Nghiên cứu nuôi cấy tế bào cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) và khảo sát khả năng tích lũy một số hợp chất có hoạt tính sinh học của chúng

LỜI CẢM ƠN

Hoàn thành luận án này, trước hết chúng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc
đến GS. TS. Nguyễn Hoàng Lộc và PGS. TS. Cao Đăng Nguyên đã quan tâm giúp
đỡ và hướng dẫn tận tình.
Xin được bày tỏ lòng biết ơn tới các cán bộ, giảng viên của Phòng thí
nghiệm Các hợp chất thứ cấp, Viện Tài nguyên-Môi trường và Công nghệ sinh học,
Đại học Huế; Bộ môn Sinh lý-Sinh hóa, Khoa Sinh học, Trường đại học Khoa học,
Đại học Huế đã giúp đỡ chúng tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Xin cám ơn Ban Giám đốc, Ban Đào tạo Sau đại học của Đại học Huế; Ban
Giám hiệu, Phòng Nghiên cứu Khoa học và Hợp tác Quốc tế, Phòng Đào tạo Sau
đại học Trường đại học Khoa học; Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh học, Trường đại học
Khoa học, Đại học Huế; Ban Giám hiệu, Khoa Sinh-Môi trường, Trường Đại học
Sư phạm - Đại học Đà Nẵng đã có nhiều giúp đỡ quí báu, tạo mọi điều kiện tốt nhất
để chúng tôi hoàn thành luận án.
Xin cám ơn các đồng nghiệp, bạn bè đã nhiệt tình động viên, hỗ trợ chúng tôi
hoàn thành luận án.
Cuối cùng, xin được bày tỏ lòng biết ơn đến những người thân trong gia đình
đã đóng góp một phần không nhỏ trong việc hoàn thành luận án này.
Huế, ngày 15 tháng 02 năm 2014
Tác giả

Võ Châu Tuấn


LỜI CAM ĐOAN


Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả
trình bày trong luận án là trung thực, khách quan, nghiêm túc và chưa từng được ai

công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Nếu có gì sai sót, tôi xin chịu hoàn toàn
trách nhiệm.
Tác giả

Võ Châu Tuấn



MỤC LỤC
LỜI CÁM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
MỤC LỤC
BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
MỞ ĐẦU 1
1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 1
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 3
3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN 3
4. ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 4
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5
1.1. NUÔI CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT 5
1.1.1. Sơ lƣợc lịch sử nuôi cấy tế bào thực vật 5
1.1.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật 6
1.1.2.1. Nuôi cấy callus 6
1.1.2.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào 7
1.1.2.3. Các thông số đánh giá khả năng sinh trưởng của tế bào 10
1.1.2.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào 12
1.1.2.5. Nuôi cấy tế bào thực vật ở qui mô lớn 16
1.2. SỰ TÍCH LŨY CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP TRONG TẾ BÀO THỰC

VẬT NUÔI CẤY IN VITRO 19
1.2.1. Vai trò của các hợp chất thứ cấp ở thực vật 19
1.2.2. Các nhóm hợp chất thứ cấp chủ yếu ở thực vật 19
1.2.2.1. Nhóm terpene 20
1.2.2.2. Nhóm phenol 20
1.2.2.3. Các hợp chất chứa nitrogen 20

1.2.3. Những nghiên cứu sản xuất các hợp thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực
vật 21
1.2.3.1. Những nghiên cứu ngoài nước 21
1.2.3.2. Những nghiên cứu trong nước 25
1.3. GIỚI THIỆU VỀ CÂY NGHỆ ĐEN 28
1.3.2. Thành phần hóa học 28
1.3.3. Công dụng 30
1.3.3.1. Công dụng cổ truyền 30
1.3.3.2. Các hoạt tính sinh học 30
1.3.4. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy in vitro của cây nghệ đen 35
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 37
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 37
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 37
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38
2.3.1. Nuôi cấy callus 39
2.3.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào 39
2.3.2.1. Nuôi cấy huyền phù tế bào trong bình tam giác 39
2.3.2.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào trong hệ lên men 40
2.3.3. Xác định khả năng sinh trƣởng của tế bào 40
2.3.4. Định lƣợng tinh dầu 41
2.3.5. Định lƣợng curcumin 41
2.3.6. Định lƣợng polysaccharide hòa tan trong nƣớc 42
2.3.7. Xác định sesquiterpene 42

2.3.8. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu 43
2.3.9. Xử lý thống kê 43
Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 44
3.1. NUÔI CẤY CALLUS NGHỆ ĐEN 44
3.2. NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO TRONG BÌNH TAM GIÁC 47
3.2.1. Ảnh hƣởng của cỡ mẫu nuôi cấy 47

3.2.2. Ảnh hƣởng của tốc độ lắc 49
3.2.3. Ảnh hƣởng của chất ĐHST 51
3.2.3.1. Ảnh hưởng của BA 51
3.2.3.2. Ảnh hưởng của 2,4-D 52
3.2.3.3. Ảnh hưởng của 2,4-D và BA 52
3.2.4. Ảnh hƣởng của nguồn carbon 54
3.2.4.1. Ảnh hưởng của sucrose 54
3.2.4.2. Ảnh hưởng của glucose 56
3.3. NUÔI CẤY TẾ BÀO HUYỀN PHÙ TRONG HỆ LÊN MEN 59
3.3.1. Khảo sát sinh trƣởng của tế bào 59
3.3.2. Ảnh hƣởng của điều kiện nuôi cấy 61
3.3.2.1. Cỡ mẫu 61
3.3.2.2. Tốc độ khuấy 62
3.3.2.3. Ảnh hưởng của tốc độ sục khí 63
3.4. KHẢO SÁT SỰ TÍCH LŨY MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH
SINH HỌC TRONG TẾ BÀO NGHỆ ĐEN 65
3.4.1. Hàm lƣợng tinh dầu 65
3.4.2. Hàm lƣợng polysaccharide hòa tan trong nƣớc tổng số 67
3.4.3. Hàm lƣợng curcumin 68
3.4.4. Xác định sesquiterpene 73
3.5. HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA TINH DẦU TẾ BÀO NGHỆ ĐEN 77
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 80
NHỮNG CÔNG TRÌNH ĐÃ ĐƢỢC CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

