Phân tích đa hình một số gen liên quan đến chất lượng thịt lợn bằng phương pháp PCR RFLP

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
- -
1
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
  




NGUYỄN THỊ HOA







PHÂN TÍCH ĐA HÌNH MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN
ĐẾN CHẤT LƢỢNG THỊT LỢN BẰNG PHƢƠNG
PHÁP PCR-RFLP




LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2010
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
- -
2
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
  




NGUYỄN THỊ HOA




PHÂN TÍCH ĐA HÌNH MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN
ĐẾN CHẤT LƢỢNG THỊT LỢN BẰNG PHƢƠNG
PHÁP PCR-RFLP



Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 62.42.70

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC



Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Văn Cƣờng






Thái Nguyên - 2010
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
- -
3
LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn
Văn Cường, phòng Công nghệ gen động vật, viện Công nghệ sinh học, viện
Khoa học và Công nghệ Việt Nam; PGS đã nhiệt tình chỉ bảo, định hướng
và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình công tác, học tập và
nghiên cứu để thực hiện luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của các nghiên cứu
viên, các cán bộ phòng Công nghệ gen động vật đã chỉ bảo, hướng dẫn
tôi về mặt kỹ thuật, chuyên môn, giúp đỡ tôi học tập và làm việc.
Để hoàn thành tốt luận văn, tôi cũng đã nhận được sự ủng hộ, động
viên khuyến khích của gia đình, bạn bè trong suốt quá trình học tập,
nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn‼

Thái Nguyên, ngày 22 tháng 8 năm 1010
Tác giả


Nguyễn Thị Hoa





Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
- -
4
CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Kí hiệu
chữ
Tên Tiếng Anh
Tên Tiếng Việt
AFLP

bp
BF
dNTP
DGAT

H-FABP
EDTA
EtBt

IMF
Lpin1
LB
OD
PAP

PPARα
PGC-1α
QTL
RAPD

RFLP

RNase
SDS
TAG
TE
TBE
Amplifed Fragment Length
Polymorphism
Base paire
Backfat
Deoxynucleoside triphosphate
Diacyl glycerol acyltransferase

Heart fatty acid binding protein
Ethylene diamine tetracetic acid
Ethidium bromid
Intramuscular fat content
Lipin1 gene

Loading buffer
Optical density
Phosphatidate phosphatase

Peroxisome proliferator
Coactivator-1α
Quantitative trait loci
Random Amplified Polymorphic
DNA
Restriction Fragment Length
Polymorphism
Ribonucleasa
Sodium dodecyl sulfate
Triacylglycerol
Tris- EDTA
Tris boric acid- EDTA
Đa hình chiều dài các đoạn DNA
được khuyếch đại
cặp bazơ
Độ dày mỡ lưng
Deoxynucleosit triphotphat
Enzyme Diacyl glycerol
acyltransferase
Protein liên kết acid béo ở tim
Axit ethylen diamin tetracetic
Ethiđium bromit
Hàm lượng mỡ giắt trong cơ
Gen Lpin1
DNA vi vệ tinh
Mật độ quang học

Enzyme Phosphatidate
phosphatase
Thụ thể Peroxisome
Coactivator-1α
Vị trí tính trạng số lượng
Đa hình DNA được khuyếch đại
ngẫu nhiên
Đa hình độ dài các đoạn cắt giới
hạn
Ribonucleaza
Sodium dodexyl sunfat
Triacylglycerol
Đệm TE
Đệm TBE

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
- -
5
MỤC LỤC Trang
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
2. Mục tiêu và nhiệm vụ của đề tài
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Chỉ thị di truyền (Genetic marker)
1.1.1. Chỉ thị loại 1 (known function)
1.1.2. Chỉ thị loại 2 (unknown function)
1.2. Ứng dụng các chỉ thị di truyền đến các tính trạng
số lượng ở lợn
1.2.1. Nghiên cứu gen lợn ở nước ngoài
1.2.2. Nghiên cứu gen lợn ở Việt Nam

1.3. Gen Heart- fatty acid binding protein (H-FABP)
1.3.1. Vị trí, cấu trúc, chức năng của gen H-FABP
1.3.2. Đa hình di truyền gen H-FABP
1.4. Gen Lipin 1 (Lpin1)
1.4.1. Vị trí, cấu trúc, chức năng của gen Lpin1
1.4.2. Đa hình di truyền gen Lpin1
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu, hoá chất và trang thiết bị
2.1.1. Nguyên liệu
2.1.2. Hoá chất
2.1.3. Máy móc, trang thiết bị
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp tách chiết DNA từ mẫu mô tai lợn
2.2.2. Phương pháp kiểm tra DNA bằng điện di gel agarose
1
1
2
3
3
5
5
6

7
9
11
11
15
18
18

25
28
28
28
28
30
30
32
33
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
- -
6
2.2.3. Định lượng DNA bằng quang phổ kế
2.2.4. Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)
2.2.5. Phương pháp phân tích đa hình đoạn cắt giới hạn (RFLP)
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1.Tách chiết DNA tổng số từ các mẫu mô tai lợn
3.2. Phân tích đoạn gen H-FABP bằng phương pháp PCR-RFLP
3.2.1. Phân tích đoạn gen H-FABP bằng phương pháp PCR
3.2.2. Phân tích đoạn gen H-FABP bằng enzyme cắt giới hạn HaeIII
3.3. Phân tích gen Lpin1 bằng phương pháp PCR- RFLP
3.3.1. Phương pháp phân tích gen Lpin1 bằng phương pháp PCR
3.3.2. Phân tích gen Lpin1 bằng enzyme cắt giới hạn MspI
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1. KẾT LUẬN
2. ĐỀ NGHỊ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. TIẾNG VIỆT
2. TIẾNG ANH
PHỤ LỤC

35
36
38
40
40
41
41
42
47
47
48
51
51
52
53
53
55
61









Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
- -
7

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Bảng
Tên bảng
Trang
Bảng 1.1.
Bảng 1.2

Bảng 1.3.

