục giữa primer sợi đơn và ADN khuôn mẫu sợi đơn. Các liên kết ion ổn
định hơn tạo thành một đoạn nhỏ (các primer đã lắp ráp chính xác) và trên các
đoạn nhỏ ADN sợi đôi đó (khuôn mẫu và primer) enzyme Taq polymerase có
thể bắt đầu quá trình sao chép khuôn mẫu.

- Kéo dài phân tử (extension) ở nhiệt độ 70-75
o
C. Đây là khoảng nhiệt
độ tối thích cho Taq polymerase tiến hành tổng hợp ADN bắt đầu từ các vị
trí có primer theo chiều 5’→3’. Các primer có một vài base gắn vào khuôn
mẫu có mối liên kết ion mạnh hơn các lực phá vỡ các liên kết này sẽ không
bị đứt gãy. Các primer ở các vị trí không bắt cặp chính xác lại bị rời ra (do
nhiệt độ cao) khỏi khuôn mẫu đã không tổng hợp được ADN. Enzyme Taq
polymerase bổ sung các dNTP từ 5’→ 3’.
2.2. Tạo dòng (gắn) đoạn ADN/gen vào vector và biến nạp vào tế bào
vật chủ
2.2.1. Enzyme hạn chế
Việc phát hiện ra các enzyme hạn chế (restriction enzyme) của vi khuẩn
cắt ADN ở những trình tự đặc trưng, đã giúp cho việc thao tác gen dễ dàng hơn,
vì nó có thể giảm chiều dài của các phân tử ADN thành một tập hợp bao gồm các
đoạn ngắn hơn.
Các enzyme hạn chế hiện diện trong hầu hết các tế bào vi khuẩn để ngăn
cản ADN ngoại lai tiếp quản bộ máy tổng hợp protein của tế bào. ADN của
chính chúng sẽ được bảo vệ khỏi tác dụng của enzyme hạn chế, nhờ sự có mặt
của các enzyme nội bào có thể methyl hóa (methylation) các nucleotide đặc biệt,
vì thế các nucleotide này không thể bị nhận biết bới các enzyme hạn chế.
Mỗi enzyme hạn chế nhận biết và cắt một trình tự ADN đặc trưng chứa
bốn hoặc sáu cặp nucleotide. Ví dụ: enzyme EcoRI chiết từ E. coli cắt trình tự
GAATTC, enzyme BalI của Brevibacterium albidum cắt trình tự TGGCCA
(Hình 2). Có hơn 500 enzyme hạn chế khác nhau được tinh sạch từ khoảng 250
loài vi sinh vật. Các enzyme hạn chế cắt gãy các phân tử ADN sợi đôi theo hai
cách khác nhau như:
- Cắt trên một đường thẳng đối xứng để tạo ra các phân tử đầu bằng.
- Cắt trên những vị trí nằm đối xứng quanh một đường thẳng đối
xứng để tạo ra những phân tử đầu so le (đầu kết dính).

Hình 2. Hai kiểu cắt của enzyme hạn chế. (a) tạo ra đầu bằng,
và (b) tạo ra đầu so le.
Vì một enzyme hạn chế nhận biết một trình tự duy nhất, cho nên số vị trí
cắt trên một phân tử ADN đặc biệt thường là nhỏ. Các đoạn ADN được cắt bởi
enzyme hạn chế có thể được phân tách theo kích thước bằng điện di agarose gel
để nghiên cứu. Do sự tương tự của tổ chức phân tử trong tất cả các cơ thể, cho
nên ADN vi khuẩn, ADN thực vật và ADN động vật có vú tương hợp nhau về
cấu trúc. Vì thế, một đoạn ADN từ một dạng sống này có thể dễ dàng được pha
trộn với ADN của một dạng sống khác. Sự tương tự này cũng phù hợp đối với
plasmid, nhân tố di truyền ngoài nhân được tìm thấy trong nhiều loài vi khuẩn
khác nhau. Chúng là những phân tử ADN mạch vòng đóng sợi đôi được dùng
làm vector mang các đoạn ADN ngoại lai (foreign ADN) dùng trong kỹ thuật
ADN tái tổ hợp.
2.2.2. Vector plasmid dùng để tạo dòng các đoạn ADN
T G G C C
A
A C C G G
T
T G G C
C A
A C C G
G T
T G G C C
A
A C C G G
T
T G G C C
A
A C C G G
T

