đồ án CN 1: bệnh đốm trắng ở Tôm

Đồ án công nghệ 1
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ I
Đề tài : Nghiên cứu về bệnh đốm trắng ở tôm WSSV
Giáo viên hướng dẫn : PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ
Sinh viên thực hiện : TRẦN DUY SƠN
NGUYỄN THỊ THÂN
NGUYỄN THỊ THANH NHÀN
Lớp : 10SH
Đà Nẵng,ngày….tháng… năm…
SVTH:Trần Duy Sơn-10SH
Đồ án công nghệ 1

SVTH:Trần Duy Sơn-10SH
Đồ án công nghệ 1
PHỤ LỤC: Các hình vẽ trong đồ án
ST
T
Hình vẽ Tên hình vẽ Trang
1 Hình 2.1
Phân bố địa lí bệnh đốm trắng
3
2 Hình 4.1
Virus đốm trắng (WSSV) hình que dưới kính hiển vi điện tử
7
3 Hình 4.2 Cấu trúc protein của virus WSSV 8
4 Hình 4.3 Nucleocasid của WSSV đã nhuộm âm được quan sát dưới kính
hiển vi điện tử
8

5 Hình 4.4 Cấu trúc nucleocapsid của WSSV 9
6 Hình 4.5 Bản đồ điện di protein của WSSV và mô hình cấu tạo Whispovirus 10
7 Hình 4.6 Vị trí của 39 gen mã hóa cho 39 protein cấu trúc trong genome của
WSSV
13
8 Hình 4.7 DNA của WSSV bị cắt bởi bởi enzyme giới hạn 14
9 Hình 5.1 Vỏ của một tôm sú ấu niên bị bệnh đốm trắng 16
10 Hình 5.2 Vỏ đầu ngực của tôm bị bệnh đốm trắng do vi khuẩn 17
11 Hình 6.1 Hai vòng lây nhiễm của virus gây bệnh đốm trắng trong ao nuôi 18
12 Hình 6.2 Sơ đồ thể hiện nguyên nhân và cơ chế gây bệnh đốm trắng
(WSSV)
19
13 Hinh 7.1 Thiết bị PCR 21
14 Hình 7.2 Nguyên lí của phản ứng PCR 22
15 Hình 7.3 Các chu kì của kĩ thuật PCR. 22
16 Hình 7.4 Sơ đồ các bước phản ứng chuỗi polymerase 24
17 Hình 7.5 Quy trình của phản ứng PCR 25
18 Hình 7.6 Hệ thống Real-time PCR 26
19 Hình 7.7 Nguyên tắc hoạt động của hệ thống Real-time PCR 28
20 Hình 7.8 Biểu đồ biểu diễn khuếch đại cường độ huỳnh quang 29
21 Hình 7.9 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ:nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ 31
22 Hình7.10 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn 32
23 Hình7.11 Đồ thị biễu diển mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu
kì của 12 mẩu tôm sú
33
24 Hình7.12 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu
kỳ của 3 mẫu tôm sú
34
25 Hình7.13 Quy trình thực hiện Real - time PCR 36
26 Hình7.14 Mô hình chung cho kỹ thuật chạy PCR 37

PHỤ LỤC: Các bảng,biểu đồ trong đồ án:
SVTH:Trần Duy Sơn-10SH
Đồ án công nghệ 1
ST
T
Bảng/biể
u
Tên bảng/biểu đồ Trang
1 Bảng 3.1 Các chủng virus gây bệnh đốm trắng 7
2 Bảng 4.1 Trọng lượng phân tử của 5 loại protein chính ở
WSSV
11
PHỤ LỤC: Danh sách các chữ viết tắt trong đồ án.
1. WSSV : White Spot Syndrome Virus
2. PCR : Polymerase Chain Reaction
3. PL : Postlarve
4. MBV : Monodon Baculovirus
5. VP28 : Envelope protein (28kDa)
6. VP26 : Envelope protein (26kDa)
7. KDa : Kilo Dalton
8. DNA : Deoxyribonucleic acid
9. UV : Ultraviolet
10. NTP : Deoxynucleoside-triphosphate
11. WSBV: White Spot Baculovirus Virus
12.WSVD : White Spot Viral Disease
13.WSS : White Spot Syndrome
14. WSV : White Spot Virus
15.SEMBV: Systemic Ectodermal and Mesodermal Baculovirus Disease
16.HHNBV: Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Baculovirus

