Phân loại, nuôi trồng và khảo sát sơ bộ các chất có hoạt tính sinh học của loài vân chi đỏ tại việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN


NGUYỄN THỊ THU TRANG


PHÂN LOẠI, NUÔI TRỒNG VÀ KHẢO SÁT SƠ BỘ
CÁC CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA
LOÀI VÂN CHI ĐỎ TẠI VIỆT NAM


Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC
Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC



NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. NGUYỄN ĐỨC HOÀNG


Tp. Hồ Chí Minh, Năm 2012




MỞ ĐẦU

Trametes là nấm có khả năng hóa sube, tai nấm khi khô trở nên cứng giòn.

Trên thế giới có khoảng 50 loài thuộc chi Trametes, trong số đó có một số loài là
nấm phá gỗ, nhưng cũng có một số khác thuộc chi Trametes là nấm dược liệu. Hiện
nay, đã ghi nhận có khoảng 820 chủng Trametes khắp trái đất [102].
Vân chi đỏ (Trametes sanguinea) là một loài nấm có nhiều ứng dụng tiềm
năng về dược liệu cũng như xử lý môi trường. Các nghiên cứu cho thấy rằng vân
chi đỏ được tìm thấy ở rất nhiều vùng trên thế giới và có một số chất có hoạt tính
sinh học như polysaccharide, saponin, carotenoid, hay alkaloid…
Ở Việt Nam, trong những năm gần đây cũng phát hiện nhiều loài vân chi
trong tự nhiên, trong đó có vân chi đỏ. Tuy nhiên, các nghiên cứu về phân loại cũng
như khảo sát các chất có hoạt tính sinh học của nấm có nguồn gốc từ Việt Nam vẫn
còn rất hạn chế. Đề tài nhằm định danh, nuôi trồng và khảo sát sơ bộ các hợp chất
có hoạt tính sinh học của loài vân chi đỏ được phát hiện tại Việt Nam.
Kết quả phân loại dựa trên hình thái và rDNA đã xác định nấm vân chi đỏ
được phân lập là Trametes sanguinea, sẽ là cơ sở cho việc phân loại chi Trametes
nói riêng và các loài nấm lớn khác tại Việt Nam nói chung trong các nghiên cứu
tiếp theo. Ngoài ra, kết quả khảo sát các hoạt chất sinh học sẽ rất có giá trị trong các
nghiên cứu hướng đến việc khai thác các chất có lợi của nấm vân chi đỏ.


i

MỤC LỤC


Trang
Trang phụ bìa
Mục lục i
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt v
Danh mục các bảng vii
Danh mục các hình vẽ, đồ thị viii

MỞ ĐẦU
Chương 1-TỔNG QUAN
1.1. Vị trí của giới nấm trong hệ thống phân loại học .1
1.2. Phương pháp phân loại nấm .4
1.2.1 Phương pháp phân loại dựa trên hình thái và đặc điểm sinh lý .4
1.2.1.1. Giới thiệu chung về giới nấm .4
1.2.1.2. Ngành Basidiomycota (nấm đảm) .4
1.2.2. Phân loại học giới nấm dựa vào sinh học phân tử .7
1.2.2.1. DNA ribosome .7
1.2.2.2. DNA mã hóa cho enzyme ATPase của ti thể tiểu phần số 6 (atp6) .9
1.2.2.3. DNA mã hóa cho nhân tố kéo dài dịch mã alpha 1 (tef1) 10
1.2.2.4. Gen mã hóa cho protein RPB1 và RPB2 (rpb1, rpb2) 10
1.2.2.5. Gen mã hóa α-tubulin và β-tubulin (α-tub, β-tub) 11
1.2.2.6. Gen mã hóa cho enzyme cytochrome oxidase (cox) 11
1.3. Khái quát về nấm được nuôi trồng 12
1.3.1. Đặc điểm sinh lý nấm trồng 13
1.3.1.1. Nhu cầu dinh dưỡng của hệ sợi nấm 13
1.3.1.2. Ảnh hưởng của các yếu tố vật lý 14
1.3.2. Phương pháp nuôi trồng 15
1.3.2.1. Nguyên liệu trồng nấm 15

ii

1.3.2.2. Kỹ thuật trồng nấm 15
1.4. Nấm dược liệu và dược tính 18
1.5. Các hợp chất có hoạt tính sinh học trong nấm dược liệu 21
1.5.1. Polysaccharides 21
1.5.1.1. β- D- glucan 21
1.5.1.2. Các dị polysaccharide (Heteropolysaccharides) 21
1.5.2. Saponin 22

1.5.3. Steroid 23
1.5.4. Carotenoid 25
1.5.5. Alkaloid 26
Chương 2-VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu 28
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 28
2.1.2. Môi trường sử dụng 28
2.1.2.1. Môi trường dinh dưỡng 28
2.1.2.2. Môi trường nuôi trồng 29
2.2. Phương pháp nghiên cứu 29
2.2.1. Phân lập nấm vân chi đỏ 29
2.2.1.1. Phương pháp lấy mẫu 29
2.2.1.2. Phương pháp phân lập 29
2.2.2. Phân loại nấm bằng hình thái và di truyền 29
2.2.2.1. Phân loại nấm bằng hình thái 29
2.2.2.2. Phân loại dựa trên DNA Ribosome 29
2.2.3. Khảo sát một số đặc điểm sinh lý của hai loài nấm vân chi 31
2.2.3.1. Khảo sát tốc độ lan tơ 31
2.2.3.2. Hình thái tơ nấm trên môi trường nuôi cấy lắc 32
2.2.4. Trồng để thu nhận nấm 32
2.2.4.1. Chuẩn bị meo giống cấp 2 32
2.2.4.2. Chuẩn bị meo cọng 32

iii

2.2.4.3. Trồng nấm trên giá thể mạt cưa 32
2.2.4.4. Quy trình trồng nấm vân chi 33
2.2.5. Khảo sát các hoạt chất sinh học 33
2.2.5.1. Phân tích sơ bộ thành phần hóa học 34
2.2.5.2. Phương pháp định lượng β-1,3-glucan 38