(a) (b)
Các đoạn ADN thu được từ phản ứng cắt hạn chế được gắn đồng hóa trị in
vitro vào vector tạo dòng bằng cách dùng enzyme gắn ADN ligase. Trước khi
gắn, vector được cắt ra ở một vị trí đơn, thông thường là cùng với enzyme được
dùng để cắt ADN nguồn, nhằm tạo các đầu kết dính bổ trợ cho các đầu của đoạn
ADN chèn vào (ADN ngoại lai). Một đôi khi, vector và ADN nguồn được cắt
với tổ hợp hai enzyme khác nhau để ngăn cản mỗi loại phân tử tự gắn lại. Sự tự
tái tạo lại vòng của vector cũng có thể giảm thiểu bằng cách xử lý với enzyme
alkaline phosphatase để loại nhóm 5’-PO4 khỏi các đầu của vector.
Plasmid là các thông tin di truyền ngoài nhân, được tìm thấy trong nhiều
loài vi khuẩn khác nhau. Chúng là những phân tử ADN mạch vòng, sợi đôi, kích
thước từ 1- ≥ 200 kb, có khả năng tự sao chép để tồn tại độc lập trong tế bào.
Các plasmid dùng làm vector tạo dòng có các đặc điểm sau: Kích thước
tương đối nhỏ, mang một hoặc nhiều gen chỉ thị chọn lọc (selectable marker) cho
phép xác định các nhân tố biến nạp và duy trì plasmid trong quần thể vi khuẩn,
chứa các vị trí nhận biết đơn cho một hoặc nhiều enzyme hạn chế.
Các plasmid được sử dụng phổ biến nhất hiện nay là các plasmid đa năng
(polycloning plasmid) và chuyên dụng thuộc thế hệ thứ ba. Để tiện cho việc sử
dụng nhiều loại enzyme hạn chế khác nhau, nhiều trình tự nhận biết của chúng
được xếp nối tiếp nhau thành một đoạn dài gọi là polylinker (vùng đa nối) hay
multiple cloning sites (các vị trí tạo dòng). Các plasmid vi khuẩn có thể chứa
đoạn ADN ngoại lai khoảng 3-10 kb. Ví dụ: plasmid pGEM-T dùng để tạo dòng
các đoạn ADN là sản phẩm PCR (Hình 3).
Hình 3. Plasmid vector pGEM-T. Loại vector này đã được mở
sẵn ở vùng tạo dòng trên gen lacZ mang hai đầu T, thích hợp cho gắn các
sản phẩm PCR do chúng có mang hai đầu A.
Về nguyên tắc, ADN plasmid bị cắt bởi enzyme hạn chế và gắn in
vitro với đoạn ADN ngoi lai tạo ra các plasmid tái tổ hợp, sau đó chúng
được dùng để biến nạp vào vi khuẩn. Khó khăn lớn nhất là phân biệt giữa
các plasmid chứa các đoạn ADN ngoại lai-thể tái tổ hợp (recombinant) và

các phân tử ADN vector đã tái tạo lại vòng (recircularization). Sự tái tạo lại
vòng của plasmid có thể được hạn chế bằng cách điều chỉnh nồng độ ADN
ngoại lai và ADN vector trong phản ứng gắn (ligation).
2.2.3. Gắn đoạn ADN (sản phẩm PCR) vào vector
Trong một số trường hợp nhất định có thể thay thế phương pháp tạo dòng
truyền thống bằng kỹ thuật PCR, vì PCR cho phép sản xuất ra một lượng lớn
đoạn ADN mong muốn và sau đó có thể tạo dòng đoạn ADN này trong các
plasmid vector hoặc phage thích hợp. Phương thức tạo dòng cho các sản phẩm
PCR hoàn toàn giống tạo dòng các đoạn ADN thu được từ những thao tác ADN
truyền thống, và có thể được tạo dòng với đầu bằng hoặc đầu kết dính (so le).
ADN polymerase ổn nhiệt như Taq polymerase đã khuếch đại các sản phẩm PCR
có gốc A lồi ra ở đầu 3’. Như vậy, có thể tạo dòng sản phẩm PCR vào trong các
dT vector (được gọi là tạo dòng dA:dT). Điều này cho thấy việc bổ sung các gốc
A vào đầu cuối có thể giúp gắn thành công sản phẩm PCR với vector đã được
chuẩn bị với gốc T lồi ra (Hình 4). Phản ứng được xúc tác bởi ADN ligase, như
trong một phản ứng gắn truyền thống.
Người ta cũng có thể tạo dòng đầu kết dính với các sản phẩm PCR.
Trong trường hợp này các oligonucleotide primer được thiết kế với một vị
trí cắt hạn chế được kết hợp chặt chẽ trong chúng. Do sự bổ trợ của các
primer cần thiết là tuyệt đối ở đầu 3’, nên thông thường đầu 5’ của primer
là vùng định vị của vị trí cắt hạn chế. Điều này cần phải được thiết kế với sự
chú ý thận trọng do hiệu suất cắt ADN bằng một enzyme hạn chế nhất định
sẽ giảm nếu các nucleotide bổ sung thêm cho sự nhận biết của enzyme lại
thiếu ở đầu 5’. Trong trường hợp này các phản ứng cắt và gắn giống như
các phản ứng truyền thống.
Hình 4. Tạo dòng các sản phẩm PCR bằng phương thức tạo dòng dA:dT.
2.2.4. Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn/tế bào vật chủ
Sau khi tạo được vector tái tổ hợp mang gen ngoại lai, việc tiếp theo là
biến nạp nó vào tế bào vật chủ. Trong trường hợp này tế bào vật chủ thường
được sử dụng là vi khuẩn E. coli để khuếch đại một lượng lớn ADN plasmid tái