17.WSBV : White Spot Baculovirus Virus
18.WSVD : White Spot Viral Disease
19.WSS : White Spot Syndrome
SVTH:Trần Duy Sơn-10SH
Đồ án công nghệ 1
20.WSV : White Spot Virus
SVTH:Trần Duy Sơn-10SH
Đồ án công nghệ 1
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
- Bệnh đốm trắng là một trong những bệnh đặc biệt nguy hiểm xảy ra
trên rất nhiều đối tượng tôm nuôi và các loại giáp xác khác.Đặc trưng của
bệnh là tỷ lệ chết cao và chết hàng loạt trong một thời gian rất ngắn trên
các ao nuôi. Bệnh hội chứng đốm trắng đã và đang gây nhiều thiệt hại cho
ngành nuôi trồng thủy sản đặc biệt là ngành nuôi tôm trên thế giới,vì chưa
có biện pháp chữa trị đặc hiệu. Vì vậy, việc nghiên cứu để hiểu rõ bản
chất tác nhân gây bệnh là hết sức cần thiết.
SVTH:Trần Duy Sơn-10SH Page 6
Đồ án công nghệ 1
TỔNG QUAN
2.1. Lịch sử xuất hiện của hiện tượng đốm trắng ở tôm:
Bệnh đốm trắng xuất hiện lần đầu tiên ở vùng đông bắc của Đài Loan vào
cuối năm 1991 đầu 1992.Đầu tiên virus này chỉ gây bệnh trên loài tôm
Marsupenaeus japonicus. Sau đó bệnh lan truyền sang loài tôm sú Penaeus
monodon. Bệnh hội chứng đốm trắng trên tôm nhanh chóng lan rộng ra các tỉnh
ven biển từ bắc tới nam của Trung Quốc. Các loài tôm M. japonicus, P.
monodon và Fenneropenaeus chinensis đều có thể bị bệnh này, sau đó dịch bệnh
lan sang Nhật Bản (1993), Indonesia, Thái Lan, Malaysia, Ấn Độ, Bangladesh,
Texas (Hoa Kỳ, 1995) kèm theo sự sa sút nghiêm trọng sản lượng tôm ở các
quốc gia trên [29]. Từ đầu năm 1999, hội chứng đốm trắng xuất hiện và lan
nhanh từ Trung Mỹ đến Bắc Mỹ và sau đó bệnh đã lan khắp Châu Âu và Châu

Úc.
Hình 2.1: Phân bố địa lí bệnh đốm trắng
SVTH:Trần Duy Sơn-10SH Page 7
Đồ án công nghệ 1
2.2. Tình hình bệnh và tác hại của đốm trắng đối với nghề tôm trên thế giới:
Bệnh đốm trắng là một trong những bệnh nguy hiểm nhất đối với tôm nuôi
hiện nay.Bệnh xảy ra ở tất cả các nước nuôi tôm và ảnh hưởng phần lớn đến
nghề nuôi tôm công nghiệp trên thế giới [3]. Trong thời gian qua, bệnh đốm
trắng đã bùng phát ở nhiều khu vực nuôi tôm trên thế giới, đặc biệt là các nước
Châu Á. Bệnh đốm trắng đã gây tỷ lệ chết cao và gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi
tôm công nghiệp ở Trung Quốc, Nhật Bản, In-đô-nê-xi-a và Ấn Độ. Trong thời
gian 1994 – 1995, virus gây bệnh đốm trắng đã gây chết hầu hết tôm nuôi (P.
monodon; P. indicus) dọc theo bờ biển phía Đông Ấn Độ và phía Tây Ấn Độ
[11].
Ở Thái Lan, dịch bệnh đốm trắng bùng nổ đã làm giảm sản lượng tôm nuôi
từ 225 000 tấn năm 1995 xuống 160 000 tấn năm 1996, làm thiệt hại trên dưới
500 triệu USD. Ở các nước Châu Á bệnh gây thiệt hại khoảng 3 tỷ USD mỗi
năm [3].
Thực tế hiện nay ở các nước trong khu vực Đông Nam Á, bệnh đốm trắng
được xem là phổ biến và nguy hiểm nhất. Vì vậy, hầu hết các nghiên cứu đều tập
trung ngăn ngừa sự lây nhiễm và bùng nổ bệnh đốm trắng ở các ao nuôi [3]
2.3.Tình hình bệnh và tác hại của đốm trắng đối với nghề tôm ở Viêt Nam:
Việt Nam có nhiều điều kiện thuận lợi để phát triển nghề nuôi tôm biển.
Sản lượng tôm xuất khẩu toàn quốc đã từng đạt 40-45 ngàn tấn/năm, chiếm gần
10% sản lượng tôm Châu Á, mang lại lợi ích đáng kể cho người nuôi tôm[4].
Cùng với sự phát triển của nghề nuôi tôm trên qui mô công nghiệp, “dịch
bệnh” tôm tại Việt Nam cũng đã bắt đầu xuất hiện ngay từ những năm đầu thập
niên 90. Năm2001, Bùi Quang Tề và cộng sự đã điều tra 483 hộ nuôi tôm sú
thuộc 23 huyện của 8 tỉnh ven biển phìa Bắc (Quảng Ninh, Hải Phòng, Thái
Bình, Nam Định, Ninh Bình, Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh) có 166 hộ (34.3%)