2.2.5.3. Phương pháp định tính và định lượng saponin 39
2.2.6. Phương pháp xử lý số liệu 42
Chương 3-KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Phân lập mẫu nấm vân chi đỏ 44
3.1.1. Hình thái mẫu nấm vân chi đỏ ngoài tự nhiên 44
3.1.2. Phân lập nấm vân chi đỏ 45
3.2. Phân loại nấm vân chi đỏ và đen 45
3.2.1. Phân loại nấm bằng hình thái 45
3.2.2. Phân loại bằng sinh học phân tử 52
3.2.2.1. Kết quả PCR 52
3.2.2.2. Kết quả giải trình tự 54
3.2.2.3. Xây dựng cây phân loại 54
3.3. Khảo sát một số đặc điểm sinh lý hai loài nấm 56
3.3.1. Khảo sát tốc độ lan tơ 56
3.3.2. Hình thái tơ nấm trên môi trường nuôi cấy lắc 58
3.4. Nuôi trồng hai loài nấm 59
3.4.1. Nuôi trồng nấm vân chi đỏ 59
3.4.1.1. Chuẩn bị giống 59
3.4.1.2. Quy trình nuôi trồng 60
3.4.2. Nuôi trồng nấm vân chi đen 62
3.4.2.1. Chuẩn bị giống 62
3.4.2.2. Quy trình nuôi trồng 63
3.5. Khảo sát các hoạt chất sinh học 64
3.5.1. Phân tích sơ bộ thành phần hóa học 64

iv

3.5.2. Định lượng β-1,3-glucan 67
3.5.3. Định tính và định lượng saponin 70
3.5.3.1. Định tính saponin 70

3.5.3.2. Định lượng saponin 73
Chương 4 -KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. Kết luận 74
4.2. Kiến nghị 74
TÀI LIỆU THAM KHẢO xi
PHỤ LỤC














Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Tổng quan



Nguyễn Thị Thu Trang 1

1.1. Vị trí của giới nấm trong hệ thống phân loại học
Phân loại học đã có từ lâu đời, phát triển theo sự phát triển của lịch sử loài
người, nó ra đời khi con người phân biệt được các loại thực vật gây độc và có thể sử
dụng làm thực phẩm và dược liệu, cũng như sự ghi nhớ và phân loại các loài vật
nuôi. Sự phát triển của phân loại học của nấm đi sau thực vật và động vật. Trong
các hệ thống phân loại cũ từ 2 giới (kingdom) của Carl Linnaeus đến 4 giới của
Herbert F. Copeland năm 1938, nấm được coi là thuộc trong giới thực vật (Plantae),
mặc dù các đặc điểm mô tả về hình thái nấm đã được biết đến trước đó rất nhiều thế
kỉ. Khi hệ thống phân loại 5 giới của Robert Whittaker ra đời năm 1969 thì sự khác
biệt giữa nấm và các sinh vật khác đặc biệt là thực vật sau một thời gian mới được
nhận biết và phân loại một cách có hệ thống. Ông phân loại sinh vật đa bào dựa vào
khả năng dinh dưỡng: giới Animalia là sinh vật dị dưỡng, không có khả năng tự tạo
ra dinh dưỡng cho cơ thể mà phải lấy từ các nguồn khác, giới Plantae là sinh vật tự
dưỡng, thực vật sử dụng ánh sáng mặt trời tạo nguồn dinh dưỡng cho chính chúng
và nguồn thức ăn cho các loài dị dưỡng khác, còn giới Fungi là dị dưỡng, nấm tiết
các enzym ra ngoài môi trường, tiêu thụ các chất hữu cơ thông qua sợi nấm gọi là
hệ sợi, chúng không thể thiếu được trong chu trình biến đổi vật chất. Về căn bản

Robert Whittaker vẫn chia giới Monera thuộc nhóm sinh vật nhân sơ và giới
Protista là sinh vật nhân thực, chúng đều là sinh vật sống đơn bào.
Vào giữa những năm 70 của thế kỉ XX, sự phát triển của sinh học phân tử đã
giúp cho sự phân loại sinh vật sống đi vào bản chất của gen hơn là quan tâm tới
hình thái và hành vi của thế giới sống bằng việc so sánh các vùng gen tương đồng
và bảo tồn cao (ban đầu là rDNA). Lúc này đã chia ra nhiều nhóm loài có những
đặc điểm chung về gen bảo tồn. Hơn nữa, liên tiếp các khám phá về sự sống đã đưa
luận điểm chung: tất cả các sinh vật đều có một tổ tiên chung. Sự bao quát về sự
sống không còn chỉ ở mức giới mà còn tổ chức sự sống ở mức cao hơn, bao quát
hơn. Dựa trên các nghiên cứu về RNA, Carl Woese đã tìm ra sự khác biệt trong giới
Monera, đó là vi khuẩn và vi khuẩn cổ. Một cách khái quát, đến thập niên 1990,
Carl Woese cho rằng, sự sống được chia làm 3 lãnh giới (domain): lãnh giới


Tổng quan



Bacteria gồm giới Bacteria, lãnh giới Archaea gồm giới Archaea, lãnh giới Eukarya
gồm giới Protista, Fungi, Plantae và Animalia. Theo như hệ thống phân loài này thì
giới Fungi có mối quan hệ gần gũi với giới Animalia (Hình 1.1) [21].