tổ hợp dùng cho các phân tích về sau.
Sản phẩm PCR được khuếch đại bằng Taq polymerase
A
A
Vector (dT)
Phản ứng gắn T4 ADN ligase
Vector (dT) + đoạn chèn PCR
Hai phương pháp được dùng để biến nạp vector tái tổ hợp vào E. coli
là điện biến nạp (electroporation transformantion) và hóa biến nạp
(chemical transformation).
2.2.4.1. Điện biến nạp
Đây là kỹ thuật hiệu quả nhất để biến nạp vi khuẩn. Hai thông số quan
trọng của phương thức này là loại tế bào vi khuẩn và tần số xung điện cần thiết.
Thể tích của dung dịch tế bào thường được dùng là 30 µL (tương ứng với nồng
độ 1010 tế bào E. coli/mL) có bổ sung 5 ng plasmid trong một cuvette có khoảng
trống điện cực (electrode gap) 0,1 cm. Hiệu suất biến nạp của phương thức này
lớn hơn 1× 109 thể biến nạp/µg plasmid siêu xoắn và khoảng 1× 108 thể biến
nạp/µg plasmid được dùng trong phản ứng gắn. Tần số biến nạp khoảng 0,02 cho
cả hai loại plasmid. Tần số biến nạp thấp đã ngăn cản được sự đồng biến nạp
(co-transformation) vào vi khuẩn của hai hoặc nhiều phân tử plasmid.
Phương pháp điện biến nạp có một số ưu điểm sau:
- Hiệu suất biến nạp cao.
- Có thể dùng một thể tích dịch tế bào nhỏ. Thể tích dịch tế bào khoảng 20
µL có thể cho hiệu suất khoảng 109 thể biến nạp.
- Phương pháp chuẩn bị tế bào biến nạp rất đơn giản, không sử dụng các
kỹ thuật phức tạp và tốn thời gian. Hơn nữa, các tế bào dùng để biến nạp có thể
được chuẩn bị trước và bảo quản vô hạn định mà không mất tính khả biến.
- Tần số điện biến nạp với ADN siêu xoắn và ADN mạch vòng là giống
nhau. Do đó, không cần thiết phải dùng vector được tinh sạch cao trong các phản
ứng gắn.

- Hiệu suất biến nạp phân tử cho ADN mạch vòng rất cao đối với các
plasmid có kích thước lên đến 50 kb.
Nhược điểm của phương pháp này là đòi hỏi thiết bị biến nạp đắt tiền.
2.2.4.2. Hóa biến nạp
Đây là phương thức kinh điển để biến nạp ADN plasmid vào tế bào E.
coli. Các tế bào được ủ trong dung dịch CaCl2 để trở thành tế bào khả biến giúp
cho chúng dễ tiếp nhận ADN plasmid. ADN plasmid đưa vào bằng cách shock
nhiệt nhanh (40-50 giây), các tế bào biến nạp sau đó được chọn lọc bằng phương
pháp chọn lọc dương tính trên đĩa agar chứa môi trường LB với kháng sinh thích
hợp. Mỗi khuẩn lạc trên đĩa kháng sinh đại diện cho một thể biến nạp đơn. Các
tế bào chứa plasmid mang ADN ngoại lai có thể xác định bằng mắt trên đĩa môi
trường có bổ sung thêm cơ chất nhiễm sắc thể cho β-galactosidase (X-gal) vì
chúng là các khuẩn lạc không màu do sự khử hoạt tính của enzyme bằng cách
chèn đoạn ADN ngoại lai.
Phương pháp chuẩn bị và bảo quản tế bào khả biến trong hóa biến
nạp cũng rất đơn giản. Hiệu suất biến nạp của phương pháp này trong
khoảng 104-106 thể biến nạp/µg plasmid, tùy thuộc vào kích thước của đoạn
ADN chèn và chủng vi khuẩn được sử dụng. Hiệu suất này thích hợp cho
các phương thức tạo dòng truyền thống. Đối với các phương thức cần hiệu
suất biến nạp cao hơn (ví dụ: xây dựng thư viện cADN, xây dựng thư viện
phân tích trình tự ADN ) thì tốt hơn hết là dùng phương pháp điện biến
nạp. Tuy nhiên, nếu không có sẵn thiết bị biến nạp bằng điện thì vẫn có thể
thu được hiệu suất biến nạp cao bằng cách dùng các chủng vi khuẩn thích
hợp hơn cho mục đích này và có thể thu được hiệu suất 109 thể biến nạp/µg
plasmid.
2.3. Chọn dòng mang ADN tái tổ hợp
Trong thí nghiệm tạo vector tái tổ hợp, hỗn hợp vector và một lượng lớn
phân tử ADN cắt cùng một enzyme hạn chế được gắn lại với nhau bằng enzyme
ADN ligase. Kết quả, hỗn hợp này có plasmid tái tổ hợp lẫn các plasmid
không có gen ngoại lai chèn vào và chúng được trộn lẫn với các tế bào vi