có tôm nuôi và tôm cua tự nhiên đã mang mầm bệnh đốm trắng và có 169 hộ
SVTH:Trần Duy Sơn-10SH Page 8
Đồ án công nghệ 1
(34.99%) có tôm chết vì bệnh đốm trắng. Năm 2003, Bùi Quang Tề và cộng sự
phân tích bệnh WSSV bằng kỹ thuật PCR của 145 mẫu tôm sú và tôm chân
trắng nuôi ở các tỉnh ven biển miền Bắc (Quảng Ninh, Hải Phòng, Nam Định,
Thanh Hoá và Hà Tĩnh) và tôm Postlarve (PL) đưa từ Quảng Nam và Đà Nẵng
chuyển ra Bắc. Kết quả cho thấy tỷ lệ nhiễm bệnh đốm trắng của tôm (PL) đưa
từ Đà Nẵng, Quảng Nam là 23,08%; tôm sú nuôi thương phẩm ở các tỉnh phìa
Bắc là 26,92%; tôm chân trắng là 13,33% [11] .
Theo báo cáo kết quả nuôi trồng thủy sản (NTTS) năm 2003, cả nước có
546.757 ha nuôi tôm nước lợ thương phẩm, trong đó diện tích có tôm nuôi bị
bệnh và chết là 30.083 ha. Các tỉnh, thành ven biển từ Đà Nẵng đến Kiên Giang
có tới 29.200ha nuôi tôm bị chết nhiều, chiếm 97,06% diện tìch có tôm bị chết
trong cả nước. Bệnh xảy ra với tôm chủ yếu là bệnh đốm trắng (WSSV), bệnh
MBV (Monodon Baculovirus), bệnh do vi khuẩn Vibrio. Kết quả kiểm tra bệnh
ở tôm giống nhập về Hải Phòng và Quảng Ninh trong năm 2003 do Trạm nghiên
cứu NTTS nước lợ thực hiện cho thấy tỷ lệ nhiễm virus gây bệnh đốm trắng từ
25 - 46,6%, trung bình 38,9%.
Theo số liệu từ Trung Tâm Môi Trường và Dịch Bệnh (Viện nghiên cứu
NTTS I), Thanh Hóa có hơn 40% diện tìch nuôi tôm bị bệnh, trong đó phần lớn
thường là bệnh đốm trắng.Bệnh này tập trung ở vùng nuôi tôm công nghiệp như
khu công nghiệp Hoằng Phụ, với 70 / 110 ha nuôi tôm bị nhiễm bệnh. Ở Hà
Tĩnh, trong số 150 ha nuôi tôm bị bệnh, có 67 ha bị bệnh đốm trắng, trong đó 27
ha có tôm nuôi bị chết. Theo kết quả nghiên cứu của Viện Nghiên Cứu NTTS II,
tại các tỉnh Nam Bộ, tỷ lệ nhiễm bệnh đốm trắng trên mẫu tôm có biểu hiện
bệnh thu ở đầm nuôi quảng canh cải tiến là 56%. Những ngày đầu năm 2004, tại
nhiều tỉnh ở Đồng Bằng Sông Cửu Long đã xảy ra tính trạng tôm nuôi bị chết do
virus gây bệnh đốm trắng gây nên và bệnh này lây lan nhanh ngay từ đầu vụ.
Hiện nay, bệnh đốm trắng vẫn đang diễn ra và đã gây nhiều tổn thất cho nhiều