Phân loại học đầu thế kỉ XXI dựa trên phân loại 3 lãnh giới của Woese,
nhưng đi sâu vào phân loại lãnh giới Eukarya. Đó là kết quả một quá trình phát triển
của công nghệ sinh học và sinh tin, phôi thai học, hóa thạch học và lịch sử học,
ngày càng nhiều các loài sinh vật thuộc lãnh giới nhân thực được giải trình tự và
phân loại. Do vậy, hội nghị phân loại học quốc tế năm 2005 đã đưa ra cách phân
loại mới của lãnh giới Eukarya (Eukaryota). Theo đó, lãnh giới Eukarya được chia
làm 6 siêu giới và tiếp tục khẳng định quan điểm của Woese là giới nấm có mối

quan hệ gần với giới Metazoa (Animalia) hơn là giới Plantae. Do vậy, giới Fungi
nằm trong siêu giới Opisthokonts (Opisthokonta) cùng với giới Metazoa (Hình 1.2)
[21].

Hình 1.1. Hệ thống phân loại 6 giới và 3 lãnh giới [72].


Tổng quan




Sau năm 2005, các nghiên cứu về phân loại học càng đi sâu đặc điểm của
lãnh giới Eukarya, đặc biệt các bằng chứng về rDNA trên nguyên sinh động vật đã
thay đổi quan điểm về 6 siêu nhóm. Lãnh giới Eukarya được chia làm hai siêu
nhóm.
 Unikonts-Unikonta (một roi): gồm siêu giới Amoebozoa và Opisthokonts
[22, 30, 31, 32].
 Bikonts-Unikonta (hai roi): gồm siêu giới Excavata, Rhizaria,
Chromalveolata, Archaeplastida. Trong đó, ngành Heterkontophyta (Stramenopiles)
và Alveolata thuộc siêu giới Chromalveolata và siêu giới Rhizaria có quan hệ gần
gũi với nhau, được gọi là siêu giới SAR, giới Plantae nằm trong siêu giới
Archaeplastida [13].
Hình 1.2. Hệ thống phân loại 6 siêu giới của lãnh giới Eukarya [19].


Tổng quan

1.2. Phương pháp phân loại nấm
1.2.1. Phương pháp phân loại dựa trên hình thái và đặc điểm sinh lý
1.2.1.1. Giới thiệu chung về giới nấm
Nấm được phân loại từ rất lâu và đến hết thế kỉ XIX các nhà phân loại học
vẫn còn cho rằng nấm thuộc giới Plantae. Chỉ khi các nghiên cứu sau này về đời
sống, cách thức sinh sản, đặc điểm biến dưỡng mới tách nấm ra một giới riêng biệt.
Cho tới ngày nay việc phân loại nấm vẫn chủ yếu dựa vào mô tả hình thái, nghiên
cứu trên đặc điểm sinh lý để đưa ra phân loại nấm nói chung.
Theo công ước phân loại mới vào năm 2007, giới nấm được chia làm 5
ngành: Chytridiomycota (nấm roi), Neocallimastigomycota, Blastocladiomycota,
Microsporidia, Glomeromycota) và 1 giới phụ Dikarya (nấm bậc cao) bao gồm có
hai ngành Ascomycota (nấm nang khuẩn) và Basidiomycota (nấm đảm) [28].
Trong đó nấm vân chi đỏ thuộc ngành nấm đảm và sẽ được trình bày rõ hơn
trong phần tiếp theo.
1.2.1.2. Ngành Basidiomycota (nấm đảm)
Hình 1.3. Hệ thống phân loại 2 siêu nhóm của lãnh giới Eukarya [13].



Tổng quan





Nấm đảm là những nấm dạng sợi, trong chu trình sống cơ quan sinh sản
được tạo thành từ những sợi nấm thứ cấp mà có thể nhìn thấy được bằng mắt
thường gọi là quả thể (basidiocarp), mang đảm (basidia), thông thường mỗi đảm
mang 4 đảm bảo tử (basidiospore) (Hình 1.4). Ngoài ra có một số loài nấm thuộc
ngành này sinh sản vô tính. Đặc điểm nổi bật của ngành Basidiomycota là có hệ sợi

thứ cấp có hình thành các mấu liên kết (clamp connections).
 Các loại hệ sợi tơ nấm ở ngành Basidiomycota
 Hệ sợi cấp 1 hay hệ sợi sơ cấp (primary mycelium)
Hệ sợi sơ cấp phát triển từ sự nảy mầm của một đảm bào tử, gồm những tế
bào đơn nhân gọi là đồng nhân. Tuy nhiên, sau đó phát triển thành những tế bào đa
Hình 1.4. Chu trình sống của các loài trong ngành Basidiomycota [46].


Tổng quan



nhân có vách ngăn ngang thành những tế bào đơn nhân. Đảm không bao giờ phát
triển trên hệ sợi cấp 1.
 Hệ sợi cấp 2
Hệ sợi cấp 2 gồm những tế bào nhân kép và phát triển bởi sự hợp nhân của 2
tế bào đơn nhân. Trong những loài dị tản, tế bào hợp nhân khi hệ sợi của những loài
khác nhau nhưng ở trường hợp đồng tản (homothallic) thì sự hợp nhân xảy ra giữa
hai hệ tơ nấm cấp 1. Quá trình phối hợp của hệ sợi sơ cấp để trở thành hệ sợi cấp 2
hay nhân kép gọi là nhân kép hóa (dikaryotization) hay nhị bội hóa (diploidization).
Bắt đầu từ hệ sợi cấp 2, tơ nấm được gọi là tơ nấm thứ cấp (secondary mycelium).
Sự tạo mấu liên kết hình thành suốt trong sự phân chia của hệ sợi cấp 2, quá
trình tạo mấu liên kết bắt đầu khi giữa hai nhân của tế bào song nhân xuất hiện một
đoạn dài, một nhân di chuyển hình thành một mấu, đồng thời hai nhân phân chia.
Hai nhân mới di chuyển về phía trước, hình thành vách ngăn giữa các nhân, tạo
thành tế bào song nhân mới (Hình 1.5).
 Hệ sợi cấp 3
Hệ sợi cấp 2 tạo thành cơ quan sinh sản hữu tính là quả thể mang các đảm,
đảm được gọi là hệ sợi cấp 3 ở nấm đảm. Ngoài ra, một số loài trong ngành nấm
đảm tạo các tế bào Cystidia nằm gần với các đảm, hình dạng của Cystidia rất đa

Hình 1.5. Quá trình hình thành mấu liên kết ở ngành Basidiomycota [75].