Bảng 2.1.
Bảng 2.2.
Bảng 2.3.
Bảng 2.4.
Bảng 2.5.

Bảng 2.6.

Bảng 2.7.

Bảng 2.8.
Bảng 3.1.

Bảng 3.2.

Bảng 3.3.

Bảng 3.4.
Bảng 3.5.
Các loại chỉ thị di truyền phân tử chính ở động vật
Một số gen và các chỉ thị di truyền phân tử có tương

quan với các tính trạng quan trọng ở lợn.
Vị trí của các yếu tố phiên mã bám trên vùng phía
trước đầu 5’ của gen mã hóa H-FABP
Danh mục hoá chất đã sử dụng trong luận văn
Trình tự mồi và điều kiện phản ứng
Đệm và các dung dịch pha chế
Trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
Tương quan giữa nồng độ gel agarose và kích thước
đoạn DNA cần phân tích theo Sambrook và CS
Thành phần phản ứng PCR của gen H-FABP và
Lpin1
Chu trình nhiệt phản ứng PCR của gen H-FABP và
Lpin1
Thành phần phản ứng cắt sản phẩm PCR
Tần số các alen ở cả 3 vị trí RFLP của gen H-FABP
của một số giống lợn
Các điểm cắt của enzyme HaeIII trên đoạn gen H-
FABP
Kết quả phân tích đa hình RFLP kiểu gen H-FABP
bằng enzyme HaeIII.
Điểm cắt của MspI ở đoạn gen Lpin1
Tần số alen và tần số kiểu gen Lpin1
6
8

12

28
29
29

30
34

37

38

39
43

44

45

48
49
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
- -
8
Hình
Tên hình vẽ, Bảng biểu
Trang
Hình 1.1.

Hình 1.2
Hình 1.3
Hình 1.4.
Hình 1.5.
Hình 1.6.

Hình 1.7.
Sơ đồ
Hình 3.1.

Hình 3.2.

Hình 3.3.

Sơ đồ

Hình 3.4.

Đồ thị
Hình 3.5.
Sơ đồ
Hình 3.6.

Đồ thị
Vị trí gen mã hóa H-FABP trên nhiễm sắc thể số 6
ở lợn
Trình tự aminoacid của các loại F-ABP
Cơ chế hoạt động của H-FABP trong tế bào
Vị trí gen Lpin1 của lợn trên nhiễm sắc thể số 3
Chức năng phân tử của gen Lipin 1, 2, 3
Các loại Lpins: Lpin-1A, Lpin-1B, Lpin-2, Lpin-3.
Gen Lpin1 trong các loại tế bào.
Quy trình thí nghiệm
Điện di đồ sản phẩm DNA tách chiết từ mô tai
lợn
Phổ hấp thụ tử ngoại của DNA của lợn Móng cái

và Yorshire
Điện di đồ sản phẩm PCR nhân đoạn gen H-
FABP
Vị trí cắt của enzyme HaeIII trên đoạn gen H-
FABP
Điện di đồ sản phẩm cắt đoạn gen H-FABP bằng
enzyme HaeIII
Tần số kiểu gen H-FABP
Điện di đồ sản phẩm PCR nhân đoạn gen Lpin1
Vị trí cắt của MspI trên đoạn gen Lpin1
Điện di đồ sản phẩm cắt đoạn gen Lpin1 bằng
enzyme MspI
Tần số kiểu gen của Lpin1
11

14
15
19
20
25
26
31
40

41

42

44

44

46
47
48
49

50
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
- -
1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Ngành chăn nuôi lợn của Việt Nam đóng vai trò quan trọng trong sản
xuất nông nghiệp với sản lượng thịt chiếm 80% lượng thịt được tiêu thụ và
chiếm 25% giá trị sản suất nông nghiệp của Việt Nam [7]. Từ nhiều năm qua
sự phát triển của nghành chăn nuôi lợn đã góp phần đáng kể trong việc nâng
cao chất lượng cuộc sống cho người dân.
Theo thông báo của FAO, 55% số lượng lợn trên thế giới thuộc về
vùng Châu Á – Thái Bình Dương. Trong đó, Việt Nam có số lượng lợn lớn
nhất với khoảng 12 triệu con. Các giống lợn nội ở Việt Nam rất đa dạng,
chiếm 60 – 90% về mặt số lượng chúng thích nghi với điều kiện khí hậu nhiệt
đới và điều kiện chăn nuôi của các vùng nông thôn nghèo [26]. Các giống lợn
thường cho chất lượng thịt tốt, ngon khi chế biến. Song nhược điểm của các
giống lợn này là tăng trưởng chậm, trọng lượng thấp, thành phần mỡ nhiều,
trong thịt xẻ và tỷ lệ tiêu tốn thức ăn cao. Do vậy, các hướng nghiên cứu
nhằm cải thiện giống vật nuôi cho năng suất cao mà vẫn giữ được chất lượng
thịt ngon, phù hợp với điều kiện khí hậu ở Việt Nam có ý nghĩa rất quan trọng
trong sản xuất.
Trong công tác lai tạo và chọn giống truyền thống ở lợn, các chỉ tiêu