82
TÀI LIỆU THAM KHẢO 83
PHỤ LỤC

BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT

BAP : 6-benzylaminopurine
BA : 6-benzyladenine
CIB : centrifugal impeller bioreator
cs : cộng sự
DMSO : dimethyl sulfoxide
ĐC : đối chứng
ĐHST : điều hòa sinh trưởng
HPLC : high performance liquid chromatography
(sắc ký hiệu năng cao áp)
IAA : indoleacetic acid
IBA : indolebutyric acid
Kin : kinetin
L : lít
L-DOPA : L-3,4 -dihydrooxyphenylamine
LPS : lipopolysaccharide
MS : Murashige và Skoog (1962)
NAA : naphthaleneacetic acid
Nxb : nhà xuất bản
TNF-α : tumor necrosis factor-alpha
2,4-D : 2,4-dichlorophenoxyacetic acid

DANH MỤC CÁC BẢNG

TT
Tên bảng
Trang
1
Bảng 3.1.Khả năng tạo callus từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro

44
2
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của chất ĐHST lên sinh trưởng và phát
sinh hình thái của callus
46
3
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của cỡ mẫu lên sinh trưởng của tế bào
nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác
48
4
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên sinh trưởng của tế bào
nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác
50
5
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của BA lên sinh trưởng của tế bào nuôi
cấy huyền phù trong bình tam giác
51
6
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của 2,4-D lên sinh trưởng của tế bào nuôi
cấy huyền phù trong bình tam giác
52
7

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của 2,4-D và BA lên sinh trưởng của tế
bào nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác
53
8
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của sucrose lên sinh trưởng của tế bào
nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác
54
9
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của glucose lên sinh trưởng của tế bào
nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác
56
10
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của fructose lên sinh trưởng của tế bào
nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác
57
11
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của cỡ mẫu lên sinh trưởng của tế bào
nuôi cấy huyền phù trong hệ lên men 10 L
62
12
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy lên sinh trưởng của tế
bào nuôi cấy huyền phù trong hệ lên men 10 L
63
13
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của tốc độ sục khí lên sinh trưởng của tế
bào nuôi cấy huyền phù trong hệ lên men 10 L
64

14
Bảng 3.14. Hàm lượng tinh dầu của tế bào nghệ đen nuôi cấy

trong hệ lên men 10 L
66
15
Bảng 3.15. Hàm lượng polysaccharide của tế bào nghệ đen nuôi
cấy trong hệ lên men 10 L
67
16
Bảng 3.16. Hàm lượng curcumin của tế bào nghệ đen nuôi cấy
trong hệ lên men 10 L
69
17
Bảng 3.17. Chiều cao phổ hấp thụ (mAU) của sesquiterpene
trong tế bào nuôi cấy ở hệ lên men 10 L và tế bào củ nghệ tự
nhiên
74
18
Bảng 3.18. Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu tế bào nghệ đen
78

DANH MỤC CÁC HÌNH

TT
Tên hình
Trang
1
Hình 2.1. Cây nghệ đen nuôi cấy in vitro
37
2
Hình 2.2. Sơ đồ thí nghiệm
38
3
Hình 3.1. Callus hình thành từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro
(A) callus trắng và xốp, (B) callus trắng và mọng nước
45
4
Hình 3.2. Callus có màu vàng, rắn, rời rạc sau 14 ngày nuôi cấy
47
5
Hình 3.3. Dịch huyền phù tế bào nghệ đen sau 14 ngày nuôi cấy
trong bình tam giác trên môi trường có 3% sucrose
55
6
Hình 3.4. Sinh trưởng của tế bào nghệ đen nuôi cấy trong bình
tam giác trên môi trường MS có 3% sucrose; 0,5 mg/L BA và
1,5 mg/L 2,4-D, lắc 120 vòng/phút
58
7

Hình 3.5. Nuôi cấy tế bào nghệ đen trong bình tam giác 250 ml
đặt trên máy lắc
59
8
Hình 3.6. Nuôi cấy tế bào nghệ đen trong hệ lên men 10 L
60
9
Hình 3.7. Sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong hệ lên men
nuôi cấy trên môi trường MS có 3% sucrose; 0,5 mg/L BA; 1,5
mg/L 2,4-D ; khuấy 120 vòng/phút; sục khí 2,0 L/phút, cỡ mẫu
100 g
60
10
Hình 3.8. Sinh khối tươi (A) và sinh khối khô (B) của tế bào
nghệ đen sau 14 ngày nuôi cấy trong hệ lên men 10 L
61
11
Hình 3.9. Sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong hê lên men
nuôi cấy trên môi trường MS có 3% sucrose; 0,5 mg/L BA; 1,5
mg/L 2,4-D ; khuấy 150 vòng/phút; sục khí 2,5 L/phút, cỡ mẫu
200 g
65
12
Hình 3.10. Phổ HPLC của curcumin chuẩn (0,5 mg/ml)
71

13
Hình 3.11. Phổ HPLC curcumin của củ nghệ đen 01 năm tuổi
ngoài tự nhiên
72

14
Hình 3.12. Phổ HPLC curcumin của tế bào nghệ đen sau 2 đến
18 ngày nuôi cấy trong hệ lên men 10 lít
73
15
Hình 3.13. Phổ HPLC của sesquiterpene. A: Củ nghệ đen tự
nhiên; B: tế bào nghệ đen nuôi cấy trong hệ lên men 10 L từ 2
đến 18 ngày
76
16
Hình 3.14. Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu nghệ đen
77


1
MỞ ĐẦU

1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Trong nhiều thế kỷ qua, loài người đã dựa chủ yếu vào thực vật như là
nguồn cung cấp carbohydrate, protein và chất béo làm thực phẩm. Hơn nữa, thực
vật cũng là nguồn cung cấp phong phú các hợp chất tự nhiên dùng làm dược
phẩm, hóa chất nông nghiệp, hương liệu, chất màu, thuốc trừ sâu sinh học hoặc
các chất phụ gia thực phẩm có giá trị [132]. Những sản phẩm này được biết như
là các chất trao đổi thứ cấp, được hình thành với một lượng rất nhỏ trong cây
(thường nhỏ hơn 1% khối lượng khô) và chức năng trao đổi chất chưa được biết
đầy đủ. Chúng được xem là sản phẩm của các phản ứng hóa học của thực vật với
môi trường hoặc là sự bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật và động vật [177].
Những nghiên cứu về các hợp chất thứ cấp có nguồn gốc thực vật đã phát triển
từ cuối những năm 50 của thế kỷ XX và đến nay có khoảng hơn 80.000 hợp chất
thứ cấp khác nhau ở thực vật đã đuợc công bố [19], [23].

Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), có đến 80% dân số thế giới sử dụng
thảo dược làm thuốc để chữa bệnh và chăm sóc sức khỏe. Việc khai thác nguồn
dược liệu tự nhiên từ thực vật đang trở thành một vấn đề quan trọng mang tính
toàn cầu và chúng ngày càng được thương mại hóa nhiều hơn. Tuy nhiên, vấn đề
đặt ra hiện nay là nơi sống tự nhiên của các loài cây thuốc đang bị biến mất
nhanh chóng do sự biến đổi của khí hậu toàn cầu cũng như sự khai thác bừa bãi
của con người. Như vậy, sản xuất các hợp chất thứ cấp thực vật bằng con đường
canh tác truyền thống và tổng hợp hóa học sẽ có nhiều hạn chế, khó có thể đáp
ứng đủ nhu cầu dược liệu ngày càng tăng trong tương lai [188]. Điều này buộc
các nhà khoa học cần phải tính đến công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật như một
con đường tiềm năng để cung cấp nguyên liệu cho ngành công nghiệp dược
phẩm [106].

2
Nuôi cấy tế bào thực vật đã được quan tâm nghiên cứu từ những năm
1950. Nhiều nghiên cứu cho thấy, nuôi cấy tế bào thực vật là một phương thức
có hiệu quả trong sản xuất các hợp chất có hoạt chất sinh học hoặc các chất
chuyển hóa của chúng [132]. Ưu điểm của nuôi cấy tế bào thực vật là có thể
cung cấp liên tục nguồn nguyên liệu dồi dào để tách chiết ở quy mô công nghiệp
các hoạt chất mà không phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên [106]; có thể tạo ra các
hợp chất mới và chủ động nâng cao khả năng sản xuất chúng bằng cách thay đổi
các điều kiện nuôi cấy [128]; các hoạt chất thu được không bị nhiễm bẩn bởi
thuốc trừ sâu, diệt cỏ, kháng côn trùng cũng như tránh được sự không đồng nhất
về nguồn nguyên liệu và những biến động hàm lượng của các sản phẩm thực vật
ngoài tự nhiên. Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu cũng cho thấy, hàm lượng các
chất có hoạt tính sinh học tích lũy trong tế bào thực vật nuôi cấy in vitro tương
đương hoặc cao hơn nhiều lần so với cơ quan tích lũy của chúng trong cây ngoài
tự nhiên [140], [167]. Đến nay, người ta đã thành công trong sản xuất rất
nhiều loại hợp chất có giá trị theo phương thức này trên qui mô lớn
như anthraquinone ở cây Rubia akane, vincristine ở cây dừa cạn (Catharanthus

roseus), berberin ở cây Coscinium fenustratum, diosgenin ở cây Dioscorea
doryophora, taxol ở các loài thuộc chi Taxus, ginsenoside ở các loài thuộc chi
Panax… [163].
Nghệ đen còn gọi là nga truật thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) có nguồn
gốc từ Đông Bắc Ấn Độ, được trồng ở khắp khu vực Nam Á, Đông Nam Á,
Trung Quốc, Đài Loan, và Madagasca [9], [115]. Củ của cây nghệ đen có chứa
các hoạt chất sinh học chủ yếu là curcumin, terpenoid và tinh dầu. Ngoài ra nó
còn có tinh bột, chất dẻo và một số chất có vị đắng như tannin và flavonoid [82].
Các nghiên cứu cho thấy, curcumin có khả năng chống được sự phát sinh khối u;
một số dạng ung thư ở chuột như ung thư ruột kết, ung thư dạ dày, ung thư vú và
ung thư buồng trứng [55], [66], [152]; curcumin cũng có tác dụng chống đông
máu và hạ huyết áp; curcuminoid và sesquiterpene là những chất có khả năng ức

3
chế sự hình thành TNF-α của đại thực bào đã được hoạt hóa, do đó có tác dụng
chống viêm nhiễm [152]; curcumin còn là một chất chống oxy hóa có khả năng
bảo vệ tế bào. Nhiều công trình nghiên cứu cũng cho thấy, tinh dầu nghệ đen có
tác dụng kháng khuẩn và kháng đột biến rất cao [176]. Bên cạnh đó,
polysaccharide của nghệ đen ức chế hiệu quả sinh trưởng của các bướu thịt
(sarcoma 180) được cấy dưới da của chuột, ngăn cản đột biến nhiễm sắc thể, có
hoạt tính kích thích đại thực bào [75], [105], [169]. Trong tự nhiên, nghệ đen là
loài nhân giống bằng thân rễ, phải mất một thời gian dài để tạo củ nên hệ số
nhân kém; năng suất thu hoạch thường thấp, đặc biệt là phụ thuộc rất lớn vào
điều kiện đất đai, khí hậu, mùa vụ, chi phí nhân công và vật tư sản xuất. Mặt
khác, nghệ đen trong tự nhiên còn dễ mắc các bệnh như thối củ và đốm lá [29].
Vì vậy, rất khó có đủ nguồn nguyên liệu dồi dào và ổn định để sản xuất lượng
lớn các hợp chất có hoạt tính sinh học quý của cây nghệ đen sử dụng trong bào
chế dược phẩm.
Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu
nuôi cấy tế bào cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) và khảo sát khả

năng tích lũy một số hợp chất có hoạt tính sinh học của chúng”
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu thiết lập các điều kiện và môi trường nuôi cấy thích hợp để
sản xuất nhanh sinh khối tế bào, đồng thời xác định được khả năng tích lũy và
hoạt tính sinh học một số hợp chất trong tế bào nghệ đen nuôi cấy huyền phù
trong hệ lên men 10 L.
3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN
3.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu của luận án sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học mới, có
tính hệ thống về nuôi cấy in vitro tế bào cây nghệ đen và sự tích lũy một số hợp
chất có hoạt tính sinh học của chúng; đồng thời là nguồn tài liệu tham khảo hữu