Tổng quan



Nguyễn Thị Thu Trang 7

dạng và đặc trưng cho từng chi [52]. Ngành Basidiomycota có 3 ngành phụ, 16 lớp,
52 bộ, 177 họ, 1589 giống và 31525 loài [71].
 Chu trình sống của các loài trong ngành Basidiomycota
- Đảm bào tử (đơn bội-n) phát tán ra môi trường nếu gặp điều kiện thuận lợi,
bào tử nảy mầm thành dạng sợi, là các tế bào đồng nhân và đơn nhân, đây hệ sợi sơ
cấp.
- Hệ sợi sơ cấp dung hợp thành các tế bào song nhân (n+n), trong mỗi tế bào
tồn tại hai nhân riêng biệt. Các tế bào song nhân tăng trưởng bằng cách hình thành
các mấu liên kết.
- Khi gặp điều kiện thích hợp, hệ sợi cấp 2 sẽ phát triển thành cơ quan sinh sản
là quả thể. Trong quả thể có một lớp thụ tầng, tế bào ngọn của lớp thụ tầng hình
thành một mấu tạo thành một tế bào chuyên hóa lưỡng bội (2n) hay đảm, tế bào này
giảm phân tạo 4 đảm bào tử ngoại trừ chi Dacrymyces, Calocera, nấm mỡ
(Agaricus bisporus) đảm chỉ tạo 2 đảm bào tử.
1.2.2. Phân loại học giới nấm dựa vào sinh học phân tử
Sinh học phân tử có ứng dụng lớn trong phân loại học giới nấm, dựa vào các
vùng gen bảo tồn trên DNA bộ gen mà các nhà phân loại có thể tìm ra và phân loại
nấm một cách nhanh chóng, chính xác.
1.2.2.1. DNA ribosome
Nấm là một sinh vật nhân thực (Eukaryote) do vậy cấu trúc ribosome cũng
giống như những loài Eukaryote khác. Ribosome có hệ số lắng là 80S gồm có hai

tiểu phần:
 Tiểu phần lớn (large subunit)
Tiểu phần lớn có hệ số lắng là 60S bao gồm đoạn 5S RNA, 28S RNA, 5.8
RNA và khoảng 49 protein.
 Tiểu phần nhỏ (small subunit)
Tiểu phần nhỏ có hệ số lắng là 40S được cấu trúc từ 18S RNA và 33 protein.
DNA mã hóa cho hai tiểu phần của ribosome ở nấm đã được nghiên cứu từ
lâu và trên vùng gen mã hóa này có nhiều vùng bảo tồn có ý nghĩa trong phân loại.


Tổng quan



Trong vùng gen liên kết từ vùng 18S, 5.8S và 28S có hai vùng trình tự không mã
hóa: ITS1 và ITS2.
 ITS1 và ITS2
Là hai vùng trình tự không mã hóa, chúng không có chức năng gì trong cấu
trúc của ribosome, do đó chúng sẽ được cắt đi khi tạo thành ribosome trưởng thành
(Hình 1.6). Tuy nhiên, các nghiên cứu đã cho thấy rằng hai vùng ITS bảo tồn cao và
biến thể của hai vùng này cũng khác biệt ở cấp độ loài cũng như dưới loài [25].
Hiện nay, vùng DNA mã hóa cho ITS1, ITS2 và 5.8S ribosome được sử dụng cho
hệ thống phân loại phân tử của giới phụ Dikarya là chủ yếu [28].



 DNA tiểu phần lớn ribosome (LSU) và tiểu phần nhỏ ribosome (SSU)
Vùng này mã hóa cho vùng 28S của ribosome, tiểu phần D1/D2 của LSU và
toàn bộ DNA mã hóa cho SSU. Hầu hết các loài trong giới nấm đều phân loại dựa
vào gen mã hóa cho LSU và SSU [28].

 DNA mã hóa cho tiểu phần nhỏ ribosome ti thể
Hình 1.6. Cấu trúc rDNA ở Eukaryote

[60].



Tổng quan



Ti thể có chức năng chính là chuyển hóa vật chất hữu cơ thành năng lượng
dưới dạng ATP ở hầu hết các tế bào sinh vật nhân thực và có cấu trúc khác biệt.
Theo như thuyết cộng sinh, thì “ti thể” bắt nguồn từ một loài vi khuẩn có khả năng
tạo ra ATP, do đó ti thể có DNA và ribosome của riêng nó. Ribosome có hệ số lắng
là 70S giống như ở các loài prokaryote khác. Hiện nay, vùng DNA mã hóa cho tiểu
phần nhỏ của ribosome ti thể là được sử dụng trong phân loại các loài nấm trong lớp
Eurotiomycetes, Lecanoromycetes, Lichinomycetes, Agaricomycetes và lớp phụ
Pleosporomycetidae [28].
1.2.2.2. DNA mã hóa cho enzym ATPase của ti thể tiểu phần số 6 (atp6)
ATPase của ti thể là một enzym có khả năng tổng hợp ATP từ ADP và một
phân tử phosphate và giải phóng năng lượng. Enzym này nằm trong màng trong của
ti thể và có cấu trúc gồm [4]:
- Phần F
1
: hình cầu, thích nước, nhô ra ngoài matrix (ti thể) là phần xúc tác
của enzym.
- Phần F
0
: hình trụ, thích lipid, xen trong màng, là kênh proton.