chọn lọc thuộc về kiểu hình mà chủ yếu là các chỉ tiêu về hình thái và một số
chỉ tiêu về hóa sinh như: tốc độ sinh trưởng được xác định bằng cân, đo; chất
lượng thịt được xác định bằng màu sắc thịt, số lượng cơ, độ pH [17]. Phương
pháp trên đã góp phần vào việc cải tạo giống lợn nuôi ở Việt Nam. Tuy nhiên
việc lựa chọn bằng ngoại hình có trở ngại là đòi hỏi nhiều thời gian, thường
không ổn định và nhiều khi không chính xác hoặc không thể thực hiện được.
Những thành tựu về giải mã gen người và động vật đã làm sáng tỏ
nhiều locus tính trạng số lượng có ý nghĩa kinh tế. Thành tựu này mở ra khả
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
- -
2
năng ứng dụng chỉ thị di truyền phân tử hỗ trợ chọn giống trong ngành công
nghiệp chăn nuôi lợn. Phương pháp này cho phép khắc phục những hạn chế
của phương pháp chọn lọc truyền thống như: rút ngắn thời gian chọn lọc,
chọn lọc chính xác hơn, thực hiện chọn lọc được đối với những tính trạng khó
xác định dựa vào ngoại hình. Do tính ưu việt trên nên thời gian qua hướng
nghiên cứu này phát triển rất mạnh mẽ. Đến nay đã có 4928 QTLs liên quan
đến 499 tính trạng khác nhau đã được xác định chủ yếu tập chung vào các
tính trạng có ý nghĩa kinh tế như: chất lượng thịt, tốc độ tăng trọng, số con
sinh trong một lứa, gen kháng bệnh [27].
Để nâng cao năng xuất, trong những năm vừa qua tiến hành lai giữa lợn
thuần ngoại với lợn nội. Trong chương trình nghiên cứu này, lợn ngoại được
sử dụng là Yorshire cho lai với lợn nội là Móng Cái.
Với mục đích xác định tính đa hình của một số ứng cử gen liên quan
đến chất lượng thịt lợn, góp phần phát triển chỉ thị di truyền phân tử phục vụ
cho công tác chọn giống chúng tôi tiến hành nghiên cứu
“ Phân tích đa hình một số gen liên quan đến chất lượng thịt lợn bằng
phương pháp PCR -RFLP’’.
2. Mục tiêu và nhiệm vụ của đề tài
Mục tiêu

Xác định các biến thể DNA của gen Lpin1, H-FABP liên quan đến chất
lượng thịt lợn, nhằm hỗ trợ công tác chọn giống.
Nhiệm vụ
Phân tích đa hình gen Lpin1, H-FABP ở lợn Móng Cái và Yorshire
bằng phương pháp PCR-RFLP.



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
- -
3
CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Chỉ thị di truyền (Genetic marker)
Chỉ thị di truyền phân tử (genetic marker) là một gen hay một trình tự
DNA đã được xác định vị trí trên nhiễm sắc thể, và có tương quan với một
gen hoặc một tính trạng cụ thể. Nó được biết như một biến dị được sinh ra do
đột biến hoặc do sự biến đổi vị trí trong hệ gen. Một chỉ thị di truyền có thể là
một trình tự DNA ngắn như trình tự lặp lại xung quanh một base-pair hoặc
một đoạn dài như minisatellites [28].
Trong nhiều thập kỷ qua, ứng dụng các phương pháp chọn lọc dựa trên
khoa học về di truyền quần thể và khoa học thống kê đã cho phép tạo ra vật
nuôi có hiệu suất tăng trưởng cao. Các kết quả dựa trên chọn lọc kiểu hình với
một số tính trạng kinh tế quan trọng ở gia súc, gia cầm đã đạt được nhiều
thành tựu đáng kể. Tuy nhiên, theo thời gian những hạn chế của phương pháp
này trong việc cải thiện tính di truyền vật nuôi đã trở nên rõ ràng. Hiệu quả
của chúng giảm khi các tính trạng mong muốn khó định lượng, khả năng di
truyền thấp (ví dụ: tính kháng bệnh). thêm vào đó, việc chọn lọc nói chung
chỉ hạn chế vào các đặc tính có thể đo lường một cách phù hợp ở một số
lượng lớn các mẫu. Một vài đặc tính như: tỉ lệ sống sót, năng suất trứng lại