4
ích trong nghiên cứu, giảng dạy về nuôi cấy tế bào và sản xuất các hoạt chất sinh
học có giá trị cao từ nuôi cấy tế bào thực vật.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả của luận án là cơ sở khoa học để phát triển hệ thống nuôi cấy
huyền phù tế bào cây nghệ đen ở qui mô lớn nhằm sản xuất nhanh sinh khối,
cung cấp nguồn nguyên liệu liên tục và ổn định để thu hồi các hợp chất có giá trị
cao dùng làm thuốc, góp phần bảo vệ và chăm sóc sức khỏe cộng đồng.
4. ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
- Đã tạo ra dòng tế bào callus (rắn và rời rạc) từ bẹ lá của cây nghệ đen in
vitro thích hợp để nuôi cấy huyền phù, đồng thời xác định một cách có hệ thống
các điều kiện và môi trường nuôi cấy thích hợp cho sự sinh trưởng nhanh và ổn
định của tế bào nghệ đen nuôi cấy trong bình tam giác 250 ml và trong hệ lên
men 10 L.
- Đã khảo sát sự tích lũy các chất có hoạt tính sinh học như: tinh dầu,
curcumin, sesquiterpene và polysaccharide trong tế bào nghệ đen nuôi cấy.
Nghiên cứu đã xác định được hàm lượng và thời điểm tích lũy cao nhất của các
hợp chất này theo đường cong sinh trưởng và đồng thời cho thấy có sự chuyển

hóa sinh học các chất như curcumin và sesquiterpene xảy ra trong nuôi cấy
huyền phù tế bào cây nghệ đen.
- Đã khảo sát được khả năng kháng khuẩn của tinh dầu chiết rút từ tế bào
cây nghệ đen nuôi cấy in vitro và nhận thấy, tinh dầu của tế bào có khả năng ức
chế sinh trưởng một số loài vi sinh vật gây bệnh ở mức tương đương hoặc cao
hơn so với tinh dầu chiết rút từ củ nghệ đen 01 năm tuổi ngoài tự nhiên.

5
Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. NUÔI CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT
1.1.1. Sơ lƣợc lịch sử nuôi cấy tế bào thực vật
Nuôi cấy mô và tế bào thực vật là nuôi cấy vô trùng các tế bào, mô, cơ
quan và các bộ phận của chúng dưới các điều kiện về vật lý và hóa học in vitro
[93]. Thử nghiệm đầu tiên về nuôi cấy tế bào bên ngoài một cơ thể thực vật hoàn
chỉnh được công bố vào năm 1902 bởi Haberlandt - nhà Sinh lý thực vật người
Đức, người được biết đến như nhà sáng lập ra phương pháp nuôi cấy tế bào thực
vật. Trong bài viết nổi tiếng với tiêu đề “Những thử nghiệm nuôi cấy các tế bào
thực vật tách rời”, ông đã mô tả những nổ lực trong thiết lập có hệ thống nuôi
cấy các tế bào thịt lá, biểu bì và lông hút. Mặc dù không thành công trong nuôi
cấy phân chia tế bào, nhưng ông dự đoán sẽ có khả năng đạt được sự phân chia
tế bào trong nuôi cấy các tế bào riêng rẽ, điều này đã ảnh hưởng mạnh mẽ đến sự
nghiệp của nhiều nhà nhà khoa học sau này. Tiếp sau đó là những nghiên cứu
rộng rãi theo hướng cải thiện các dung dịch dinh dưỡng và khám phá về các chất
ĐHST thực vật nhằm kiểm tra lại những dự đoán của Haberlandt [164]. Trong
những năm 1960, nhiều nổ lực hơn nữa để cải thiện dung dịch dinh dưỡng đã
đưa đến 2 công bố đáng chú ý của Skoog và cs, với hai môi trường nuôi cấy đã
được dùng và mô tả đó là môi trường Murashige và Skoog [107] và môi trường
Linsmaier và Skoog [85].
Nuôi cấy các tế bào đơn và các khối nhỏ tế bào thành công đầu tiên trong

nuôi cấy tế bào cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) và cây Tagetes erecta trên máy
lắc. Nuôi cấy tế bào thực vật trên qui mô lớn đầu tiên thành công ở tế bào của
các cây bạch quả, bắt ruồi, cỏ Lolium và hoa hồng trong hệ lên men kiểu ráy
nước dạng đơn giản với dung tích 20 L [164].
Những thử nghiệm đầu tiên trong nuôi cấy tế bào đơn để sản xuất dược

6
phẩm đã được tiến hành trong những năm 1950 tại công ty Charles Pfizer [164].
Đến năm 1987, đã có 30 hệ thống nghiên cứu nuôi cấy tế bào thực vật có khả
năng sản xuất các hợp chất thứ cấp cao hơn trong các thực vật tương ứng [177].
Đến nay, một thế kỷ sau những nghiên cứu của Haberlandt, nhiều hợp chất thứ
cấp đã được sản xuất thương mại bằng con đường nuôi cấy tế bào thực vật như
berberine, paclitaxel, ginseng saponin, polysaccharide [177].
1.1.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật
Mỗi tế bào thực vật là một đơn vị độc lập, chứa đầy đủ thông tin di truyền
của một cơ thể. Trong những điều kiện nhất định, mỗi tế bào có thể hình thành
lại được một cơ thể hoàn chỉnh. Hoàn toàn có thể tách riêng và nuôi cấy tế bào
độc lập để nghiên cứu mọi quá trình sống xảy ra trong đó [12].
1.1.2.1. Nuôi cấy callus
Nuôi cấy tế bào thực vật được khởi đầu bằng việc hình thành các tế bào
không phân hóa, được gọi là callus. Nuôi cấy callus đạt được bằng cách nuôi cấy
các mẫu mô tách từ thực vật trên môi trường dinh dưỡng cơ bản có chất làm rắn
là agar. Môi trường dinh dưỡng cơ bản này chứa các chất dinh dưỡng khoáng đa
lượng, vi lượng, nguồn carbon và nhiều loại chất ĐHST thực vật. Đánh giá chính
xác các ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng hoặc chất ĐHST lên
khả năng sinh trưởng của callus là yêu cầu quan trọng để xác định môi trường tối
ưu cho nuôi cấy. Các thông số phổ biến nhất dùng trong đánh giá sinh trưởng
trong nuôi cấy callus bao gồm khối lượng tươi, khối lượng khô và chỉ số sinh
trưởng [93].
Trong nuôi cấy callus, các tế bào của callus có thể trải qua biến dị dòng

soma trong quá trình cấy chuyển. Vì vậy, các dòng tế bào ổn định di truyền nên
được lựa chọn để tránh sự sản xuất thất thường các chất trao đổi thứ cấp trong
nuôi cấy. Thông thường, sau một số lần cấy chuyển, callus có thể được xem là
dòng tế bào đồng nhất khi các thông số sinh trưởng của dòng tế bào được lặp lại