Hình 1.7.
Cấu trúc ATPase của nấm men Saccharomyces cerevisiae [7].



Tổng quan



Nguyễn Thị Thu Trang 10

Atp6 nằm trong phần F
0
trong ATPase, cấu trúc Atp6 ở nấm men cho thấy
rằng Atp6 liên kết với tiểu phần Apt4 tạo lên cánh tay quay của tiểu phần F
0
. Sự kết
hợp giữa các phần của ATPase và Atp6 cần thiết có sự hiện diện của Atp10 (Hình
1.7) [7].
atp6 thường được dùng để phân loại nấm trong lớp Ustilaginomycetes,
Exobasidiomycetes và Agaricomycetes [28].
1.2.2.3. DNA mã hóa cho nhân tố kéo dài dịch mã alpha 1 (tef1)
Tef1 nằm trong phức hợp efF-1, phức hợp có nhiệm vụ gắn acid amin mở
đầu lên ribosome tiểu phần 40S, sau đó các nhân tố kéo dài dịch mã khác gắn với
RNA tới vị trí của Tef1 để bắt đầu quá dịch mã ở Eukaryote. tef1 được bảo tồn cao
trong các loài sinh vật, do vậy nó đã được đề nghị sử dụng trong xây dựng cây phát
sinh loài cũng như xác định loài mới [14].
1.2.2.4. Gen mã hóa cho protein RPB1 và RPB2 (rpb1, rpb2)
RNA polymerase II là enzym xúc tác quá trình sao mã RNA từ DNA ở
Eukaryote, enzym có khoảng 12 tiểu phần do 12 gen mã hóa ở người và nấm (Hình

1.9). Trong đó, tiểu phần 1 và 2 là lớn nhất, tiểu phần 1 chứa vùng carbon đầu cuối
là 52 vùng lập lại heptapeptide có chức năng quan trọng trong sự hoạt động của
enzym RNA polymerase, ngoài ra chính vùng lập lại có ý nghĩa quan trọng trong
tiến hóa cũng như phân loại các loài nấm nói riêng.
Tiểu phần 2 có chức năng liên kết với các tiểu phần khác tạo nên cấu trúc
liên kết giữa DNA và RNA mới được tổng hợp.
rpb1 và rpb2 có thể được dùng để phân loại hầu hết tất cả các loài trong giới
nấm [26].






Tổng quan




1.2.2.5. Gen mã hóa α-tubulin và β-tubulin (α-tub, β-tub)
Tubulin là protein cấu trúc lên vi ống ở tế bào sinh vật nhân thực, vi ống là
một trong ba cấu trúc tạo nên bộ xương của tế bào, có chức năng quan trọng trong
vận chuyển bên trong tế bào, vận động của lông roi, thoi vô sắc và lớp bảo vệ ở
màng tế bào thực vật. Vi ống là chuỗi polypeptide hình trụ rỗng, được tổ hợp từ α
và β tubulin.
Hai gen trên được sử dụng để phân loại ngành Chytridiomycota,
Microspodia và bộ Mucorales. Riêng β-tub ở ngành phụ Taphrinomycotina, lớp phụ
Sodariomycetidae, lớp Ustilaginomycetes, Exobasidiomycetes [26].
1.2.2.6. Gen mã hóa cho enzym cytochrome oxidase (cox)
Hình 1.8

. Cấu trúc RNA polymerase II của Schizosaccharomyces pombe và
S. cerevisiae [86].


Tổng quan



Nguyễn Thị Thu Trang 12

Enzym cytochome oxidase nằm trong màng trong của ti thể, có chức năng
quan trọng trong chuỗi vận chuyển điện tử tổng hợp ATP. Enzym có từ 3 đến 4 tiểu
phần, trong đó các tiểu phần 1, 2, 3 là được nghiên cứu nhiều trên khía cạnh phân
loại học của nấm [68].
Gen cox được dùng chủ yếu trong phân loài ngành Neocallimastigomycota.

1.3. Khái quát về nấm được nuôi trồng
Hầu hết nấm ăn trên thế giới đều thuộc giới phụ Dikarya, đặc biệt là các loài
nấm trồng nằm trong ngành Basidiomycota. Hiện nay có khoảng 1,5 triệu loài nấm
nói chung, nhưng số lượng loài được trồng làm thực phẩm và dược liệu chỉ chiếm
một phần nhỏ. Loài người đã biết tới nấm từ rất lâu, sự hiện diện của nấm đã có từ
những nền văn hóa từ Châu Âu, Châu Mỹ và Châu Á. Trong một số tín ngưỡng cổ,
nấm được coi như là những món quà của Thần Chết bởi chúng mang những độc
chất do đó mang tới sự chết chóc. Nấm ma thuật (Plilocybe) được thu hoạch từ tự
nhiên và ngày nay được trồng ở một vài nước trên thế giới, nấm gây hiện tượng ảo
giác vì độc tính của nó, việc trồng nấm này được coi là phạm pháp bởi vì chiết xuất
từ nấm này là tiền chất để tổng hợp ma túy. Mặc dù các thổ dân Châu Mỹ sử dụng
nấm ma thuật trong rất nhiều hoạt động nghi lễ và săn bắn từ lâu. Ngoài biểu tượng
của Thần Chết, nấm còn được coi là món quà của Chúa Trời. Người Trung Quốc và
Nhật Bản thu hoạch nấm linh chi và đông cô từ trước công nguyên, người Châu Âu

thu hoạch nấm từ trong rừng, đặc biệt là nấm Cesár (Amanita caesarea). Ngay từ xa
xưa, việc thu hoạch nấm chủ yếu từ tự nhiên, do vị khác biệt so với các loài thực
phẩm khác và điều kiện để thu hoạch mà nấm được coi là một thực phẩm quý hiếm,
các loài nấm ăn và dược liệu chỉ để vua chúa và tầng lớp quý tộc sử dụng [73].
Người Trung Quốc được coi là dân tộc đầu tiên trồng được nấm đông cô.
Tuy nhiên, sự phát triển của trồng nấm nhân tạo chỉ từ khi kĩ thuật vô trùng ra đời,
nuôi trồng nấm quy mô đầu tiên tại Châu Âu với kĩ thuật nuôi trồng loài nấm mỡ
(A. bisporus) vào năm 1707 [73]. Đến ngày nay, nấm đã được trồng tại hơn 60 nước
trên thế giới, 5 nước đứng đầu về tổng sản lượng là Trung Quốc, Mỹ, Hà Lan, Pháp


