tìm hiểu phương pháp Rapid amplification of 5’cDNA (5RACE)

Rapid amplicaon of
5’cDNA - end
Nhóm 7:
-
Lê Văn Duy Thanh
-
Nguyễn Minh Thành
-
Trương Thị Hoài Thu
-
Nguyễn Thị Thu Thủy
-
Trương Thanh Tỉnh
-
Hồ Thị Trang
-
Trịnh Xuân Tùng
3. Kỹ thuật 5’ RACE
2. Ứng dụng
1. Giới thiệu
Nội dung
1/ Giới thiệu:
•
Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE) – là quy trình nhằm khuếch đại
trình tự acid nucleic từ khuôn mẫu mRNA giữa một trình tự bên trong đã được
xác định và một trình tự chưa biết ở đầu 5’ hoặc 3’ của mRNA.
•
RACE được nghiên cứu một cách độc lập bởi nhiều nhà khoa học và được đặt bởi
nhiều tên gọi khác nhau như: RACE; PCR mỏ neo; PCR một bên.
2/ Ứng dụng
1

Khuếch đại và tạo
dòng các RNA hiếm.
2
Phân tích biểu hiện
gen
3
Phát hiện các tác nhân
gây bệnh ở các loài
4
Nghiên cứu cấu trúc,
đặc điểm một số gene
chưa rõ trình tự
RACE được ứng dụng nhiều trong y học và sinh học
RACE được ứng dụng nhiều trong y học và sinh học
3/ Kỹ thuật
a/ Tách mRNA
b/ Thiết kế mồi
c/ Tổng hợp cDNA
d/ Tinh sạch cDNA
-
Loại bỏ dNTP, enzyme RNase, GSP1
-
Dùng cột S.N.A.P.

e/ Gắn đuôi polyC vào cDNA
-
Thêm các thành phần:
-
Ủ 2-3 phút ở 94°C, làm lạnh trong 1 phút.
-

Thêm 1 ml TdT (Terminal deoxynucleotidyl transferase), trộn nhẹ nhàng, và ủ trong 10
phút ở 37°C.
-
Nhiệt bất hoạt các polyC ở 65°C trong 10 phút.
-
Làm lạnh.
Thành phần Thể tích (μl)
Nước cất 6.5
Đệm 5X 5.0
dCTP 2mM 2.5
Mẫu cDNA đã tinh sạch 10.0
f/ PCR khuếch đại PolyC-cDNA

Phản ứng PCR được thực hiện qua
3
bước.
-
Bước
1: biến tính DNA mẫu.
-
Bước 2: gắn mồi.
-
Bước 3:
kéo dài mồi
Các bước trên được lặp lại nhiều lần, thường là 30 – 35 lần

Chu kỳ nhiệt:
-
Biến Inh: 94
0

C trong 1 phút
-
Gắn mồi:
55
0
C trong 30s
-
Kéo dài mồi: 72
0
C trong 2 phút
Thành phần
Thể tích (µl)
Taq DNA polymerase 0.5
Nước cất 31.5
Đệm 10X (200mM Tris-HCl, 500 mM KCl) 5.0
MgCl
2
25mM 3.0
dNTP 10mM 1.0
GSP2 2.0
Abridged Anchor Primer (AAP) 10µM 2.0
cDNA đã gắn đuôi polyC 5.0
g/ Nested PCR