7
trong quá trình cấy chuyển trên cùng một loại môi trường nuôi cấy [35]. Bouque
và cs (1998) đã nghiên cứu nuôi cấy 217 dòng callus khác nhau từ các loài của
chi Psoralea nhận thấy, sau 16 lần cấy chuyển (48 tuần), có khoảng 90% số
dòng callus sinh trưởng ổn định [22]. Fett-Neto và cs (1994) nuôi cấy tế bào cây
Taxus cuspidate và thu được dòng tế bào ổn định sinh trưởng sau 2 năm cấy
chuyển [42].
1.1.2.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào
Nuôi cấy huyền phù tế bào thường được khởi đầu bằng cách chuyển các
khối callus vào nuôi cấy trong môi trường lỏng được khuấy bởi máy lắc, quay
hoặc màng lọc xoay. Mô callus nuôi cấy nên là loại mô dễ vỡ vụn để có thể thiết
lập được dịch huyền phù tế bào với mức độ phân tán cao nhất. Nuôi cấy huyền
phù tế bào trong môi trường lỏng cung cấp một hệ thống duy nhất cho những
nghiên cứu chi tiết về sinh trưởng và sản xuất các chất chuyển hóa. So với nuôi
cấy callus, nuôi cấy huyền phù sản xuất ra lượng lớn sinh khối tế bào mà từ đó
các chất chuyển hóa thứ cấp có thể dễ dàng chiết tách [35].
Nuôi cấy dịch huyền phù là sự tiến triển từ thực vật đến mẫu vật, đến
callus và cuối cùng đến dịch huyền phù [7]. Trong quá trình nuôi cấy, các tế
bào sẽ dần dần tách ra khỏi callus do những chuyển động xoáy của môi
trường. Sau một thời gian ngắn nuôi cấy, trong dịch huyền phù là hỗn hợp các
tế bào đơn, các khối tế bào với kích thước khác nhau và các tế bào chết. Tuy
nhiên, cũng có những dịch huyền phù tốt, chứa tỷ lệ cao các tế bào đơn và tỷ
lệ nhỏ các cụm tế bào. Khả năng tách rời của các tế bào trong môi trường có
thể cải thiện bằng cách thay đổi thành phần môi trường nuôi cấy [104]. Mặc
dù sự kết khối của tế bào có thể được loại bỏ bởi sự thay đổi điều kiện môi

trường nuôi cấy, nhưng thường trong cuối pha lag của quá trình nuôi cấy, các
tế bào trở nên kết dính với nhau như là một qui luật. Để thu được dịch huyền
phù gồm phần lớn các tế bào đơn, người ta thường sử dụng các enzyme phá
hủy thành tế bào hoặc dùng các sàng (rây). Tuy nhiên, các dịch huyền phù

8
đồng nhất đã được thiết lập thường chúng có xu hướng quay trở lại tình trạng
kết khối ban đầu (Fowler và cs 1982) [104].
Cho đến nay, hầu hết các dịch huyền phù tế bào đã được nuôi cấy có sự
hiện diện của cả những tế bào đơn và các khối tế bào. Nhìn chung, môi trường
thích hợp cho nuôi cấy callus thì cũng thích hợp cho nuôi cấy huyền phù tế bào.
Tuy nhiên, trong một số trường hợp, nồng độ của các auxin và cytokinin đòi hỏi
cao hơn. Thông thường, động học sinh trưởng của các tế bào nuôi cấy huyền phù
là đường hàm mũ; các hợp chất thứ cấp chủ yếu tạo ra trong pha ổn định, liên
quan với trao đổi chất sơ cấp và phân chia tế bào [35].
Nuôi cấy huyền phù tế bào là tiến hành nuôi tế bào trong môi trường lỏng
có dung tích nhất định để thiết lập hệ huyền phù tế bào. Trong quá trình nuôi
cấy, bình nuôi cấy không chỉ thường xuyên có sự tăng lên của các sản phẩm trao
đổi chất mà còn luôn luôn diễn ra sự trao đổi không khí với bên ngoài. Khi các
chất dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy bị tiêu hao, cùng với sự tạo thêm một
số sản phẩm trao đổi chất có hại, thì sự phân chia và sinh trưởng của tế bào sẽ bị
ức chế. Khi đó, thông qua cấy chuyển hoặc thay đổi môi trường nuôi cấy sẽ kích
thích sự sinh trưởng mạnh mẽ trở lại của huyền phù tế bào [12]. Nhìn chung, có
ba phương thức nuôi cấy huyền phù tế bào là nuôi cấy mẻ, nuôi cấy mẻ có bổ
sung chất dinh dưỡng và nuôi cấy liên tục.
- Nuôi cấy mẻ
Nuôi cấy mẻ là phương thức mà trong suốt thời gian nuôi cấy không thêm
vào chất dinh dưỡng cũng như không loại bỏ sản phẩm cuối cùng của quá trình
trao đổi chất. Do vậy, các điều kiện môi trường luôn thay đổi theo thời gian, mật
độ tế bào tăng lên còn nồng độ cơ chất giảm xuống. Nuôi cấy mẻ được xem là

một hệ thống đóng, quần thể tế bào sinh trưởng và phát triển theo một số pha
nhất định với những điều kiện đặc trưng [7]. Mặc dù tế bào thực vật và tế bào vi
sinh vật có một số điểm khác nhau như kích thước của tế bào thực vật lớn hơn,
chu kỳ sinh trưởng của tế bào thực vật dài hơn, sự trao đổi chất chậm hơn…