Tổng quan



Nguyễn Thị Thu Trang 13

và Ba Lan. Tổng sản lượng nấm tươi ngày càng tăng trên thế giới, năm 1997 chỉ có
gần 6,2 triệu tấn nấm tới năm 2008 sản lượng lên tới 25 triệu tấn [101].
Nấm có nhiều protein, khoáng chất, vitamin và ít chất béo. Ngoài làm thực
phẩm, nấm trồng còn được sử dụng như một dược liệu tăng cường và bổ trợ cho sức
khỏe, một số loài nấm còn được sử dụng như là một chất bổ sung cho điều trị các
bệnh ung thư.
1.3.1. Đặc điểm sinh lý nấm trồng
1.3.1.1. Nhu cầu dinh dưỡng của hệ sợi nấm
 Nguồn Carbon
Nấm tiết enzym phân hủy các hợp chất khó tan trong gỗ, đất, rơm rạ như
cellulose, hemicellulose, lignin… thành các cấu tử có cấu trúc nhỏ hơn và sản phẩm
cuối là D-glucose, là chất dự trữ căn bản và tham gia vào quá trình biến dưỡng của
nấm để tổng hợp các hợp chất khác.

 Nguồn Nitơ (đạm)
Là thành phần dinh dưỡng quan trọng của nấm, tham gia vào tổng hợp acid
nucleic-vật liệu di truyền, protein, các enzym và vách chitin của tế bào nấm. Nguồn
nitơ cung cấp cho nấm có thể ở dạng vô cơ muối nitrat (
3
NO

), muối amon (
4
NH

),
hoặc dạng hữu cơ như cám gạo, cám bắp, bột đậu nành, peptone…
 Nguồn khoáng
Các khoáng chất như phospho (P), kali (K), sulfur (S), magie (Mg) tham gia
vào cấu trúc vật liệu di truyền, protein và là đồng cấu trúc cho nhiều loại enzym
khác, tạo khuynh độ điện hóa và sự thẩm thấu nước vào tế bào. Các nguyên tố vi
lượng như sắt (Fe), kẽm (Zn), mangan (Mn)… chỉ cần một lượng nhỏ nhưng lại cần
thiết trong việc hoạt hóa các enzym, tổng hợp vitamin, quá trình hấp thu và trao đổi
chất, kể cả việc hình thành quả thể một cách bình thường.
 Vitamin
Là những phân tử hữu cơ được dùng với số lượng rất ít chúng không phải là
nguồn cung cấp năng lượng cho tế bào mà giữ chức năng đặc biệt trong hoạt động


Tổng quan



Nguyễn Thị Thu Trang 14

của enzym. Hai vitamin tối cần thiết cho nấm là Biotin (vitamin H) và Thiamin
(vitamin B
1
).
1.3.1.2. Ảnh hưởng của các yếu tố vật lý
Sự phát triển của nấm cơ bản là hệ sợi nấm và quá trình hấp thu chất dinh
dưỡng cũng thông qua hệ sợi này. Nấm là loài nhạy cảm với các yếu tố vật lý của
môi trường như nhiệt độ, độ ẩm, pH, ánh sáng và chế độ thông khí. Mức độ tác
động của từng yếu tố tới nấm là khác nhau và tùy thuộc vào từng loài nấm.
 Nhiệt độ
Đây là yếu tố ảnh hưởng rất lớn tới sự phát triển của nấm. Do ảnh hưởng tới
sự hoạt động của các enzym. Nhiều loài nấm phát triển ở nhiệt độ 10-20
0
C, có loài
nấm khác như nấm nhiệt đới phát triển và ra quả thể ở 25-30
0
C, cá biệt như nấm
rơm mọc tốt ở 33-37
0
C. Mặt khác, nhiệt độ ra quả thể bao giờ cũng nhỏ hơn nhiệt
độ tăng trưởng của hệ sợi sinh dưỡng khoảng vài độ [3].
 Độ ẩm
Tất cả các loài nấm đều lấy chất dinh dưỡng và nước thông qua thẩm thấu
vào các tế bào của hệ sợi, do vậy chúng đều cần độ ẩm cao và ổn định. Thông
thường độ ẩm của hệ sợi (khoảng 40-60%) cũng nhỏ hơn độ ẩm của quả thể (80-
95%). Do độ ẩm quá cao hệ oxi khó khuếch tán qua màng tế bào dẫn tới nấm sẽ
chết, quả thể cần độ ẩm cao để không bị mất nước và phát triển bình thường. Do
vậy khi nuôi trồng nấm, cần quan tâm tới độ ẩm của nguyên liệu trồng nấm và độ
ẩm của không khí khi nấm ra quả thể.

 pH
Hầu hết các loài nấm phát triển tại pH trung tính, pH môi trường cũng chi
phối rất nhiều đến sự tăng trưởng của nấm, đặc biệt trong quá trình hình thành quả
thể. pH chua hoặc phèn (pH thấp) làm tơ nấm mọc chậm thưa và thường xoắn đầu,
quả thể bị biến dạng. pH kiềm (pH cao) tơ mọc chậm hoặc ngừng tăng trưởng, quả
thể bị chai và không tiếp tục phát triển.
 Chế độ thông khí