biểu hiện rất muộn trong quá trình sống nên khó có thể dùng để làm tiêu chí
có ích trong chọn lọc. Ngoài ra hiệu quả chọn lọc dựa trên kiểu hình thường
không cao khi mục tiêu chọn lọc có tương quan di truyền không phù hợp (ví
dụ: năng suất sữa và hàm lượng protein của sữa), sự tương tác giữa các gen
trong cùng một locus hay các locus khác nhau (hiện tượng át gen) và giữa các
gen với môi trường cũng rất phức tạp, do đó khó có thể xác định một cách
chính xác nếu chỉ dựa trên thông tin về kiểu hình và phả hệ [24].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
- -
4
Sự phát triển của kỹ thuật sinh học phân tử đã mở ra khả năng xác định
và sử dụng các biến dị hệ gen cho việc nâng cao tính di truyền của giống vật
nuôi. Đặc biệt sự ra đời của các chỉ thị di truyền (các trình tự đánh dấu trên bộ
gen liên kết với các tính trạng cần quan tâm) có thể giúp giải quyết những hạn
chế của phương pháp trên.
Việc sử dụng các thành phần của kiểu gen, các chỉ thị di truyền cho
phép bỏ qua các biến động không di truyền đồng thời theo dõi được các biến
động di truyền không biểu hiện ra kiểu hình, xác định sớm các tính trạng, do
vậy rút ngắn được thời gian chọn lọc. Hơn nữa, phương pháp này đi vào xác
định trực tiếp trên vật liệu di truyền nên kết quả chọn lọc nhanh và chính xác
hơn so với dựa vào ngoại hình [46].
Hệ thống các chỉ thị phân tử chính ở động vật có thể kể đến: RFLP,
RAPD, AFLP, Microsatellites Trong nghiên cứu, các chỉ thị này được sử
dụng vào rất nhiều mục đích:
* Dùng để đánh giá mức độ biến động di truyền trong một quần thể vật nuôi.
Nếu mức biến động di truyền này còn cao thì cần tiếp tục quá trình chọn lọc
nhằm ổn định dòng.
* Cho phép đánh giá sự khác biệt di truyền giữa hai cá thể bố mẹ. Sự khác
biệt này càng lớn thì tính dị hợp tử ở thế hệ con càng cao.
* Theo dõi hiệu quả của một chương trình chọn giống định hướng đối với một

allele đặc biệt.
* Xác định các chỉ thị ở các locus có liên kết chặt chẽ với các tính trạng mong
muốn.
Dựa trên chức năng, người ta chia chỉ thị di truyền làm 2 loại cơ bản
như sau:


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
- -
5
1.1.1. Chỉ thị loại 1 (known function)
Còn gọi là các ứng cử gen (candidate gene) - là những chỉ thị đối với
những gen đã biết chính xác sản phẩm biểu hiện, do vậy được coi là quyết
định tới các tính trạng mong muốn [46]. Những chỉ thị loại này được phát
hiện nhờ kỹ thuật RFLP, SNP chủ yếu là các chỉ thị đối với các gen nằm trong
vùng mã hóa (coding gene).
Ví dụ:
Đột biến gen RYR-1 ở vị trí 1843 (do việc thay thế base C bằng T) có
liên quan đến bệnh tăng thân nhiệt ác tính (malignant hyperthermia) ở lợn [1].
1.1.2. Chỉ thị loại 2 (unknown function)
Là những chỉ thị nằm ngoài vùng mã hóa của gen, nó có thể nằm gần
hoặc cách xa đoạn gen đã biết sản phẩm biểu hiện. Chỉ thị loại này chưa được
biết sản phẩm của nó, song được xác định là có tác động hoặc ảnh hưởng đến
tính trạng [46]. Chỉ thị DNA này thường được phát hiện nhờ kỹ thuật RAPD,
AFLP, Microsatellite, Minisatellite…
Trong nghiên cứu và phân tích di truyền các giống vật nuôi, mỗi loại
chỉ thị phân tử có thế mạnh riêng và đem lại hiệu quả nhất định. Do vậy, việc
lựa chọn và sử dụng chỉ thị phân tử nào phù hợp còn tùy thuộc vào mục đích
nghiên cứu cũng như điều kiện về cơ sở vật chất và các trang thiết bị thí
nghiệm. Một vài chỉ thị di truyền phân tử được sử dụng phổ biến trên động

vật, thể hiện ở bảng 1.1 dưới đây:






Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
- -
6

Bảng 1.1. Các loại chỉ thị di truyền phân tử chính ở động vật
Loại chỉ
thị
RFLP
SNP
Microsa-
tellite
RAPD
Minisa-
tellite
AFLP
1
1
2
2
2
2
Phân bố
hệ gen

Toàn bộ
Toàn bộ
Toàn bộ
Toàn bộ
Vùng dị
nhiễm sắc
Toàn
bộ
PIG
*

Thấp
Thấp
Cao
Tương
đối
Cao
Tương
đối
Số
lượng
allele
2
2
2-30
2
2
2
Kiểu di
truyền

Đồng
trội
Đồng
trội
Đồng trội
Trội
Trội
Trội
Độ tin
cậy
Cao
Cao
Cao
Thấp
Cao
Tương
đối
Tốc độ
phép
thử
Thấp
Cao
Cao
Cao
Thấp
Cao
Đầu tư
ban đầu
Tương
đối

Cao
Cao
Thấp
Tương
đối
Thấp
Giá
thành
Tương
đối
Tương
đối
Cao
Thấp
Cao
Tương
đối
*: Hàm lượng thông tin đa hình (Polymorphism Information Content)

1.2. Ứng dụng các chỉ thị di truyền đến các tính trạng số lƣợng ở lợn
Trong chọn giống ở lợn và nhiều gia súc khác, thường các chỉ thị di
truyền được sử dụng có liên quan đến các tính trạng năng suất, chất lượng
thịt, sức sống cao, khả năng kháng bệnh…Đó là các tính trạng số lượng
(quantitative trait) hay còn gọi là các tính trạng liên tục (vì trong quần thể, giá
trị của các tính trạng này biến thiên liên tục) và vị trí di truyền tương ứng của
chúng được gọi là các vị trí tính trạng số lượng (QTL – Quantitative trait
loci).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
- -
7