9
nhưng nhìn chung sinh trưởng của tế bào thực vật trong nuôi cấy mẻ cũng trải
qua các giai đoạn như tế bào vi sinh vật, gồm có bốn pha. Pha lag (pha tiềm
phát): bắt đầu từ khi callus được đưa vào môi trường cho đến khi có dấu hiệu
phân chia tế bào đầu tiên; trong pha này không xảy ra sự tăng về khối lượng và
số lượng tế bào. Pha log (pha lũy thừa): ở pha này, sự phân chia và tăng khối
lượng tế bào diễn ra với tốc độ lớn nhất (số lượng tế bào tăng theo hàm mũ); Pha
ổn định: ở pha này, khả năng phân bào giảm mạnh, số lượng và khối lượng tế
bào ổn định. Pha suy vong: sự sinh trưởng của tế bào ra khỏi đỉnh cao, giảm
xuống và dần đến ngừng sinh trưởng nếu không được cấy chuyển [12].
- Nuôi cấy mẻ có bổ sung chất dinh dưỡng
Đây là một hình thức khác của phương thức nuôi cấy mẻ. Sau khi tế bào
nuôi cấy sinh trưởng cực đại, các chất dinh dưỡng sẽ dần cạn kiệt, lúc này người
ta sẽ cung cấp thêm các chất dinh dưỡng mới vào hệ lên men mà không loại bỏ
dịch nuôi cũ. Trong hệ lên men này, có các bộ phận điều khiển hàm lượng các
chất dinh dưỡng được thêm vào giúp hạn chế hay tăng cường tốc độ sinh trưởng
hoặc sự tích lũy hợp chất thứ cấp. Tuy nhiên, như vậy thể tích hệ lên men sẽ tăng
lên, để hạn chế việc này người ta thường sử dụng dung dịch chất dinh dưỡng
dưới dạng đậm đặc. Phương thức này vẫn được gọi là nuôi cấy mẻ, vì toàn bộ
thể tích của hệ lên men cuối cùng được thu hồi theo từng mẻ [129].
- Nuôi cấy liên tục
Những hạn chế chính của nuôi cấy mẻ đó là tốn thời gian nhiều cho quá
trình khử trùng, bổ sung vào và lấy môi trường ra, làm sạch hệ thống lên men
[48]. Nuôi cấy liên tục là phương pháp kinh tế vì có thể kéo dài thời gian nuôi
cấy hay kéo dài pha log trong một thời gian nhất định. Trong phương thức nuôi

cấy này, dòng đi vào (môi trường mới) bằng với dòng đi ra (gồm môi trường, tế
bào và các chất chuyển hóa) để giữ cho thể tích bình nuôi không thay đổi, và
điều kiện nuôi cấy của hệ thống luôn ổn định [138].

10
Nhìn chung, các phương thức nuôi cấy có tính truyền thống như nuôi cấy
mẻ, nuôi cấy mẻ có bổ sung chất dinh dưỡng và nuôi cấy liên tục trong nuôi cấy
vi sinh vật có thể được dùng trong nuôi cấy tế bào thực vật. Về cơ bản, thiết lập
một phương thức nuôi cấy tế bào phụ thuộc bởi (1) mối quan hệ giữa sinh trưởng
và tổng hợp các chất trao đổi thứ cấp và (2) khả năng các sản phẩm thứ cấp tiết
ra hoặc không tiết ra môi trường [23].
1.1.2.3. Các thông số đánh giá khả năng sinh trưởng của tế bào
Trong nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật, cần phải theo dõi chặt chẽ sự
sinh trưởng và sức sống của tế bào để tăng hiệu suất nuôi cấy tế bào cũng như
cải thiện điều kiện nuôi cấy [12]. Một số chỉ tiêu dùng để đánh giá động học sinh
trưởng tế bào thực vật trong nuôi cấy, bao gồm thể tích lắng, thể tích đóng gói,
khối lượng tươi và khối lượng khô, mật độ, chỉ số sinh trưởng, thời gian nhân
đôi và một số chỉ tiêu khác của tế bào [135].
- Thể tích lắng và thể tích đóng gói của tế bào
Thể tích lắng của tế bào được xác định bằng cách cho các huyền phù tế
bào trầm tích trong một cái ống có chia vạch và được biểu thị bằng phần trăm thể
tích chung của dịch huyền phù, bao gồm cả sinh khối tế bào. Thể tích đóng gói
của tế bào được xác định bằng cách tương tự sau khi tế bào được nén chặt bởi
quay ly tâm. Hai thông số này cho phép đánh giá nhanh sinh trưởng của tế bào
trong khi vẫn duy trì được điều kiện vô trùng mẫu. Các phương pháp này thuận
lợi để giám sát sự sinh trưởng của tế bào suốt một chu kỳ nuôi cấy trong các bình
tam giác với điều kiện nuôi cấy như nhau, bởi vì dịch huyền phù có thể đưa trở
lại các điều kiện nuôi cấy trước đó. Tuy nhiên, dựa vào thể tích tế bào có lẽ
không phải là cách chính xác để kiểm tra sinh trưởng vì nó phụ thuộc vào hình
thái tế bào [93].