khuẩn để thực hiện biến nạp. Sau đó, người ta chuyển tất cả lên môi trường
dinh dưỡng chọn lọc để chúng phát triển thành các dòng tức các khuẩn lạc
vi khuẩn. Do cách tiến hành thí nghiệm trong một hỗn hợp không đồng nhất
như vậy nên các dòng vi khuẩn mọc lên có ba loại như sau:
- Tế bào vi khuẩn không nhận plasmid.
- Tế bào nhận được plasmid không có gen ngoại lai chèn vào.
- Tế bào vi khuẩn nhận đúng plasmid tái tổ hợp.
Hình 5. Khử hoạt tính bằng chèn đoạn. AmpR: gen kháng ampicillin,
lacZ: gen lacZ mã hóa enzyme β-galactosidase.
Vì vậy, việc xác định đúng các dòng vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp phải
mất nhiều công sức. Có ba hướng chính trong thí nghiệm tạo dòng thừ thư viện
ADN là lai khuẩn lạc và vết tan, khử hoạt tính bằng chèn đoạn và tạo dòng
định hướng. Dưới đây chỉ trình bày phương pháp thông dụng đó là khử
hoạt tính bằng chèn đoạn.

Amp
r
lacZ
Plasmid vector ADN ngoại lai
Bam
HI
Bam
HI
Bam
HI
Bam
HI
Amp
r

Amp
r
Gen
lacZ
mất hoạt tính
lacZ
Đoạn ADN
ngoại lai
chèn giữa
gen
lacZ
làm
gen
lacZ
mất
hoạt tính
Amp

r
ADN ligase
Biến nạp vào
E.coli
và sinh
trưởng ở 37
o
C trên môi trường
có Amp và IPTG + X-gal
Vi khuẩn
E.coli
chứa vector tái tạo

vòng phát triển thành khuẩn lạc có
màu xanh
Vi khuẩn
E.coli
chứa vector tái tổ
hợp phát triển thành khuẩn lạc có
màu trắng
Bam
HI
Phương pháp khử hoạt tính bằng chèn đoạn dùng cho các plasmid
mang hai hoặc nhiều marker (ví dụ Ampr, lacZ). ADN ngoại lai và ADN
plasmid được thủy phân cùng một loại enzyme hạn chế và tinh sạch, sau đó
gắn hai ADN với nhau, hỗn hợp gắn được biến nạp vào E. coli mẫn cảm
Amp để chọn lọc thể biến nạp nhờ tính kháng Amp của plasmid và hoạt
tính β-galactosidase của gen lacZ. Các khuẩn lạc chứa các plasmid tái tổ
hợp sinh trưởng trên môi trường có mặt Amp và isopropyl-thiogalactoside
(IPTG) cùng với cơ chất nhiễm sắc thể X-gal sẽ có màu trắng do đoạn ADN
ngoại lai xen vào giữa gen lacZ làm gen này mất hoạt tính. Trong khi đó, các
khuẩn lạc chứa ADN plasmid tái tạo lại vòng sẽ có màu xanh do gen lacZ
không bị mất hoạt tính (Hình 5.5).
2.4. Biểu hiện của gen được tạo dòng
Về mặt lý thuyết, kỹ thuật ADN tái tổ hợp cho phép đưa bất kỳ một đoạn
gen nào từ sinh vật này vào sinh vật khác. Vấn đề quan trọng tiếp theo là làm sao
các gen lạ có sự biểu hiện.
Muốn gen tạo dòng có biểu hiện tổng hợp protein cần cấu tạo vector có đủ
các yếu tố phiên mã và dịch mã. Các vector này được gọi là vector biểu hiện.
Nếu gen không nằm giữa promoter và terminator, nó sẽ không được phiên mã.
Các gen được tổng hợp hóa học hay từ cADN không có promoter nên phải gắn
chúng cạnh promoter thì mới có thể biểu hiện phiên mã. Để sự dịch mã được
thực hiện, mARN cần phải mang ở đầu 5’ trình tự rbs (ribosome binding site-vị

trí liên kết ribosome). Đoạn gen ngoại lai thiếu điểm bám của ribosome (rbs), do
đó muốn được dịch mã thì nó phải gắn vào vị trí nằm sau promoter và rbs.
Ở một số gen của sinh vật eukaryote, sự dịch mã đòi hỏi quá trình splicing
tức là cắt bỏ các đoạn intron khỏi tiền mARN thông tin (premature mARN) và
nối các exon lại với nhau để tạo thành mARN hoàn chỉnh (mature mARN).
Mục đích việc tạo dòng các gen của động vật có vú, nhất là của người,
là nhằm tạo ra các sản phẩm đúng như trong cơ thể với số lượng lớn và có
giá trị thương mại. Sự biểu hiện của các gen eukaryote trong tế bào vi
khuẩn nhiều khi gặp trở ngại, do đó cần phải thiết kế các vector biểu hiện
thích hợp cho phép gen ngoại lai biểu hiện ở mức độ cao.
2.4.1. Vector biểu hiện
Các vector biểu hiện là vector có thể mang các gen ngoại lai mong muốn
cho phép thực hiện sự phiên mã của các bản sao được tạo dòng và sự dịch mã
các mARN của chúng trong E. coli. Những vector như thế được dùng để biểu
hiện các gen của eukaryote trong E. coli và tăng sản xuất các sản phẩm của gen ở
prokaryote. Để biểu hiện tất cả các gen ngoại lai trong E. coli phải bắt đầu bằng
việc gắn đoạn gen ngoại lai vào trong vector biểu hiện (thường là plasmid).
Vector này phải có đủ các cấu trúc cần thiết sau:
- Các trình tự mã hóa gen chỉ thị chọn lọc (selectable marker) để đảm bảo
duy trì vector trong tế bào.
- Một promoter kiểm soát phiên mã (ví dụ: lac, trp hoặc tac) cho phép sản
xuất một lượng lớn mARN từ các gen được tạo dòng.
- Các trình tự kiểm soát dịch mã như vị trí liên kết ribosome được bố
trí thích hợp và codon khởi đầu AUG.
- Một polylinker để đưa gen ngoại lai vào trong một hướng chính xác
với vector.
Chỉ khi được cấu trúc đầy đủ như thế, các vector biểu hiện mang gen
ngoại lai mới được biến nạp vào chủng E. coli thích hợp.
Tuy nhiên, cần lưu ý là số lượng các bản sao của vector phải hợp lý
đối với một tế bào vật chủ và nó có sự ổn định lâu dài, đồng thời cần tránh