Hiện nay, việc sử dụng các chỉ thị di truyền để phát hiện những vùng
trong bộ gen liên quan đến các tính trạng số lượng được ứng dụng rộng rãi,
đặc biệt chúng được sử dụng vào việc xác định dấu vết di truyền, hình thành
các bản đồ liên kết (linkage map) hay bản đồ khu trú tính trạng số lượng
(QTL mapping) với vị trí các gen mã hóa cho những tính trạng mong muốn,
nhằm đáp ứng nhanh và hiệu quả việc chọn lọc phục vụ cho những chiến lược
lai tạo và chọn giống theo phương pháp cổ điển.
Phát triển các chỉ thị di truyền phân tử nhìn chung đều đòi hỏi trình độ
kỹ thuật cao song có nhiều ưu điểm như: cho phép sử dụng nguồn gen mà
không làm ảnh hưởng đến sự điều hòa, biểu hiện tự nhiên của gen, chỉ với
lượng mẫu chứa vật liệu di truyền ít vẫn cho kết quả nhanh và chính xác. Do
vậy mà thời gian qua, số lượng gen và chỉ thị di truyền trên bản đồ di truyền
lợn liên tục được phát triển. Nhiều chỉ thị di truyền liên quan đến tính trạng có
ý nghĩa kinh tế đã đem lại hiệu quả to lớn trong điều khiển năng suất giống
vật nuôi này.
1.2.1. Nghiên cứu gen lợn ở nƣớc ngoài
Đầu những năm 90, các nước trong khối EU đã bắt đầu tiến hành
chương trình nghiên cứu genome của lợn (PigMap), tiếp theo đó là chương
trình nghiên cứu gen lợn của Mỹ, Úc, Trung Quốc…Mục đích của chương
trình nghiên cứu gen lợn để tìm ra chỉ thị di truyền phân tử giúp chương trình
chọn tạo giống được nhanh và chính xác hơn. Đến nay hơn 4000 chỉ thị di
truyền phân tử và gen lợn đã được phân tích và chủ yếu tập trung vào những
tính trạng sinh trưởng nhanh, tỷ lệ nạc cao, chất lượng thịt tốt, khả năng sinh
sản và chống được bệnh tật tốt Dưới đây là một số gen và các chỉ thị di
truyền phân tử chính liên quan đến các tính trạng: tăng trưởng, khả năng sinh
sản, chất lượng thịt đã được nghiên cứu.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
- -
8
Một số chỉ thị di truyền đã phát triển ở lợn được thể hiện trong bảng 1.2

dưới đây:
Bảng 1.2. Một số gen và các chỉ thị di truyền phân tử có tƣơng quan với
các tính trạng quan trọng ở lợn.
Tính trạng
Tên chỉ thị
phân tử, gen
Đặc tính quy định
Tài liệu tham
khảo

Tốc
độ
tăng
trưởng
GH
Tăng trưởng nhanh
Water M.J.2006
Wang
W.,C.2003
MYOG
Trọng lượng sơ sinh,
tốc độ tăng trưởng, tỷ
lệ nạc
Te Pas. 1999

Khả
năng
sinh sản
FSH
số con/ lứa đẻ

Nguyễn T. D
Thúy, 2004
ESR
số con/ lứa đẻ
Rothschild, 1996
PRLR
Kích cỡ lứa đẻ
Vincent, 1998



Chất
lượng
thịt

RN
Độ pH, hàm lượng
nước trong thịt
Milan, 1996
SLA
Phẩm chất thịt
Rothschild, 1995
RYR-1, HAL
Độ pH, màu sắc thịt,
mẫn cảm stress
Nguyễn Văn
Cường, 2002
PIT-1
Dày mỡ lưng
Anderson, 1994

H-FAPB,A-FABP
Hàm lượng mỡ cơ
Gerbens, 1998
Lpin 1
Hàm lượng mỡ mô
Ponsuksili et al.
2001
Nghiên cứu lập bản đồ gen lợn
Năm 1964, bản đồ di truyền lợn được công bố bởi Andreson và Baker,
số lượng gen và chỉ thị di truyền trên bản đồ di truyền lợn liên tục được phát
triển. Mục đích chính của chương trình nghiên cứu hệ gen vật nuôi nói chung
và lợn nói riêng là xác định và đặc trưng hóa các vùng trên nhiễm sắc thể mà
có ảnh hưởng, điều khiển các đặc tính kiểu hình [12].
Các vạch ghi trên bản đồ gen lợn đã nhanh chóng được tăng lên từ 28
locus trong năm 1984, năm 1989 có 50 gen và chỉ thị, đến năm 1994 có gần
800 chỉ thị và gen lợn đã được tìm thấy. Năm 1999 số lượng gen và chỉ thị di
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
- -
9
truyền là hơn 1800 trong đó có khoảng hơn 250 gen, năm 2003 con số này lên
tới 3017 locus. Đến tháng 1/2006 cơ sở dữ liệu QTLs có 4081 chỉ thị liên
quan đến 236 tính trạng kinh tế [47]. Đến tháng 1/2009 ngân hàng dữ liệu bản
đồ gen lợn đã có 4928 QTLs liên quan đến 499 tính trạng khác nhau, trong đó
3711 QTLs liên quan đến tính trạng chất lượng thịt, 494 QTLs liên quan đến
tính trạng sản lượng thịt, 199 QTLs liên quan đến khả năng sinh sản [27].