hộ dân tại các tỉnh này [10].
SVTH:Trần Duy Sơn-10SH Page 9
Đồ án công nghệ 1
Nhín chung, tình hình dịch bệnh đốm trắng diễn ra ở Việt Nam rất nghiêm
trọng và đã ảnh hưởng lớn đến nghề nuôi tôm trong cả nước.
GIỚI THIỆU CHUNG VỀ BỆNH
3.1. Tên gọi WSSV:
Tên WSSV có nguồn gốc từ các dấu hiệu lâm sàn của bệnh,ví dụ như sự
xuất hiện của những đốm trắng và canxi lắng đọng bên trong lớp biểu bì tôm
3.2. Định danh và phân loại:
Định danh
- Giống: Non Occuluded Baculovirus
- Họ: Baculoviridae
- Họ phụ: NudiBaculoviridae
Theo hội nghị virus học quốc tế lần thứ 12 (2002), các nhà khoa học đã
phân loại virus gây bệnh đốm trắng là một giống mới Whisspovirus thuộc họ
mới Nimaviridae [11].
Tác nhân virus gây bệnh đốm trắng được gọi bởi nhiều tên do nhiều nhóm
nghiên cứu khác nhau [28]:
- WSSV: White Spot Syndrome Virus
- WSBV: White Spot Baculovirus Virus
- WSVD: White Spot Viral Disease
- WSS: White Spot Syndrome
- WSV: White Spot Virus
- SEMBV: Systemic Ectodermal and Mesodermal Baculovirus Disease
- HHNBV: Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Baculovirus
Các chủng virus gây bệnh đốm trắng bao gồm:
Bảng 3.1 Các chủng virus gây bệnh đốm trắng [11]
Tên virus Kích thước virus Kích thước nhân
SVTH:Trần Duy Sơn-10SH Page 10

Đồ án công nghệ 1
Virus Trung Quốc (HHNBV) 120 x 360 nm
Virus tôm Nhật 1(RVPJ-1) 84 x 226 nm
Virus tôm Nhật 2 (RV-PJ-2) 83 x 275 nm 54 x 216 nm
Virus bệnh đốm trắng Thái
lan (SEMBV)
121 x 276 nm 89 x 201 nm
Virus bệnh đốm trắng
(WSBV)
70-150x350-
380nm
58-67x330-
350nm

ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC GEN CỦA VIRUT GÂY BỆNH:WSSV
4.1. Đặc điểm hình thái:
- Virus dạng hình trứng, kích thước 120x275nm, có một đuôi phụ ở một đầu,
kích thước 70x300nm
- Virus có ít nhất 5 lớp protein, trọng lượng phân tử từ 15- 28 kilodalton. Vỏ bao
có hai lớp protein VP28 và VP19; Nucleocapsid có 3 lớp VP26, VP24, VP15
- Nhân cấu trúc dsADN: Không có thể ẩn (Occlusion body).
- Khi môi trường nuôi tôm xấu bệnh dễ xuất hiện.

A B
Hình 4.1: Virus đốm trắng (WSSV) hình que dưới kính hiển vi điện tử
A- Nhân tế bào mang tôm sú nhiễm bệnh WSSV;
B- Thể virus có vỏ bao ở nhân tế bào mang tôm sú nhiễm bệnh WSSV [8]
SVTH:Trần Duy Sơn-10SH Page 11
Đồ án công nghệ 1
4.2. Cấu trúc protein:

Hạt virus cấu trúc bao gồm 3 phần:
Bao màng (envelope), capsid và vật chất di truyền.
Mỗi nucleocapsid có đường kình 65-70 nm và chiều dài 300-350 nm, có 5
protein chính VP28, VP26, VP24, VP29, VP15 và còn nhiều protein khác.[26].
Hình 4.2:Cấu trúc protein
của virus WSSV
Hình 4.3:Nucleocasid của WSSV đã nhuộm âm được quan sát dưới kính hiển vi
điện tử
SVTH:Trần Duy Sơn-10SH Page 12
Đồ án công nghệ 1
Hình 4.4:Cấu trúc nucleocapsid của WSSV [14]
Kích thước trung bình của nucleocapsid bên trong lớp vỏ thứ hai là 80 x
350nm, có 15 đường xoắn ốc rõ ràng và quấn quanh trục dài, mỗi đường xoắn ốc
có hai đường kẻ sọc gồm có 7 cặp capsomer hình cầu, mỗi capsomer hình cầu có
đường kính 8 nm, khoảng cách giữa các đường xoắn ốc là 7 nm
Năm 2000, bốn loại protein cấu trúc của WSSV đã được xác định và được gọi
tên theo trọng lượng phân tử khi điện di trên gel SDS-Polyacrylamide là
VP28 (có trọng lượng phân tử 28 kDa), protein VP26 (26 kDa), protein
VP24 (24 kDa) và protein VP19 (19 kDa). Trong đó, VP19 và VP28 đựơc xác
định là hiện diện tại vỏ của virus, còn VP24 và VP26 thì hiện diện trong
nucleocapsid. Có sự tương đồng về trính tự acid amin giữa VP28 và VP26 là
41% , VP28 và VP24 là 46% [25]
Năm 2001, một protein cấu trúc khác của WSSV đã được xác định là VP15 có
trọng lượng phân tử 15 kDa hiện diện trong nucleocapsid [26]
SVTH:Trần Duy Sơn-10SH Page 13
Đồ án công nghệ 1
Hình 4.5:Bản đồ điện di protein của WSSV và mô hình cấu tạo Whispovirus
A- Bản gel điện di protein của WSSV
(1- marker; 2- protein của tôm sông không nhiễm bệnh;
3- virus WSSV; 4- Nucleocapsid của WSSV);

B- mô hình cấu tạo Whispovirus [17]
Bảng 4.1: Trọng lượng phân tử của 5 loại protein chính ở WSSV [27]
Những nghiên cứu sâu hơn trên protein vỏ VP28 đã chỉ ra protein này có
vai trò như là chía khóa giúp WSSV xâm nhiễm vào cơ thể tôm [27]
Trong kiểm soát bệnh thí hiện nay người ta đã dựa vào protein vỏ
để tạo ra kháng thể chống lại sự xâm nhập của WSSV, chủ yếu là kháng thể chống
SVTH:Trần Duy Sơn-10SH Page 14
Đồ án công nghệ 1
lại VP28, vì kháng thể này có thể làm mất khả năng xâm nhập của WSSV [26].
Theo Jeroen Witteveldt và cộng sự khi so sánh giữa 2 kháng thể chống lại
VP28 và VP19 thì ông cho rằng kháng thể chống lại VP28 giúp tôm chống lại bệnh
rất hiệu quả còn kháng thể chống lại VP19 thì hầu như không có khả năng giúp
tôm chống lại bệnh [21].
Ngoài 5 protein chính đã được công bố thì theo một số nhà khoa học thì ở
WSSV có thêm các protein sau:
VP281: là protein vỏ chứa 281 axit amin. Trọng lượng phân tử lý thuyết là
31.5 kDa và là 37 kDa khi xác định thực nghiệm bằng SDS-PAGE. Protein này
được mã hóa bởi ORF1050 trên bộ gen chứa 843 nucleotid từ vị trì 290363 đến
289998 (GenBank AF 411634)
VP292 : là protein vỏ chứa 292 axit amin, được mã hóa bởi ORF948
(GenBank AF411634). Trọng lượng phân tử theo lý thuyết của protein này là 33
kDa [16].
VP466 : là protein vỏ chứa 466 axit amin, có trọng lượng phân tử lý thuyết là
51.2 kDa. Protein này được mã hóa bởi ORF trên bộ gen chứa 1398 nucleotid từ vị
trì 177124 đến 178521 (GenBank AF 395545).
VP35 : là protein nucleocapsid, protein được mã hóa bởi ORF trên bộ gen
chứa 687bp và trọng lượng phân tử của VP35 tái tổ hợp khi điện di trên gel SDS-
PAGE là 35 kDa.[16]
VP39: là protein vỏ chứa 283 axit amin, protein này được mã hóa bởi
ORF339 trên bộ gen chứa 849bp, trọng lượng thực tế của protein này khi điện di