sự thủy phân sản phẩm protein (proteolysis) do các enzyme của tế bào.
2.4.2. Xác định mức độ biểu hiện của gen được tạo dòng
Nói chung có ba cách thường được dùng để đánh giá mức độ biểu
hiện protein ngoại lai của gen được tạo dòng:
- Điện di polyacrylamide gel để xác định protein có kích thước thích
hợp được sản xuất ở mức độ cao trong các tế bào mang vector biểu hiện.
Thông thường, protein quan tâm có thể quan sát bằng cách nhuộm gel với
Coomassie Brilliant Blue hoặc bằng thuốc nhuộm bạc. Nếu không có băng
protein mới được thấy khi dùng các thuốc nhuộm này, thì đánh dấu sự trao
đổi chất với 100 µCi của [35S]Met hoặc [35S]Cys trên 1 mL dịch nuôi cấy
trong 5 phút. Điện di SDS-polyacrylamide gel và phóng xạ tự ghi có thể cho
phép phát hiện protein quan tâm.
- Phân tích Western blot bằng cách dùng các kháng thể liên kết đặc
hiệu với protein quan tâm đã được thẩm tích lên màng nitrocellulosse sau
khi thực hiện diện di SDS-PAGE.
- Nếu mức độ biểu hiện thấp thì nên đặt gen lacZ cùng hướng với gen
được biểu hiện. Như vậy, nếu sự phiên mã hoặc dịch mã hạn chế biểu hiện
thì những thay đổi trong hệ thống biểu hiện có thể được kiểm soát bằng
những thay đổi trong hoạt tính của β-galactosidase.
* Kỹ thuật Western blot
+ Điện di SDS-PAGE
Điện di trên polyacrylamide gel với sự có mặt của SDS cho phép phân
ly các phân tử protein có trọng lượng khác nhau. SDS có điện tích âm rất
lớn và có khả năng liên kết với mạch peptide. Như vậy, số lượng SDS tương
tác với protein tỷ lệ với kích thước phân tử protein và điện tích của SDS
bám vào có thể làm bất cứ phân tử protein nào cũng chuyển động trong
điện trường từ cực âm sang cực dương. Do đó, bằng phương pháp điện di,
có thể phân tách riêng biệt các phân tử protein có trọng lượng phân tử khác
nhau. Ngoài ra, có thể điện di các protein tùy theo điểm đẳng điện
(isoelectric focusing) của chúng. Phương pháp này được gọi là điện di đẳng

điện. Trong dung dịch đệm có pH biến thiên liên tục (gradient pH), các
protein sẽ phân ly đến vị trí tương thích với điểm đẳng điện của chúng. Hai
phương pháp điện di theo trọng lượng phân tử và điểm đẳng điện có thể kết
hợp với nhau tạo nên kỹ thuật điện di 2 chiều (2-D electrophoresis). Điện di
protein trên acrylamide gel cho phép phân đoạn, xác định trọng lượng phân
tử và phân lập protein. Ngoài ra, trọng lượng protein còn được xác định
chính xác bằng phương pháp sắc ký khối phổ.
+ Phản ứng lai kháng nguyên-kháng thể
Phản ứng kháng nguyên-kháng thể có tính đặc hiệu rất cao. Vì vậy, có
thể áp dụng phản ứng này để phát hiện sự có mặt và tinh sạch protein.
Kháng thể (antibody) được sản xuất khi đưa kháng nguyên vào thỏ và được
tinh sạch từ máu thỏ sau khi gây nhiễm. Những kháng thể tạo ra bằng cách
này là những kháng thể đa dòng (polyclonal antibodies-do các tế bào
lympho khác nhau tiết ra), do đó chúng có khả năng nhận biết một số kháng
nguyên. Ngược lại, kháng thể đơn dòng (monoclonal antibodies) chỉ tương
tác với một kháng nguyên nhất định.
Kháng thể được đánh dấu bằng enzyme (hoặc bằng chất phát huỳnh
quang) để phát hiện protein đặc hiệu (thường được thẩm tích lên màng
nitrocellulose sau khi chạy điện di SDS-PAGE, và cố định ở đó) thông qua
kỹ thuật Western blot (hoặc immunoblot) (Hình 6). Cơ chế của phản ứng lai
kháng nguyên-kháng thể được trình bày ở hình 7 Sau khi protein trên màng
lai gắn với kháng thể thứ nhất đặc hiệu và tiếp đến là kháng thể thứ hai có
đánh dấu enzyme (alkaline phosphatase, horse-radish peroxidase…) thì
phức hợp này sẽ được liên kết với cơ chất để tạo màu. Sự hiện diện của
protein ngoại lai (sản phẩm dịch mã của gen ngoại lai được chuyển vào tế
bào vật chủ) sẽ được phát hiện nhờ sự xuất hiện màu của phản ứng lai.
Hình 6. Sơ đồ kỹ thuật Western blot.
Hình 7. Cơ chế liên kết protein (kháng nguyên) với kháng thể thứ nhất
đặc hiệu và kháng thể thứ hai có đánh dấu enzyme trong Western blot.
Sự phân bố của protein đặc hiệu trong tế bào và tổ chức mô cũng có