1.2.2. Nghiên cứu gen lợn ở Việt Nam
Nghiên cứu trong nước về lĩnh vực này đã được bắt đầu quan tâm, tuy
nhiên kết quả mới dừng ở một số gen riêng lẻ. Nghiên cứu về đặc điểm di
truyền của một số chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa có liên quan đến khả năng kháng

bệnh của lợn nội và lợn ngoại được nuôi ở Việt Nam đã được đề cập trong
công trình nghiên cứu của Văn Lệ Hằng và cs (1998) [4] cho thấy rằng giống
lợn nội có khả năng kháng bệnh do thích nghi với điều kiện khí hậu nhiệt đới
tốt hơn so với các giống lợn ngoại.
Trình tự nucleotid của gen hormone sinh trưởng của một số giống lợn
nội Việt Nam như lợn Móng Cái, lợn Ỉ, lợn H’mông đã được xác định trong
công trình nghiên cứu của Nguyễn Thị Diệu Thúy, Geldermann H (2004) [9].
Bằng kỹ thuật PCR Nguyễn Văn Cường và cs (2003) [2], Nguyễn Thị
Diệu Thúy và cs (2003, 2004) [10, 11] cũng xác định kiểu gen liên quan đến
số con/lứa đẻ qua phân tích gen FSH. Việc xác định tần suất xuất hiện kiểu
gen này ở các giống lợn nghiên cứu đã chỉ ra rằng: với giống lợn ngoại do đã
qua quá trình chọn lọc nhân tạo nên kiểu gen có số con/ lứa đẻ thấp đã bị loại,
còn ở lợn nội do hoàn toàn chăn nuôi tự nhiên nên kiểu gen quy định tính
trạng này còn cao. Do vậy, ở các giống lợn nội nếu được tiến hành chọn lọc
có định hướng sẽ nâng cao được năng suất sinh sản và số con/ lứa đẻ.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
- -
10
Các nghiên cứu sử dụng RFLP cũng đem lại kết quả nhanh chóng và
chính xác trong chẩn đoán, phát hiện các bệnh di truyền ở lợn [1, 2]. Các cá
thể mang kiểu gen RYR-1 ở dạng đồng hợp tử lặn (nn) có biểu hiện bệnh mẫn
cảm với stress (Pocine stress Syndrome- PSS). Áp dụng kỹ thuật này vào việc
xác định tần suất kiểu gen RYR-1 trong quần thể lợn: Móng Cái, Landrace và
Yorshire cho thấy khả năng mắc bệnh PSS ở lợn nội Móng Cái thấp hơn
nhiều so với lợn ngoại.
Nguyễn Ngọc Tuân và cs (2001) đã bước đầu nghiên cứu khảo sát tần
số gen Halothane và ảnh hưởng lên sức tăng trưởng, phẩm chất thịt và khả
năng sinh sản của lợn tại thành phố Hồ Chí Minh [6].
Nghiên cứu về đa hình gen H-FABP và gen RYR-1 ở một số giống lợn
ở Việt Nam được đề cập đến trong công trình nghiên cứu của Nguyễn Thu

Thúy và cs (2005). Kết quả cho thấy 5 giống lợn nội chỉ xuất hiện 2 kiểu gen
DD và Dd và kiểu gen DD có tần số xuất hiện cao hơn nhiều so với kiểu gen
Dd. Tỷ lệ kiểu gen DD ở 5 giống lợn Tạp Ná, Móng Cái, Cỏ, Mường
Khương, Mẹo lần lượt là: 100%, 98,82%, 94,59%, 94,44%, 93,62% và tỷ lệ
kiểu gen Dd tương ứng là 0%, 1,18%, 5,41%, 5,56%, 6,38% [8].
Tạ Thị Thoa và cs (2009) Đã tiến hành phân tích đánh giá mức độ liên
quan giữa Haplotype của gen MYOG và H-FABP với tốc độ sinh trưởng và
chất lượng thịt lợn. Hàm lượng mỡ cơ tương ứng của kiểu gen DD<Dd<dd:
2,27<2,49<2,91% [7].
Tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam
từ năm 2001 đã hợp tác với trường đại học Stuttgart, CHLB Đức nghiên cứu
đa hình gen trong một số giống lợn thuần nội Việt Nam. Kết quả nghiên cứu
cho thấy các giống lợn nội Việt Nam có tính di truyền cao. Tuy nhiên tần suất
kiểu gen liên quan đến tốc độ sinh trưởng cao, chất lượng thịt tốt ở lợn Việt
Nam là thấp.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
- -
11
Để nâng cao tần suất gen có ý nghĩa kinh tế trong lợn nuôi thương
phẩm chúng tôi xác định kiểu gen liên quan đến chất lượng thịt của lợn
Yorshire và Móng Cái với mong muốn từ đó đưa ra mô hình lai thích hợp.
1.3. Gen Heart- fatty acid binding protein (H-FABP)
1.3.1. Vị trí, cấu trúc, chức năng của gen H-FABP
Gen H-FABP là gen mã hóa cho protein gắn axit béo ở cơ, nằm trên
nhiễm sắc thể số 6 ở lợn, tại vị trí 6q21 -> 6q26 [19], tương ứng vị trí gen H-
FABP ở người là 1p32 -> 1p33, ở chuột nằm trên nhiễm sắc thể số 4. Đó là
vùng có tính bảo thủ cao trong quá trình tiến hóa. Khi tiến hành nghiên cứu
bản đồ liên kết của 7 microsatellites trên nhiễm sắc thể số 6, Ovilo đã xác
định được gen H-FABP nằm trong khoảng giữa marker SW316 và SO228
(SW316- 3,4cM – H-FABP – 12,5cM – SO228) [39, 40].