Tổng quan



Nguyễn Thị Thu Trang 15

Hàm lượng O
2
và CO
2
, là những chất có chủ yếu trong không khí. Oxy cần
cho sự hô hấp của tế bào nấm. CO
2
không ảnh hưởng nhiều trong giai đoạn tơ nấm
phát triển nhưng trong suốt giai đoạn phát triển quả thể, nhiều loài nấm rất nhạy
cảm với nồng độ CO
2
cao trong môi trường, quả thể có cuống dài và mũ nhỏ hoặc
bị ức chế sự phát triển [73].
 Ánh sáng
Ánh sáng gần như chỉ có giá trị trong giai đoạn ra quả thể. Ở nhiều loài nấm,

ánh sáng góp phần quan trọng trong việc kích thích sự hình thành nụ nấm và giúp
tai nấm phát triển bình thường.
1.3.2. Phương pháp nuôi trồng
1.3.2.1. Nguyên liệu trồng nấm
Nấm ăn chủ yếu là các loài nấm hoại sinh, sống trên các cây gỗ chết hoặc đất
nhiều xác bã thực vật. Do đó nguyên liệu trồng nấm chủ yếu là từ các cây gỗ không
có cấu trúc nhân thơm, rơm rạ, bông thải, cùi bắp hay bã mía. Hiện nay, nguyên liệu
trồng nấm chủ yếu là từ phụ phẩm của ngành nông nghiệp và công nghiệp chế biến
gỗ. Trồng nấm đã giải quyết vấn đề môi trường trong nông nghiệp và công nghiệp,
khi các phụ phẩm trên thải ra môi trường và rất lâu chúng mới được phân hủy hết,
gây ô nhiễm môi trường ảnh hưởng không tốt tới sức khỏe con người. Đặc điểm
chung của nguyên liệu trồng nấm đó là giàu cellulose, lignin. Ngoài ra để nấm phát
triển tốt và năng suất cao, khi trồng nấm còn bổ sung một số cơ chất giàu protein
như đạm vô cơ, cám lúa mạch, gạo, bắp, bột hạt bông…Tại các nước ôn đới nấm
được trồng chủ yếu trên gỗ sồi (Fagus crenata), trừ nấm mỡ (A. bisporus) được
trồng trên rơm rạ phủ đất bổ sung một số dưỡng chất khác. Còn ở các nước nhiệt
đới, nguyên liệu trồng nấm chủ yếu trên mạt cưa cao su (Hevea brasiliensis), ngoài
ra còn có cùi bắp, rơm rạ và bã mía.
1.3.2.2. Kỹ thuật trồng nấm
Nấm ngày càng phổ biến trên thế giới và trở thành một sản phẩm thương mại
có giá trị. Sự thành công của việc nuôi trồng nấm nhân tạo đã phát triển một số
lượng lớn nấm ăn và nấm dược liệu, là những nấm có tiềm năng sản xuất cao.


Tổng quan



Nguyễn Thị Thu Trang 16

Trước khi trồng nấm cần có giống tốt, các bước làm giống.
 Phân lập nấm và giữ giống
Nấm được phân lập trên môi trường PDA hay PGA, nước chiết malt từ lúa
hoặc lúa mạch, môi trường được chứa trong ống nghiệm hoặc đĩa Petri. Hệ sợi từ
quả thể nấm được chuyển vào trong ống nghiệm hoặc Petri chứa môi trường, nuôi ở
nhiệt độ thích hợp. Khi tơ nấm lan đầy cấy chuyền sinh khối sang môi trường mới.
Đây được coi là giống cấp 1 [73].
 Chuẩn bị giống cấp 2 và meo giá môi
Tùy theo điều kiện từng địa phương và loài nấm mà người ta chọn cơ chất
giống cấp 2. Do đó nguyên liệu của giống cấp 2 rất đa dạng từ lúa mạch, lúa mì hay
rơm rạ. Mục tiêu của việc chuẩn bị giống ở giai đoạn này là nhân cấp giống để
chuẩn bị bước vào giai đoạn nuôi trồng, mặt khác giúp nấm quen với môi trường
giàu các chất khó tan. Một số vùng còn giai đoạn meo giá môi sau giai đoạn giống
cấp 2, meo giá môi nhằm nhân cấp để tạo một số lượng giống lớn hơn và giúp nấm
mọc tốt khi nuôi trồng [3].
Sau khi giống chuẩn bị xong, bước cuối cùng là nuôi trồng nấm.
Những kỹ thuật trồng nấm nhân tạo hiện nay.
 Trồng nấm trong nhà
Nhà trồng cho phép người trồng điều khiển các thông số về điều kiện môi
trường như nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm… phù hợp cho từng loại nấm. Những nấm
nhạy cảm với các điều kiện về độ ẩm và nhiệt độ cần được nuôi trong nhà, như kim
châm (Flammulina velutipes), đuôi gà (Grifola frondosa), bào ngư vua (Pleurotus
eryngii). Trong khi đó, đa số nấm bào ngư (Pleurotus) có thể phát triển tốt trong
nhà trồng ít cần sự điều chỉnh.
 Trồng nấm trên khay
Nấm mỡ được trồng phổ biến bằng kỹ thuật này. Hai loài nấm mỡ thường
được nuôi trồng là A. bisporus và Agaricus bitorquis. Nguyên liệu sau khi ủ được
cho vào khay, cấy giống khi tơ nấm lan đầy, phủ lên bề mặt một lớp đất mùn hay đá
vôi. Lớp bề mặt này giúp cơ chất không bị khô và kích thích tơ nấm tạo quả thể.