thể phát hiện bằng kỹ thuật lai in situ (in situ hybridization) với nguyên tắc
tương tự Western blot. Ngoài ra, kháng thể được sử dụng để tinh sạch
protein đặc hiệu bằng kết tủa miễn dịch hoặc sắc ký ái lực (affinity
chromatography). Kháng thể đánh dấu được dùng để định lượng kháng
Alkaline phosphatase
Kháng thể thứ hai (Rabbit)
Kháng thể thứ nhất (Rabbit)
Kháng nguyên
Thẩm tích (blot)
Protein gel
Western blot
Ủ và rửa màng lai Kết quả
nguyên trong kỹ thuật xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme
(enzyme-linked immunosorbent assay) gọi tắt là ELISA.

Quá trình nhân lên của AND tái tổ hợp
3. Ứng dụng của ADN tái tổ hợp
3.1. Sản xuất các loại vacxin phòng bệnh
Vaccine được đưa vào cơ thể với mục đích làm tăng khả năng đáp ứng
miễn dịch, đặc biệt với các tác nhân gây bệnh si sinh vật. Những vaccine kinh
điển được sản xuất dựa trên vi khuẩn, virus đã bị chết hoặc độc lực của chúng bị
suy giảm để không gây bệnh. Tuy nhiên, những vaccine kinh điển này vẫn có
Kỹ thuật ADN tái tổ hợp
một tỷ lệ nhỏ tác hại không mong muốn cho người sử dụng. Vì vậy, vaccine thế
hệ mới sử dụng công nghệ ADN tái tổ hợp để thu nhận vaccine có hoạt tính đặc
hiệu cao và đảm bảo an toàn. Công nghệ ADN tái tổ hợp được sử dụng vào sản
xuất vaccine gồm những bước cơ bản sau:
Đưa gen mã hóa kháng nguyên của vi khuẩn hoặc víu gây bệnh vào vector
biểu hiện có promoter mạnh; rồi đưa vector vào tế bào nhận. Tế bào nhận có thể
là prokaryot hoặc tế bào động vật nuôi cấy, thu nhận và tinh sạch kháng nguyên

từ những tế bào này để sản xuất vaccine.
Gây đột biến, hoặc loại bỏ các gen quy định độc tính của chủng vi khuẩn
hoặc virus gây bệnh. Nhờ đó những chủng đột biến không còn nguy hiểm nhưng
vẫn có khả năng tạo kháng nguyên đặc hiệu cao. Chúng được sử dụng để sản
xuất các vaccine.
Sau đây là một số thành tựu trong sản xuất vaccine đã đạt được:
Vaccine viêm gan A do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương bào chế
Với những kinh nghiệm sẵn có trong việc phát triển vaccine mới, kỹ thuật
nắm được, trong vòng 4 năm, các nhà khoa học Việt Nam đã bào chế thành công
vaccine viêm gan A và viêm gan B tái tổ hợp, có hiệu quả tốt khi được đánh giá
và thử nghiệm trên thực địa lâm sàng. Vaccine viêm gan B tái tổ hợp đảm bảo
tính an toàn, không gây các tác dụng phụ. 95,39% số người được tiêm có đáp
ứng miễn dịch sau 3 mũi tiêm với hiệu giá kháng thể cao là 448mIU/ml (nồng độ
kháng thể đủ bảo vệ là 10mIU/ml). Công trình nghiên cứu đoạt giải nhì (không
có giải nhất) Giải thưởng sáng tạo KH-CN Việt Nam (VIFOTEC) 2002 trong
lĩnh vực sinh học phục vụ sản xuất và đời sống.
Từ khi xảy ra vụ dịch cúm gia cầm H5N1 tới nay có rất nhiều nước tham
gia nghiên cứu sản xuất vaccine phòng bệnh cúm H5N1 như Trung Quốc, Hàn
Quốc, Pháp, Úc, Việt Nam…, từ loại vaccine truyền thống (vaccine bất hoạt và
vaccine giảm độc lực), đến các loại vaccine thế hệ mới (vaccine virus tái tổ hợp;
các loại vaccine tiểu đơn vị như vaccine DNA, vaccine vector, vaccine protein
tái tổ hợp, split vaccine).
Tuy nhiên, để kịp thời có vaccine tiêm chủng phòng bệnh cho vật nuôi thì
chiến lược sản xuất vaccine virus tái tổ hợp là một phương thức hiệu quả. Bằng
công nghệ di truyền ngược (reverse genetics), vaccine được tạo ra theo hệ
thống 8 plasmid (rescue plasmid system) mà nhóm tác giả Hoffmann và
cộng sự thực hiện năm 2002. Hai plasmid mang gene HA và NA bắt nguồn
từ chủng virus A/Vietnam/1203/04 (H5N1) mà Tổ chức Y tế Thế giới
(WHO) khuyến cáo dùng làm vaccine. Và các gene còn lại (M, NS, NP, PA,
PB1 và PB2) từ chủng virus cúm A/Puerto Rico/8/34 (H1N1). Gene HA