trên SDS-PAGE là 39 kDa.( Zhu YB và cộng sự., PMID: 16132182 [PubMed -
indexed for MEDLINE ).
VP110: là protein vỏ có trọng lượng phân tử khi điện di trên gel SDS-PAGE
là 110 kDa [19]
SVTH:Trần Duy Sơn-10SH Page 15
Đồ án công nghệ 1
VP664: là protein ở nucleocapsid có dạng cụm vòng đơn độc, có một ORF
khổng lồ chứa 18.234 nucleotide mã hóa một polypeptide gồm 6.077 axit amin với
chức năng chưa biết [18].
Theo Jyh-Ming Tsai,và cộng sự 2004: thì ở WSSV có 39 protein
4.3. Vật chất di truyền:
Virus đốm trắng có DNA bộ gen mạch đôi dạng vòng. Bộ gen của WSSV đã
được giải trình tự năm 2001 [30]. Bộ gen của WSSV có nguồn gốc từ Thái Lan có
kích thước là 292.967bp, chứa 184 khung đọc mở (open reading frame, ORF) [26].
DNA bộ gen của WSSV có nguồn gốc từ Trung Quốc có kích thước là 305.107bp
chứa 181 khung đọc mở (GenBank Accession No. AF332093). Trình tự DNA toàn
bộ của WSSV phân lập ở Đài Loan là 307287bp chứa 532 khung đọc mở [22]
SVTH:Trần Duy Sơn-10SH Page 16
Đồ án công nghệ 1
Hình 4.6:Vị trí của 39 gen mã hóa cho 39 protein cấu trúc trong genome của
WSSV

Bộ gen của WSSV khi cắt với các enzyme cắt khác nhau sẽ cho các band khác
nhau:
SVTH:Trần Duy Sơn-10SH Page 17
Đồ án công nghệ 1
Hình 4.7:DNA của WSSV bị cắt bởi bởi enzyme giới hạn:
giếng 1: Sal I, giếng 2: BamH I, giếng 3: Hind III, giếng 5: Sac I, giếng 6: XhoI
[14]
4.4. Đặc điểm sinh học:

Virus đốm trắng ký sinh ở các tổ chức ngoại bì, trung bì, mang, cơ quan
lymphoid và biểu bì dưới vỏ kitin. Virus xâm nhập vào nhân tế bào gây hoại tử và
sưng to. Virus sống và tồn tại trong nước có độ mặn từ 5 – 40‰, độ pH từ 4 – 10,
có khả năng chịu đựng được nhiệt độ từ 0 – 800C [5].
Cũng như đa số các virus, virus gây bệnh đốm trắng WSSV có sức chịu
đựng yếu với các yếu tố môi trường [15]:
SVTH:Trần Duy Sơn-10SH Page 18
Đồ án công nghệ 1
Sau 48 –72 giờ sau khi tiếp xúc môi trường nước mà không tìm được vật chủ
thì WSSV sẽ bị phân hủy.
Virus mất khả năng gây nhiễm sau 60 phút dưới tia UV (Ultraviolet) 9 x 105
µWs/cm2.
Trong khoảng nhiệt độ 55 – 750C trong 5 – 90 phút, virus mất khả năng gây
nhiễm.
Ozone ở nồng độ 0,5 µg/ml sẽ làm bất hoạt WSSV ở 250C.
TÁC NHÂN GÂY BỆNH VÀ DẤU HIỆU BỆNH LÍ
5.1. Đốm trắng do virut:
Tác nhân gây bệnh
Vi-rút gây hội chứng đốm trắng (White Spot Syndrome Virus - WSSV) là
giống mới Whispovirus thuộc họ mới là Nimaviridae.Vi-rút dạng hình trứng, kích
thước 120 x 275 nm, có một đuôi phụ ở một đầu, kích thước 70 x 300 nm. Nhân có
cấu trúc DNA dạng vòng với 2 chuỗi nucleotide và không có thể ẩn (Occlusion
body), bộ gen 292.967 bp. Virus có ít nhất 5 lớp protein với trọng lượng phân tử từ
15-28 kilodalton. Vỏ bao có có đường kính khoảng 120-150 nm và chiều dài 270-
290 nm với 2 lớp protein VP28 và VP19, nucleocapsid có đường kính 65-70 nm,
chiều dài 300-350 nm với 3 lớp VP26, VP24, VP15.
Dấu hiệu bệnh lý
Triệu chứng của bệnh là tôm có rất nhiều đốm trắng kích thước 0,5-2,0 mm
xuất hiện bên trong vỏ nhất là ở giáp đầu ngực (Hình 5.1), đốt bụng thứ 5, thứ 6 và
lan toàn thân. Bên cạnh đó, tôm bệnh hoạt động kém, ăn nhiều đột ngột sau đó bỏ