- Khối lượng tươi và khối lượng khô của tế bào
Khối lượng tươi và khối lượng khô của tế bào cho phép đánh giá sinh

11
trưởng của tế bào chính xác hơn các chỉ tiêu về thể tích tế bào. Tuy nhiên, yêu
cầu của các thao tác mẫu lại tiến hành trong điều kiện không vô trùng. Việc xác
định khối lượng tươi của tế bào ít tốn thời gian hơn khối lượng khô, nhưng nó
không phản ánh được sự gia tăng sinh khối thực của tế bào, đặc biệt là cuối giai
đoạn nuôi cấy, khi mà hầu hết sự tăng trưởng của tế bào trong nuôi cấy là do sự
hấp thu nước [161].
- Mật độ tế bào nuôi cấy
Để thu được giá trị tin cậy về số lượng tế bào trong nuôi cấy huyền phù,
trước hết các khối tế bào phải được phá vỡ bằng cách ủ dịch huyền phù với dung
dịch chromium trioxide 8% hoặc với các enzyme thủy phân như cellulase và
pectinase. Phương pháp sử dụng chromium trioxide thì nhanh hơn và ít phức tạp
hơn dùng các enzyme thuỷ phân, tuy nhiên nó gây trở ngại trong ước tính các tế
bào sống của cùng một mẫu. Phương pháp dùng enzyme duy trì được các tế bào
sống và đánh giá về số lượng các tế bào sống trong cùng một mẫu bởi nhuộm
màu tế bào có thể thực hiện được [122].
- Chỉ số sinh trưởng
Khối lượng tươi và khô của tế bào chỉ cho phép đánh giá sinh khối thuần
túy của mô tại thời điểm lấy mẫu, chỉ số sinh trưởng tương quan với dữ liệu sinh
khối tại thời điểm lấy mẫu và nuôi cấy ban đầu. Nó được tính toán bằng tỉ lệ sinh
khối được tích lũy với sinh khối ban đầu nuôi cấy [93].
- Thời gian tế bào nhân đôi
Thời gian nhân đôi là thời gian để lượng sinh khối của một quần thể tế
bào đạt gấp hai lần so với ban đầu. Một trong những điểm khác biệt lớn nhất
giữa sinh trưởng của tế bào thực vật và tế bào vi sinh vật có liên quan tới tốc độ
sinh trưởng riêng của chúng. Mặc dù kiểu sinh trưởng có thể giống nhau, tế bào
thực vật có thời gian nhân đôi hoặc tốc độ phân chia đo theo ngày, trong khi đó ở

trong nhiều loài vi sinh vật thì xác định theo phút đến giờ. Thời gian nhân đôi

12
nhanh nhất trong nuôi cấy tế bào thực vật được ghi nhận trong nuôi cấy tế bào
cây thuốc lá là 15 giờ [24].
1.1.2.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào
- Môi trường nuôi cấy
Thành phần môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh
trưởng và phát triển của tế bào. Trong giai đoạn đầu của quá trình nuôi cấy, các
chất dinh dưỡng giảm nhanh, sản phẩm trao đổi chất mới bắt đầu được tích tụ và
tăng dần. Ba hợp phần của môi trường có ảnh hưởng lớn đến quá trình nuôi cấy tế
bào thực vật là carbon, nitrogen và phospho. Tuy nhiên, cũng không thể coi nhẹ
các hợp phần khác của môi trường nuôi cấy, đặc biệt là các nguyên tố vi lượng và
các chất ĐHST. Chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất mặc
dù nồng độ của chúng có trong môi trường ở mức độ rất thấp [17].
+ Các chất ĐHST
Nhiều nghiên cứu cho thấy, các chất ĐHST có ảnh hưởng lớn đến tốc độ
sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp các chất của mô thực vật trong nuôi cấy
in vitro cũng như trong cây hoàn chỉnh. Zhao và cs (2001) đã nghiên cứu ảnh
hưởng của 2,4-D và NAA phối hợp với BAP ở các nồng độ khác nhau lên sinh
trưởng và tích lũy jaceosidin của tế bào cây hoa sen tuyết (Saussurea medusa).
Kết quả cho thấy, các môi trường có sự phối hợp giữa BAP với 2,4-D thì không
thích hợp cho sinh trưởng của tế bào; khi nồng độ 2,4-D gia tăng lên, khả năng
sinh trưởng của tế bào giảm đi rõ rệt. Sử dụng các môi trường bổ sung phối hợp
giữa BAP với NAA, lượng jaceosidin tích lũy trong tế bào tăng tỷ lệ thuận với
sự gia tăng nồng độ của NAA [189]. Mô của cây cà trái vàng (Solanum
xanthocarpum) khi nuôi cấy trên môi trường chứa 2,4-D thì có khả năng sản xuất
được solasodine, nhưng khi nuôi cấy trên môi trường có chứa IAA hoặc IBA thì
không sản xuất được chất này [111]. Năm 1993, khi nghiên cứu sản xuất
berberine từ nuôi cấy huyền phù tế bào cây Thalictrum minus, Hara và cs nhận

13
thấy, môi trường nuôi cấy có bổ sung 2,4-D và NAA không có tác dụng kích
thích sản xuất berberine, trong khi đó khả năng sản xuất berberine của tế bào
tăng khi sử dụng BAP [56].
+ Nguồn carbon
Mô và tế bào thực vật trong nuôi cấy in vitro sống chủ yếu dựa theo
phương thức dị dưỡng. Vì vậy, việc bổ sung vào môi trường nuôi cấy nguồn
carbon hữu cơ là điều bắt buộc. Nguồn carbon trong môi trường nuôi cấy tế bào
thực vật thường được cung cấp dưới dạng carbohydrate. Carbon vừa tham gia
tổng hợp các thành phần của tế bào vừa cung cấp năng lượng cho quá trình sinh
trưởng và tồn tại của tế bào. Ngoài ra, carbohydrate cũng là nguồn cung cấp
carbon cần thiết cho sự hình thành các sản phẩm trung gian thông qua trao đổi
chất [191]
Trong phần lớn các môi trường nuôi cấy, nguồn carbon được bổ sung chủ
yếu là đường sucrose và glucose với nồng độ 20 - 40 g/L. Gautheret (1959) cho
rằng đối với phần lớn các mô và tế bào nuôi cấy, đường sucrose và glucose là
nguồn carbon tốt nhất, trong một số trường hợp khác, có thể dùng fructose,
galactose và maltose (Nguyễn Đức Thành, 2000) [14]. Ảnh hưởng của nồng độ
sucrose trong môi trường nuôi cấy đã được nghiên cứu ở nuôi cấy tế bào tam
thất (Panax notoginseng). Khối lượng khô của tế bào tăng tỷ lệ thuận với sự gia
tăng nồng độ sucrose từ 20 đến 40 g/L, nhưng khi nồng độ sucrose lên đến 60
g/L thì dường như ức chế sự sinh trưởng của tế bào [140]. Theo Gunter và cs
(2003), nuôi cấy tế bào cây Silene vulgaris ở các môi trường có nồng độ đường
sucrose thấp (dưới 30 g/L), khả năng sinh trưởng và tổng hợp polysaccharide của
tế bào không cao. Khi tăng nồng độ sucrose lên dến 30 g/L khả năng tích lũy
sinh khối tế bào cũng gia tăng. Môi trường có chứa 30 g/L sucrose hoặc phối hợp
giữa đường sucrose (15 g/L) và glucose (15 g/L) là thích hợp nhất cho sinh
trưởng của tế bào [50].