được biến đổi di truyềnđể làm giảm tính độc lực của virus cúm bằng cách
cắt bỏ ba acid amin Arginine (R), 1 acid amin Lysine (K) và thay thế 1 acid
amin Lysine (K) bằng 1 acid amin Threonine (T), ở vị trí 327-328, vị trí
phân cắt HA1 và HA2 của gene HA, vị trí góp phần tính độc lực cao của
virus cúm. Biến nạp 2 plasmid mang gene HA và NA từ chủng
A/Vietnam/1203/04 (H5N1) và 6 plasmid mang các gene còn lại (M, NS, NP,
PA, PB1 và PB2) từ chủng virus cúm A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) vào tế bào
nuôi cấy (phôi trứng gà, hoặc tế bào Vero, tế bào MDCK,…). Virus tái tổ
hợp này sẽ có đặc điểm kháng nguyên bề mặt giống với chủng hoang dại
A/Vietnam/1203/04 (H5N1). Sau đó chọn lọc dòng virus tái tổ hợp này làm
vaccine phòng cúm H5N1.

Hình vẽ. Nguyên tắc tạo vaccine virus H5N1 tái tổ hợp và cơ chế loại
bỏ độc tính ở gene HA của chủng virus cúm H5N1
3.2. Sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học phục vụ và nâng cao
chất lượng cuộc sống
Sản xuất kháng sinh: Nguồn kháng sinh trong tự nhiên được tìm thấy chủ
yếu trong vi sinh vật. Quá trình chọn lọc môi trường nuôi cấy cũng như sàng lọc
các chủng vi sinh vật cho kháng sinh đặc hiệu và có năng suất cao rất tốn công
sức và chi phí. Kỹ thuật tách dòng ADN cho phép tạo ra toàn bộ các dòng gồm
những gen tham gia vào quá trình tổng hợp kháng sinh. Nhờ vậy, chúng ta kiểm
soát và điều chỉnh một cách chủ động toàn bộ quy trình sản xuất kháng sinh ở
quy mô công nghiệp.
Sản xuất hoocmon: Một số bệnh di truyền gây ra do đột biến ở gen mã cho
hoocmon gây thiếu hụt hoocmon. Kỹ thuật gen đã phân lập cADN của những
gen mã cho các hoocmon đó và đưa chúng vào vector có promoter mạnh. Vector
tái tổ hợp được biến nạp vào tế bào nhận; từ đó các protein tương ứng được tách
triết và tinh sạch.
Sản xuất kháng thể đơn dòng: Kháng thể đơn dòng có rất nhiểu ứng dụng
trong chuẩn đoán và điều trị bệnh, đặc biệt là điều trị ung thư. Chúng ta có thể