Hình 1.1. Vị trí gen mã hóa H-FABP trên nhiễm sắc thể số 6 ở lợn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
- -
12
Cấu trúc gen H-FABP gồm: 4 exon mã hóa lần lượt cho các đoạn
polipeptide gồm 24, 58, 34, 17 axit amin và 3 intron có kích thước khoảng
4,2; 2,5; 1,5 kb [19].
Phân tích vùng trình tự điều khiển 5’ của gen H-FABP chứa các TATA
- Box nằm phía trước mã khởi đầu (ATG) 92 bp và có chứa nhiều vị trí liên
kết tiềm năng tương ứng với các yếu tố phiên mã khác nhau, các thụ thể của
các hormone.
Bảng 1.3. Vị trí của các yếu tố phiên mã bám trên vùng phía trƣớc đầu 5’
của gen mã hóa H-FABP

Yếu tố
Trình tự tƣơng ứng
Vị trí
Yếu tố hoạt
hóa protein 1 (AP-1)
STGACTMA
-875
Yếu tố hoạt
hóa protein 2 (AP-2)
CCSCRGGC
-408
Yếu tố hoạt
hóa protein 3 (AP-3)
TGTGWWW

-1545, -714
CCAAT–EBP
(C/EBP)
TKNNGYAAK
-1608, -1504, -1072,
-665, -628
E-Box
CANNTG
-1539, -1328, -1308,
-1111, -768, -110
Growth hormone
(GH-cse2)
AATAAAT
-1441
Glucocorticoids (GRE)
TGTTCT
-1000
Krox-24
GCGSGGGCG
-134
Yếu tố hoạt hóa
tuyến vú (MAF)
GRRGSAAGK
-1134
Sat-5
TTCNNNGAA
-1178

Những yếu tố này phù hợp với những báo cáo về sự biểu hiện đặc hiệu
mô hay chức năng của H-FABP. E-Box có chức năng điều khiển biểu hiện

các H-FABP đặc hiệu trong tế bào cơ xương nhờ sự liên kết với họ protein
MYOD của cơ. Cơ chế chung điều khiển H-FABP có thể giải thích bằng sự có
mặt của các vị trí liên kết tiềm năng tương ứng như yếu tố hoạt hóa protein
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
- -
13
(activator protein- AP 1, 2, 3), Krox 24 và các yếu tố đáp ứng glucocorticoid.
Một đoạn 13 nucleotid (CTTCCT[A/C]TTTCGG) tìm thấy ở vị trí nucleotid
- 250 ở lợn là một nhân tố mới trong điều khiển phiên mã khi so sánh với
trình tự trên genbank/EMBL. Yếu tố liên kết tiềm năng Stat-5 giải thích cho
sự phụ thuộc của quá trình tiết sữa với sự biểu hiện của gen H-FABP. Vị trí
liên kết Stat-5 cũng được phát hiện trong các promotor của các gen mã hóa
protein sữa.
Vùng 3’ không dịch mã bao gồm các đoạn poly-A.
Chức năng của gen H-FABP
Gen H-FABP là gen mã hóa cho một protein H-FABP liên kết axit béo
ở cơ, có kích thước là 15kDa. H-FABP là một thành viên thuộc nhóm protein
liên kết lipid nằm trong tế bào, chúng bao gồm 9 loại F-ABP khác nhau nằm ở
các mô đặc hiệu khác nhau của cơ thể. Đó là A-FABP nằm ở mô mỡ, B-FABP
ở các tế bào thần kinh của não, E-FABP ở biểu bì, H-FABP ở tế bào cơ, I-
FABP ở ruột, IL-FABP ở ruột hồi, L-FABP ở gan, M-FABP ở myelin và T-
FABP nằm ở tinh hoàn [14].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
- -
14

Hình 1.2 Trình tự aminoacid của các loại F-ABP
H-FABP thường có mặt ở các mô có nhu cầu cao về các axit béo là mô
cơ hay các mô cơ tim hay mô cơ xương và tuyến sữa. Nguồn gốc của chất ức
chế sinh trưởng trong vú là một protein ức chế sự phát triển các tế bào u, thực

chất là hỗn hợp của H-FABP và một loại A-FABP.
H-FABP là các protein nhỏ nội bào liên kết với các axit béo để vận
chuyển các axit béo này qua màng tế bào chất đến vị trí β-oxi hóa các axit béo
để cung cấp năng lượng hoặc tổng hợp triacylglycerol (TAG) hay
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
- -
15
phospholipid [62]. Hơn thế nữa, H-FABP có thể điều chỉnh hàm lượng axit
béo trong cơ và thông qua con đường này chúng điều khiển quá trình tổng
hợp lipid. H-FABP và A-FABP được coi là hai ứng cử gen cho tính trạng hàm
lượng mỡ ở lợn.