14
- Điều kiện nuôi cấy
+ Cỡ mẫu nuôi cấy ban đầu
Cỡ mẫu đưa đưa vào nuôi cấy ban đầu rất quan trọng khi cấy chuyển tế bào
thực vật, và cũng có thể ảnh hưởng đến sự sản xuất hợp chất trao đổi thứ cấp. Khi
lượng mẫu ban đầu thấp hơn lượng mẫu tới hạn thấp nhất thì tế bào thường không
sinh trưởng được [78]. Matsubara và cs (1989) trong nghiên cứu nuôi cấy tế bào
cây Coptis japonica đã nhận thấy, khi lượng mẫu đưa vào nuôi cấy cao thì sinh
khối tế bào và berberine thu được cũng cao. Lượng mẫu đưa vào nuôi cấy thích
hợp nhất cho sinh trưởng và tích lũy berberine của tế bào là 8 g/L, đạt 55 g/L sinh
khối và 3,5 g/L berberine sau nuôi cấy [97]. Lượng mẫu nuôi cấy ảnh hưởng lớn
đến sinh trưởng tế bào được tìm thấy trong nuôi cấy tế bào cây Gymnema
sylvestre. Với lượng mẫu tế bào đưa vào nuôi cấy là 60 g/L thì khả năng sinh
trưởng của tế bào là cao nhất, nếu lượng mẫu đưa vào nuôi cấy là 80 hoặc 100 g/L
thì sinh trưởng tế bào bị giảm rõ rệt [78]. Kết quả nghiên cứu nuôi cấy ở mật độ
cao tế bào của cây tía tô (Perilla frutescens ) để sản xuất anthocyanin cho thấy,
lượng mẫu đưa vào nuôi cấy ảnh hưởng đáng kể lên động học của quá trình sinh
trưởng và tích lũy anthocyanin của tế bào. Sinh trưởng và tích lũy anthocyanin của
tế bào tốt nhất khi nuôi cấy với lượng mẫu nuôi cấy là 50 g/L, sinh khối tế bào đạt
38,3 g/L sau 11 ngày nuôi cấy, và anthocyanin đạt 5,8 g/L sau 10 ngày nuôi cấy;
cao gấp 3,3 lần (lượng sinh khối) và 24 lần (lượng anthocyanin) so với nuôi cấy
mà lượng mẫu chỉ sử dụng là 15 g/L [191].
+ Khuấy trộn
Khuấy trộn là điều cần thiết để phân bố đồng đều tế bào, mô, chất dinh
dưỡng trong pha lỏng [77]. Việc khuấy trộn thường được thực hiện bằng cách
sục khí hoặc dùng cánh khuấy cơ học hoặc kết hợp cả 2 phương pháp trên.
Thủy động lực cho việc hòa trộn cần phải nhỏ để không làm hư hại mô hay tế
bào nhưng phải đủ để kích thích chức năng của tế bào [116]. Hầu hết các chất
dinh dưỡng đều có khả năng hòa tan cao trong nước, do đó trong thời gian lên

15
men nếu chỉ để phân bố đều môi trường thì sự khuấy trộn không thật cần
thiết. Tuy nhiên, đối với oxy hòa tan thì phải có sự khuấy trộn tốt vì khả năng
hòa tan của nó trong môi trường lên men là rất kém, trong khi yêu cầu oxy
cho sự sinh trưởng của các vi sinh vật hiếu khí (hoặc tế bào thực vật và động
vật) lại rất cao [7].
Nghiên cứu của Wang và cs (2010) cho thấy, nuôi cấy tế bào cây
Glycyrrhiza inflata trong hệ lên men, với tốc độ khuấy đạt 150 vòng/phút thì
sinh khối tế bào đạt cao nhất, trong khi đó với tốc độ khuấy ở 100 và 300
vòng/phút thì sự tích lũy sinh khối tế bào kém hơn [171]. Nghiên cứu ảnh hưởng
của tốc độ khuấy lên sinh trưởng của tế bào cây dầu cọ, Choi và cs (2008) đã
khảo sát ở các tốc độ khuấy từ 80 - 335 vòng/phút. Kết quả cho thấy, ở tốc độ
khuấy 120 và 225 vòng/phút, sinh khối tế bào tăng 200%; ở tốc độ khuấy 335
vòng/phút sinh khối tế bào chỉ tăng khoảng 7% so với sinh khối tế bào đưa vào
nuôi cấy ban đầu [33].
+ Sục khí
Sục khí trong nuôi cấy tế bào thực vật nhằm đáp ứng ba chức năng chính
đó là duy trì điều kiện hiếu khí, giảm hấp thụ các sản phẩm bay hơi và loại bỏ
nhiệt sinh ra từ quá trình trao đổi chất. Tốc độ tiêu thụ oxy đặc trưng của tế bào
thực vật phụ thuộc vào dòng tế bào, điều kiện nuôi cấy và giai đoạn sinh trưởng,
nhưng nhìn chung là khoảng 6 x 10
−4
g O
2
/g khối lượng khô/phút [72].

Tốc độ
hấp thụ oxy

phải đủ lớn để cung cấp đầy đủ lượng oxy cần thiết cho nhu cầu hô
hấp của tế bào và vì thế nó hỗ trợ cho sinh trưởng tế bào và sản xuất các hợp
chất mong muốn, tuy nhiên không nên quá cao bởi vì cả việc cung cấp dư thừa
hoặc thiếu oxy đều có thể ức chế sự sinh trưởng và trao đổi chất thứ cấp của tế
bào. Để tránh những mặt hạn chế của oxy, hàm lượng oxy hòa tan trong môi
trường nuôi cấy phải được giữ trên mức hàm lượng oxy hòa tan tới hạn (thông
thường khoảng 15-20% bão hòa không khí) [72].