ăn, bơi lờ đờ ở mặt nước hay dạt vào bờ ao. Đôi khi tôm có dấu hiệu đỏ thân.Bệnh
thường xuất hiện ở thời điểm 1-2 tháng sau khi thả nuôi, khi môi trường nuôi tôm
xấu bệnh dễ xuất hiện.Khi các đốm trắng xuất hiện sau 3-10 ngày tôm chết hầu hết
trong ao nuôi (100%), tỉ lệ chết cao và nhanh.
SVTH:Trần Duy Sơn-10SH Page 19
Đồ án công nghệ 1

Hình 5.1: Vỏ của một tôm sú ấu niên bị bệnh đốm trắng [20]
5.2. Đốm trắng do vi khuẩn:
Tác nhân gây bệnh
Vi khuẩn gây hội chứng đốm trắng (Bacterial White Spot Syndrome - BWSS)
một số nghiên cứu cho rằng có liên quan đến một số loài thuộc họ Bacillaceae.
Dấu hiệu bệnh lý
Trong giai đoạn đầu nhiễm khuẩn tôm vẫn còn hoạt động ăn mồi và lột vỏ,
lúc đó có thể mất đi các đốm trắng. Tuy nhiên quá trình lột vỏ bị chậm lại, chậm
lớn và chết rải rác đối với tôm bị nhiễm nặng nhưng không có hiện tượng tôm chết
hàng loạt, hầu hết tôm bị đóng rong, mang bị bẩn.Tôm bệnh có các đốm trắng mờ
đục nhìn thấy trên vỏ khắp cơ thể (Hình 5.2). Hiện tượng ăn mòn làm lớp vỏ thoái
hóa và mất màu sắc. Đốm trắng hình tròn, nhỏ và ít hơn đốm trắng do vi-rus
(WSSV). Soi mẫu tươi dưới kính hiển vi đốm trắng có dạng lan tỏa hình địa y với
viền kiểu gờ khía tròn ở giữa rỗng, trong khi đó đốm trắng do vi-rus có đốm đen
(melanin) ở giữa. Các đốm trắng thường chỉ ở phía ngoài lớp biểu bì và tổ chức
liên kết. Nhìn chung tôm có ăn chậm hơn nhưng không gây thiệt hại đáng kể.
SVTH:Trần Duy Sơn-10SH Page 20
Đồ án công nghệ 1
Trong trường hợp này nên kiểm tra ở mức độ mô học và kiểm tra bằng kỹ thuật
PCR.
Hình 5.2:Vỏ đầu ngực của tôm bị bệnh đốm trắng do vi khuẩn
( Nguồn: Nongnghiep.net.vn )
5.3. Đốm trắng do môi trường:

Tôm có đốm trắng ở vỏ đầu ngực hoặc phần vỏ ở sống lưng nhưng vẫn khoẻ
mạnh, không có tôm tấp bờ, đàn tôm vẫn hoạt động và ăn đều ở mức bình thường,
chu kỳ lột xác dài hơn bình thường và tôm sinh trưởng hơi chậm thì nguyên nhân
bị đốm trắng là do môi trường chứ không phải là do vi-rút hay vi khuẩn. Khi độ
cứng (Ca
2+
và Mg
2+
) của nước cao, tôm sẽ hấp thu quá nhiều Ca
2+
và Mg
2+
làm xuất
hiện trên vỏ những đốm trắng. Để khắc phục hiện tượng này có thể thay nước để
làm giảm độ cứng, tránh bón vôi quá liều, cho tôm ăn đầy đủ chất dinh dưỡng kết
hợp với biện pháp kích thích lột xác. Sau khi lột xác thì đốm trắng sẽ mất đi.
LÂY TRUYỀN VÀ XÂM NHẬP
6.1. Các con đường lây truyền WSSV:
Bệnh đốm trắng do virus WSSV lây lan rất nhanh qua hai đường chính:
SVTH:Trần Duy Sơn-10SH Page 21
Đồ án công nghệ 1
- Lây lan theo chiều dọc (Vertical transmission): từ bố mẹ nhiễm bệnh lây lan
cho con.
- Lây lan theo chiều ngang (Horizontal transmission): bị nhiễm virus từ nguồn
nước nuôi, từ cua, còng mang virus từ ao này sang ao kia, từ dùng cụ sản xuất còn
mang mầm bệnh, từ tôm chết, do người hoặc chim, cò vô tình đưa vào ao,…(Trần
Thị Việt Ngân, 2002)
Trong đó, lây lan theo chiều ngang là đường lan truyền chủ yếu. Bệnh đốm
trắng dễ bị bùng phát khi tôm bị sốc do môi trường biến đổi xấu (Tạp chí thông tin
KHCN và Kinh Tế Thủy Sản, số 4 – 2004).