phân biệt tế bào ung thư với tế bào lành nhờ kháng nguyên trên bề mặt tế bào
ung thư. Kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên được sản xuất nhờ kỹ
nghệ ADN tái tổ hợp. Kháng thể này được ghép nối với độc tố, hoặc với đồng vị
phóng xạ rồi được đưa vào cơ thể. Nhờ kháng thể chỉ liên kết đặc hiệu với kháng
nguyên trên bề mặt tế bào ung thư nên chỉ những tế bào này bị tiêu diệt.
3.3 Chuẩn đoán mầm bệnh
Chuẩn bệnh truyền nhiễm: Hiện nay nhờ các kỹ thuật PCR, kỹ thuật lai
được áp dụng để xét nghiệm nhanh, chính sác sự có mặt của vi sinh vật
gây bệnh.
Chuẩn đoán các đột biến gen và tư vấn trước sinh: Các bệnh di
truyền gây ra do đột biến gen hầu hết là đột biến lặn và thường để lại hậu
quả hết sức nặng nề cho gia đìn và xã hội. Vì vậy, chuẩn đoán các đột biến
gen ở giai đoạn thai nhi sớm rất có ý nghĩa trong tư vấn di truyền trước sinh
đối với các gia đình có tiền sử bệnh.
3.4. Liệu pháp gen
Liệu pháp gen được hiểu là thay thế gen hỏng (gây bệnh) bằng gen lành.
Liệu pháp gen có thể thực hiện ở hai mức độ: thực hiện với tế bào soma (tế bào
sinh dưỡng) hoặc trên tế bào sinh dục.
Liệu pháp gen thực hiện với tế bào soma người được thực hiện lần đầu
tiên vào năm 1990. Một bé gái 4 tuổi mắc bệnh không có khả năng đáp ứng miễn
dịch do đột biến gen mã hóa cho enzym adenosine deaminase (ADA). Khi không
có gen này, tế bào lympho T bị chết do cơ chất tích tụ. Tế bào bạch cầu của bé
gái được nuôi cấy và nhận gen lành mã hóa cho enzym. Sau đó những tế bào
chuyển gen được truyền cho bé. Em bé này đã nhận dòng tế bào của chính mình,
những tế bào có khả năng tổng hợp enzym ADA. Nhờ đó khả năng đáp ứng miễn
dịch của bé gái trở nên bình thường.
Tiếp sau đó, nhiều bệnh nhân của căn bệnh này cũng được điều trị bằng
liệu pháp gen. Do thời gian sống của tế bào bạch cầu ngắn nên bệnh nhân phải
được truyền tế bào liên tục. Để khắc phục nhược điểm này, tế bào mầm tủy
xương được lấy ra từ bệnh nhân và được chuyển gen ADA. Sau đó những tế bào

mầm đã nhận gen được đưa trở lại bệnh nhân. Đây là những tế bào có khả năng
sản sinh ra các tế bào bạch cầu mới. Liệu pháp gen với tế bào mầm đã được áp
dụng thành công trong điều trị cho 2 bệnh nhi vào năm 1993. Cho đến nay Liệu
pháp gen đang là một biện pháp chữa bệnh thu hút sự chú ý của các nhà khoa
học…
3.5. Chuyển gen tạo các động, thực vật có năng suất chất lượng cao
3.5.1. Động vật chuyển gen
Chuột chuyển gen là động vật mô hình sử dụng trong nghiên cứu
phục vụ y học như tác dụng của thuốc, miễn dịch, cấy ghép tạng, tìm hiểu cơ
chế gây bệnh, các biện pháp gen…
Ngoài ra còn sử dụng một số động vật như bò, cừu, cá …Chuyển gen
thể hiện những tính trạng mong muốn như chất lượng thịt và sữa tốt, sản
lượng lông tăng cao, tăng trưởng nhanh….
3.5.2. Thực vật chuyển gen
Thực vật chuyển gen thể hiện những tính trạng mong muốn như có
năng suất cao, có tính chống chịu sâu bệnh hay điều kiện môi trường (hạn,
mặn…) khắc nhiệt. Những gen quy định tính trạng này được phân lập từ vi
sinh vật hay thực vật khác loài và được đưa vào tế bào thực vật chủ yếu
thông qua Agrobacterium tumerfaciens. Ví dụ, các gen cry quy định tính
kháng côn trùng sâu bệnh phân lập từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis được
chuyển vào nhiều loài thực vật như bông, thuốc lá, khoai tây … tạo nên các
giống có tính chống chịu sâu bệnh cao.
Khoai tây chuyển gen (GM) áp dụng kỹ thuật ADN tái tổ hợp.
Khoai tây chứa vắc-xin.
Khoai tây chuyển đổi gien (GM), chứa vắc-xin ngừa viêm gan B, đã thúc
đẩy thành công khả năng miễn dịch trong các cuộc thử nghiệm lâm sàng đầu
tiên. Trong nghiên cứu, hơn 60% tình nguyện viên ăn khoai tây GM, tương
đương ba liều vắc xin. Kết quả là cơ thể họ tạo thêm một lượng lớn kháng thể
chống lại virus. Tình nguyện viên ăn khoai tây bình thường không sinh thêm
kháng thể. Tuy nhiên, do những người ăn sống khoai tây GM đã được tiêm vắc-

xin viêm gan B thông thường nên vắc-xin khoai tây chỉ tăng cường khả năng
miễn dịch của họ.Để tạo vắc-xin trong khoai tây, nhóm nghiên cứu do Charles
Arntzen thuộc ĐH Arizona (Mỹ) đứng đầu đã bổ sung vào cây khoai tây thông
thường một protein của virus viêm gan B. Khi con người ăn khoai tây này,
protein sẽ giúp hệ miễn dịch nhận ra và tiêu diệt mọi virus viêm gan B trong
tương lai.
PHẦN III. KẾT LUẬN
Tóm lại CNSH mà đỉnh cao là kỹ thuật tái tổ hợp ADN đang ngày càng có
ý nghĩa to lớn đối với đời sống con người, tạo ra được những điều mà trước đây
tưởng chừng như không làm được.
Thực vậy, nhờ kỹ thuật tái tổ hợp ADN con người đã làm ra được nhiều
sản phẩm mới ưu việt hơn, điều chế ra được nhiều loại văcxin phòng được nhiều
bệnh nguy hiểm, nâng cao chất lượng cuộc sống.