Hình 1.3 Cơ chế hoạt động của H-FABP trong tế bào

1.3.2. Đa hình di truyền gen H-FABP
Tính trạng chất lượng thịt gồm một tập hợp các tính trạng được điều
khiển bởi nhiều gen. Các tính trạng này bao gồm các thành phần của cơ (hàm
lượng mỡ cơ, tỷ lệ cũng như độ dày của thịt nạc, hàm lượng cholesterol) và
các chỉ tiêu chất lượng (độ pH, màu sắc, khả năng giữ nước hay mất nước, độ
mềm, ngon khi chế biến). Hàm lượng mỡ giắt trong cơ (intramuscular fat
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
- -
16
content - IMF) là lượng mỡ được phân bố trong thịt nạc. Hàm lượng mỡ cơ
ảnh hưởng đến lượng nước, độ mềm và vị ngon của thịt lợn.
Chất lượng thịt lợn bị ảnh hưởng bởi hai yếu tố di truyền và dinh
dưỡng. Để nghiên cứu đồng tác dụng của hai loại yếu tố đó, Li C.L., Sa X.Y.,
Meng H., Pan Y.C. (2009), thực hiện thử nghiệm này trên 136 lợn lai với

khoảng 65 kg trọng lượng, chia thành 4 nhóm, mỗi nhóm được cho ăn với
khẩu phần khác nhau. Sau 35 ngày nuôi, lợn thịt khoảng 95 kg trọng lượng cơ
thể và chất lượng thịt lợn được đánh giá. Đa hình gen H-FABP được phân
tích. Các kết quả thu được: (1) nguồn thức ăn có tác dụng rất lớn đến màu thịt
(MC), pH24, chất béo trong cơ (IMF,%), và protein trong cơ bắp (IMP,%);
(2) đa hình gen H-FABP ảnh hưởng đến IMF (%) và IMP (%); (3) sự tương
tác giữa gen và thành phần thức ăn có tác dụng đáng kể đến pH và IMF (%)
[31].
Gen H-FABP nằm trên nhiễm sắc thể số 6, chúng được giải trình tự và
có 3 vị trí cắt của enzym giới hạn. Ba vị trí đa hình độ dài đoạn giới hạn đã
được xác định trên trình tự gen H-FABP: điểm cắt của enzyme HinfI tại
nucleotit 1324 nằm ở phía trước đầu 5’ của gen H-FABP (T bị thay thế bằng
C), điểm cắt của enzyme MspI tại nucleotit 1489 (T bị thay thế bằng C), điểm
cắt của enzyme HaeIII tại nucleotit 1811 (G bị thay thế bằng C), cả 2 điểm cắt
của enzyme MspI và HaeIII nằm trên intron của gen H-FABP [19].
FABPs là một họ các protein nhỏ có khả năng liên kết và vận chuyển
các axit béo đến các vị trí mà ở đó các axit béo được sử dụng. H-FABP là một
thành viên của họ protein FABPs, vì vậy H-FABP được coi là ứng cử gen cho
hàm lượng mỡ cơ liên quan đến độ dày mỡ lưng ở lợn. Gerben và cs [21],
bằng cách sử dụng ba vị trí đa hình ở gen H-FABP của lợn đã phát hiện ra
mối liên quan giữa kiểu gen mã hóa cho H-FABP với IMF (hàm lượng mỡ
giắt trong cơ) và BF (hàm lượng mỡ lưng). Nghiên cứu này cho thấy lợn có
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
- -
17
kiểu gen H-FABP là aaddHH có hàm lượng IMF cao nhất. Kết quả nghiên
cứu cho thấy đa hình RFLP gen H-FABP có liên quan đến hàm lượng IMF
cũng như hàm lượng BF.
Ảnh hưởng của đa hình gen H-FABP với sự tăng hàm lượng IMF có
thể là do sự khác biệt trong vận chuyển các axit béo của các protein H-FABP.

Sự khác biệt của các allele tăng sự tích lũy mỡ trong cơ bằng cách tăng hiệu
quả tích lũy của các axit béo trong mô cơ xương và diều khiển vận chuyển các
axit béo nội bào khác nhau. Ngược lại, gen H-FABP tác động làm tăng lượng
mỡ lưng một cách gián tiếp, bởi vì các mô mỡ dưới da không biểu hiện H-
FABP, nhưng có mặt của A-FABP. Do H-FABP không được tiết ra bởi các tế
bào cơ cho nên chúng không tương tác trực tiếp với các mô mỡ dưới da. Bên
cạnh ảnh hưởng không trực tiếp của H-FABP lên độ dày mỡ lưng, thì ảnh
hưởng của H-FABP lên IMF cũng góp phần giải thích sự biến đổi của độ dày
mỡ lưng. Đã có những bằng chứng cho thấy ảnh hưởng của đa hình gen H-
FABP liên quan đến tốc độ phát triển của lợn. Tóm lại, H-FABP ảnh hưởng
đến hàm lượng IMF, độ dày mỡ lưng và tốc độ sinh trưởng của quần thể lợn
[21].
Ảnh hưởng hàm lượng mỡ cơ với đa hình gen mã hóa H-FABP cũng
được nghiên cứu ở lợn: Landrace, Large White, và một số giống lợn nội ở
Trung Quốc: Neijiang, Rongchang, Hanjiang đen, Hanzhong trắng,
Banmei Thì kiểu gen H-FABP có tương quan với hàm lượng mỡ cơ. Dựa
trên phương pháp đa hình đoạn cắt giới hạn, kết quả nghiên cứu cho thấy có
sự khác nhau về các tính trạng hàm lượng mỡ ở trong thịt giữa các nhóm kiểu
gen lần lượt là: AA<Aa<aa; HH>Hh>hh và DD<Dd<dd. Hiệu suất di truyền
tương ứng là: 2,28<2,7<2,95; 3,89>3,42>3,17; 2,27<2,49<2,91 [41]. Những
nghiên cứu trên lợn Cinta Senese cũng cho thấy đa hình H-FABP liên quan
đến hàm lượng mỡ trong cơ [15]. Ở lợn Calabrese đã chứng minh là lợn mang