Hình 6.1:Hai vòng lây nhiễm của virus gây bệnh đốm trắng trong ao nuôi
(theo Passano L.M 1960) [5]
SVTH:Trần Duy Sơn-10SH Page 22
Đồ án công nghệ 1
6.2. Cơ chế gây bệnh:
Virus gây hội chứng đốm trắng khi xâm nhập vào tôm sẽ cư trú ở nhiều bộ
phận của tôm như mô nội bì, mô dạ dày, mang, buồng trứng, tinh hoàn, hệ thống
thần kinh, mắt, chân bơi và các bộ phận khác. Sau khi xâm nhập vào tế bào chủ,
virus này tiến hành tự nhân bản dựa trên cơ sở vật chất và năng lượng của tế bào.
Thông qua quá trình này, số lượng thể virus tăng lên rất nhanh, đồng thời làm thay
đổi hoạt động bình thường của tế bào. Khi quan sát dưới kính hiển vi, các tế bào bị
nhiễm virus thường có nhân phình to. Virus phát triển đến giai đoạn phá vỡ nhân
và giết chết tế bào, virus lan truyền ra môi trường nước, đi tìm ký chủ khác và lại
tiếp tục xâm nhập và tấn công [5]. Ngoài ra, tôm ăn phải virus tự do tồn tại trong
bùn ao và trong nước cũng dẫn đến nhiễm mầm bệnh WSSV [1].
SVTH:Trần Duy Sơn-10SH Page 23
Đồ án công nghệ 1
Hình 6.2: Sơ đồ thể hiện nguyên nhân và cơ chế gây bệnh đốm trắng (WSSV)
CHUẨN ĐOÁN BỆNH
Kết hợp với dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm trắng có thể phát hiện bằng
nhiều phương pháp khác nhau [7]
- Phương pháp mô học: dấu hiệu định bệnh là sự xuất hiện của những thể vùi
trong nhân tế bào của các mô có nguồn gốc trung bì.
- Phương pháp PCR: dấu hiệu định bệnh là phát hiện sản phẩm khuếch đại
của một đoạn gen đặc hiệu của tác nhân gây bệnh.
SVTH:Trần Duy Sơn-10SH Page 24
Đồ án công nghệ 1
- Phương pháp lai tại chỗ ADN (In situ DNA hybridization): dấu hiệu định
bệnh là kết quả lai giữa đoạn gen dùng làm mẫu dò và đoạn gen của tác nhân gây
bệnh trong điều kiện nghiêm ngặt.

-Phương pháp Dot blot và Southern blot: được thực hiện với sản phẩm khuếch
đại của một đoạn gen đặc trưng của tác nhân.
- Phương pháp miễn dịch huỳnh quang: dấu hiệu định bệnh là kết quả kết hợp
đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể.
Trong đó kỹ thuật PCR là kỹ thuật chẩn đoán nhanh, nhạy, và có tính đặc hiệu
cao. Kỹ thuật này đã được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm và phát triển, đồng thời
đưa ra các cải tiến mới như: Nested PCR, Semi – Nested PCR, Real - time PCR,…
Với độ nhạy, độ đặc hiệu rất cao kết hợp với khả năng phát hiện và định lượng
đồng thời, Real - time PCR được xem như một phương pháp rất có ý nghĩa trong
việc xác định chính xác mức độ nhiễm mầm bệnh, đặc biệt là bệnh đốm trắng trên
tôm.
PHƯƠNG PHÁP PCR VÀ CÁC CẢI TIẾN
7.1. Phương pháp PCR:
Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) được Kary Mullis và cộng sự phát minh
vào năm 1985. PCR cho phép một lượng rất nhỏ ADN (một phân tử) được khuếch
đại đến mức mà ở đó người ta dễ dàng phát hiện bằng những phương pháp thông
thường như điện di gel [6].
PCR là một phương pháp tạo dòng in vitro, nghĩa là cũng nhằm mục đích thu
nhận một số lượng lớn bản sao của một trình tự xác định. PCR dùng để khuếch đại
số lượng bản sao của một trình tự ADN đích thông qua các chu kỳ gồm ba bước:
biến tính, bắt cặp với primer và tổng hợp mạch mới nhờ ADN polymerase [2]
SVTH:Trần Duy Sơn-10SH Page 25