Tổng quan



Nguyễn Thị Thu Trang 17

 Trồng nấm trong chai nhựa hoặc túi ni-lông
Phương pháp này thường dùng để trồng đa số các loài nấm như nấm linh chi
(Garnoderma lucidum), đông cô (Lentinus edodes), bào ngư tím (Pleurotus
ostreatus), đuôi gà (G. frondosa), bào ngư vua (P. eryngii), kim châm (F. velutipes),
ngọc bích (Hypsizygus marmoreus). Những cơ chất thường sử dụng là mạt cưa, dăm
bào, rơm rạ, cùi bắp, cỏ khô, bã mía. Những cơ chất này thường được bổ sung thêm
cám gạo, cám lúa mạch, lúa mì, bột bắp, bột hạt bông để tăng hàm lượng đạm.
Ngoài ra còn có thể bổ sung thêm đường, mật rỉ đường, thạch cao, đá vôi. Hỗn hợp
được phối trộn và bổ sung nước sao cho đạt độ ẩm khoảng 60-70% là được. Sau đó
phân phối hỗn hợp vào các túi PP hoặc PE. Các túi này được khử trùng từ 1-2 giờ ở
121
0
C, 1atm, thời gian khử trùng phụ thuộc vào trọng lượng của túi. Cấy giống và ủ
tơ nhiệt độ thích hợp, sau khi ủ tơ các túi phôi được chuyển vào nhà tưới.
 Trồng nấm ngoài trời trên gỗ khúc
Gỗ thường dùng là gỗ của cây gỗ mềm như sồi, liễu, cao su, so đũa… Cây
nên đốn vào thời điểm chứa nhiều chất dự trữ nhất. Cây đốn xuống, nếu chuẩn bị
trồng thì cưa thành những khúc 0,8-1,2m. Cây khi cưa khúc phải xử lý đầu gốc bị
cưa, nếu không sẽ dễ bị mốc. Cấy meo giống vào những lỗ được khoan trên khúc
cây. Đậy lỗ khoan lại và phủ lên một lớp sáp để tránh làm khô meo giống và tránh
nhiễm khuẩn.
Phương pháp này sử dụng phổ biến trong nuôi trồng nấm đông cô, nấm mèo,
nấm tuyết, nấm đuôi gà tạo ra sản phẩm có chất lượng cao. Đôi khi các khúc cây

còn được chôn dưới đất, phủ lên một lớp lá mục hoặc vải ni-lông. Đây là phương
pháp để trồng nấm trân châu (Pholiota nameko) và nấm linh chi (G. lucidum).
Khác với kỹ thuật trên là các khúc cây được thay bằng các cơ chất như mạt
cưa, dăm bào, rơm rạ, cùi bắp, bã mía… Sau khi tơ nấm lan kín cơ chất các túi phôi
được đem ra ngoài trời và cho xuống đất sao cho 1/3 túi phôi nhô lên khỏi mặt đất.
Quả thể sẽ mọc ra từ trên miệng túi phôi. Kỹ thuật này chỉ áp dụng ở các vùng có
khí hậu thích hợp như độ ẩm cao, nhiệt độ ổn định. Ở Trung Quốc, phương pháp
này để trồng nấm đông cô.


Tổng quan



Nguyễn Thị Thu Trang 18

 Trồng nấm ngoài trời
Thích hợp cho những loài nấm ra quả thể khi ở ngoài trời. Cơ chất được sử
dụng là rơm rạ, mạt cưa và dăm bào. Cơ chất được xếp thành từng lớp tạo thành
luống hay mô dưới bóng râm. Cuối cùng cho meo giống vào giữa các lớp. Mô nấm
được tưới nước hàng ngày và được phủ bằng áo mô làm từ rơm rạ bện thành tấm.
Việc thiết kế mô nấm và áo mô tùy theo từng vùng. Áo mô chỉ được mở ra khi cần
thu đón nấm. Những loài thường trồng theo phương pháp này là nấm rơm.

1.4. Nấm dược liệu và dược tính
Nấm dược liệu chỉ những loài nấm có khả năng ngăn chặn, phòng chống
bệnh tật và được sử dụng làm thuốc từ hàng ngàn năm nay tại Châu Á. Theo kinh
nghiệm tích lũy có rất nhiều loài nấm được thu hái từ tự nhiên và trồng khắp thế
giới. Ngày nay, các nhà khoa học đã có nhiều công trình nghiên cứu chứng minh
nấm dược liệu có những khả năng trên. Một số loại nấm đang được trồng nhiều trên

thế giới như: nấm vân chi, nấm linh chi và chân chim…
 Nấm vân chi
Vân chi là những loài có quả thể không có cuống hoặc cuống rất ngắn, mỏng,
bìa quả thể quăn hoặc hơi quăn, bề mặt quả thể tạo ra các vân đồng tâm, mặt dưới
có nhiều lỗ nhỏ. Tùy theo màu sắc của loài vân chi mà chúng được gọi tên như vân
chi đen, vân chi đỏ, vân chi trắng…Hiện nay loài vân chi được biết tới nhiều nhất là
vân chi đen với thành phần có nhiều các hợp chất sinh học như PSK và PSP. PSK
tác động lên với thụ thể CD4 của đại thực bào, cảm ứng sự tăng tiết TFN-α,
cytokine gây viêm IL-6 [61, 77]. Các phức hợp protein polysaccharide thu thập cho
thấy có các hoạt tính sinh học như là chất chống oxi hóa, giảm stress [54]. Phân
đoạn polysaccharide ức chế hơn 90% sự phát triển của dòng tế bào ung thư B-cell
lymphoma (Raji), ung thư bạch cầu (HL-60, NB-4), 4 dòng tế bào ung thư vú (T-
47D, Bcap37, ZR75-30, MCF-7), ung thư gan (7703) [23, 95]. Ly trích phân đoạn
PSP cho thấy khả năng ức chế sự phát triển của căn bệnh ung thư phổi nguyên phát
tế bào lớn, nghiên cứu trên các bệnh nhân cho thấy rằng sau khi sử dụng PSP trong